CN110967488B - 试纸条、试剂盒以及测定糖化血红蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种试纸条、试剂盒以及测定糖化血红蛋白的方法。该试纸条包括:底板,底板上设置有至少一个检测孔;层析膜,层析膜位于底板上,且经过所述检测孔,至少部分所述层析膜修饰有硼酸基团;吸水纸,吸水纸位于所述底板上,所述吸水纸的一端与所述层析膜的一端接触;挡板,挡板设置于所述层析膜上,且所述挡板与所述检测孔对应设置;和防水纸,防水纸设置在所述吸水纸的上表面。所提供的试剂盒包括该试纸条。应用该试纸条或试剂盒,可以实现糖化血红蛋白的快速测定。该测定方法具有样本需求量极低,结果准确,稳定性好,操作简单,价格低廉等优点,不仅满足临床诊断和POCT,也适用于广大群众使用,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断领域,涉及一种试纸条、试剂盒以及测定糖化血红蛋白的方法。
背景技术
在上世纪90年代,英美等西方国家便对糖尿病进行了大规模临床病理和生理学的研究,科学家们发现糖尿病并发症的减少和糖化血红蛋白(HbA1c)占总血红蛋白(Hb)百分比的降低有关。HbA1c不仅可以反映血糖控制、治疗达标等指标,它也在糖尿病预测、诊断、愈后判定上有重要的价值。与空腹血糖(FPG)和空腹葡萄糖耐量测试(OGTT)相比,HbA1c有几个优势:(1)方便;(2)更好的预分析稳定性;(3)抗干扰性能。HbA1c能准确反应患者长期的血糖控制水平,也是监测糖尿病发展的重要指标。准确的HbA1c检测方法将简化糖尿病诊断过程,并在一定程度上实现糖尿病的早期诊断。
目前,临床和实验室使用的HbA1c测定方法有很多种,大体可以基于原理分为两种类型:(1)基于HbA1c和非糖化血红蛋白的电荷不同,主要方法有离子交换法和电泳法;(2)基于HbA1c和非糖化血红蛋白的结构不同,这种结构不同主要来自于糖基化位点,主要方法有免疫法和亲和层析法。液相色谱法是目前国际所公认的HbA1c测定方法,临床上也大量使用。这种方法虽然较为稳定、有参考价值且线性度好,但此法的缺点是设备昂贵,仪器巨大,且需要专业的操作人员操作,检测费时长,不利于广泛使用。电泳法利用不同电荷的血红蛋白样本在电泳凝胶上迁移速度不同的原理测定HbA1c。由于电泳法操作复杂,得到结果时间长,现在该方法已很少应用于临床。免疫法基于抗体和抗原特异性结合的原理,其中,侧向免疫层析试纸,以荧光量子点/荧光微球/金纳米颗粒为信号载体,以检测线和质控线的信号为检测结果,适合有快速诊断需求的科室和家庭,但该方法线性范围小、易受血红蛋白变异体和HbA1c前体的干扰,应用受到巨大限制。亲和层析法基于硼酸基团对多羟基类物质的吸附能力,亲和层析柱中的硼酸基团首先与HbA1c糖基化位点的顺位二醇结合,接着从柱子中流出的部分为非糖化的血红蛋白(用紫外-可见吸收光谱判断浓度),再用Tris、甘露醇、山梨醇等多羟基类物质竞争并洗脱柱子上的HbA1c,最后从柱子中流出的部分为HbA1c。亲和层析柱法测定HbA1c在临床上也有所普及,亲和层析柱法不受诸多血红蛋白变异体的影响。HbA1c前体的存在对其所测定结果无明显影响,血样无需预处理去除HbA1c前体。但目前亲和层析柱法的填料昂贵、操作复杂并且得到结果所需要的时间较长。
针对HbA1c检测的方法学研究已经有很多年,但仍需进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此,本发明的一个目的在于提出一种试纸条、试剂盒以及测定糖化血红蛋白的方法。应用该试剂条、试剂盒可以实现糖化血红蛋白的快速检测,检测结果既满足HbA1c检测的国际标准,又突破现有方法的局限,可以实现准确度、线性范围、床旁检测(point-of-care testing,POCT)、廉价、操作简单、检测耗时短,微量样本等方面的需求。
具体而言,本发明提供了如下技术方案:
根据本发明的第一方面,本发明提供了一种试纸条,包括:
底板,所述底板上设置有至少一个检测孔;
层析膜,所述层析膜位于所述底板上,且经过所述检测孔,至少部分所述层析膜修饰有硼酸基团;
吸水纸,所述吸水纸位于所述底板上,所述吸水纸的一端与所述层析膜的一端接触;
挡板,所述挡板设置于所述层析膜上,且所述挡板与所述检测孔对应设置;
防水纸,所述防水纸设置在所述吸水纸的上表面。
本发明提供了一种试纸条,该试纸条包括底板、层析膜、吸水纸、挡板和防水纸,其中底板主要用来支撑试纸条的其他部件或者结构,底板上设置有至少一个检测孔,该检测孔可以通过底板挖空的方式形成,也可以将几块底板拼接形成检测孔。底板上设置有层析膜,且层析膜经过所述检测孔,由此可以通过层析膜将挖空或者拼接的底板连接在一起。层析膜上进一步设置有挡板,挡板与检测孔对应设置,这样使得光源照射到检测孔时,挡板遮挡住经过检测孔的光通道,从而可以避免外源光的干扰。底板上还同时设置吸水纸,吸水纸的一端与层析膜的一端接触,通过相接触的吸水纸和层析膜,可以使得液体经由层析膜流到吸水纸。吸水纸的上表面还设置有防水纸,避免在应用试纸条时,吸水纸中液体对于操作人员的干扰等。
应用上述试纸条对糖化血红蛋白进行测定,可以实现床旁检测(point-of-caretesting,POCT),方便诊断与医疗;而且十分廉价,大大降低医疗成本;操作十分简单,不需要特定的专业人员操作,不需要特殊培训,适用于普通大众;检测耗时短,从测定开始到测定结束只需要4-6min,大大提高了效率;同时只需要微量血样,例如只需要0.5-1.5μL的血样即可实现精准检测,指尖血与静脉血均可。
根据本发明的实施例,以上所述的试纸条可以进一步包括如下技术特征:
在本发明的一些实施例中,所述底板上设置有一个检测孔,所述层析膜为阳离子交换层析膜。底板上仅设置有一个检测孔,层析膜表面呈负电性,可以作为阳离子交换层析膜。当血红蛋白(pI基于6~8之间)在中性或弱酸性环境中时,血红蛋白表面的正电基团与阳离子交换层析膜上的负电基团相互吸引,从而被固定在该阳离子交换层析膜上,通过检测孔测定此时结合的血红蛋白即为总的血红蛋白(Hb);当体系pH变为碱性时,血红蛋白的正电基团被封闭而带上负电荷,非糖基化的血红蛋白与阳离子交换层析膜相互排斥,可被逐渐洗脱下来,而HbA1c由于其糖基化位点的顺位二醇与硼酸基团特异性结合而不被洗脱,仍然固定在该阳离子交换层析膜上,通过检测孔测定此时结合的血红蛋白即为HbA1c。通过计算糖化血红蛋白与总血红蛋白的比值(HbA1c/Hb)得到糖化血红蛋白的浓度。
