CN101558309B - 一种诊断方法和用于此的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于检测或监测样品中细胞的数目的试剂盒和方法。所述细胞包含含有细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)。所述试剂盒包括:(i)层析装置;(ii)CSAP结合试剂。所述方法包括:(i)任选地,将样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触;(ii)将样品与CSAP结合试剂接触,所述的CSAP结合试剂与CSAP的细胞质结构域结合;和(iii)直接或间接地评估样品中结合的CSAP的水平或存在。
Description
技术领域
本发明主要涉及诊断领域并且提供用于精确评估来自受试者的样品中特定细胞类型,其细胞结合蛋白或其可溶(细胞外)形式的存在或数量的方法和试剂。在一些实施方案中,本发明涉及快速的,自足的诊断,所述诊断可以在大部分环境中使用,例如诊所,实验室,在野外,在家和在资源贫乏的地区。在一个实施方案中,提供用于评估来自受试者的样品中的CD4T细胞数目的方法和试剂盒。
背景技术
主题说明书中的参考文献的著书目录的详细资料还列于说明书结尾。
在本说明书中对任何现有技术的引用不被认为,也不应被认为是这样的承认或任何形式的暗示,即该现有技术在任何国家中构成公知常识的部分。
不同领域的技术用于研究,分析,开发并且临床上用于检测目的细胞。手动或自动技术可用于对特别设计的小室中的细胞进行计数,其允许评估样品中的细胞数目。可以用特殊的染色剂对细胞进行染色以区别细胞类型。组织化学技术可以用于进一步区分样品中的细胞。还可以诊断细胞通过增殖或产生细胞因子响应特定抗原,结合其他细胞,吞噬(engulf)其他细胞或通过趋化作用进行移动的能力。细胞表面标记对于区分细胞类型和评估样品中特定细胞的数目来说特别有用。很多技术使用抗体以检测标记的存在。
原核和真核生物体的细胞在其所有不同的形式下包含细胞膜,其将细胞内容物与细胞外环境分隔开。细胞膜是选择性屏障,其决定进出细胞的物质并且其还与其他细胞和细胞的环境中的分子一起承担复杂的信号传导活动。细胞膜包含磷脂双层并且大多数跨双层膜或与双层膜相互作用的分子在插入双层膜中的蛋白的帮助下实现跨双层膜或与双层膜相互作用,所述的蛋白具有细胞质和细胞外部分。
通常,细胞与其环境的最初的相互作用经由在质膜上表达的受体或细胞表面结合分子而产生。不管是通过结合内源性配体(例如细胞因子或激素)还是外源性配体(例如抗原),这些受体的活化引发从细胞膜经细胞质到细胞核的生化级联。已知大量受体或细胞表面结合蛋白质分子介导细胞:细胞相互作用和细胞:分子相互作用。这些包括,例如,MHC蛋白,细胞因子,激素或神经递质受体,束缚配体,G蛋白偶联受体,受体蛋白酪氨酸激酶,受体蛋白酪氨酸磷酸酶,蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶和受体鸟苷酸环化酶。
在免疫系统中介导细胞-细胞识别或抗原识别的大多数蛋白包含Ig或Ig样结构域,暗示它们具有共同的进化历史。这些蛋白包括抗体,T细胞受体,分化簇(CD)抗原例如CD4,CD8和CD28蛋白,B和T细胞受体以及与淋巴细胞和其他白细胞上的Fc受体结合的恒定多肽链。已表征在白细胞表面上的蛋白约一半属于这一超家族。因此,免疫系统的细胞表达一系列细胞表面蛋白,所述细胞表面蛋白的同一性可以用于评估样品中不同细胞的数目和状态。
例如,可以用抗B和T细胞抗原受体的恒定区的抗体鉴别B和T淋巴细胞。可分别基于共受体蛋白CD4和CD8的表达的基础上鉴别T辅助细胞和细胞毒性T细胞。
流式细胞术是用于细胞鉴别和细胞计数的有力的工具。流式细胞术检测并计数经过激光束的流中的单独的细胞。通过检查大量细胞,流式细胞术可以对具有不同分子(例如表征B细胞的表面免疫球蛋白,称为CD3的T细胞受体相关分子,和区别主要T细胞亚群(subset)的CD4和CD8共受体蛋白)的细胞的百分数提供定量数据。用经荧光染料标记的特异性抗体对混合群内的单独的细胞加标签,或例如,通过特异性抗体接着通过经标记的抗免疫球蛋白抗体对混合群内的单独的细胞加标签。然后经标记的细胞的悬浮混合物被迫经过孔,产生每隔一段距离被逐一隔开的包含细胞的细的液体流。当各个细胞经过激光束,细胞散射激光,并且结合到细胞上的任何染料分子将被激发并且发出荧光。灵敏型光电倍增管检测散射光(提供细胞的大小和粒度的信息)和荧光发射(提供经标记的抗体的结合信息从而提供各个细胞的细胞表面蛋白的表达的信息)。如果使用两个或更多抗体,各个抗体与不同荧光染料偶联,则数据可以以二维散点图的形式或作为等值线图展示,其中对比第二个染料标记的抗体的荧光对第一个染料标记的抗体的荧光作图,从而用一个抗体标记的细胞群体可以基于其与第二个抗体的反应性进一步细分。
免疫测定是另一种特别有用的测定形式,其利用抗体-抗原反应的特异性,强度和差异来分析样品并且检测其中的特异性组分。大量的免疫测定技术是可获得的,例如在Wild D.″The ImmunoassayHandbook″Nature Publishing Group,2001中描述的那些技术。
用于检测抗特定抗原的抗体的大量方法也是已知的。例如,在实验室常规使用酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。还使用阵列和高通量筛选方法。这些方法通常需要在实验室技术上具有高水平的技术人员。
还开发了多种方法,其不太要求技能并且快速完成,因此,其适用于在即席检验时(at the point of care)检测抗特定抗原的抗体,和/或检测特定抗原。特别地,已经开发侧向流动(lateral flow),测验片(dipstick)和毛细管试剂盒以测定许多感染,包括病毒感染。
患有免疫缺陷性疾病例如AIDS的受试者中,表达CD4的T细胞的水平是何时开始抗逆转录病毒药物治疗的指标。病毒感染这些T细胞并且最终破坏它们。低CD4+T细胞水平还是临床进展风险和机会性感染的易感性的指标。
在一种检测CD4细胞的方法中,用抗CD4抗体包被的免疫磁珠(dynabeads)用于结合CD4+T淋巴细胞。用经抗CD14抗体包被的珠粒将表达CD14和CD4的单核细胞从新鲜血液样品中除去。之后,分离的CD4 T淋巴细胞被裂解,用吖啶橙进行染色并且经染色的细胞核通过荧光显微法计数。″TRAx CD4″检测试剂盒在Paxton等人,Clin.Diagn.Lab.Immunol.,2(1):104-114,1995中描述。该试剂盒为基于ELISA的方法,用于测量全血样品中的总CD4。所用的抗体不区别细胞结合的和可溶的CD4(参见Lyamuya等人,J.Imm.Methods.,195:103-112,1996)。国际公开号WO 2006/115866描述用于测量CD4抗原的免疫层析装置。然而,在该文献中仍没有公开能够在来自受试者的样品中区别细胞结合的CD4和缺失细胞质结构域的可溶的CD4的捕获试剂。此外,在WO 2006/115866中描述的装置依赖于样品流经一系列有限的捕获区域以通过渗透试纸条上的连续的捕获区域来捕获CD4,从而提供样品中的CD4细胞的浓度的可视化指标。
需要测量特定细胞类型或它们的细胞结合蛋白的改进的方法,特别是可以用于即席检验(point of care)和提供快速而精确的结果的方法。
发明概述
贯穿整个说明书和接着的权利要求书,除非上下文另外要求,词语“包含”和其变体例如“含有”和“包括”应理解为表示包括所述的整体或步骤或整体或步骤的组,但不排除任何其他的整体或步骤或整体或步骤的组。“由......组成”表示包括并且仅限于短语“由......组成”所陈述的任何事物。因此,短语“由......组成”指列出的要素是必需的或者必要的,并且不可以存在其他要素。“基本由......组成”表示包括该短语所陈述的任何要素,并且限于不干扰或不促成公开内容中指定的列出的要素的活性或作用的其他要素。因此短语“基本由......组成”指列出的要素是必需的或必要的,但有没有其他的要素是任选的并且依赖于它们是否影响所列出的要素的活性或作用,其他的要素可以存在或不可以存在。
应注意的是,如在主题说明书中所用的,单数形式“一个”,“一种”,“这个”,“这种”,“该”包括复数方面,除非上下文明确另外指出。例如,“样品垫”包括一个样品垫或一个以上的样品垫。
在本说明书中的各个实施方案通过作适当的修改可用于每个其他实施方案,除非特别另外说明。
核苷酸和氨基酸序列通过序列标识编号(SEQ ID NO:)指明。SEQID NO:数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1),<400>2(SEQID NO:2)等。序列标识符的总结在表1中提供。序列表在权利要求书之后提供。
在概括性的实施方案中,本说明书描述用于评估来自受试者的样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)的水平或存在或具有CSAP的细胞的水平或存在的方法,该方法包括:(i)任选地将样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触;(ii)将样品与和CSAP的细胞质结构域结合的CSAP结合试剂接触;和(iii)直接地或间接地评估样品中结合的CSAP的水平或存在。在一些实施方案中,至少包含细胞质结构域的结合的CSAP的水平或存在指示受试者中具有CSAP的细胞的数目。
