BRPI0609981A2

BRPI0609981A2 - dispositivo imunocromatográfico semiquantitativo

Info

Publication number: BRPI0609981A2
Application number: BRPI0609981-5A
Authority: BR
Inventors: Paul E Goldenbaum; Stephen J Lovell
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2006-04-17
Publication date: 2010-05-18
Also published as: US20060240569A1; WO2006115866A1; EP1877793A1; JP2008537145A; KR20080003431A

Abstract

DISPOSITIVO IMUNOCROMATOGRáFICO SEMIQUANTITATIVO. A invenção fornece um dispositivo compreendendo um ou mais materiais de suporte capazes de fornecer fluxo lateral. Um ou mais materiais de suporte contém uma área para receber uma amostra biológica contendo um analito alvo, uma área tendo um ligante detector contido de forma móvel capaz de formar um complexo com o analito alvo, uma primeira área de captura tendo uma quantidade pré-determinada de um reagente de captura imóvel, onde o reagente de captura imóvel é capaz de especificamente ligar ao complexo, e uma segunda área de captura tendo o reagente de captura imóvel, e um agente de lise. Tipicamente, a área para receber a amostra biológica, a área tendo o ligante detector contido de forma móvel, a primeira área de captura, e a segunda área de captura são arranjadas em um ou mais materiais de suporte tal que uma amostra é capaz de fluxo lateral sequencial através dessas áreas.

Description

"DISPOSITIVO IMUNOCROMATOGRAFICO SEMIQUANTITATIVO"

Pedidos Relacionados

Esse pedido reivindica prioridade para o Pedido dePatente Provisória Norte-Americana, No. Serial 60/673218,depositado em 20 de Abril de 2005. A descrição do qual é a-qui incorporada como referência.

Campo da Invenção

A presente invenção é direcionada a dispositivos emétodos para a análise semiquantitativa de uma amostra paraum analito alvo.

Fundamentos da Invenção

Na seguinte discussão, certos artigos e métodosserão descritos para propósitos introdutórios e de fundamen-tos. Nada contido aqui é para ser construído como uma "ad-missão" da técnica anterior. O requerente expressamente re-serva o direito de demonstrar, onde apropriado, que os arti-gos e métodos relacionados aqui não constituem a técnica an-terior sob as provisões estatutárias aplicáveis.

Várias reações imunológicas foram encontradas ú-teis como técnicas analíticas. Ensaios imunoquimicos geral-mente caem em um número de diferentes categorias. Dois dostipos mais freqüentemente encontrados são o ensaio competi-tivo, e o ensaio de sanduíche. Em um ensaio competitivo, umaquantidade limitada de material de ligação é contatada comuma solução contendo um analito e uma concentração conhecidade um analito marcado. O analito marcado e não marcado com-petem por sitios de ligação em um material de ligação. Aquantidade de analito marcado vinculado ao material de liga-ção pode estar correlacionada com a concentração do analitopresente na solução teste. A quantificação é tipicamente e-xecutada por referência a uma curva de calibração, compara-ção visual da extensão de mudança de cor causada pela rea-ção, ou avaliação com um instrumento de teste.

0 ensaio de sanduíche envolve contatar um materialde ligação com uma solução contendo o analito, desse modolevando o analito a ligar a um material de ligação. Essecomplexo é então contatado com um material de ligação raarca-do, geralmente um anticorpo, que reage com o analito vincu-lado. A quantidade de material de ligação marcado vinculadoé assim diretamente proporcional à quantidade da analitovinculado. A quantificação é tipicamente executada comparan-do-se a mudança de cor causada pela reação com um padrão oureferência, referência a uma curva de calibração, ou inspe-ção por um instrumento de teste.

Técnicas convencionais, e dispositivos que contamcom tais técnicas, entretanto, têm demonstrado várias defi-ciências. Por exemplo, enquanto dispositivos de faixa de.teste relativamente simples têm sido desenvolvidos, eles.freqüentemente carecem da capacidade de pelo menos imediata-mente quantificar os resultados do ensaio. Quanto a isso,muitos dispositivos simplesmente indicam um resultado posi-tivo ou negativo para a presença do analito acima ou abaixode um valor limite escolhido. Além disso, tais dispositivostipicamente exigem uma etapa de lavagem, ou eles exigem a-mistura de um ou mais dos reagentes e a amostra. A exigênciade executar tais etapas de lavagem ou mistura introduz umacomplexidade indesejável ao ensaio, que não o faz desejávelpara uso por pessoas leigas ou até pessoal medicamente trei-nado de nivel mais baixo.

Aperfeiçoamentos, e novas aplicações para taistestes são desejados.

Sumário da Invenção

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção for-nece um dispositivo compreendendo um ou mais materiais desuporte capazes de fornecer fluxo lateral. Um ou mais mate-riais de suporte contém uma área para receber uma amostrabiológica contendo um analito alvo, uma área tendo um ligan-te detector contido de forma móvel capaz de formar um com-plexo com o analito alvo, uma primeira área de captura tendouma quantidade pré-determinada de um reagente de captura i-móvel, onde o reagente de captura imóvel é capaz de especi-ficamente ligar ao complexo, uma segunda área de capturatendo o reagente de captura imóvel, e um agente de lise. Ti-picamente , a área para receber a amostra biológica, a áreatendo o ligante detector contido de forma móvel, a primeiraárea de captura, e a segunda área de captura são arranjadasem um ou mais materiais de suporte tal que uma amostra é ca-paz de fluxo lateral seqüencial através dessas áreas.

De acordo com um outro aspecto, o analito alvo é oantigeno CD4 presente em linfócitos CD4. Assim, um ou maismateriais contém uma área tendo um ligante detector contidode forma móvel capaz de formar um complexo com o antigenoCD4, uma primeira área de captura tendo uma quantidade pre-determinada de um reagente de captura imóvel capaz de espe-cificamente ligar ao complexo, e uma segunda área de capturacompreendendo o reagente de captura imóvel. Tipicamente, aárea para receber a amostra biológica, a área tendo o ligan-te detector contido de forma móvel, a primeira área de cap-tura, e a segunda área de captura são arranjadas m um oumais materiais de suporte tal que uma amostra é capaz defluxo lateral seqüencial através dessas áreas.

A invenção adicionalmente fornece métodos de usartais dispositivos.

Breve Descrição dos Desenhos

As características, aspectos e vantagens anterio-res e outras da presente invenção se tornarão aparentes apartir da descrição seguinte, reivindicações em anexo e asmodalidades exemplares mostradas nos desenhos, que são bre-vemente descritos abaixo. Deveria ser notado que, a menosque de outra forma especificado, elementos similares têm osmesmos números de referência.