在本发明的一些实施例中,所述阳离子交换层析膜上修饰有功能基团,所述功能基团包括选自氨基、季铵基、羟基、磷酸基、硫酸基、亚硫酸基、磺酸基和亚磺酸基中的至少一种。该功能基团的修饰可有效改善层析膜的亲水性能和稳定性,也可有效改善层析膜的层析效果,增加测定的准确定性。
在本发明的一些实施例中,所述底板上设置有第一检测孔和第二检测孔;所述层析膜包括第一层析膜和第二层析膜,所述第一层析膜一端和所述第二层析膜一端接触,所述第二层析膜的另一端与所述吸水纸的一端接触;所述第一层析膜修饰有硼酸基团,所述第一层析膜为阳离子交换层析膜,所述第二层析膜未修饰有硼酸基团,所述第二层析膜为阴离子交换层析膜;所述第一层析膜上设置有第一挡板,所述第一挡板和所述第一检测孔对应设置,所述第二层析膜上设置有第二挡板,所述第二挡板和所述第二检测孔对应设置。
用于测定血红蛋白的层析膜包含两种层析膜,第一层析膜为一种富含硼酸基团的阳离子交换层析膜(同上实施例),第二层析膜为一种阴离子交换层析膜,表面呈正电性。在碱性环境中,血红蛋白带上负电荷,其中HbA1c由于糖基化位点的顺位二醇与硼酸基团特异性结合的性质,会被固定在上部分膜上,而非糖化的血红蛋白由于同种电荷的相互排斥作用继续向下层析,被固定在下部分带正电的阴离子交换膜上。利用光的反射原理分别测定上部分膜和下部分膜的光反射信号,得到HbA1c和非糖化血红蛋白的测定值,通过计算可以计算得到糖化血红蛋白的百分含量。
在本发明的一些实施例中,作为阳离子交换层析膜的第一层析膜上修饰有功能基团,所述功能基团包括选自氨基、季铵基、羟基、磷酸基、硫酸基、亚硫酸基、磺酸基和亚磺酸基中的至少一种。该功能基团的修饰可有效改善层析膜的亲水性能和稳定性,也可有效改善层析膜的层析效果,增加检测的准确定性。
在本发明的一些实施例中,所述层析膜中均含有微米级微通道。层析膜膜内部富含连通的微米级微通道,可以容许液流和容纳红细胞进入,从而可以方便快速利用试纸条进行检测。
在本发明的一些实施例中,所述微米级微通道的孔径大小为5~60微米,优选为5~30微米。该孔径大小的微米级微通道,可以有效容纳红细胞的进入以及容许液流的流动,从而可以方便快速利用试纸条进行检测。
在本发明的一些实施例中,所述层析膜为高分子有机材料制成,所述层析膜的厚度应不小于0.4mm,优选为0.6~1.2mm,进一步优选为0.6~0.9mm。该层析膜保证至少一定厚度以确保负载足量的血红蛋白用于检测,另一方面所述层析膜厚度不宜过厚,避免影响检测的灵敏度及精确度。
在本发明的一些实施例中,所述高分子有机材料包括选自纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯,聚苯乙烯和聚乙烯醇中的至少一种。
在本发明的一些实施例中,所述硼酸基团包括选自硼酸化合物中的至少一种。
在本发明的一些实施例中,所述硼酸化合物包括选自邻氨基苯硼酸、间氨基苯硼酸、对氨基苯硼酸、3-氨基-4-甲基苯硼酸盐酸盐、3-氨基-5-羧基苯硼酸和4-氨基甲酰苯硼酸中的至少一种。这些硼酸化合物提供的硼酸基团可与HbA1c的糖基化位点特异性结合,从而用来检测HbA1c(GHb)含量。
在本发明的一些实施例中,所述底板和所述挡板各自独立地为高分子聚合材料制成。由高分子聚合材料制成的底板和挡板分别可以起到支撑以及挡光作用。
在本发明的一些实施例中,所述高分子聚合材料包括选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚碳酸树酯、聚苯醚、聚亚苯基硫醚、聚苯硫醚中的至少一种。这些高分子聚合材料制成的底板和挡板分别可以起到支撑以及挡光作用。
根据本发明的第二方面,本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括本发明第一方面任一实施例所述的试纸条。通过本发明所提供的试剂盒,可以用来测定样本中,例如血液样本中糖化血红蛋白的含量,而且只需微量样本,即可以实现精准检测,且不需要特定的专业人员进行操作,操作简单,具有多种优势。
根据本发明的实施例,以上所述的试剂盒可以进一步包括如下技术特征:
在本发明的一些实施例中,所述试剂盒进一步包括:第一缓冲试剂,所述第一缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0,优选为8.5-9.5。可用的第一缓冲试剂包括但不限于Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液。
根据本发明的实施例,所述第一缓冲试剂还包含至少一种表面活性剂,含有表面活性剂可增加缓冲液在层析膜上的液流稳定性。根据本发明的实施例,所述表面活性剂的浓度为0.1%-10%(w/v)。该表面活性剂可以为非离子型表面活性剂,根据本发明的实施例,可用的非离子型表面活性剂包括但不限于Tween 20、DD、DDM和Triton X-100。
根据本发明的实施例,第一缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。加入钠离子和/或者镁离子有助于糖化血红蛋白的糖基化位点与硼酸基团稳定结合。
在本发明的一些实施例中,所述试剂盒进一步包括:第二缓冲试剂,所述第二缓冲试剂的pH值为5.5-8.0,优选为6.5-7.5。可用的第二缓冲试剂包括但不限于Tris-HCl、甘氨酸-盐酸、MES、磷酸氢二钠-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液等。
在本发明的一些实施例中,所述第二缓冲试剂还包括至少一种表面活性剂,该表面活性剂用于裂解红细胞,释放血红蛋白,且可增加缓冲液在层析膜上的液流稳定性;优选地,所述表面活性剂的质量浓度为0.3%-10%(w/v)。根据本发明的实施例,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。可用的非离子型表面活性剂包括但不限于Tween 20、DD、DDM和Triton X-100等。