在另一个实施方案中,本说明书描述了用于评估来自受试者的样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)的水平或具有CSAP的细胞的水平的方法,该方法包括:a)将测试样品用于免疫层析装置的样品部分,其中样品部分可操作地与装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向和流经捕获部分,所述的捕获部分包含与CSAP的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,以便只有包含细胞质结构域的CSAP(而非不包含细胞质结构域的可溶的CSAP)与抗体或其片段结合从而形成被捕获的CSAP;b)将捕获部分与第二结合试剂接触,所述的第二结合试剂与CSAP结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合;c)任选地将第二结合试剂与包含检测标记的第三或随后的结合试剂接触;评估检测标记的存在。
在举例说明性的实施方案中,该方法用于评估来自受试者的血液样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的T细胞结合CD4的水平或CD4 T细胞的水平,该方法包括:(i)任选地,将样品与能够裂解或透化CD4 T细胞的试剂接触;(ii)将样品与和CD4的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段接触;和(iii)直接地或间接地评估样品中结合的CD4的水平或存在。
在该方面的另一个实施方案中,该方法用于评估来自受试者的包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的T细胞结合CD4的水平或CD4T细胞的水平并且包括:a)将测试样品用于免疫层析装置的样品部分,其中样品部分可操作地与装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向和流经包含与CD4的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段的捕获部分,以便只有包含细胞质结构域的CD4(而非不包含细胞质结构域的可溶的CD4)与抗体或其片段结合从而形成捕获的CD4;b)将捕获部分与第二结合试剂接触,所述的第二结合试剂与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合;和c)任选地,将第二结合试剂与包含检测标记的第三或随后的结合试剂接触;评估检测标记的存在。
与CSAP或sCSAP的细胞质结构域结合的试剂可以是与CSAP特异性结合的任何形式的分子。CSAP结合试剂,例如配体,适体或抗体,是特别预期的。对CSAP的部分具有高特异性的抗体或其抗原结合片段可方便地制备。另外,抗体可以方便地缀合到可检测标记或与可检测标记一起产生或与缀合至可检测标记的第二或随后的抗体结合。其功能为直接或间接地检测试剂-CSAP复合物的任一形式的抗体可以称为检测抗体。
在另一个概括性的实施方案中,该方法包括:(i)任选地,将样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触,(ii)将待测试的样品与和CSAP的细胞外结构域结合的试剂接触,以便通过试剂结合全长(CSAP)和可溶形式(sCSAP)的CSAP并且形成包含试剂-CSAP和/或试剂-sCSAP的复合物(iii)任选地,如果试剂不是已经与固体或半固体支持物的区域结合或关联,则将样品与固体或半固体支持物接触,以便试剂和任何试剂-CSAP复合物和/或试剂-sCSAP复合物与固体支持物结合(iii)将样品或支持物的适当区域与和CSAP的细胞质结构域特异性结合的第二试剂接触和(iv)直接或间接地确定结合的第二试剂的存在或水平。
在另一个概括性的实施方案中,本说明书提供用于检测来自受试者的样品中a)包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的在细胞表面表达的蛋白(CSAP)或具有CSAP的细胞的水平或存在和b)在待测试的样品中可溶的非细胞膜结合的细胞外形式的CSAP(sCSAP)的存在水平的方法。该方法包括(i)任选地,将待测试的样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触,(ii)将样品与和CSAP的细胞质结构域结合的试剂以及和缺失细胞质结构域的可溶形式的CSAP结合的第二试剂接触,(iii)直接或间接地评估样品中的结合的CSAP和结合的sCSAP的水平。在其中还测量sCSAP的水平或存在的实施方案中,评估步骤(iii)区别试剂-CSAP复合物和试剂-sCSAP复合物。在这个实施方案中,可以确定来自受试者的样品中细胞结合的和可溶的sCSAP的相对存在或数量。
在另一个方面中,主题说明书描述了用于检测或监测来自受试者的样品中的细胞数目的试剂盒,其中所述细胞的特征在于包含含有细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)。在概括性的实施方案中,试剂盒包括:(i)包括与样品部分可操作连接的多孔膜,测试(捕获)部分,缀合部分,吸取部分,任选的对照部分和任选的裂解部分的层析装置;(ii)CSAP结合试剂,例如与CSAP的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,其中试剂或抗体固定(结合)于一个或多个测试部分和/或包含在缀合部分内;和(iii)使用装置以检测或监测样品或受试者中具有CSAP的细胞的水平或存在的说明书。
在举例说明性的实施方案中,提供用于检测或监测来自受试者的血液样品中的CD4T细胞的数目的试剂盒。在概括性的实施方案中,试剂盒包括:(i)包括可操作地与样品部分连接的多孔膜,测试(捕获)部分,缀合部分,吸取部分,任选地对照部分和任选地裂解部分的层析装置;(ii)CD4结合试剂,例如与CD4的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,其中试剂或抗体固定(结合)于一个或多个测试部分和/或包含在缀合部分内;和(iii)使用装置以检测或监测样品或受试者中的CD4细胞的水平或存在的说明书。如免疫层析装置领域的技术人员所理解的,主题试剂盒可以设计为任何适当的形式,包括反向或侧向流动免疫层析形式。
以上的概述不以任何方式视为也不应以任何方式视为是本发明的所有实施方案的穷举。
附图简介
图1(A)是与T淋巴细胞细胞表面膜结合的人CD4的图示。展示了包含氨基酸1-395的细胞外结构域,该结构域与其二硫键区域一起排列为四个免疫球蛋白样结构域。展示了包含氨基酸396-420的跨膜结构域,其跨T淋巴细胞细胞表面膜。还展示了包含氨基酸421-458的细胞质(胞质)结构域。图1(B)表示包含细胞质和细胞外结构域并且缺失跨膜结构域加上细胞质结构域的前两个氨基酸的TM^CD4的结构,这样该TM^CD4蛋白表示与氨基酸423-458融合的氨基酸1-395。
图2为人CD4细胞质结构域的图示和为了产生抗细胞质结构域的抗体而合成的亚序列肽的序列。肽1包含来自氨基酸436至454的缺失了氨基酸446至447(QC)的17个氨基酸(SEQ ID NO:1)。肽2包含来自人CD4的氨基酸422至441的20个氨基酸(SEQ ID NO:2)。氨基酸的编号如实施例1中所描述的。
图3为测量抗CD4细胞质肽的绵羊多克隆抗体的特异性和滴度的ELISA测定的结果的图示。图3A和3B表示分别来自绵羊G-6和绵羊G-7的结果。血液为预取血(PB),两次测试中取血(TB1和TB2)和终取血(FB)的样品。
图4为测量抗肽1和肽2的CD4多克隆抗体特异性的ELISA测定的结果的图示。如其中所示,绵羊通过ELISA对两个肽具有相似的反应性。TB2是来自G-7或G-6绵羊免疫后的第二次测试取血的血液。
图5为比较抗CD4cyto肽2的抗CD4cyto单克隆抗体(MAb)反应性的ELISA测定的结果的图示。如其中所示,三个单克隆抗体显示与肽2结合。
图6为评估抗CD4cyto单克隆抗体ID2和4B4与新鲜的(非固定化/透化)CD4+T细胞(A,B,C和D)结合的能力的流式细胞术分析的结果的图示。抗体不能结合新鲜的细胞。
图7为评估抗CD4cyto单克隆抗体ID2和4B4与固定化/透化的CD4+T细胞(A,B,C,D)结合的能力的流式细胞术分析的结果的图示。抗体与固定化/透化的细胞结合并且92%的CD4+细胞被选择。
图8为适合于实施本发明的两种免疫测定形式的图示。
图9为测量抗CD4的细胞质结构域的单克隆抗体包括商业可获得的抗CD4cyto单克隆抗体(chemicon)的反应性的ELISA的结果的图示。
图10为测量抗CD4的细胞质结构域的单克隆抗体1D2的特异性和其从JC53细胞裂解物捕获CD4的能力的捕获ELISA的结果的图示和用抗CD4胞外结构域的单克隆抗体(RPAT4)检测的结果的图示。1D2从JC53细胞裂解物捕获用RPAT4可检测的CD4,但是可溶CD4没有被捕获。
图11为测量抗CD4细胞质结构域的单克隆抗体1D2的特异性和其从JC53细胞裂解物捕获CD4的能力的捕获ELISA的结果的图示和用抗CD4胞外结构域的多克隆抗体检测的结果的图示。1D2从JC53细胞裂解物捕获用抗CD4细胞外结构域的多克隆抗体可检测的CD4,但是可溶CD4没有被捕获。
图12为来自供体的外周血单核细胞(PBMC)的细胞CD4的捕获ELISA的结果的图示。A表示来自供体1至6的通过单克隆抗体4B4捕获的PBMC裂解物的滴度,所述的供体在总PBMC群中具有不同比例的CD4T细胞。B表示富含细胞CD4的淋巴细胞的捕获。
图13为来自供体的外周血单核细胞(PBMC)的细胞CD4的捕获ELISA的结果的图示。展示了来自三个供体的结果以及OD450-620与每微升的CD4+T细胞的数目之间的关联。