A FIG. 1 é uma vista em perspectiva de um disposi-tivo construído de acordo com os princípios da: presente in-venção.

A FIG. 2 é uma vista em perspectiva de um disposi-tivo construído de acordo com uma modalidade alternativa dapresente invenção.

As FIGs. 3A-3D são vistas em perspectiva de dispo-sitivos construídos de acordo com modalidades adicionais dapresente invenção.

A FIG. 4 é ainda uma outra modalidade1 de um dispo-sitivo construído de acordo com os princípios da presenteinvenção.

Descrição Detalhada da Invenção

Os princípios da presente invenção agora serão a-dicionalmente descritos pela seguinte discussão de certasmodalidades ilustrativas dessa e por referência às seguintesfiguras. A menos que de outra forma indicado aqui, os mesmosnúmeros de referência dos desenhos ou caracteres foram uti-lizados em múltiplas figuras para indicar a ilustração dosmesmos elementos ou elementos similares.

O termo "analito", como usado aqui, se refere a umcomposto ou composição a ser detectado ou medido na amostrateste. O analito terá pelo menos um epitope que um anticorpoou um fragmento reativo imunologico desse pode reconhecer. 0analito pode incluir quaisquer substâncias antigênicas, hap-teno, anticorpos e combinações desses. 0 analito alvo de in-teresse em um ensaio pode ser, por exemplo, uma proteina, umpeptideo, um aminoácido, um ácido nucléico, um hormônio, umesteróide, uma vitamina, um microorganismo patogênico para oqual anticorpos policlonal e/ou monoclonal podem ser produ-zidos, uma substancia quimica natural ou. sintética, um con-taminante, uma droga incluindo aqueles administrados parapropósitos terapêuticos bem como aqueles administrados parapropósitos ilicitos, e metabolitos de anticorpos para qual-quer das substâncias acima. Um exemplo especifico compreen-dido por esse termo é o antigeno CD4 presente nos linfócitosCD4.

0 termo "amostra biológica" como usado aqui se re-fere a qualquer amostra que poderia conter um analito paradetecção. Preferencialmente, a amostra biológica está naforma liquida ou pode ser alterada para uma forma liquida. Aamostra biológica pode compreender todo sangue, urina, sali-va, ou outros fluidos corpóreos e secreções. 0 termo amostrabiológica não é especifico a sua fonte. Assim, a amostra po-de ser obtida a partir de qualquer fonte, tal como humanosou outros mamíferos.

Como usado aqui, o termo "área de recebimento deamostra" significa a parte de um dispositivo de ensaio que éprimeiro contatado com a amostra biológica, isto é, ele re-cebe a amostra a ser testada para o analito em questão.

O termo "fluxo lateral" se refere ao fluxo no qualos componentes da amostra são carregados através do materialna direção lateral. Por exemplo, quando o dispositivo de en-saio está na forma de uma lâmina ou tira, a direção lateralé paralela ao plano definido pela maior superfície(s) dodispositivo.

Como usado aqui, o termo "material" se refere aqualquer substancia capaz de fornecer fluxo lateral. Issoincluiria materiais tais como ésteres de celulose, nitroce-lulose, misturas de nitrocelulose com poliéster ou celulose,papel não tratado, papel poroso, polietileno poroso, poli-propileno poroso, raiom, fibra de vidro, copolimero de acri-lonitrilo ou náilon. Um versado na técnica estará ciente deoutros materiais porosos que permitem fluxo lateral.

O termo "móvel", como referido aqui, significa a-nexado de forma difusiva ou não- difusiva, ou impregnado.Substâncias e reagentes, que são móveis, são capazes de dis-persar com a amostra e ser carregados pelo fluxo lateral.

0 termo "imóvel", como usado aqui se refere asubstâncias ou reagentes, que são conectados a um materialde suporte tal que o fluxo lateral da amostra liquida nãoafeta a localização da partícula imóvel no material. Tal co-nexão pode ser, por exemplo, através de meios covalentes ouiônicos. Aqueles versados na técnica estarão cientes de mei-os de conexão para imobilizar várias substâncias ou reagentes.

O termo "ligante detector" como usado aqui se re-fere a qualquer partícula, proteina ou molécula que reconhe-ce ou liga o analito em questão, e tem conectado conjugadoou vinculado a ele, ou de forma quimica, covalente, não co-valente, iônica ou não iônica, qualquer substância capaz deproduzir um sinal detectável. Tais substâncias capazes deproduzir um sinal detectável incluiriam cromogenes, catali-sadores, compostos fluorescentes, partículas metálicas e nãometálicas coloidais, partículas de corante, enzimas ou subs-tratos, polímeros orgânicos, partículas de látex, lipossomascom substâncias de produção de sinal do tipo descrito na Pa-tente Norte-Americana No. 4.703.017, o conteúdo inteiro daqual é incorporado aqui como referência. A partícula ou mo-lécula reconhecendo o analito pode ser ou natural ou não na-tural. De acordo com modalidades exemplares, o ligante de-tector compreende um ligante conjugado a uma partícula deouro coloidal, ou a um lipossoma contendo um corante visível.

O termo "sinal detectável", como usado aqui se re-fere a qualquer indicador que é visivel a olho nu e/ou uminstrumento ótico de leitura no qual pode ser traduzido emtal indicador visual. "Visivel a olho nu" pretende abrangero uso de lentes corretivas e de dispositivos de ampliação. 0sinal detectável pode ser imediatamente e continuamente vi-sivel, ou pode se tornar visivel somente mediante reação comum outro reagente. Por exemplo, metais coloidais tais comoouro são tipicamente imediatamente e continuamente visíveis.

Alternativamente, a substância capaz de produzir um sinalpode compreender um primeiro reagente tal como uma enzima, eum segundo reagente pode ser fornecido em uma área separada,tal que mediante migração da enzima para a área separada,uma reação quimica ocorre e uma mudança em cor resulta naárea separada.

O termo "área de ligante detector", como usado a-qui, se refere a uma área do dispositivo onde o ligante de-tector móvel está disposto.

0 termo "reagente de controle", como usado aqui,se refere a qualquer partícula ou molécula que é capaz deligar o detector ligante, mas não reconhece ou liga o anali-to alvo. Por exemplo, o ligante detector pode ser um liganteconjugado a uma substância capaz de produzir um sinal. 0 re-agente de controle seria uma partícula ou molécula, que re-conhece ou liga a parte de ligante do ligante detector quan-do o analito não está vinculado a esse. Preferencialmente, oreagente de controle seria um anticorpo monoclonal ou poli-clonal, que reconhece o ligante. O reagente de controle éimóvel. Assim, uma vez que ele liga o reagente de marcaçãonão vinculado, ele imobiliza o reagente de marcação e o im-pede de continuar no fluxo lateral.