在本发明的一些实施例中,所述试剂盒进一步包括:第三缓冲试剂,所述第三缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0,优选为8.5-9.5。
在本发明的一些实施例中,所述第三缓冲试剂包括选自Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种;优选地,所述第三缓冲试剂还包含至少一种表面活性剂;所述表面活性剂优选为非离子型表面活性剂;优选地,所述非离子型表面活性剂为选自Tween 20、DD、DDM和Triton X-100中的至少一种。
在本发明的一些实施例中,所述表面活性剂的质量浓度为0.1%-10%(w/v)。
在本发明的一些实施例中,所述第一缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。
在本发明的第三方面,本发明提供了一种测定糖化血红蛋白的方法,包括采用本发明第一方面任一实施例所述的试纸条或者本发明第二方面任一实施例所述的试剂盒对样本进行测定。
在本发明的第四方面,本发明提供了一种测定样本中糖化的蛋白质的方法,包括:提供第一固体载体基质和第二固体载体基质,所述第一固体载体基质的末端和所述第二固体载体基质的一端接触,所述第一固体载体基质上修饰有硼酸基团,所述第二固体载体基质上未修饰有硼酸基团;使所述第一固体载体基质、所述第二固体载体基质和第三缓冲试剂接触,所述第三缓冲试剂具有使得糖化的蛋白质与所述第一固体载体基质结合、非糖化的蛋白质与所述第二固体载体基质结合的pH值;将样本先后和所述第一固体载体基质、所述第二固体载体基质接触,分别测定结果所述第一固体载体基质以及经过所述第二固体载体基质的蛋白质的含量,以便测定样本糖化蛋白质的含量。这里提到的“固体载体基质”不做特殊限制,只要能够实现承载样本和缓冲试剂的目的即可,例如可以是上文提到的试剂条中的第一层析膜和第二层析膜。
根据本发明的实施例,所述第三缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0,优选为8.5-9.5;
根据本发明的实施例,所述第三缓冲试剂包括选自Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种。
根据本发明的实施例,所述第三缓冲试剂还包含至少一种表面活性剂;所述表面活性剂优选为非离子型表面活性剂;优选地,所述非离子型表面活性剂为选自Tween 20、DD、DDM和Triton X-100中的至少一种。
根据本发明的实施例,所述表面活性剂的质量浓度为0.1%-10%(w/v)。
根据本发明的实施例,所述第三缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。
附图说明
图1为根据本发明的实施例所提供的试纸条A的结构示意图;
图2为根据本发明的实施例所提供的试纸条B的结构示意图;
图3为根据本发明的实施例2所提供的检测过程的光信号变化曲线图;
图4为根据本发明的实施例2所提供的血红蛋白浓度与测定值的标准曲线图;
图5为根据本发明的实施例2所提供的HbA1c测定值与临床值相关性图;
图6为根据本发明的实施例3所提供的血红蛋白浓度与测定值的标准曲线图;
图7为根据本发明的实施例3所提供的HbA1c测定值与临床值相关性图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所述实施例的示例在附图中示出。需要说明的是,所描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
本文中,“接触”即可以表示两种部件相接,也可以表示两种部件发生部分重叠。例如,当表示吸水纸的一端与层析膜的一端接触时,可以指吸水纸的一端与层析膜的一端相接,也可指吸水纸的一端和层析膜的一端发生部分重叠。
本发明提供了一种试纸条以及包含该试纸条的试剂盒。其中所提供的试纸条包括:底板,所述底板上设置有至少一个检测孔;层析膜,所述层析膜位于所述底板上,且经过所述检测孔,至少部分所述层析膜修饰有硼酸基团;吸水纸,所述吸水纸位于所述底板上,所述吸水纸的一端与所述层析膜的一端接触;挡板,所述挡板设置于所述层析膜上,且所述挡板与所述检测孔对应设置;和防水纸,所述防水纸设置在所述吸水纸的上表面。应用该试纸条可以实现糖化血红蛋白的快速、准确测定。
吸水纸的一端与层析膜的一端接触,可以通过吸水纸促进液体的流动,用于促进层析过程的持续进行。吸水纸可以自己制备获得,也可以直接购买获得。根据本发明的实施例,吸水纸的吸液量应不小于750g/m2,由此可以用于促进层析过程的持续进行,并快速获得测定结果。
防水纸可以采用本领域常用的防水材料,能起到防水作用即可。利用可以采用聚乙烯膜涂胶纸作为防水纸。防水纸可以自己制备获得,也可以直接购买获得。
底板主要起到支撑的作用,挡板能够遮挡光即可。底板和挡板可以采用同一种高分子聚合材料制成,也可以采用不同的高分子聚合材料制成。可用的高分子聚合材料包括但不限于聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚碳酸树酯、聚苯醚、聚亚苯基硫醚、聚苯硫醚等等。
层析膜用作加入样品溶液,而且能够使得样品溶液流动,因此层析膜中富含微米级微通道,这些微米级微通道的孔径大小可以为5-60μm,可有效容纳红细胞进入。优选地,所述孔径大小为5-30μm。另外,层析膜作为检测糖化血红蛋白的载体,一方面应确保足够的血红蛋白负载量,另一方面又不应影响测定的灵敏度及准确度,因此层析膜的厚度应不小于0.4mm。优选地,所述厚度为0.6~0.9mm。可以通过高分子有机材料获得一定厚度的富含微米级微通道的层析膜,可用的高分子有机材料包括但不限于纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯,聚苯乙烯和聚乙烯醇等,这些高分子有机材料均可以作为血红蛋白结合的载体。层析膜可以自己制备获得,也可以直接通过商购获得,例如可以采用深圳优迪生物技术有限公司的层析膜。
试纸条A和试剂盒A