图14为来自供体的外周血单核细胞(PBMC)的细胞CD4的捕获ELISA的结果的图示。展示了来自5个不同HIV感染患者的结果并且证明OD450-620与每微升全血的CD4+T细胞的数目之间的紧密的关联。
图15为用于检测全长的细胞结合CD4并且由此评估CD4+细胞数目的免疫层析装置的图示。
图16为编码一种形式的TM^CD4的核酸序列的图。下划线文本(text)为His标签。加框文本为肠激酶识别位点。粗体文本为CD4的细胞外结构域以及斜体字文本为CD4的细胞质尾部。
图17为一种形式的TM^CD4的氨基酸序列的图。下划线文本为His标签。加框文本为肠激酶识别位点。粗体文本为CD4的细胞外结构域以及斜体字文本为CD4的细胞质尾部。
图18为展示示通过ELISA(A)和通过Western免疫印迹(B)检测重组TM^CD4的数据的图表和照片示意。(A)全长(FL)CD4或TM^CD4通过各自的pcDNA4/HisMax构建体的转染或模拟转染在293T细胞中表达。用所述的方法通过CD4 ELISA测试细胞裂解物和细胞上清液。结果显示,全长CD4在细胞中有效表达但不被释放到上清液中,而TM^CD4在细胞中有效表达并且大部分重组蛋白释放到上清液中,从而允许简单纯化(如果需要)。(B)通过Western免疫印迹用抗CD4细胞质结构域的定制(custom)的MAb 4B4(3μg/ml)检测培养上清液中的TM^CD4。
图19为展示通过ELISA和免疫层析的快速的,即席检验测定检测TM^CD4的数据的图表和照片示意。连续稀释来自用TM^CD4的质粒稳定转染的HEK293细胞的上清液(以1∶5开始稀释),用于ELISA测定(A),在ELISA中显示出线性反应,证明TM^CD4可作为对照试剂在CD4 ELISA测定中用于评估总的CD4 T细胞数目。在该图中,在相同的测定中测试四个不同的全血样品(样品IDS72,51,40,49),与标准相比较的CD4的相对数量可以用所示的回归曲线或其他方法来评估。为了能够将CD4的数量转换为每微升的CD4 T细胞的数目,通过流式细胞术和ELISA多次测试全血参比样品并与TM^CD4标准比较,从而允许确定正确的转换因子(数据未显示)。(B)通过快速即席检验测定检测来自两个不同的稳定HEK293-TM^CD4细胞系克隆(H5和F5)的上清液,表明在此类测定中TM^CD4可以用作对照试剂或标准。
图20为展示通过流式细胞术和ELISA计算的CD4细胞数目之间的良好关联的图示。使用重组可溶形式的CD4作为CD4 ELISA的内在测定对照,并且使用基于通过流式细胞术和ELISA平行测定参比样品而确定的转换因子,对于评估的CD4 T细胞数目来说,用CD4 ELISA与用CD4流式细胞术相比获得非常紧密的关联。特别地,注意到当大于或少于每微升250个T细胞时,所有样品都被正确鉴别,如在加框区域中所示的。在该测定中,在通过ELISA测定全血的CD4 T细胞前,用CD14磁珠从全血中除去单核细胞。
图21为快速免疫层析形式中的结果的图示,其展示TM^CD4(作为包含细胞质结构域的CD4的替代物)的不同的数量和信号强度之间的良好关联。这证明TM^CD4可作为对照试剂用于CD4测定的ELISA和快速的即席检验形式的制备,测试和质量控制。该图还证明Chemicon 3706抗细胞质结构域Mab,和定制的4B4抗细胞质结构域Mab可以独立地或作为混合物用于在测定的快速形式中捕获CD4。此外,这证明在快速形式中信号强度与样品中的CD4的数量是成比例的,允许快速即席检验形式用于CD4 T细胞数目的定量或半定量评估。
图22为快速免疫成像(immunographic)装置中的结果的照片示意。(A)提供快速即席检验测定形式的测试结果,以所示的每微升的细胞数使用纯化的T细胞(在测试线反应)。(B):通过用与抗生物素金缀合物(gold conjugate)直接反应的生物素化的单克隆抗体划条带,制备与500个T细胞/微升和250个T细胞/微升等价的对照线。
图23(A)为根据本发明的全血CD4快速即席检验测定的图示。(B)在如A中所示的全血测定中测试包含高CD4T细胞水平(通过流式细胞术测定为1452/μl)的全血样品,如通常在裂解垫中具有去污剂(“+TX”),或从裂解垫除去去污剂(“-TX”)。在该实施例中,当存在去污剂以裂解垫中的T细胞时,仅在快速测试中见到CD4信号。(C)在CD4快速即席检验测定中测定的代表性全血样品的实例。展示通过流式细胞术确定的各个样品的CD4数量,并且在该全血形式中可见高CD4T细胞数给出较强的信号而低CD4T细胞数给出弱的信号。
图24为展示样品中的单核细胞的减少的数据的示意。在ELISA形式的测定中,可以如上述通过在本领域公知的方法中使用为此目的而设计的抗CD14磁珠和强磁体,在测定之前从全血中除去单核细胞。该方法还可以用于即席检验测定之前的全血的预处理,但是为了即席检验测试要求优选避免样品处理和加工。还没有描述过通过使用与快速的即席检验测定中的内容相容的方法除尽特定白细胞类型或其他细胞类型的方法。本发明人设计了如实施例12中所述的用于有效除去快速即席检验测试的样品垫中的单核细胞的方法。
在图中,纯化的单核细胞和纯化的外周血淋巴细胞(PBL,除尽单核细胞)分别用红外荧光染料标记-单核细胞用绿色(Mini CellVueNIR815,PTI Research,Inc),PBL用红色(Mini CellVue Burgundy,PTI Research Inc.)。图像展示了在Licor Odyssey红外荧光扫描仪上经不同的滤光器观察到的相同的样品垫:(A)=组合滤光器,(B)=Em800,(C)=Em700。磁体使其中使用它的样品垫的扫描变暗。将1.5×104个单核细胞(结合到磁珠)和除尽单核细胞的2×104个PBL组合并点样到无磁体(左)或有磁体(右)的抗血型糖蛋白A包被的样品垫上。用60ul PBS冲洗样品以允许样品流入吸收垫(此处用于代替实际的裂解垫和硝酸纤维素试纸条,用于举例说明性目的)。在存在磁体的情况下在图(A)和(B)中可以看到保留>80%的单核细胞(绿色),而没有绿色细胞进入吸收垫,同时在存在或不存在磁体的(A)和(C)中证明除尽了单核细胞的PBL流入吸收垫。(D)展示如(A)-(C)中所示的测试的示意图。
表格简介
表1提供本文提供的SEQ ID NO的描述。
表2提供氨基酸亚分类。
表3提供示例性的氨基酸取代。
优选的实施方案的详述
在准备本发明的工作中,发明人已开发了用于精确计数来自受试者的细胞样品中的特定细胞类型的策略。本发明部分以这样的认识为基础,即用于检测特定细胞类型的蛋白标记的现有技术方法使用与细胞标记的细胞外部分结合的试剂。因为很多细胞表面结合分子以细胞结合的和可溶的形式存在,这些试剂检测可溶形式的标记,导致假阳性或特定细胞类型的数目的过高估计。在一些实施方案中,该方法不检测缺失细胞质结构域的可溶CSAP(其可能存在于样品中)。在其他实施方案中,该方法区别包含细胞质结构域的细胞结合的CSAP和缺失细胞质结构域的可溶的CSAP。
在一些实施方案中,本发明提供测定,例如免疫测定,其包含区别可溶和全长形式的细胞表面标记的试剂。在本发明的特别有用的实施方案中,提供不需要样品加工,显微术,使用其他仪器或科学的专门技能的快速即席检验(RPOC)方法和试剂盒。
因此,在一个实施方案中,本发明提供用于评估来自受试者的样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)或具有CSAP的细胞的水平或存在的方法,该方法包括(i)任选地,将样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触,(ii)将样品与和CSAP的细胞质结构域结合的试剂接触(iii)直接或间接地评估样品中结合的CSAP的水平。根据本发明的这一方面,该方法允许在也包含可溶CSAP的样品中检测或测量细胞结合的CSAP。试剂-CSAP复合物的水平可以用于证明样品中特定细胞结合的CSAP的存在或定量样品中特定细胞结合的CSAP分子的数量。通过使用关于平均多少CSAP分子存在于特定细胞类型的表面上的信息,可以评估样品中存在的具有CSAP的细胞的数目。
与CSAP的细胞质结构域或可溶形式的CSAP结合的试剂可以是任何CSAP结合试剂,例如配体,适体或抗体,然而方便地制备特异性抗体或其抗原结合片段。特别地,抗体可以方便地与可检测标记缀合或与可检测标记一起产生或与缀合至可检测标记的第二或随后的抗体结合。
可以以本领域已知的任何方便的形式进行免疫测定。其包括Western印迹,免疫组织化学测定和ELISA测定。由于大量产生单克隆抗体的能力和产物的同质性,免疫测定中特别优选使用单克隆抗体。然而,如本文所示,也可以使用多克隆抗体。用于产生单克隆抗原的杂交瘤细胞系的制备通过将永生细胞系和敏化的抗目的抗原的淋巴细胞融合而得到(在非限制性实例中,在CD4多肽的情况下,抗体为肽1或2或其同源物,衍生物,变体)或可以通过本领域技术人员公知的技术进行(参见,例如Douillard和Hoffman,Basic Facts aboutHybridomas,Compendium of Immunology第II卷,由Schwartz编辑,1981;Kohler和Milstein,Nature 256:495-499,1975;European Journal of Immunology 6:511-519,1976或更新的参考文献Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdEdition,CSHLP,CSH,NY,2001)。