0 termo "linha de controle", como usado aqui, serefere a uma área do dispositivo onde o reagente de controleé imobilizado.

O termo "reagente de captura", como usado aqui, serefere a qualquer partícula ou molécula, que reconhece ouliga ao analito de interesse ou ao ligante detector vincula-do ao analito. 0 reagente de captura é imóvel, assim uma vezque o reagente de captura liga o complexo analito-ligantedetector, ele impede o complexo de continuar com o fluxo la-teral. O reagente de captura pode compreender qualquer li-gante adequado, tal como anticorpos, fragmentos, peptideos,aptâmero, etc. De acordo com uma modalidade exemplar, o rea-gente de captura compreende um anticorpo para o antígeno CD4presente em linfócitos CD4.

O termo "área de captura", como usado aqui, se re-fere a uma área do dispositivo onde o reagente de captura éimobilizado no material.

O termo "especificamente ligado", como usado aqui,se refere a um mecanismo de ligação que ocorre via um recep-tor, agente de captura, ou similares, e que seletivamenteacopla somente com um agente especifico ou substância.

Uma primeira modalidade construída de acordo comos princípios da presente invenção será agora descrita comreferência às FIGs. 1 e 2. O dispositivo 10 geralmente com-preende um material de suporte 15, que é capaz de produzirfluxo lateral, que é fluxo na direção da seta LF.Como ilustrado na FIG. 1, o material de suporte 15pode ser na forma de uma tira, e será relacionado como talna descrição que segue. Alternativamente, o material de su-porte 15 pode ser fornecido em uma ampla variedade de formasenquanto a forma particular permita as várias funções des-critas aqui.

Esse suporte 15 pode também ser formado a partirde um número de diferentes materiais adequados, já que osmateriais permitem a funcionalidade de fluxo lateral mencio-nada acima. Por exemplo, o material pode compreender: fibrade vidro, éster celulose, náilon, dextran cruzado, etc. Deacordo com uma modalidade, o material compreende nitrocelu-lose. Como notado no exemplo abaixo, o suporte pode compre-ender um ou mais materiais de suporte distintos, em adição aserem uma única tira.

No dispositivo ilustrativo 10, uma área de recebi-mento de amostra biológica 20 é fornecida na tira 15. En-quanto na modalidade ilustrada somente uma área de recebi-mento de amostra 20 é mostrada localizada na extremidade datira 15, deveria ser entendido que ela é compreendida pelapresente invenção que a pluralidade de áreas de recebimentode amostra pode ser fornecida. Além disso, a área(s) de re-cebimento de amostra pode ter localizações que diferem da-quela da modalidade ilustrada. O dispositivo 10 adicional-mente inclui uma área 25 contendo o ligante detector. O li-gante detector está contido na área 25 de uma maneira talque ela é • móvel. Em outras palavras, o ligante detector écapaz de ser realizado da área 25 pelo fluxo lateral mencio-nado anteriormente. De acordo com um exemplo ilustrativo nãolimitante, 3-7 )aL, preferencialmente 5 uL de ligante detec-tor é aplicado por cm de largura na área 25 e seco. 0 ligan-te detector preferencialmente compreende 10-200 \xq, prefe-rencialmente 50 ug, de anticorpo conjugado de 10-100 nm por1 mL em suspensão, preferencialmente 40 nm de partículas deouro coloidais. Na modalidade ilustrada, a área 25, contendoo ligante detector, e a área de recebimento de amostra bio-lógica 20 são ilustradas como áreas separadas e distintas natira 15. Entretanto, está no escopo da presente invenção queessas duas áreas poderiam ser combinadas tal como para defi-nir uma única área distinta da tira 15.

Uma linha de controle opcional 30 pode também serfornecida na tira 15. Quando presente, a linha de controle30 define uma área que contém um reagente de controle. O re-agente de controle contido na linha de controle 30 é imóvel.De acordo com um exemplo ilustrativo não limitante, 0,1-10ug, preferencialmente 1 ^g do reagente de controle é dispos-to por cm de largura na linha de controle 30.

Uma primeira área de captura 35 é fornecida na mo-dalidade ilustrada, e está em comunicação de fluxo lateralcom as áreas previamente descritas da tira 15. A primeiraárea de captura 35 contém um reagente de captura nesta. Oreagente de captura está contido de forma imóvel na primeiraárea de captura 35. Em uma modalidade útil para determina-ções- de CD4, 2 ng por cm de largura do agente de captura édisposto na primeira área de captura 35 (assumir 60.000 mo-léculas de CD4 por célula, 100 uL de amostra de sangue, áreade captura saturada em 100 células de CD4 por jiL, 5 mm delargura de tira, massa molar de anticorpo de 150.000 g/mol).

De acordo com uma outra característica opcional dapresente invenção, um agente de lise pode ser adicionado aomaterial de tira 15 em várias localizações. Por exemplo, oagente de lise pode estar contido na área de recebimento deamostra 20 ou qualquer área da tira 15 localizada entre aárea de recebimento de amostra 20 e a primeira área de cap-tura 35. Agentes de lise adequados incluem, por exemplo,zwittergent 3-10 e 3-14, saponina, Triton X100, Tween 20,SDS (dodecil sulfato de sódio) e CTAB.

De acordo com a modalidade ilustrada, a segunda, aterceira, e a quarta área de captura 40, 45 e 50, respecti-vamente, são adicionalmente fornecidas na tira 15. Entretan-to, deveria ser entendido que está no escopo da presente in-venção que a tira 15 contém pelo menos uma área de captura.De acordo com uma modalidade adicional, a tira 15 pode in-cluir pelo menos duas áreas de captura. De acordo com umamodalidade adicional, a tira 15 pode incluir pelo menos qua-tro áreas de captura.