在本发明的至少一些实施方式中,本发明提供了一种试纸条A,该试纸条如图1所示,包括底板1、层析膜2、吸水纸3、防水纸4、挡板5和检测孔6,其中层析膜2为阳离子交换层析膜。底板1被分为两块,通过层析膜2连接,形成检测孔6,作为光检测通道,在层析膜2上设置挡板5,挡板5与检测孔6对应设置,需完全遮挡住检测孔的光线,避免外源光的干扰。底板上方同时设置有吸水纸,吸水纸的一端与层析膜的一端接触,用于吸收液体,同时在吸水纸上方覆盖防水纸,防止对于操作人员造成干扰。
应用该试纸条进行糖化血红蛋白检测,可以基于如下检测原理:层析膜富含硼酸基团,表面呈负电性,其内部还富含许多连通的微米级微通道,可以容许液流和容纳红细胞进入。血红蛋白等电点(pI)基于6~8之间,在中性或弱酸性环境中,血红蛋白表面的正电基团与负电膜相互吸引,从而被固定在层析膜上,测定此时结合的血红蛋白即为总的血红蛋白(Hb);当体系pH变为碱性时,血红蛋白的正电基团被封闭而带上负电,非糖化的血红蛋白与负电膜相互排斥,可被逐渐洗脱下来,而HbA1c由于其糖基化位点的顺位二醇与硼酸基团特异性结合而不被洗脱,仍然固定在层析膜上,测定此时结合的血红蛋白即为HbA1c。通过计算糖化血红蛋白与总血红蛋白的比值(HbA1c/Hb)得到糖化血红蛋白的浓度。
本发明还提供了一种试剂盒A,该试剂盒包括上述试纸条A和两种试剂。根据本发明的实施例,这两种试剂分别是第一缓冲试剂和第二缓冲试剂。其中第一缓冲试剂呈现碱性,可以作为洗脱液,第二缓冲试剂呈现弱酸性或中性,可以作为裂解液。
所述第一缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0,优选为8.5-9.5。可用的第一缓冲试剂包括但不限于Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种。根据本发明的实施例,所述第一缓冲试剂还包含一种非离子型表面活性剂,这些非离子型表面活性剂包括但不限于为Tween 20、DD、DDM和Triton X-100;表面活性剂的浓度可以为0.1%-10%(w/v)。根据本发明的实施例,第一缓冲试剂中还可以包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。
所述第二缓冲试剂的pH值为5.5-8.0,优选为6.5-7.5。可用的第二缓冲试剂包括但不限于Tris-HCl、甘氨酸-盐酸、MES、磷酸氢二钠-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。根据本发明的实施例,第二缓冲试剂还可以包括至少一种非离子表面活性剂,可用的非离子型表面活性剂包括但不限于Tween 20、DD、DDM和TritonX-100;表面活性剂的质量浓度为0.3%-10%(w/v)。
应用所提供的试纸条A或者试剂盒A进行检测,包括如下步骤:(1)首先在试纸条层析膜上方加入第二缓冲试剂,等待其在层析膜上形成稳定液流(目测膜被试剂A完全浸润,自加液起5~10s左右);(2)待层析膜被完全浸润后,再在膜上端加入微量血液样品(1-1.5μL),血液中的红细胞随即沉积在膜上,并在所提供的缓冲环境中快速裂解释放血红蛋白,血红蛋白随着液流层析,会均匀的结合在膜上,利用一定波长光照射检测孔,通过光的反射强度测定得到此时的总血红蛋白(Hb)值;(3)待第二缓冲试剂流尽后,在层析膜上方加入一定量第一缓冲试剂,提供碱性环境,此时非糖化的血红蛋白可被逐步洗脱,测定可得到HbA1c值,最终计算可得到HbA1c浓度。
在进行检测时,可用的检测光波长范围为380nm~550nm。
试纸条B和试剂盒B
在本发明的另一些实施方式中,本发明提供了一种试纸条B,如图2所示,包括:底板1、第一层析膜201、第二层析膜202、吸水纸3、防水纸4、第一挡板501、第二挡板502、第一检测孔601和第二检测孔602。底板被分为三块,分别通过第一层析膜和第二层析膜连接,并形成第一检测孔和第二检测孔。底板上设置有吸水纸,吸水纸的一端与第二层析膜的一端接触,用于吸收液体。在第一层析膜上设置有第一挡板,第一挡板与第一检测孔对应设置,在第二层析膜上设置有第二挡板,第二挡板与第二检测孔对应设置。第一挡板和第二挡板用于挡住经过第一检测孔和经过第二检测孔的光通道,避免其他光的干扰。吸水纸上方覆盖防水纸,用于避免对操作人员的干扰。
应用所提供的试纸条B可以基于如下检测原理进行糖化血红蛋白的检测:第一层析膜作为阳离子交换层析膜,富含硼酸基团,表面呈负电性;第二层析膜作为阴离子交换层析膜,表面呈正电性。在碱性环境中,血红蛋白带上负电荷,其中HbA1c由于糖基化位点的顺位二醇与硼酸基团特异性结合的性质,会被固定在第一层析膜上,而非糖化的血红蛋白由于同种电荷的相互排斥作用继续向下层析,被固定在第二层析膜上。利用光的反射原理分别测定第一层析膜和第二层析膜的光反射信号,得到HbA1c和非糖化血红蛋白的测定值,通过计算可以计算得到糖化血红蛋白的百分含量。
本发明还提供了一种试剂盒B,该试剂盒B包括上述试纸条B和一种试剂。该试剂为第三缓冲试剂,该第三缓冲试剂呈现碱性,可以作为洗脱液。
所述第三缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0,优选为8.5-9.5。可用的第三缓冲试剂包括但不限于Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种。根据本发明的实施例,所述第三缓冲试剂还包含一种非离子型表面活性剂,这些非离子型表面活性剂包括但不限于为Tween 20、DD、DDM和Triton X-100;表面活性剂的浓度可以为0.3%-10%(w/v)。根据本发明的实施例,第三缓冲试剂中还可以包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。
应用所提供的试纸条B或试剂盒B进行糖化血红蛋白的检测,具体检测步骤为:
首先在试纸条第一层析膜上方加入一定量第三缓冲试剂,等待其在层析膜上形成稳定液流后,再在膜上端加入微量血液样品(1-1.5μL),在此条件下,血红蛋白被快速释放,且带上负电荷,HbA1c会随着液流层析,与第一层析膜上的硼酸基团结合,而非糖化的血红蛋白由于同种电荷相互排斥的原因,不会结合在第一换层析膜上,而与第二层析膜结合,利用一定波长光分别照射两个检测孔,通过光的反射强度分别得到HbA1c和非糖化血红蛋白的测定值,最终计算可得到HbA1c浓度。