本发明的另一个方面关注用于检测来自受试者的生物样品中的CSAP的方法,所述的方法包括在足以使抗体-CSAP复合物形成的条件下,将所述生物样品与对CSAP的细胞质结构域特异的抗体接触一段时间,然后检测所述复合物。
可以用很多方式,例如通过Western印迹和ELISA方法评估CSAP的存在。可使用大量的免疫测定技术,如可以参见美国专利4,016,043,4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争型的单个位点和两个位点或“夹心”测定,以及传统的竞争结合测定。
夹心测定为最有用的和普遍使用的测定之一并且适合用于本发明。存在很多夹心测定技术的变形,并且本发明意欲包括所有变形。简单来说,在通常的正向测定中,将抗体固定于固体或半固体基底上并且使待测试的样品与结合的分子接触。在温育合适的时间(一段足以允许抗体-抗原复合物形成的时间)后,然后添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的对抗原特异的第二抗体并温育,进行足以形成另一个抗体-抗原-经标记的抗体的复合物的时间。清洗掉任何未反应的物质,并且通过观察由可检测的标记(报告分子)产生的信号确定CSAP的存在。通过简单观察可视信号,结果可以是定性的或定量的,或可以通过与包含已知数量的CSAP的对照样品比较,定量结果。正向测定的变形包括同时测定,其中同时添加样品和经标记的抗体至结合的抗体。这些技术对本领域技术人员来说是公知的,其包括任何小的明显的变化。根据本发明,样品为可能包含CSAP的样品,例如细胞提取物或活组织检查样品。因此,样品通常为包含生物体液的生物样品。
在通常的正向夹心测试中,针对CSAP的细胞质结构域具有特异性的第一抗体共价或被动地与固体或半固体支持物结合。支持物通常为玻璃或聚合物,最常用的聚合物为硝酸纤维素,纤维素,聚丙烯酰胺,尼龙,聚苯乙烯,聚氯乙烯,聚丙烯或这些物质的混合物或衍生物。固体支持物可以为管,珠,盘或微孔板的形式,或任何其他适合于进行免疫测定的表面。结合过程是本领域公知的并且通常由交联共价结合或物理吸附聚合物-抗体复合物到固体表面组成,所述表面然后在测试样品的制备中进行清洗。然后,将待测试的样品的等分试样添加到固相复合物并且在合适的条件(例如从室温至约37℃包括25℃)下温育一段足够的时间(例如2-40分钟或如果适宜,过夜)以允许存在于抗体中的任何亚基的结合。温育后,清洗抗体亚基固相并且与对抗原的部分特异的第二抗体一起温育。第二抗体连接到用于指示第二抗体与抗原的结合的可检测的标记。
可选的方法包括固定生物样品中的靶分子然后将固定化的靶暴露于特异性抗体,所述的抗体可以用或者可以不用可检测标记进行标记。取决于靶的数量和可检测标记的信号强度,可以通过直接用抗体标记检测结合的靶。可选地,将对第一抗体特异的经标记的第二抗体暴露于靶-第一抗体复合物以形成靶-第一抗体-第二抗体三联(tertiary)复合物。通过由报告分子发出的信号检测复合物。基于珠粒的方法的显著改进包括用独特的识别标签(例如寡核苷酸或电泳标签)标记各个珠粒,以便促进各个文库成员的氨基酸序列的鉴别。这些改进的基于珠粒的方法在国际公开号WO 93/06121中描述。
在其他实施方案中,该方法为液相方法。在液相免疫测定的一个实例中(参见例如美国专利6,632,603),将样品与能够结合CSAP的细胞质部分的试剂和包含视觉可检测的试剂(例如标记的胶体金或银)的检测子试剂接触。通过流到不溶多孔支持膜的指定区域上来应用测试样品,所述的不溶多孔支持膜具有不能使CSAP(如果存在)与结合物和检测子物质形成的复合物通过,但可以使结合物和检测子物质(当不存在期望的CSAP时保持未复合)通过的孔径。如果在测试样品中存在CSAP,检测子物质与CSAP和结合物结合以在多孔支持膜表面形成视觉可检出的复合物。在将测试样品应用到多孔支持物后,直观检查多孔支持物的表面的颜色以确定测定的CSAP的存在和数量或不存在。
在另一个测定中,与CSAP标记结合的磁性抗体用于标记CSAP并且使用高Tc超导量子干涉仪以测量游离和结合的抗体的数量并且因此测量CSAP的存在或水平。例如,脂质体免疫迁移,液相竞争试纸条免疫测定在Glorio-Paulet等人J Agric Food Chem 48(5):1678-1682,2000中描述。
用于进行不同形式的ELISA的通用的形式和方案已在本领域中公开并且对诊断学领域的技术人员来说是已知的。例如,可以参考Ausubel(Ed)Current Protocols in Molecular Biology,5th Edition,John Wiley & Sons,Inc,NY,2002的第11章。
在进一步优选的实施方案中,与CSAP的细胞质结构域结合的试剂用于将CSAP连接到固体或半固体支持物。这允许将样品中的任何可溶CSAP从CSAP物理分离,然后CSAP可以用与CSAP的细胞外结构域结合的试剂检测。
在另一个实施方案中,该方法包括(i)任选地,将样品与能够裂解或透化具有CSAP的细胞的试剂接触,(ii)将待测试的样品与和CSAP的细胞外结构域结合的试剂接触,从而CSAP和CSAP的可溶形式与试剂结合并且形成包含试剂-CSAP和/或试剂-sCSAP的复合物(iii)任选地,如果试剂不是已经结合至或另外与固体或半固体支持物的区域相关联,则将样品与固体或半固体支持物接触以便试剂和任何试剂-CSAP复合物和/或试剂-sCSAP复合物与固体支持物结合(iii)将样品与特异性和CSAP的细胞质结构域结合的第二试剂接触和(iv)直接或间接地确定结合的第二试剂的存在或水平。
在另一个实施方案中,本发明提供用于确定来自受试者的样品中a)包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的在细胞表面上表达的蛋白(CSAP)或具有CSAP的细胞的水平或存在和b)样品中CSAP的可溶的非膜结合的细胞外形式的存在水平的方法。在该实施方案中,将样品进一步与结合可溶形式的CSAP的试剂接触。在其中还测量可溶CSAP的水平或存在的实施方案中,评估步骤(iii)区别试剂-CSAP复合物和试剂-sCSAP复合物。在该实施方案中,可以确定来自受试者的样品中细胞结合的CSAP和可溶CSAP的相对存在或数量。
在一些实施方案中,该方法包括(i)将来自受试者的样品用于具有特异性与CSAP的细胞质结构域结合的抗体的层析或免疫成像装置的部分,以便基本上只有包含细胞质部分的细胞结合的CSAP被捕获到测试部分上。在其中需要检测可溶CSAP的存在或水平的一些实施方案中,层析装置的另一个部分具有结合可溶CSAP的抗体,以便任何可溶CSAP被捕获到层析装置的另外的测试部分。当然,与可溶CSAP细胞外结构域结合的抗体也能够与CSAP的细胞外结构域结合。然而,如果存在于样品中的所有CSAP经由抗细胞质结构域的抗体与装置的其他部分结合,则抗可溶CSAP的抗体将只结合CSAP的可溶形式。
在一些实施方案中,待测试的样品包含得自身体(例如脊髓液,骨或组织样品,血清,血浆,唾液,泪液和乳液)的细胞。在一些实施方案中,测试样品为全血或稀释的全血为全血衍生物。在一些实施方案中,可以在抗凝血剂(例如肝素,柠檬酸钠或乙二胺四乙酸(EDTA))存在的条件下保存血液。
在一种或多种上述方法中,检测步骤包括将结合的CSAP与和CSAP结合且包含检测标记或能够与包含检测标记的第三结合试剂结合的第二结合试剂接触,和检测检测标记。在一些特别的实施方案中,CSAP结合试剂为抗体或其抗原结合片段。类似地,在一些实施方案中第二结合试剂为与CSAP结合(包括与CSAP的细胞质或细胞外结构域结合)的抗体或其抗原结合片段。
如上所述,该方法的特别的实施方案包括评估样品中具有CSAP的细胞的数目。在一些实施方案中,这通过将结合的CSAP的水平或存在,或结合的检测标记的水平或存在与预先确定的对照比较而实现。在一些实施方案中,预先确定的对照为预先确定量的对照多肽,当与可视的检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的CSAP细胞产生的信号等价的可视的内标。
用于评估细胞的方法取决于所用的方法的形式并且ELISA类型,流式细胞术或层析法都是预期的。在其中所述方法为ELISA或层析方法的一些实施方案中,与CSAP的细胞质结构域结合的CSAP结合试剂固定在固体或半固体支持物上。在其他实施方案中,所述方法为ELISA或层析法并且与CSAP结合包括与CSAP的细胞质或细胞外结构域结合的第二结合试剂固定于固体或半固体支持物上。
所述方法适合在免疫层析装置中使用。在这方面的一些实施方案中,提供了用于评估来自受试者的样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)的水平或具有CSAP的细胞的水平的方法。在一些实施方案中,该方法包括:a)将测试样品用于免疫层析装置的样品部分,其中的样品部分可操作地与装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向并通过捕获部分,所述的捕获部分包含与CSAP的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,以便只有包含细胞质结构域的CSAP(而非不包含细胞质结构域的可溶CSAP)与抗体或其片段结合从而形成捕获的CSAP;b)将捕获部分与和CSAP结合(包括与细胞质或细胞外结构域结合)且包含检测标记或能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合的第二结合试剂接触。在一些实施方案中,该方法进一步包括c)任选地,将第二结合试剂与包含检测标记的第三结合试剂接触;评估检测标记的存在。当然,如果需要,可以使用进一步的结合伴侣。