De acordo com a modalidade ilustrada, as áreas decaptura são distintas e separadas umas das outras na direçãodo fluxo lateral LF. Entretanto, é compreendido pela presen-te invenção que uma ou mais áreas de captura podem ser com-binadas e/ou de outra forma mescladas. Adicionalmente, a lo-calização, a forma, o tamanho e a configuração das áreas decaptura podem também desviar daquelas da modalidade ilustra-da.A modalidade representada na FIG. 2 essencialmentecorresponde à modalidade da FIG. 1, mas adicionalmente in-cluir um alojamento opcional 55. 0 alojamento 55 pode serformado de qualquer material adequado. Por exemplo, o aloja-mento pode ser formado de um material plástico, tal como M-ylar. 0 alojamento 55 pelo menos parcialmente envolve oucircunda a tira 15. Como ilustrado na FIG. 2, o alojamentopode ser fornecido com uma janela de área de recebimento deamostra 60, uma janela de linha de controle 62, e uma janelade área de captura 65. De acordo com a modalidade ilustrada,a área contendo o ligante detector é obscurecida a partir davisualização do usuário através do alojamento 55. É claro,compreendido que a área contendo o ligante detector pode servisivel através do alojamento ao usuário também. Além disso,o alojamento 55 pode ser formado a partir de um materialplástico claro ou translúcido.

O alojamento 55 pode opcionalmente ser fornecidocom indicios 70 que identificam várias degradações da con-centração do analito alvo determinado como estando presentena amostra biológica pelo dispositivo 10. Como evidente apartir dos indicios 70 ilustrados na FIG. 2, é possivel ve-rificar, em uma faixa particular de valores, a concentraçãode um analito presente em uma amostra biológica, como des-crito em detalhes adicionais aqui.

As modalidades ilustradas nas FIGs. 3A-3D contêmmuitas das características descritas em conjunto com as mo-dalidades ilustradas nas FIGs. 1 e 2. Geralmente falando, asmodalidades ilustradas na FIG. 3 diferem das modalidadespreviamente descritas em que cada tira contém uma única áreade captura para indicar o nivel de concentração limite doanalito alvo. Uma indicação positiva é dada na área de cap-tura somente quando uma concentração pré-determinada especi-ficada do analito está presente na amostra biológica.

Assim, a descrição anterior, bem como a descriçãoque segue, se aplica igualmente às tiras ilustradas nasFIGs. 3A-3D.

De acordo com a modalidade ilustrada da FIG. 3A,um dispositivo 100A é fornecido pelo material de suporte115A geralmente formado como uma tira. A tira 115A incluiuma área de recebimento de amostra 120A, uma área contendoligante detector 125A, e uma linha de controle opcional130A. O ligante detector contido na área 125A é móvel, e as-sim capaz de ser transportado para fora da área 125A pelofluxo lateral. A linha de controle 130A define uma área con-tendo pelo menos um reagente de controle. O reagente de con-trole está contido de forma imóvel na linha de controle130A. Uma primeira área de captura 134A é ilustrada comosendo separada, ainda em comunicação de fluxo lateral com asáreas mencionadas anteriormente da tira 115A. É claro, comoexplicado em conjunto com as modalidades anteriores, que onúmero de localização e arranjo das várias áreas da tira115A podem variar daqueles da modalidade ilustrada. Assim,referência é feita à descrição anterior feita em conjuntocom as FIGs. 1 e 2. A área de captura 140A contém um reagen-te de captura imóvel fornecido em uma quantidade especifica-da pré-determinada.Como ilustrado nas FIGs. 3B-3D, a tira 115B-D podeser fornecida com ambas uma primeira e uma segunda área decaptura 134B-D e 140B-D, respectivamente. A quantidade dereagente de captura fornecida na área de captura 134B-D éusada para capturar uma quantidade especifica pre-determinada de analito alvo contido na amostra biológica. Aprimeira área de captura 134B-D não é utilizada para forne-cer qualquer indicação, por si mesma, considerando a quanti-dade de analito alvo contido na amostra. De acordo com a mo-dalidade ilustrada, uma segunda área de captura 140B-D éfornecida para esse propósito. A segunda área de captura140B-D também contém uma quantidade pré-determinada especi-fica de reagente de captura nesta. O reagente de captura es-tá também contido de forma imóvel na segunda área de captura140B-D. Entretanto, está no escopo da presente invenção queo número, localização, e arranjo das áreas de captura podemvariar.

A FIG. 4 é ilustrativa de uma modalidade adicionalda presente invenção onde o dispositivo 100 tem as mesmascaracterísticas acima em conjunto com as modalidades dasFIGs. 3A-3D, mas adicionalmente contém um membro de aloja-mento opcional 155. O alojamento 155 pode ser construído dequalquer material adequado. Por exemplo, o alojamento 155pode ser construído de um material plástico, tal como Mylar.

O alojamento opcional 155 pode ser fornecido com uma janelade área de recebimento de amostra 160, uma janela de linhade controle 162, uma janela de área de captura 165 e um in-dicio 170. De acordo com a modalidade ilustrada, a primeiraárea de captura é obscurecida de visualização pelo alojamen-to 155. Onde a primeira área de captura 134 não fornece in-dicação considerando a quantidade de analito contida na a-mostra biológica, não é necessário que essa área esteja vi-sivel ao usuário. Entretanto, é compreendido que o alojamen-to 155 poderia ser modificado tal que pelo menos essa áreaadicional da tira 115 pode ser feita visivel ao usuário. Al-ternativamente, o alojamento 155 pode ser construído de ummaterial plástico claro ou translúcido.

Os dispositivos acima descritos podem ser constru-ídos utilizando técnicas familiares àqueles versados na téc-nica. Os reagentes acima descritos são opcionalmente prepa-rados em uma forma liquida para depósito em e/ou mediante omaterial de suporte. Uma vez localizado em contato com o ma-terial de suporte, o reagente liquido seca e adere ao mate-rial de suporte. Preenchedores convencionais, ligantes, sur-factantes e similares podem ser incorporados no reagente li-quido se assim desejado. Em adição, materiais ligantes podemtambém ser incorporados nas composições de reagente liquidopara facilitar aderência ao material de suporte.

É desejável controlar de forma precisa o volume dereagentes introduzidos no material de suporte em qualquerárea particular. Assim, o uso de pipetas, micro-pipetas esimilares para controlar o volume de reagente introduzido, écompreendido pela presente invenção. Em adição, pode ser de-sejável isolar ou de outra forma confinar a área na qual umreagente particular é introduzido. Essa área pode ser con-trolada de acordo com as técnicas conhecidas àqueles versa-dos na técnica. Por exemplo, está no escopo da presente in-venção que uma ou mais das áreas previamente descritas datira da presente invenção podem ser separadas por áreas quenão são absorventes e/ou hidrofóbicas. Essa separação podeser executada tratando-se o material de suporte nessas áreasde intervenção, ou alternativamente, introduzindo seções ousegmentos de um material diferente que transmitem essas pro-priedades desejadas.