在进行检测时,可以利用糖化血红蛋白测定仪配合试纸条进行检测。可用的检测光波长范围为380nm~550nm。糖化血红蛋白测定仪可以结合所提供的试纸条或者试剂盒的特性,配合试纸条或者试剂盒使用。本领域技术人员可以根据所提供的试纸条A或者试纸条B匹配单孔检测通道或者双孔检测通道的仪器进行测定即可。进行测定时的仪器只要能够配合所提供的试纸条,完成相应的光学检测即可。
同时,结合本文所提到的,试纸条或者试剂盒对于糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白测定的原理,本领域技术人员可以理解的是,所提供的试纸条或者试剂盒不仅仅可以用于糖化血红蛋白的测定,还可以用于其他糖化蛋白质的测定。相应地,所用到的样品不仅仅可以是血液样本,也可以是其他用于研究或者区分的含有糖化蛋白质的生物样品。这些均包含在本发明所要求保护的范围之内。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
实验组1制备修饰有功能基团的阳离子交换层析膜
以高分子聚乙烯为核心原料制备的阳离子交换层析膜,膜厚度为0.6mm,微通道孔径为7-15μm范围,其上修饰有羟基,具体修饰方法为:
称取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(购自于Sigma)0.05g溶于100mL纯水中,再添加500μL乙醇胺(购自于国药集团)和750μL浓盐酸(购自于国药集团),搅拌均匀后,再加入阳离子交换层析膜1.5g,搅拌反应过夜。反应结束后,纯水洗涤两遍,100mM MES缓冲液漂洗,烘干,获得修饰有功能基团的阳离子交换层析膜。
实验组2制备修饰有功能基团的阳离子交换层析膜
以高分子聚乙烯为核心原料制备的阳离子交换层析膜,膜厚度为0.6mm,微通道孔径为7-15μm范围,其上修饰有羟基,具体修饰方法为:
称取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(购自于Sigma)0.04g溶于100mL纯水中,再添加400μL正丙醇胺(购自于国药集团),用盐酸调节pH至6左右,搅拌均匀后,再加入阳离子交换层析膜1.5g,搅拌反应过夜。反应结束后,纯水洗涤两遍,100mMMES缓冲液漂洗,烘干,获得修饰有功能基团的阳离子交换层析膜。
实验组3亲和硼酸基团的修饰
以实验组1修饰有功能基团的阳离子交换层析膜作为反应膜,在该阳离子交换层析膜上进一步修饰对氨基苯硼酸,具体修饰方法为:
称取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(Sigma)0.02g,对氨基苯硼酸(购自于Sigma)0.04g,溶于100mL纯水中,用盐酸调节pH至6左右,搅拌均匀后,再加入实验组1所获得的修饰有功能基团的阳离子交换层析膜1.5g,搅拌反应过夜。反应结束后,纯水洗涤两遍,100mM MES缓冲液漂洗,烘干,获得可用的硼酸修饰的阳离子交换层析膜。
实验组4亲和硼酸基团的修饰
以实验组2修饰有功能基团的阳离子交换层析膜作为反应膜,在该阳离子交换层析膜上进一步修饰间氨基苯硼酸,具体修饰方法为:
称取EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)(Sigma)0.02g,间氨基苯硼酸(Sigma)0.04g,溶于100mL纯水中,用盐酸调节pH至6左右,搅拌均匀后,再加入实验组2所获得的修饰有功能基团的阳离子交换层析膜1.5g,搅拌反应过夜。反应结束后,纯水洗涤两遍,100mM MES缓冲液漂洗,烘干,获得可用的硼酸修饰的阳离子交换层析膜。
实施例2
实施例2提供了一种试纸条,该试纸条可以作为糖化血红蛋白的检测试纸条。其具体结构如图1所示,包括底板1、层析膜2、吸水纸3、防水纸4、挡板5和检测孔6;其中底板被分成两块,层析膜位于所述底板上,使得两块底板连接,并形成一个检测孔,层析膜经过该检测孔。底板上同时设置有吸水纸,吸水纸的一端与层析膜的一端重叠,层析膜的上方设置有挡板,挡板与检测孔对应设置,且挡板完全遮挡住检测孔的光线,避免外源光的干扰。同时在吸水纸上方覆盖防水纸。层析膜为实施例1中实验组3所获得的阳离子交换层析膜。
应用该试纸条对糖化血红蛋白进行检测,检测过程如下所示:
首先将试纸条插入糖化血红蛋白测定仪,仪器开始测定,此时仪器检测的光反射信号为空白试纸卡信号;随后加入第二缓冲试剂,液体开始在层析膜上缓慢流动,达到稳定,此时检测的光信号值为本底值,记为P;接着在层析膜上端加入微量血液样品(1-1.5μL),血液中的红细胞随即沉积在膜上,并在所提供的缓冲环境中快速裂解释放血红蛋白,血红蛋白随着液流层析,会均匀的结合在膜上,并达到稳定,此时检测的光信号值对应为总血红蛋白(Hb)的含量,记为A;待第二缓冲试剂流尽后,在层析膜上方加入一定量第一缓冲试剂,此时非糖化的血红蛋白可被逐步洗脱,而HbA1c仍可以稳定结合在膜上,此时检测的光信号值对应为HbA1c的含量,记为B。利用公式:(P-B)/(P-A)*100%,经标准曲线校准后,便可以计算得到HbA1c占总血红蛋白(Hb)的百分比。整个测定过程的光信号值变化如图3。
对该试纸条进行如下表征,检测波长为415nm。
1、重复性测试
选取两个浓度的HbA1c样品,分别为低值和高值样品,HbA1c的值分别为4.8%和10.5%,利用上述方法分别测试5次,计算平均值,标准差和变异系数(Coefficient ofVariance,CV)。
其中给出的糖化血红蛋白的值采用美国国家糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的传统蛋白,即%。本领域技术人员可以根据需要结合将其换算为国际标准单位(mmol/mol)。
其中测试使用的缓冲液分别为:第二缓冲试剂为Tris-HCl缓冲液,含1体积%Triton-X100,pH为6.5;第一缓冲试剂为甘氨酸缓冲液,pH为9。
所获得的测定结果如下表1所示:
表1HbA1c浓度高值和低值样品的测定值
由表1可知,采用上述提供的试纸条测定HbA1c,不管总血红蛋白浓度如何变化,最终得到的HbA1c的百分比保持稳定,测试不受样本量的干扰。高值样品和低值样品(P-B)/(P-A)值的变异系数(Coefficient of Variance,CV)分别为1.27%和1.77%,表明采用上述试纸条对糖化血红蛋白进行测试,能够获得良好的测试重复性。