在举例说明性的实施方案中,本说明书提供用于评估来自受试者的血液样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的T细胞结合CD4的水平或CD4T细胞的水平的方法,该方法包括:(i)任选地,将样品与能够裂解或透化CD4 T细胞的试剂接触;(ii)将样品与和CD4细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段接触;和(iii)直接地或间接地评估样品中结合的CD4的水平或存在。
在一些实施方案中,步骤(iii)包括将CD4-抗体复合物与第二抗体或其抗原结合片段接触,所述的第二抗体或其抗原结合片段与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包括检测标记的第三结合伴侣结合,和检测检测标记。在一些实施方案中,该方法包括通过将结合的CD4或结合的检测标记的水平或存在与预先确定的对照进行比较来确定样品中具有CD4的细胞的数目。在一些实施方案中,预先确定的对照为预先确定量的对照多肽,当与可视的检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的CD4细胞产生的信号等价的可视内标。然而如上所述,在一些实施方案中,该方法为ELISA,流式细胞术或层析法。
在一些实施方案中,所述方法为ELISA或层析法并且能够与CD4的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段(抗-cytoCD4抗体)固定于固体或半固体支持物上。
关于层析装置,可以使用很多不同的形式。然而,在一个实施方案中,提供用于评估来自受试者的血液样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的T细胞结合CD4的水平或CD4 T细胞的水平的方法。在一些实施方案中,该方法包括:a)将测试样品用于免疫层析装置的样品部分,其中样品部分可操作地与装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向并且通过捕获部分,所述的捕获部分包含与CD4细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,以便只有包含细胞质结构域的CD4(而非不包含细胞质结构域的可溶CD4)与抗体或其片段结合从而形成捕获的CD4;b)将捕获部分与这样的第二结合试剂接触,所述的第二结合试剂与CD4结合(包括与细胞质或细胞外结构域结合)并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合;c)任选地,将第二结合试剂与包含检测标记的第三或随后的结合试剂接触;评估检测标记的存在。
对于对照多肽来说,在一些实施方案中,对照多肽为至少包含细胞质结构域的CD4多肽。关于CD4细胞的数目,在一些实施方案中,其为小于200,小于250,大于250,250至350,350至500,250至500和大于500个细胞/μl血液中的一种或多种。在其他实施方案中,CD4T细胞的数目为少于200,少于500,500至1000,1000至2000,和大于2000个细胞/μl血液中的一种或多种。
如果需要,可以用多种方法从血细胞中除尽单核细胞或红细胞。在一些实施方案中,通过将样品与结合到固体或半固体支持物的抗CD14抗体接触来除尽样品中的单核细胞。在另一个实施方案中,通过将样品与结合到固体或半固体支持物的抗血型糖蛋白抗体接触来除尽样品中的红细胞。
在另一个方面中,本发明提供了适合于实施主题方法的装置或试剂盒。
在一些实施方案中,提供了层析装置,其包括具有这样的孔径的材料,所述的孔径允许或促进该方法的组分的毛细流动。在一些实施方案中,该装置包括这样的部分,所述部分包含不同孔径的材料,或非多孔材料,紧邻第一材料并且设计用于回收样品或回收或储存该方法的组分的材料。在一些实施方案中,层析装置的部分为分离的,紧邻的或重叠的或设计成在使用中集合。
在一些实施方案中,样品垫层析法地与装置的测试部分连接,所述测试部分包含抗体或其抗体结合片段。在举例说明性的实施方案中,受试者为哺乳动物并且测试部分包含抗体,所述抗体在适宜的条件下识别并结合CSAP多肽的细胞质结构域。
在一些实施方案中,样品垫层析法地与装置的测试部分连接,所述测试部分包含抗体或其抗体结合片段。在举例说明性的实施方案中,受试者为哺乳动物并且测试部分包含抗体,所述抗体在适宜的条件下识别并结合包含Ig或Ig样结构域的蛋白质的细胞质结构域。
在其他实施方案中,CSAP为受体,例如但不限于细胞因子,激素或神经递质受体,束缚配体,G蛋白偶联受体,受体蛋白酪氨酸激酶,受体蛋白酪氨酸磷酸酶,蛋白-丝氨酸/苏氨酸激酶和受体鸟苷酸环化酶。
在一些实施方案中,当待测试的样品的层析活性部分从样品垫移向并通过测试部分时,包含细胞质结构域的CSAP被捕获到装置的测试或对照部分并且来自样品垫的样品的剩余部分不被捕获。这种安排确保在该实施方案中基本上只有待检测的非可溶CSAP允许与检测抗体相互作用,因此,其可以关注于可溶或非可溶CSAP。在优选的实施方案中,用与CSAP的细胞外结构域结合的抗体检测CSAP以避免与和CSAP的细胞质结构域结合的抗体所用的位点结合。在一些实施方案中,测试样品的未捕获的组分层析法地收集到吸收垫中,所述的吸收垫位于所涉及的测试部分的任意方向。可以通过例如选择合适的网眼或孔径的垫和/或通过包含特定试剂例如抗体或凝集素以结合和保留这些组分来将受试者样品的组分,例如红细胞或特定的白细胞保留在样品垫中。例如可以用抗CD14抗体保留单核细胞。抗血型糖蛋白抗体可以用于保留/除去红细胞。
在一些实施方案中,一旦免疫层析装置的测试部分暴露于受试者样品中的CSAP,通过允许检测标记和测试部分接触,该方法开始进行。在一些实施方案中,检测标记储存在分离的检测标记垫中。
在一些实施方案中,检测标记包括视觉可检测报告分子并且在免疫层析装置的测试和/或对照部分中,阳性结果基本上可以立即被观察到。在其他实施方案中,可以使用另外的检测方案和装置(例如本领域普通技术人员公知的那些)检测检测标记。例如,除胶体金以外,如本文所示例的,方便地使用其他胶体金属或金属氧化物颗粒或胶体非金属颗粒或染料或有色乳胶。
在举例说明性实施方案中,本说明书描述了用于检测或监测来自受试者的样品中的细胞数目的试剂盒,其中所述细胞的特征在于包含含有细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)。在一些实施方案中,所述试剂盒包括:(i)层析装置,其包括与样品部分可操作连接的多孔膜,测试(捕获)部分,缀合部分,吸取部分,任选地对照部分和任选地裂解部分;(ii)CSAP结合试剂,例如与CSAP的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,其中所述试剂或抗体固定(结合)于一个或多个测试部分和/或包含在缀合部分内;和(iii)使用装置以检测或监测样品或受试者中具有CSAP的细胞的水平或存在的说明书。
在另外的非限制性的举例说明性实施方案中,所述试剂盒包括:(i)层析装置,其包括与样品部分可操作地连接的多孔膜,测试(捕获)部分,缀合部分,吸取部分,任选地对照部分和任选地裂解部分;(ii)CD4结合试剂,例如与CD4细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段,其中所述试剂或抗体固定(结合)于一个或多个测试部分和/或包含于缀合部分内;和(iii)使用装置以检测或监测样品或受试者中CD4细胞的水平或存在的说明书。当然,此类试剂盒可以以任何合适的形式存在,例如反向或侧向流动的免疫层析形式。在优选的实施方案中,缀合部分包含可视的检测标记。在其他实施方案中,对照部分包含预先确定数量的对照多肽,当与可视的检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的细胞产生的信号等价的内标。在一些实施方案中,对照部分包含预先确定量的至少包含细胞质结构域的对照CD4多肽,当与可视检测标记结合时,其足以产生信号,提供预先确定数目的CD4细胞的可视标准。在一些实施方案中,CD4多肽是缺失跨膜结构域的重组CD4。
对于CD4 T细胞的评估,在一些实施方案中,该试剂盒有利地提供一种或多种以下的预先确定的数目:小于200,小于250,大于250,250至350,350至500,250至500和大于500个细胞/μl血液。可选地,预先确定的数目为小于200,小于500,500至1000,1000至2000,和大于2000个细胞/μl血液中的一种或多种。在一些实施方案中除去红细胞和/或单核细胞并且试剂盒使用试剂以实现红细胞和/或单核细胞的除尽。在一些实施方案中,样品垫包含红细胞捕获试剂(例如血型糖蛋白A)和/或抗CD14磁珠,其他单核细胞特异性试剂。
根据本发明,已经确定廉价的或一次性磁体在本免疫层析试纸条中有效地实现细胞分离。在一些实施方案中,所用的磁体具有小于约5mm的通过样品的磁场强度范围。在一些实施方案中,磁体包括在试剂盒中。在一些实施方案中,磁性材料连接或可连接到样品垫或免疫层析装置的能够接触到样品垫的部分。
在另一个实施方案中,在试剂盒中评估具有CSAP的细胞的数目,其通过:(i)在一定条件下,将来自受试者的测试样品用于样品部分,在所述条件中,具有CSAP的细胞流过捕获部分流向吸取部分;(ii)使用可视检测标记直接或间接地检测捕获部分中捕获的CSAP的存在;和(iii)将(ii)中检测标记的信号的强度与对照部分的信号的强度进行比较,所述的对照部分包含对照多肽,提供与由预先确定数目的具有CSAP的细胞产生的信号等价的内标。