Como evidente a partir da descrição acima da moda-lidade representada nas FIGs. 1-4, é desejável introduzircertos reagentes no material de suporte de uma maneira queos faz imóveis. A imobilização pode ser executada por qual-quer técnica conveniente tal como deposição evaporativa, ad-sorção, ligação covalente ou imobilização imunológica. Taistécnicas são descritas em mais detalhes, por exemplo, na Pa-tente Norte-Americana Nos. 4.517.288 e 4.186.146, o conteúdointeiro da qual é incorporado aqui como referência em suaintegridade. É também desejável ser capaz de introduzir cer-tos reagentes no material de suporte de uma maneira que elespermanecem móveis neste. Tal aplicação pode ser executadaatravés de simplesmente pipetar pequenos volumes de soluçõesde reagente liquido às áreas desejadas. Tais técnicas sãofamiliares àqueles versados na técnica.

De acordo com um aspecto adicional da presente in-venção, um método ou técnica para ensaiar um analito alvoserá agora descrito. Para propósitos de ilustração, referên-cia será feita às modalidades ilustrativas das FIGs. 1-4.Entretanto, deveria ser entendido que os métodos e técnicasda presente invenção não são necessariamente limitados pelasconstruções físicas e arranjos das modalidades ilustradasnas FIGs. 1-4.

Uma modalidade ilustrativa de um ensaio conduzidode acordo com os princípios da presente invenção será des-crita em detalhes adicionais como segue, e será descrita pa-ra propósitos de ilustração como um ensaio do tipo sanduí-che. Entretanto, é compreendido pela presente invenção queum versado na técnica, armado com ensinamentos contidos a-qui, poderia executar os mesmos objetivos através da perfor-mance dos ensaios do tipo competição e/ou do tipo inibição.Assim, o método da presente invenção não deveria necessaria-mente ser construído como limitado a um ensaio do tipo san-duíche .

Um ensaio executado de acordo com a presente in-venção inicia com a coleta de uma amostra biológica apropri-ada (para conveniência somente, referências às FIGs. 1 e 3Bsão fornecidas). Um volume de amostra apropriado pode variaramplamente. Por exemplo, uma amostra na ordem de 1-100 ulpode ser utilizada. De acordo com uma modalidade da presenteinvenção, a amostra biológica compreende todo o sangue. Aamostra biológica é adicionada a uma área de recebimento deamostra (20, 120B) de uma tira de teste (15, 115B) . O mate-rial da tira de teste promove fluxo lateral (LF) da amostrabiológica no material. A amostra biológica flui em uma áreacontendo um ligante detector (25, 125B). O ligante detectoré projetado para especificamente ligar ao analito alvo par-ticular sob investigação. Assim, à medida que o analito alvocorre pelo fluxo lateral através da área contendo ligantedetector, o analito alvo se torna especificamente vinculadoa ele e corre, como um complexo, fora da área mencionada an-teriormente .

Opcionalmente, a amostra biológica contendo o com-plexo mencionado anteriormente é carregada pelo fluxo late-ral em uma área de linha de controle contendo um reagente decontrole (30, 130B) . Nessa região, a área da linha de con-trole serve como um controle de procedimento interno, e adetecção de sinal nessa área verifica que o fluxo capilarocorreu e que a integridade funcional do dispositivo foimantida.

A amostra biológica e o complexo contido nesta,então flui lateralmente para uma primeira área de captura(35, 134B). A primeira área de captura contém um reagente decaptura imóvel configurado para especificamente ligar aocomplexo contendo o analito alvo. Assim, à medida que o com-plexo corre através da primeira área de captura, ele se tor-na ligado de forma imóvel ao reagente de captura. Uma :vezque a amostra biológica contém uma quantidade de analito .al-vo tal que a capacidade do reagente de captura contido naprimeira área de captura é excedida, qualquer tal analitoalvo, e complexo formado desse modo, continua a correr sob ainfluência do fluxo lateral desse modo alcançando uma oumais áreas de captura adicionais opcionalmente fornecidas.

Como evidente a partir do acima determinado/ ocontrole da quantidade de reagente de captura contido- naprimeira área de captura pode ser utilizado para definir umabarreira além da qual uma quantidade ou concentração de ana-lito alvo contido em uma amostra biológica pode não passar.Uma vez que esse valor limite minimo é excedido, o analitoalvo em excesso está livre para correr sob o fluxo lateralpara uma ou mais áreas de captura que novamente estabelecemniveis limite minimos crescentes do analito alvo sob análi-se. Quanto a isto, a quantidade de reagente de captura for-necido em cada área de captura pode ser a mesma quantidade,uma em relação a outra. Alternativamente, a quantidade dereagente de captura contido em cada área de captura podeprogressivamente aumentar ou diminuir. De acordo com um e-xemplo ilustrativo não limitante, 2 ng de reagente de captu-ra pode ser fornecido, em uma primeira área de captura, 2 ngde reagente de captura pode ser fornecido em uma segunda á-rea de captura, 4 ng de reagente de captura pode ser forne-cido em uma terceira área de captura, e 8 ng de reagente decaptura pode ser fornecido em uma quarta área de captura.

A presença de uma quantidade suficiente de analitoalvo, e o complexo formado a partir do analito alvo e ligan-te detector, em uma ou mais áreas acima descritas é indicadapela geração de um sinal detectável. Esse sinal detectávelpode ser gerado em um número de diferentes formas familiaresàqueles versados na técnica. De acordo com um exemplo, o li-gante detector pode compreender uma substância que é imedia-tamente e continuamente visivel a olho nu. Assim, a merapresença fisica do complexo formado entre o analito alvo e oligante detector em uma ou mais áreas de captura é suficien-te para produzir o sinal detectável desejado. Alternativa-mente, o ligante detector pode compreender um primeiro rea-gente que se torna associado com o complexo formado com oanalito alvo, mas que não é visível. Um segundo reagente po-de então ser fornecido em uma ou mais áreas de captura que,mediante combinação e interação com o primeiro reagente pro-duz um sinal detectável. 0 sinal detectável pode ser visivela olho nu, ou pode ser lido ou analisado com o auxilio de umdispositivo separado tal como um espectrômetro, fluorimetro,microscópio ou similares. Como um aspecto opcional adicionalde um ensaio executado de acordo com os princípios da pre-sente invenção, um agente de lise pode ser introduzido nomaterial da tira, que interage com a amostra biológica, des-se modo liberando substâncias de analito alvo. Como pronta-mente aparente, os dispositivos e métodos da presente inven-ção são úteis em um número de diferentes aplicações, e paraum número de diferentes propósitos. Em geral, os dispositi-vos e métodos da presente invenção serão úteis para uma aná-lise semiquantitativa da quantidade de analito alvo contidoem uma amostra biológica quando é desejável ser verificadoem uma amostra de maneira precisa, rápida e .de custo eficaz.