2、线性测试
分别选取不同浓度的HbA1c样品,HbA1c浓度分别为4.8%、5.9%、7.6%、10.5%和13.2%,采用上述试纸条和所提到的方法进行测试,每个样品测定三次取平均值,计算结果如下表2所示,计算线性结果,如图4所示。
表2不同浓度的糖化血红蛋样品的测定值
HbA1c% | 4.8 | 5.9 | 7.6 | 10.5 | 13.2 |
(P-B)/(P-A)% | 25.71 | 29.06 | 35.09 | 45.78 | 52.50 |
从图4线性回归分析的结果可以看到,在HbA1c值在4.8-13.2%的范围内,该方法的测定值与血样的HbA1c的靶值之间存在着良好的线性关系,相关系数达到了0.995,证明了试剂盒用于临床的巨大潜力。
3、试剂盒测定值与临床样本值结果对比
采用上述试纸条测定40例已知糖化血红蛋白值的临床样本,比较两者的测定结果。临床样本根据临床测定值随机挑选,浓度分布于整个线性范围内,临床样本的测定值采用高效液相色谱法(HPLC)(仪器型号:HA-8180,爱科来医疗器械有限公司,Japan)测定得到。HPLC法受到国际临床化学和实验医学联合会(IFCC)的认可(Jeppsson J O,Kobold U,Barr J,et al.Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c inHuman Blood[J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2002,40(1):78---89.DIO:10.1515/CCLM.2002.016),现通常被作为HbA1c测定的“金标准”。
相关结果见图5所示。相关性关系方程Y=aX+b中,a值为1.0051,r值为0.9926,相关偏差在要求范围内,说明采用该试纸条对糖化血红蛋白的测定值与高效液相色谱法测定值存在较好的一致性,满足临床检测的要求。
实施例3
实施例3提供了一种试纸条,该试纸条可以作为糖化血红蛋白的检测试纸条。其具体结构如图2所示,包括:底板1、第一层析膜201、第二层析膜2、吸水纸3、防水纸4、第一挡板501、第二挡板502、第一检测孔601和第二检测孔602。底板被分成三块,分别通过第一层析膜和第二层析膜连接形成第一检测孔和第二检测孔,第一层析膜经过第一检测孔,第二层析膜经过第二检测孔。层析膜上分别设置有第一挡板和第二挡板,第一挡板和第一检测孔对应设置,用于遮挡经过第一检测孔的光,第二挡板和第二检测孔对应设置,用于遮挡经过第二检测孔的光。第二层析膜的一端与吸水纸的一端重叠,通过设置吸水纸促进层析过程的持续进行;吸水纸的上方覆盖有防水纸,可以防止层析液接触人体。其中第一层析膜为实施例1实验组4所获得的阳离子交换层析膜;第二层析膜为阴离子交换层析膜,不进行功能基团(羟基)的修饰,也不进行硼酸基团的修饰。
应用该试纸条,对糖化血红蛋白进行测定,在检测时,在第一检测孔和第二检测孔下面放置光源和检测装置,利用光的反射强度检测糖化血红蛋白的含量,其检测过程如下:
首先将试纸条插入糖化血红蛋白测定仪,仪器开始测定,此时仪器检测的光反射信号为空白试纸卡信号;随后加入第三缓冲试剂,液体开始在阳离子交换层析膜上缓慢流动,达到稳定,此时经第一检测孔和第二检测孔检测的光信号值为本底值,记为Q1和Q2;接着在膜上端加入微量血液样品(1-1.5μL),血液中的红细胞随即沉积在膜上,并在所提供的缓冲环境快速裂解释放血红蛋白,HbA1c随着液流层析,会均匀的结合在第一层析膜上,非糖化血红蛋白会均匀的结合在第二层析膜上;待第三缓冲试剂流尽后,经第一检测孔和第二检测孔检测到的光信号值分别为C1和C2,(Q1-C1)和(Q2-C2)值对应的分别为HbA1c和非糖化血红蛋白的含量,最终计算可以得到HbA1c占总血红蛋白(Hb)的百分比。
对该试纸条进行如下表征,检测波长为415nm。
1、重复性测试
选取两个浓度的HbA1c样品,分别为低值和高值样品,HbA1c的值分别为4.4%和13.2%,利用上述试纸条和方法分别测试5次,计算平均值,标准差和变异系数(Coefficient of Variance,CV)。
其中测试使用的第一缓冲试剂为Tris-HCl缓冲液,含1%Triton-X 100,pH为8.5。最后的测定结果如下表3所示:
表3HbA1c浓度高值和低值样品的测定值
由表3可知,用所提供的试纸条测定HbA1c,测试不受样本量的干扰。高值样品和低值样品(Q1-C1)/((Q1-C1)+(Q2-C2))值的变异系数(Coefficient of Variance,CV)分别为1.89%和2.07%,表明应用该试纸条能够获得良好的测试重复性。
2、线性测试
分别选取不同浓度的HbA1c样品,HbA1c浓度分别为4.4%、5.1%、6.3%、7.1%、11.3%、12.6%和15.1%,应用上述试纸条和方法进行测试,每个样品测定三次取平均值,计算结果如表4所示,计算线性结果,如图6所示。
表4不同浓度的糖化血红蛋样品的测定值
从图6线性回归分析的结果可以看到,在HbA1c值在4.4-15.1%的范围内,该方法的测定值与血样的HbA1c的靶值之间存在着良好的线性关系,相关系数达到了0.996,证明了试剂盒线性良好,临床潜力巨大。
3、试剂盒测定值与临床样本值结果对比
采用上述试纸条测定40例已知糖化血红蛋白值的临床样本,比较两者的测定结果。临床样本根据临床测定值随机挑选,浓度分布于整个线性范围内,临床样本的测定值采用高效液相色谱法(HPLC)(仪器型号:HA-8180,爱科来医疗器械有限公司,Japan)测定得到。HPLC法受到国际临床化学和实验医学联合会(IFCC)的认可(Jeppsson J O,Kobold U,Barr J,et al.Approved IFCC Reference Method for the Measurement of HbA1c inHuman Blood[J].Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,2002,40(1):78---89.DIO:10.1515/CCLM.2002.016),现通常被作为HbA1c测定的“金标准”。