在一些实施方案中,测试样品与裂解缓冲液接触或通过能够裂解或透化具有CSAP的细胞的裂解部分。
缺失跨膜结构域的重组CD4用作或适于用作所述方法或试剂盒中的对照以确定CD4 T细胞的数目。因此,本发明预期缺失跨膜结构域的重组CD4在制备用于定量来自受试者的样品中CD4 T细胞的数目的固体或半固体支持物或试剂盒中的用途。
在一些实施方案中,主题方法和/或试剂盒用于评估AIDS或其他免疫缺陷疾病患者。
在一些实施方案中,受试者为人。然而,本发明扩展到灵长类,家畜动物,实验室试验动物,伴侣动物和鸟类还有非哺乳动物,例如爬行类动物。因此,该方法用于人,家畜,兽医和野生动物治疗和诊断。
本发明进一步以分割为若干部分的形式提供试剂盒,其包括进行主题方法所需的试剂和层析装置。通常,所述试剂盒还包含一套说明书。
因此,在另一个方面,本发明提供用于评估来自受试者的样品中包含细胞质(胞质)和细胞外(胞外)结构域的细胞表面结合蛋白(CSAP)的水平或存在或具有CSAP的细胞的水平或存在的试剂盒,其以分割为若干部分的形式包含免疫层析装置,所述的免疫层析装置包含回收样品的部分,回收或包含检测标记的部分,及包含试剂(例如与在细胞表面上表达的蛋白(CSAP)的细胞质结构域结合的抗体或其抗原结合片段)的装置的测试和对照部分。在一些实施方案中,所述装置的部分是分离的,紧邻的或重叠的。在一些实施方案中,试剂盒使用反向流动免疫层析。在其他实施方案中,试剂盒使用侧向流动免疫层析。在一些实施方案中,CSAP为特定细胞类型的标记,例如包含Ig或Ig样结构域的蛋白。在一个实施方案中,细胞标记选自分化簇(CD)抗原。在示例性的实施方案中,CSAP为CD4。在本发明的这一方面中,CD4或具有CD4的细胞的水平是受试者需要抗逆转录病毒治疗的指标。特别地,在患有HIV感染的受试者的情况下,小于约200个细胞/μl血液或小于250个细胞/μl血液的水平表示需要抗逆转录病毒治疗。根据本发明的这一方面,提供了这样的免疫层析装置,其允许在临床有用的范围中,例如小于250,大于250,250至350,350至500,250至500和大于500个细胞/μl血液,定量评估CD4 T细胞。在一些实施方案中,这些范围或其修改版本(amended versions)用于监测HIV患者。在另一个实施方案中,适合于监测儿科HIV患者的装置允许定量评估少于500,500至1000,1000至2000,和大于2000个细胞/μl血液的CD4T细胞。
在另一个实施方案中,CSAP为受体,例如细胞因子,激素或神经递质的受体。在一个优选的实施方案中,受体为TNF受体。
本文涉及的术语“造血细胞”包括未分化的造血干细胞(HSC)和任意一种或多种源自HSC的血细胞类型。该术语涉及多潜能细胞和最终产生完全分化的成熟血细胞的各种不同形式的髓性或淋巴性多能细胞(myeloid-or lymphoid-restricted cell)。在成人中,HSC存在于骨髓,外周血,肺,肝,脾和其他器官中。HSC为祖细胞等级(hierarchy)的第一级。它们能够长期自我更新(长期(LT)-HSC)。LT-HSC分化为短期多潜能HSC(ST-HSC),其保留产生所有血细胞类型的能力但是只增殖相对短的时间。其次,产生淋巴祖细胞(其最终产生免疫细胞),以及产生骨髓祖细胞(其最终主要产生红细胞和血小板及一些先天性免疫细胞)。这些祖细胞具有不同的增殖和分化能力并且从这些细胞最终产生终末分化细胞。因此,涉及的HSC和造血祖细胞包括所有上述祖细胞并且涉及的造血或血细胞包括它们的任何终末分化后代(descendant)。这些包括但不限于:HSC,造血干细胞;CLP,淋巴共同前体细胞(common lymphoid precursor);CMP,髓共同前体细胞(common myeloid precursor);GMP,粒细胞巨噬细胞前体(granulocyte-macrophage precursor);MEP,巨核细胞-类红细胞前体(megakaryocyte-erythroid precursor);CFU-GM,粒细胞/巨噬细胞集落生成单位(colony formingunit-granulocytic/macrophage);CFU-G,粒细胞集落生成单位(colony forming unit-granulocytic);CFU-M,巨噬细胞集落生成单位(colony forming unit-macrophage);CFU-Mk,巨核细胞集落生成单位(colony forming unit-megakaryocytic);BFU-e,类红细胞爆发集落形成单位(Burst-forming unit erythroid);和CFU-E,类红细胞集落生成单位(colony forming unit-erythroidcells),和它们的后代。
本文涉及的“CD”蛋白或多肽包括一种或多种选自以下的CD抗原:CD1a,b,c,d,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD9,CD10,CD11a,CD11b,CD11c,CD11d,CDw12,CD13,CD14,CD15,CD15s,CD15u,CD16,CDw17,CD18,CD19,CD20,CD21,CD22,CD23,CD24,CD25,CD26,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD39,CD40,CD41,CD42a,b,c,d,CD43,CD44,CD45,CD45RO,CD45RA,CD45RB,CD46,CD47,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD50,CD51,CD52,CD53,CD54,CD55,CD56,CD57,CD58,CD59,CD60a,CD60b,CD60c,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD63,CD64,CD65,CD66a,CD66b,CD66c,CD66d,CD66e,CD66f,CD68,CD69,CD70,CD71,CD72,CD73,CD74,CD75,CD75s,CD77,CD79α,β,CD80,CD81,CD82,CD83,CDw84,CD85,CD86,CD87,CD88,CD89,CD90,CD91,CD92,CD93,CD94,CD95,CD96,CD97,CD98,CD97,CD100,CD101,CD102,CD103,CD104,CD105,CD106,CD107a,CD107b,CD108,CD109,CD110,CD111,CD112,CD114,CD115,CD116,CD117,CD118,CD119,CD120a,CD120b,CD121a,CDw121b,CD122,CD123,CD124,CD125,CD126,CD127,CDw128,CD129,CD130,CDw131,CD132,CD133,CD134,CD135,CDw136,CDw137,CD138,CD139,CD140a,b,CD141,CD142,CD143,CD144,CD145,CD146,CD147,CD148,CD150,CD151,CD152,CD153,CD154,CD155,CD156a,CD156b,CD157,CD158,CD158a,CD158b,CD159a,CD160,CD161,CD162,CD162R,CD163,CD164,CD165,CD166,CD167a,CD168,CD169,CD170,CD171,CD172a,CD173,CD174,CD175,CD175s,CD176,CD177,CD178,CD179a,CD179b,CD180,CD183,CD184,CD195,CDw197,CD200,CD201,CD202b,CD203c,CD204,CD205,CD206,CD207,CD208,CD209,CDw210,CD212,CD213a1,CD213a2,CDw217,CD220,CD221,CD222,CD223,CD224,CD225,CD226,CD227,CD228,CD229,CD230,CD231,CD232,CD233,CD234,CD235a,CD235b,CD236,CD236R,CD238,CD239,CD240CE,CD240D,CD241,CD242,CD243,CD244,CD245,CD246和CD247。此类分子和在其上发现此类分子的细胞在Janeway等人,Appendix II.CD Antigens,Immunology,Garland Publishing,New York,5thedition,2001中描述,其以其全文通过引用并入本文。
本文涉及的“层析装置”包括本领域已知的用于促进或支持层析流动或分离的任何固体,半固体,基质或凝胶材料的的装置。如本文所用的,样品的组分(包括抗体),和检测标记-抗原复合物和其组分,通过毛细流动或经由层析材料的扩散相对于彼此移动。可以官能化或包被材料以允许例如试剂的交联。用于将抗体固定到固体支持物的方法是本领域公知的并且例如在美国专利4,168,146,CautrecasesJ.Biol.Chem.245:3059,1970中描述。预期用于本文的材料包括无机材料,例如二氧化硅,玻璃,聚合材料例如纤维素,淀粉,右旋糖,琼脂糖,特殊的纤维纸(过滤/层析纸),硝酸纤维素,醋酸纤维素,PVC,聚丙烯酰胺,多糖,聚丙烯酸酯,聚乙烯基磺酸酯(polyethylensulphonate),聚乙烯等。
“层析活性”组分简单地指能够流经免疫层析装置的全部或部分的组分。
本文涉及的“得自”、“源自”表示样品获得自特定来源但并非必须直接来自该来源。