Aplicações não limitantes adequadas podem incluir monitora-mento de glicose no sangue, bem como o diagnóstico e trata-mento de doenças virais tais como HIV/AIDS. Vem sido obser-vado que um declínio em contagens de célula CD4 é um efeitodo HIV, e que a depleção de célula CD4 é indicativa de defi-ciência imunológica. Quanto a isso, à medida que a contagemde células CD4 diminui, o risco e gravidade de doenças opor-tunistas aumentaram. Assim, contagens de célula CD4 são usa-das para guiar gerenciamento clinico e terapêutico de pesso-as infectadas por HIV. 0 CDC sugere que terapia anti-retroviral deveria ser considerada por todas as pessoas comuma contagem de CD4 de menos do que 500 células/|^l, e quetratamento profilático contra Pneumocystis Carrinii Pneumo-nia (PCP) é recomendado para todos os pacientes com uma con-tagem de células CD4 de menos do que 200 células/|il.

As três categorias de CDC para contagens de célu-las de linfócito CD4 são como segue:

Categoria 1: Maior ou igual a 500 células/|al;Categoria 2: 200 - 499 célula/ul; eCategoria 3: Menos do que 200 células/ul.

Como prontamente aparente a partir do acima deter-minado, o dispositivo e técnicas da presente invenção podemser utilizados para determinado em qual categoria de CDC umacontagem de célula CD4 do paciente cai. Por exemplo, de a-cordo com a presente invenção, uma primeira área de capturapode ser fornecida com um volume especifico de agente decaptura tal que um sinal detectavel será produzido na pri-meira área de captura somente se a contagem de célula CD4presente na amostra biológica é aproximadamente 100 célu-las/(il ou mais. Uma segunda área de captura pode ser forne-cida tal que um sinal detectavel será produzido nesta somen-te mediante a presença de uma concentração de célula CD4 deaproximadamente 200 células/jil ou mais. Uma terceira área decaptura pode ser fornecida com uma quantidade apropriada dereagente de captura contido nesta tal-que um sinal detecta-vel será produzido na terceira área de captura somente medi-ante a presença de aproximadamente 400 células/|il CD4 na a-mostra biológica. Uma quarta área de captura pode ser forne-cida com uma quantidade apropriada de reagente de capturatal que um sinal detectável será produzido somente mediante a presença de aproximadamente 800 CD4 células/f^l. Está noescopo da presente invenção que as concentrações especifica-das e/ou números de áreas de captura fornecidos podem seralterados como desejado para alcançar um objetivo de diag-nóstico particular. As contagens de célula CD4 são amplamen- te reconhecidas como uma ferramenta de diagnostico importan-te no processo de determinar quando um paciente deveria ini-ciar terapias antivirais, bem como uma ferramenta importanteno monitoramento da eficiência e eficácia de tais terapiasantivirais. Assim, a determinação freqüente de contagens decélula CD4 deveria ser feita. Os dispositivos e métodos dapresente invenção fornecem um meio simples, preciso, rápidoe de custo eficaz de freqüentemente determinar contagens decélulas CD4 de uma maneira semiquantitativa.

Exemplos não limitantes específicos compreendidospelos princípios da presente invenção serão agora descritospara adicionalmente ilustrar os conceitos da presente inven-ção .

Exemplo 1. Nesse exemplo, sangue humano pode sertestado para uma quantidade semiquantitativa de linfócitosCD4. Uma gota de sangue a partir do teste é obtida por pica-da no dedo com lanceta e aplicada à área para recebimento deuma amostra biológica no dispositivo de fluxo lateral. Issoé seguido adicionando duas gotas de um tampão, tal como tam-pão fosfato salino, à área de recebimento de modo a promoverfluxo lateral- 0 dispositivo consiste de uma almofada, porexemplo, raiom ou fibra de vidro para receber a amostra desangue. Um agente de lise é impregnado na compressa paracausar a lise das células de sangue. Também nessa mesma al-mofada está o anticorpo detector (anticorpo monoclonal espe-cifico ao antigeno CD4) que é conjugado a ouro coloidal. Em-baixo dessa almofada está uma tira de nitrocelulose, tipica-mente de 5 mm de largura e 30 mm de comprimento. A almofadaestá localizada em uma extremidade extrema dessa tira. Naoutra extremidade extrema da tira, uma almofada absorventeestá em contato com a tira para facilitar e manter o fluxocapilar de liquido. Fluido na amostra de sangue moverá a ti-ra para cima ("contra corrente") como um resultado da açãocapilar. Depositadas de forma imóvel na tira de nitrocelulo-se nesse exemplo, estão quatro zonas de antigeno de capturaque são capazes de formar um complexo em sanduíche com ocomplexo detector CD4. A zona de captura mais próxima à áreade deposição da amostra contém suficiente anticorpo de cap-tura para se tornar saturada com antigeno CD4 com o equiva-lente de 100 linfócitos CD4 por (J.L de amostra. A segunda,terceira e quarta zonas de captura conteriam similarmenteanticorpo de captura para se tornar saturadas com os equiva-lentes de 200, 400 e 800 linfócitos CD4 por uL de amostra,respectivamente. A tira é permitida a desenvolver por 15 mi-nutos, tempo no qual o número de faixas visíveis na tira écontado. A leitura da tira de teste pode ser melhorada apli-cando-se uma solução de lavagem depois que a amostra de san-gue indica o número de células CD4 na amostra de sangue. Sesomente a primeira faixa é observada, o nivel de células CD4é 50 - 100 células/|aL. Se somente a primeira e a segundafaixa são observadas, o nivel é aproximadamente 200 célu-las/ uL. Se as primeiras três faixas são observadas, o nivelé aproximadamente 400 células/(aL e se todas as quatro faixassão observadas, o nivel é maior do que 800 células/|iL.

Enquanto essa invenção é satisfeita por modalida-des de muitas formas diferentes, como descrito em detalhesem conjunto com modalidades preferenciais da invenção, é en-tendido que a presente descrição é considerada como exemplardos princípios da invenção e não pretende limitar a invençãoàs modalidades especificas ilustradas e descritas aqui. Nu-merosas variações podem ser feitas por pessoas versadas natécnica sem abrir mão do espirito da invenção.