相关结果见图7所示,相关性关系方程Y=aX+b中,a值为1.0076,r值为0.9943,相关偏差在要求范围内,说明采用所提供的试纸条进行糖化血红蛋白的测定值与高效液相色谱法测定值存在较好的一致性,满足临床检测的要求。
结合实施例3和实施例2的结果不难看出,采用实施例3所提供的方法,仅需要加入一次缓冲试剂,待稳定后,同时测定经过第一检测孔和第二检测孔的光信号值,从而可以快速获得测定结果。采用实施例3的试剂条以及相应的测定方法,可以简化操作,缩减了测定时间,更加适合家用或者快速检测。而且,对比实施例3和实施例2的重复性测试、线性测试以及对临床样本的高效液相色谱测定值的比较结果来看,采用实施例3的试纸条以及相应的测定方法所获得的检测结果,测定结果更加准确,例如测定值与血样的HbAlc的靶值的线性相关系数更好,与高效液相色谱测定值的相关性也更好。
对比例1
对比例1以实施例2为例,研究了层析膜的厚度对于糖化血红蛋白的测定结果的影响。对比例1与实施例2不同之处在于,采用不同厚度的层析膜厚度进行了测定,表现为:
以高分子聚乙烯为核心原料制备得到不同厚度的阳离子交换层析膜,膜微通道孔径为7-15μm范围,层析膜的厚度分别为0.3mm、0.6mm、0.9mm、1.2mm和1.5mm,不同厚度膜上均修饰有羟基和硼酸基团,具体修饰方法同实施例2。
选取两个浓度的HbA1c样品,分别为低值和高值样品,HbA1c的值分别为4.5%和11.0%,利用实施例2测定方法分别测试5次,计算平均值,标准差和变异系数(Coefficientof Variance,CV),结果如表5所示。
其中测试使用的缓冲液分别为:第二缓冲试剂为Tris-HCl缓冲液,含1体积%Triton-X100,pH为6.5;第一缓冲试剂为甘氨酸缓冲液,pH为9。
表5不同厚度的层析膜对测定结果的影响
(注:“/”表示无法测定出结果)
从表5可以看出,层析膜的厚度对检测结果具有较大的影响。当层析膜过薄时,膜对血红蛋白负载量过低,导致测定的准确度不满足要求;当膜过厚时,血红蛋白的层析受到影响,致使仪器可能检测不到信号。在优选厚度范围内的层析膜可以获得良好的测试重复性和准确度。
对比例2
对比例2以实施例2为例,研究了层析膜微通道孔径大小对于糖化血红蛋白的测定结果的影响。对比例2与与实施例2不同之处在于,采用具有不同孔径大小微通道的层析膜进行了测定,表现为:
以高分子聚乙烯为核心原料制备得到微通道孔径不同的阳离子交换层析膜,层析膜厚度为0.6mm,微通道孔径分别为约3-8μm、7-15μm、10-20μm、20-40μm和40-60μm范围,不同厚度膜上均修饰有羟基和硼酸基团,具体修饰方法同实施例2。
选取两个浓度的HbA1c样品,分别为低值和高值样品,HbA1c的值分别为4.5%和11.0%,利用实施例2测定方法分别测试5次,计算平均值,标准差和变异系数(Coefficientof Variance,CV),结果如表6所示。
其中测试使用的缓冲液分别为:第二缓冲试剂为Tris-HCl缓冲液,含1体积%Triton-X100,pH为6.5;第一缓冲试剂为甘氨酸缓冲液,pH为9。
表6微通道孔径不同的层析膜对测定结果的影响
(注:“/”表示无法测定出结果)
从表6可以看出,微通道孔径不同对检测结果具有较大的影响。当层析膜微通道孔径太小时,红细胞会堵塞检测通道,导致层析困难,血红蛋白残留较多,进而使测定误差增大;当层析膜微通道孔径过大时,层析液流极快,血红蛋白无法有效与层析膜结合,导致测定失败。在优选厚度范围内的层析膜可以获得良好的测试重复性和准确度。
同时,发明人发现采用是实施例3的方法进行测定时,层析膜的微通道的孔径大小以及层析膜的厚度也呈现出相似的表现。结果表明,合适厚度以及合适大小的层析膜可以保证测定结果的重复性和准确度。
在本发明的描述中,需要理解的是,术语“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。
此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中,“多个”的含义是至少两个,例如两个,三个等,除非另有明确具体的限定。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,术语、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解,例如,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或成一体。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中,除非另有明确的规定和限定,第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触,或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且,第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方,或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方,或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (12)
1.一种试纸条,其特征在于,包括:
底板,所述底板上设置有至少一个检测孔;
层析膜,所述层析膜位于所述底板上,且经过所述检测孔,至少部分所述层析膜修饰有硼酸基团;
吸水纸,所述吸水纸位于所述底板上,所述吸水纸的一端与所述层析膜的一端接触;
挡板,所述挡板设置于所述层析膜上,且所述挡板与所述检测孔对应设置;和防水纸,所述防水纸设置在所述吸水纸的上表面;
所述底板上设置有第一检测孔和第二检测孔;
所述层析膜包括第一层析膜和第二层析膜,所述第一层析膜一端和所述第二层析膜一端接触,所述第二层析膜的另一端与所述吸水纸的一端接触;
所述第一层析膜修饰有硼酸基团,所述第一层析膜为阳离子交换层析膜,表面带负电基团,所述第二层析膜未修饰有硼酸基团,所述第二层析膜为阴离子交换层析膜,表面带正电基团;