“抗体”包括与抗原相互作用的免疫球蛋白基因产物,即抗原结合试剂,其片段和得自非免疫球蛋白基因的能够用作抗原结合试剂的蛋白分子。因此,术语抗体包括多克隆和单克隆抗体和其部分,包括Fab部分和抗原结合决定簇。免疫球蛋白基因包括κ,λ,α,γ,(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,)δ,ε,和μ恒定区和多种可变区基因。
通常,免疫球蛋白包含两对相同的免疫球蛋白链,每对包含具有抗原结合区的轻链(VL)和重链(VH)可变部分。每对还包含提供种属(generic)抗体功能的恒定区。免疫球蛋白的其他形式为Fv,scFv,Fab,Fab1,和(Fab1)2形式。涉及的抗体的“类(class)”包括涉及的任何类例如IgM,IgG,IgA等。
快速而精确地确定CD4+细胞水平的能力对于评估受试者响应抗病毒剂或发起免疫反应的能力是重要的。
如本文所用的,涉及的“检测”,“评估”,“计数”指它们的最广泛的意思以包括这样的测定,其在sCSAP存在下对CSAP的存在或水平和由此的CSAP阳性细胞的数目进行定性地或定量地或半定量地测试,或其通过使用能够区别CSAP和sCSAP的试剂定性或定量测试CSAP和sCSAP的存在或水平。
层析测定特别成熟并且可以使用很多不同的形式,其经裁制适合于任何特别的研究中所需要的特别的试剂和仪器和结果。使用层析原理的“快速”测定经裁制适合于精确,快速和容易地使用。特别优选免疫测定或基于酶的层析测定并且这些在Wild D″The ImmunoassayHandbook″,Nature Publishing Group,2001中描述并且可参考并入本文的美国专利4,016,043;4,590,159;5,266,497;4,962,023;5,714,389;5,877,028,5,922,537,6,168,956和6,548,309,6,180,417,和5,266,497以及其中引用的文献所公开的信息。免疫层析方法的各种改进在公开的美国专利申请20010006821,20040087036和20040214347中描述,其以其全文通过引用并入本文。用于多分析物分析的免疫金渗滤法在并入本文的公开的美国专利申请20030165970中描述。
“检测标记”或“报告分子”指这样的分子或颗粒,所述分子或颗粒通过其化学性质提供允许检测抗原结合的抗体的经分析可鉴别的信号。如所公认的,可以使用大量不同的报告系统并且允许快速的可视检测的那些报告系统显然在即席检验诊断的环境中是最有用的。
在一些实施方案中,检测标记为胶体颗粒或微粒。胶体金属和类金属颗粒包括包含金,银,铂,铁,铜,硒的那些颗粒;金属复合物(例如三羰基环戊二烯锰(I)(cyclopentadienylmanganese(I)tricarbonyl),金簇(gold cluster));和微粒(例如乳胶和染色的乳胶颗粒)。
本发明扩展到在该类型的免疫测定中使用任何常用的报告分子,例如酶,荧光团或包含放射性核素的分子和化学发光分子进行定性或定量检测。在酶免疫测定的情况下,酶通常通过戊二醛或高碘酸与第二抗体缀合。常用的酶包括辣根过氧化物酶,葡萄糖氧化酶,β半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。与特异性酶一起使用的底物通常就可检测的颜色变化的产生(基于由相应的酶进行的水解)进行选择。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可以使用荧光底物,其产生荧光产物而非上述生色底物。在所有情况下,将酶标记的抗体添加到第一抗体抗原复合物,允许它们结合,并且清洗掉过量的试剂。然后,将包含合适的底物的溶液添加到抗体-抗原抗体复合物。底物将与连接至第二抗体的酶反应,产生定性的可视信号,其可以进一步定量(通常利用分光光度法定量)以提供存在于样品中的抗原的数量的指示。可选地,将荧光化合物,例如荧光素和罗丹明化学偶联至抗体而不改变它们的结合能力。当通过照射特定波长的光进行激活时,荧光染料标记的抗体吸收光能诱导分子的可激发的状态,接着发出用显微镜视觉可检测的具有特征性波长的光。
涉及的“抗体”包括人源化的,重组的,合成的,杂合的和单链抗体。抗体可以方便地进行制备和使用,如例如在Harlow和Lane,″Antibodies:A Laboratory Manual″(Cold Spring HarborLaboratory,1988)中所述。单克隆抗体可以方便地以纯化形式大量制备。用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞系通过融合敏化的淋巴细胞和永生细胞系并且选择特异性抗体产生细胞来制备,该制备如Harlow和Lane(同上);以及Kohler和Milstein,European Journal ofImmunology,6:511-519,1976中所述,其在该领域中是常规的。
用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的(Kang等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:4363,1991;Clackson等人,Nature,352:624,1991;Lowman等人,Biochemistry,30:10832,1991;Burton等人,Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.,88:10134,1991;Hoogenboom等人,Nucleic Acids Res.,19:4133,1991,以其全文通过引用并入本文)。一个特别有利的方法使用scFv噬菌体文库(Huston等人.,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879-5883,1988;Chaudhary等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:1066-1070,1990;Clackson等人,1991,(同上))。展示在噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的各种实施方案已经被描述。其他的噬菌体展示方法也是已知的,例如,如国际公开号WO 96/06213和WO 92/01047(Medical Research Council等人)和国际公开号WO97/08320(Morphosys)中所述,其通过引用并入本文。
可以克隆并在例如酵母的表面上表达抗体单链Fv片段。通过筛选和分选来选择高亲和力的scFv。使用链替换策略开发高亲和力抗体,即通过用来自未免疫供体的全套(repertoire)v-基因顺序取代重链和轻链可变(v)区基因。可以使用来自任何物种的包含csFv的抗体。
展示系统特别有用,其使得能够将核酸连接至它表达的多肽。用于从大文库分离期望的成员的选择方案是本领域已知的,如由噬菌体展示技术所代表的。此类系统(其中不同的肽序列展示在丝状噬菌体的表面上)用于产生抗体片段(和编码它们的核苷酸序列)的文库,所述文库用于体外选择和扩增与靶抗原结合的特异性抗体片段。编码VH和VL区的核苷酸序列与这样的基因片段连接,所述的基因片段编码将它们导向大肠杆菌(E.coli)的周质空间的前导信号从而所得的抗体片段展示在噬菌体的表面上(通常与噬菌体外壳蛋白(例如pIII或pVIII)融合)。可选地,抗体片段外向地展示在λ噬菌体衣壳(噬菌体)上。基于噬菌体的展示系统的优点在于所选择的文库成员可以通过在细菌细胞中培养包含所选择的文库成员的噬菌体容易地进行扩增。此外,由于编码多肽文库成员的核苷酸序列包含在噬菌体或噬菌粒载体上,因此,测序,表达和后续的遗传操作相对容易。
本发明进一步通过下列非限制性实施例进行描述。
实施例1
抗CD4的细胞质或细胞外结构域的多克隆和单克隆抗体
在绵羊中产生抗两种人CD4胞外结构域亚序列P1和P2(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的抗CD4多克隆抗体。肽序列和肽在细胞质CD4序列中的位置在图2中展示。使用标准方法,用P1和P2注射两只绵羊,G-6和G-7。使用固定的生物素化的肽通过ELISA确定并使用与辣根过氧化物酶缀合的链霉亲合素检测抗CD4cyto的多克隆抗体的特异性和滴度。结果在图3(A)绵羊G-6和(B)绵羊G-7中进行图示。来自任一绵羊的血清同等良好地识别肽1和肽2(见图4)。还产生抗肽2的单克隆抗体并且通过ELISA测试其抗CD4cyto的肽2(见图5)。
在免疫荧光测定中,在HeLa细胞和JC53 T细胞上测试单克隆抗体1D2和4B4的反应性。两种单克隆抗体(10微克每微升)都没有表现出对HeLa细胞的反应性。然而,抗体识别固定的T细胞上的细胞内组分。识别CD4的胞外结构域的SIM2单克隆抗体不识别HeLa细胞但在10微克每微升的浓度下表现出与JC53细胞的表面结合。如所预期的,单克隆抗体1D2和4B4不能结合新鲜的CD4阳性T细胞(图6)。相反,单克隆抗体1D2和4B4都检测透化的(permeablised)细胞(见图7C和D)。
可以从不同物种产生抗CD4分子的抗体或抗原结合片段。在举例说明性的实例中来自小鼠,兔,鸡,绵羊的细胞质结构域的序列提供如下。
人 CD4:421rcrhrrrqae rmsqikrlls ekktcqcphr fqktcspi458
加框的残基突出人CD4和其他物种CD4之间的区别。
Key:人&小鼠(~79%的保守序列30/38)
人&兔(~76%的保守序列29/38)
人&鸡(~55%的保守序列18/33)
人&绵羊(~84%的保守序列32/38)
NB.