Claims

1. Dispositivo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende:um ou mais materiais de suporte capazes de forne-cer fluxo lateral, um ou mais materiais de suporte compreen-dendo :uma área para receber uma amostra biológica con-tendo um analito alvo;uma área compreendendo um ligante detector contidode forma móvel, onde o ligante detector é capaz de formar umcomplexo com o analito alvo, e onde a área compreendendo oligante detector contido de forma móvel e a área para rece-ber a amostra biológica podem ser áreas separadas, a mesmaárea, ou parcialmente a mesma área;uma primeira área de captura compreendendo umaquantidade pré-determinada de um reagente de captura imóvel,o reagente de captura imóvel capaz de especificamente se li-gar ao complexo;uma segunda área de captura compreendendo o rea-gente de captura imóvel; eum agente de lise.

2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a área para recebimento daamostra biológica, a área compreendendo o ligante detector-contido de forma móvel, a primeira área de captura, e a se-gunda área de captura são arranjadas em um ou mais materiaisde suporte tal que uma amostra é capaz de fluxo lateral se-qüencialmente através da área para receber a amostra bioló-gica, da área compreendendo o ligante detector contido deforma móvel, da primeira área de captura, e da segunda áreade captura.

3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte compreendem um éster celulose, DEAE, vidro, náilon,silica particulada, polistireno, polietileno, poliamida, po-liacrilamida, polivinil, polipropileno, celulose agarose, oudextran.

4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte compreendem uma única tira compreendendo a área parareceber a amostra biológica, a área compreendendo o ligantedetector contido de forma móvel, a primeira área de captura,a segunda área de captura, e o agente de lise.

5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito alvo é antigeno CD4presente em linfócitos CD4.

6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de captura imóvelcompreende um anticorpo capaz de especificamente se ligar aoantigeno CD4 presente em linfócitos CD4 .

7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante detector compreendeouro coloidal conjugado a um anticorpo.

8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade pré-determinadapresente na primeira área de captura é suficiente para ligaro complexo em um nivel especificado.

9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de capturacompreende uma quantidade pré-determinada do reagente decaptura imóvel suficiente para ligar o complexo em um segun-do nivel especificado.

10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos uma segunda quan-tidade do analito alvo presente na amostra.

11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte adicionalmente compreende uma terceira área de capturacompreendendo uma quantidade pré-determinada de reagente decaptura imóvel.

12. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais adicio-nalmente compreende uma quarta área de captura compreendendouma quantidade pré-determinada do reagente de captura imóvel.

13. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 12,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos uma terceira quan-tidade de analito alvo presente na amostra, e a quarta áreade captura é capaz de indicar a presença de pelo menos umaquarta quantidade de analito alvo presente na amostra, ondea terceira quantidade é maior do que a segunda quantidade, ea quarta quantidade é maior do que a terceira quantidade.

14. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende:uma linha de controle contendo um reagente de con-trole imóvel.

15. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 13,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito alvo é antigeno CD4presente em linfócitos CD4, o ligante detector contido deforma móvel é capaz de formar o complexo com o antigeno CD4,o reagente de captura imóvel especificamente liga o comple-xo, e a primeira área é capaz de indicar a presença de pelomenos aproximadamente 100 células/ul de CD4 na amostra.

16. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 15,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-200 células/ul de CD4 na amostra.

17. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 16,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-400 células/|jl de CD4 na amostra.

18. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que a quarta área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-800 células/ul de CD4 na amostra.

19. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende umalojamento pelo menos parcialmente cobrindo um ou mais mate-riais de suporte.

20. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de lise está locali-zado na área de recebimento de amostra.

21. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de lise está locali-zado lateralmente entre a área de recebimento de amostra e aprimeira área de captura, tal que uma amostra fluindo late-ralmente a partir da área de recebimento de amostra será ex-posta ao agente de lise antes da amostra alcançar a primeiraárea de captura.

22. Dispositivo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende:um ou mais materiais de suporte capazes de forne-cer fluxo lateral, um ou mais materiais de suporte compreen-dendo :uma área para receber uma amostra biológica con-tendo antigeno CD4 presente em linfócitos CD4;uma área compreendendo um ligante detector contidode forma móvel, onde o ligante detector é capaz de formar umcomplexo com o antigeno CD4, e onde a área compreendendo oligante detector contido de forma móvel e a área para rece-ber a amostra biológica podem ser áreas separadas, a mesmaárea, ou parcialmente a mesma área;uma primeira área de captura compreendendo umaquantidade pré-determinada de um reagente de captura imóvel,o reagente de captura imóvel capaz de especificamente se ligar ao complexo;uma segunda área de captura compreendendo o rea-gente de captura imóvel.

23. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a área para recebimento daamostra biológica, a área compreendendo o ligante detectorcontido de forma móvel, a primeira área de captura, e a se-gunda área de captura são arranjadas em um ou mais materiaisde suporte tal que uma amostra é capaz de fluxo lateral se-qüencialmente através da área para receber a amostra bioló-gica, da área compreendendo o ligante detector contido deforma móvel, da primeira área de captura, e da segunda áreade captura.

24. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte compreendem um éster celulose, DEAE, vidro, náilon,silica particulada, polistireno, polietileno, poliamida, po-liacrilamida, polivinil, polipropileno, celulose agarose, oudextran.

25. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte compreendem uma única tira compreendendo a área parareceber a amostra biológica, a área compreendendo o ligantedetector contido de forma móvel, a primeira área de captura,e a segunda área de captura.

26. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o reagente de captura imóvelcompreende um anticorpo capaz de especificamente se ligar aoantigeno CD4 presente em linfócitos CD4 .

27. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante detector compreendeouro coloidal conj ugado a um anticorpo que reconhece antige-no CD4 e é capaz de formar um complexo em sanduíche com oreagente de captura imóvel e o antigeno CD4.

28. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de capturacompreende uma quantidade pré-determinada do reagente decaptura imóvel, e é capaz de indicar a presença de pelo me-nos uma segunda quantidade de antigeno CD4 presente na amostra .

29. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte adicionalmente compreendem uma terceira área de captu-ra compreendendo uma quantidade pré-determinada do reagentede captura imóvel.

30. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 2 9,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte adicionalmente compreendem uma quarta área de capturacompreendendo uma quantidade pré-determinada do reagente decaptura imóvel.

31. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos uma terceira quan-tidade de antigeno CD4 presente na amostra, e a quarta áreade captura é capaz de indicar a presença de pelo menos umaquarta quantidade de antigeno CD4 presente na amostra, ondea terceira quantidade é maior do que a segunda quantidade, ea quarta quantidade é maior do que a terceira quantidade.

32. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende:uma linha de controle contendo um reagente de controle imóvel.

33. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 100 células/(il de CD4 na amostra.

34. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 200 células/|il de CD4 na amostra.

35. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 31,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 400 células/jil de CD4 na amostra.

36. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de que a quarta área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 800 células/|il de CD4 na amostra.

37. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende umalojamento pelo menos parcialmente cobrindo um ou mais materiais de suporte.

38. Método para determinar a quantidade de um ana-lito alvo em uma amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende as etapas de:fornecer um dispositivo compreendendo:um ou mais materiais de suporte capazes de forne-cer fluxo lateral, um ou mais materiais de suporte compreen-dendo:uma área para receber a amostra biológica;uma área compreendendo um ligante detector contidode forma móvel, onde o ligante detector é capaz de formar umcomplexo com o analito alvo, e onde a área compreendendo oligante detector contido de forma móvel e a área para rece-ber a amostra biológica podem ser áreas separadas, a mesmaárea, ou parcialmente a mesma área;uma primeira área de captura compreendendo umaquantidade pré-determinada de um reagente de captura imóvel,o reagente de captura imóvel capaz de especificamente se li-gar ao complexo;uma segunda área de captura compreendendo o rea-gente de captura imóvel; eum agente de lise;dispor a amostra na área para receber a amostrabiológica; eusar indicadores visuais fornecidos pelo ligantedetector para determinar informação considerando a quantida-de do analito alvo na amostra.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a área para receber a amostrabiológica, a área compreendendo o ligante detector contidode forma móvel, a primeira área de captura e a segunda áreade captura são arranjadas em um ou mais materiais de suportetal que a amostra biológica flui seqüencialmente e lateral-mente através da área para receber a amostra biológica, daárea compreendendo o ligante detector contido de forma mó-vel, da primeira área de captura e da segunda área de captura .

40. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito alvo é antigeno CD4presente em linfócitos CD4, e o reagente de captura compre-ende um anticorpo capaz de especificamente se ligar ao anti-geno CD4 presente em linfócitos CD4 .

41. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade pré-determinadapresente na primeira área de captura é suficiente para ligarao complexo em um nivel especificado.

42. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de capturacompreende uma quantidade pré-determinada do reagente decaptura imóvel suficiente para ligar o complexo em um segun-do nivel especificado, e onde o ligante detector na segundaárea de captura indica a presença de pelo menos uma segundaquantidade do analito alvo na amostra.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte adicionalmente compreendem uma terceira área de captu-ra compreendendo uma quantidade pré-determinada do reagentede captura imóvel, onde um ou mais materiais de suporte adi-cionalmente compreendem uma quarta área de captura compreen-dendo uma quantidade pré-determinada do reagente de capturaimóvel, e onde a terceira área de captura é capaz de indicara presença de pelo menos uma terceira quantidade de analitoalvo presente na amostra, e a quarta área de captura é capazde indicar a presença de pelo menos uma quarta quantidade deanalito alvo presente na amostra, onde a terceira quantidadeé maior do que a segunda quantidade, e a quarta quantidade émaior do que a terceira quantidade.

44. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito alvo é antigeno CD4presente em linfócitos CD4, o ligante detector contido deforma móvel é capaz de formar o complexo com o antigeno CD4,o reagente de captura imóvel especificamente liga o comple-xo, e a primeira área de captura é capaz de indicar a pre-sença de pelo menos aproximadamente 100 células/p.1 de CD4 naamostra.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-200 células/ul de CD4 na amostra.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-400 células/ul de CD4 na amostra.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que a quarta área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente-800 células/ul de CD4 na amostra.

48. Método para determinar a quantidade de- linfó-citos CD4 em uma amostra biológica, CARACTERIZADO pelo fatode que compreende as etapas de:fornecer um dispositivo compreendendo:um ou mais materiais de suporte capazes de forne-cer fluxo lateral, um ou mais materiais de suporte compreen-dendo :uma área para receber a amostra biológica;uma área compreendendo um ligante detector contidode forma móvel, onde o ligante detector é capaz de formar umcomplexo com um antigeno CD4 nos linfócitos CD4, e onde aárea compreendendo o ligante detector contido de forma móvele a área para receber a amostra biológica podem ser áreasseparadas, a mesma área, ou parcialmente a mesma área;uma primeira área de captura compreendendo umaquantidade pré-determinada de um reagente de captura imóvel,o reagente de captura imóvel capaz de especificamente se li-gar ao complexo; euma segunda área de captura compreendendo o rea-gente de captura imóvel;dispor a amostra na área para receber a amostrabiológica; eusar indicadores visuais fornecidos .pelo ligantedetector para determinar informação considerando a quantida-de dos linfócitos CD4 na amostra.

49. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a área para receber a amostrabiológica, a área compreendendo o ligante detector contidode forma móvel, a primeira área de captura e a- segunda áreade captura são arranjadas em um ou mais materiais de suportetal que a amostra biológica flui seqüencialmente e lateral-mente através da área para receber a amostra biológica, daárea compreendendo o ligante detector contido de forma mó-vel , da primeira área de captura e da segunda área de captu-ra .

50. Método, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito alvo é antigeno CD4presente em linfócitos CD4, e o reagente de captura compre-ende um anticorpo capaz de especificamente se ligar ao anti-geno CD4 presente em linfócitos CD4 .

51. Método, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a quantidade pré-determinadapresente na primeira área de captura é suficiente para ligarao complexo em um nivel especificado.

52. Método, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de capturacompreende uma quantidade pré-determinada do reagente decaptura imóvel suficiente para ligar o complexo em um segun-do nivel especificado, e onde o ligantedetector na segundaárea de captura indica a presença de pelo menos uma segundaquantidade dos linfócitos CD4 na amostra..

53. Método, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais materiais de su-porte adicionalmente compreendem uma terceira área de captu-ra compreendendo uma quantidade pré-determinada do reagentede captura imóvel, onde um ou mais materiais de suporte adi-cionalmente compreendem uma quarta área de captura compreen-dendo uma quantidade pré-determinada do reagente de capturaimóvel, e onde a terceira área de captura é capaz de indicara presença de pelo menos uma terceira quantidade de linfóci-tos CD4 presentes na amostra, e a quarta área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos uma quarta quanti-dade de linfócitos CD4 presentes na amostra, onde a terceiraquantidade é maior do que a segunda quantidade, e a quartaquantidade é maior do que a terceira quantidade.

54. Método, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira área é capaz deindicar a presença de pelo menos aproximadamente 100 célu-las/ul de CD4 na amostra.

55. Método, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 200 células/ul de CD4 na amostra.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55,CARACTERIZADO pelo fato de que a terceira área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 400 células/^! de CD4 na amostra.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56,CARACTERIZADO pelo fato de que a quarta área de captura écapaz de indicar a presença de pelo menos aproximadamente 800 células/|_il de CD4 na amostra.