所述第一层析膜上设置有第一挡板,所述第一挡板和所述第一检测孔对应设置,所述第二层析膜上设置有第二挡板,所述第二挡板和所述第二检测孔对应设置;
所述阳离子交换层析膜上修饰有其他功能基团,所述其他功能基团包括选自氨基、季铵基、羟基、磷酸基、硫酸基、亚硫酸基、磺酸基和亚磺酸基中的至少一种;
所述层析膜中含有微米级微通道;所述微米级微通道的孔径大小为5-30微米;
所述层析膜为高分子有机材料制成,所述层析膜的厚度为0.4-0.9毫米;
所述硼酸基团包括选自硼酸化合物中的至少一种;所述硼酸化合物包括选自邻氨基苯硼酸、间氨基苯硼酸、对氨基苯硼酸、3-氨基-4-甲基苯硼酸盐酸盐、3-氨基-5-羧基苯硼酸和4-氨基甲酰苯硼酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于,所述层析膜厚度为0.6-0.9毫米。
3.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于,所述层析膜为高分子有机材料制成,所述高分子有机材料包括选自纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯,聚苯乙烯和聚乙烯醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的试纸条,其特征在于,所述底板和所述挡板各自独立地为高分子聚合材料制成;所述高分子聚合材料包括选自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁酯、聚碳酸树酯、聚苯醚、聚亚苯基硫醚、聚苯硫醚中的至少一种。
5.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1-4中任一项所述的试纸条。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括:第一缓冲试剂和第二缓冲试剂;
其中所述第一缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0;
第一缓冲试剂包括选自Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种;
所述第一缓冲试剂还包含至少一种第一表面活性剂;所述第一表面活性剂的质量浓度为0.1%-10%(w/v);
所述第一缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+;
所述第二缓冲试剂的pH值为5.5-8.0;
所述第二缓冲试剂包括选自Tris-HCl、甘氨酸-盐酸、MES、磷酸氢二钠-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液中的至少一种;
所述第二缓冲试剂还包括至少一种第二表面活性剂;所述表面活性剂的质量浓度为0.3%-10%(w/v);
所述第一表面活性剂和所述第二表面活性剂各自为非离子型表面活性剂,非离子型表面活性剂为选自Tween 20、DD、DDM和Triton X-100中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,其中所述第一缓冲试剂的pH范围为8.5-9.5;所述第二缓冲试剂的pH值为6.5-7.5。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,进一步包括:第三缓冲试剂,所述第三缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0;
所述第三缓冲试剂包括选自Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种;
所述第三缓冲试剂还包含至少一种表面活性剂;所述表面活性剂为非离子型表面活性剂;
所述非离子型表面活性剂为选自Tween 20、DD、DDM和Triton X-100中的至少一种;
所述表面活性剂的质量浓度为0.1%-10%(w/v);
所述第三缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述第三缓冲试剂的pH范围为8.5-9.5。
10.一种测定糖化血红蛋白的方法,其特征在于,包括采用权利要求1-4中任一项所述的试纸条或者权利要求5-9中任一项所述的试剂盒对样本进行检测。
11.一种测定样本中糖化蛋白质的方法,其特征在于,包括:
提供第一固体载体基质和第二固体载体基质,所述第一固体载体基质的末端和所述第二固体载体基质的一端接触,所述第一固体载体基质上修饰有硼酸基团,所述第二固体载体基质上未修饰有硼酸基团;
使所述第一固体载体基质、所述第二固体载体基质和第三缓冲试剂接触,所述第三缓冲试剂具有使得糖化的蛋白质与所述第一固体载体基质结合、非糖化的蛋白质与所述第二固体载体基质结合的pH值;
将样本先后和所述第一固体载体基质、所述第二固体载体基质接触,分别测定经过所述第一固体载体基质以及经过所述第二固体载体基质的蛋白质的含量,以便测定样本糖化蛋白质的含量;
所述第三缓冲试剂的pH范围为8.0-10.0;
所述第三缓冲试剂包括选自Tris-盐酸、甘氨酸-氢氧化钠、醋酸铵-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸、硼酸硼砂缓冲液中的一种;
所述第三缓冲试剂还包含至少一种表面活性剂;所述表面活性剂为非离子型表面活性剂;
所述非离子型表面活性剂为选自Tween 20、DD、DDM和Triton X-100中的至少一种;
所述表面活性剂的质量浓度为0.1%-10%(w/v);
所述第三缓冲试剂还包含10-100mM的Na+和/或Mg2+;
所述第一固体载体基质和第二固体载体基质中含有微米级微通道;所述微米级微通道的孔径大小为5-30微米;
所述第一固体载体基质和第二固体载体基质为高分子有机材料制成,所述第一固体载体基质和第二固体载体基质的厚度为0.4-0.9毫米。
12.根据权利要求11所述的一种测定样本中糖化蛋白质的方法,其特征在于,所述第三缓冲试剂的pH范围8.5-9.5。
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