序列“ekktcqc”为推定的p56lck结合位点,在所有物种中保守。
实施例2
CD4 ELISA
开发CD4捕获ELISA以允许定量细胞结合CD4而不受缺失细胞质结构域的可溶CD4的干扰。抗CD4细胞质结构域的抗体用作“捕获”抗体,其与作为“检测”抗体的抗CD4细胞外结构域的抗体结合使用。只测量细胞结合CD4而排除缺失细胞质结构域的可溶CD4或被抗CD4cyto的抗体识别的表位。CD4捕获ELISA表现出与流式细胞术紧密关联并且适于提供如本文所示的快速即席检验诊断测试。
图9展示测量抗CD4细胞质结构域的单克隆抗体,包括商业可获得的抗CD4单克隆抗体(Chemicon)的反应性的ELISA的结果。产生抗如图2中所示的肽1(SEQ ID NO:1)和肽2(SEQ ID NO:2)抗体。
图10展示测量抗CD4细胞质结构域的单克隆抗体1D2的特异性和从JC53细胞裂解物捕获CD4的能力的捕获ELISA的结果和用抗CD4胞外结构域的单克隆抗体(PRAT4)检测的结果。
图11展示测量抗CD4的细胞质结构域的单克隆抗体1D2的特异性和从JC53细胞裂解物捕获CD4的能力的捕获ELISA的结果和用抗CD4的胞外结构域的多克隆抗体检测的结果。
图12展示来自供体外周血单核细胞(PBMC)的细胞CD4的捕获ELISA的结果。A)展示由单克隆抗体4B4从供体1至6捕获的PBMC裂解物的滴定。B)展示富含细胞CD4的淋巴细胞的捕获。
在举例说明性实施方案(ELISA方案)中,标准量的包含细胞质和细胞外结构域的CD4在PBS+0.5%Tween20中稀释用作对照。将全血或稀释的血液添加到等体积的包含10%Triton-X100裂解缓冲液的裂解缓冲液中并且分配到用抗CD4cyto抗体包被的标准ELISA板的指定孔中。密封ELISA板并且在室温(18至23℃)下温育60分钟。抗CD4胞外结构域的生物素化的抗CD4单克隆抗体在0.05%Tween20中进行稀释以得到0.25微克每微升的终浓度。用标准ELISA清洗缓冲液清洗ELISA板并且排干然后往各个孔添加稀释的抗CD4生物素化单克隆抗体100微升。密封平板并且在室温下温育60分钟。之后,用ELISA清洗缓冲液清洗平板(6次)并且排干。链霉亲合素-辣根过氧化物酶缀合物以1∶1000稀释于PBS 0.05% Tween20中并且往各个孔添加100微升。密封ELISA板并且在室温下温育60分钟。之后,在根据厂商说明书添加稀释于底物缓冲液中的酶生色(chromogene)底物四甲基联苯胺(tetramethylbenzldine)(TMB)之前,清洗平板并且排干。允许酶反应在黑暗中在室温下进行大约15分钟并且在底物温育结束时,向各个孔添加100微升原液(stock solution),之后使用具有450毫米滤光器和620毫米滤光器的双λELISA酶标仪(ELISA reader)读取平板的光密度作为参考。计算平均标准偏差和%CV并且使用散点图产生平均OD读数(reading)。
实施例3
捕获ELISA测定展示OD和CD4+T细胞的数目之间的关联
进行来自供体外周血单核细胞(PBMC)的细胞CD4的ELISA并且结果示于图13和图14中。来自三个供体的结果示于图13上并且展示OD450-620和每微升CD4+T细胞数目之间的关联。来自5个单独的HIV感染患者的临床样品的结果示于图14中并且证明OD450-620和每微升全血的CD4+T细胞的数目之间的正关联。
实施例4
根据本发明的使用抗CSAP的细胞质结构域的抗体的免疫层析装置
免疫层析或免疫成像装置提供了在由全世界很多不同公司生产的大量的快速的即席检验诊断测试中使用的有力的技术。其在生产能力上过剩并且在目标国家中使该技术容易被接受。已经使用免疫层析装置作为测试平台以测量作为CD4T细胞数目的关联物的细胞结合CD4。在这些测定中可溶CD4(包含细胞外结构域而不包含细胞质结构域(存在于血液中))被排除。另外,在一些实施方案中,在主题测定中排除在单核细胞上表达的CD4。在一些实施方案中,通过与各个试纸条中的标准进行视觉比较,免疫层析装置提供了CD4 T细胞数目的定量评估(小于250,大于250,250至350,350至500,250至500和大于500个细胞每微升)。这满足了目前用于成年患者开始使用抗逆转录病毒药物的标准。具有检测适当的细胞数目的适当的方法的其他的测试用相同的方法进行制备,其用于监测儿科HIV患者,所述的儿科HIV患者具有平均较高的CD4 T细胞数(即小于500,500至1000和1000至2000个细胞每微升)。
因此,在图15中示意性描述用于检测全长细胞结合CD4和评估CD4+细胞数目的免疫层析装置。通过划出由抗人CD4的细胞质结构域的单克隆抗体组成的测试线,由抗小鼠IgG组成的对照线(或其他对照),和在测定进行期间提供指导的惰性限制线(inert limit line)来制备多孔膜(例如硝酸纤维素)。将硝酸纤维素与下列装配在一起:在一端的“样品垫”(样品部分),所述的样品垫由多孔材料组成,对其应用指定量的血液并且可以对其添加试剂以捕捉样品中的红细胞或单核细胞和其他外来物质,包含裂解缓冲液的第二样品垫(裂解部分),和在另一端的“缀合垫”(缀合部分),其由多孔材料组成,对其应用由与抗CD4抗体缀合的检测试剂组成的缀合物(检测标记),和吸收材料(吸取部分)。
在一些实施方案中,裂解步骤在某些情况下是任选的,例如当使用能够穿透细胞的抗体或其它试剂时或当受试者患病并且无论如何,大部分特定细胞类型允许抗CSAP的试剂渗透通过时。
实施例5
全长CD4和缺失跨膜结构域的重组可溶全长CD4(TM^CD4)的克隆和表达
要求CD4的ELISA和快速即席检验测试定量或半定量测量存在于样品中的细胞结合的和/或可溶/细胞外CD4的总量,提供CD4T细胞的数目的评估。为此,具有明确来源的CD4是有用的,其可以用于质量控制并且用作测定标准。人T细胞或用全长人CD4转化的细胞可以用作CD4的来源,但是其产量可能不一致并且需要大量纯化膜结合CD4分子。本发明人推断,以可溶形式从细胞中释放同时保留对于CD4捕获ELISA中的反应性来说是必需的细胞质结构域的重组形式的CD4将更适用于该目的。本领域已知蛋白质跨膜结构域的缺失可以导致融合的细胞外结构域-细胞质结构域蛋白的分泌。因此,制备缺失跨膜结构域的CD4变体,将其称为TM^CD4。该蛋白的示意性结构示于图1中。
CD4序列获得自T4pmV7质粒,该质粒获得自NIH AIDS researchand reference program Cat No 158。为了制备CD4的可溶TM^CD4形式,设计引物以便它们产生两个单独的PCR产物。第一产物使用引物RL1和RL3,产生1.2kb的条带,其在细胞外结构域的5’末端具有EcoR 1限制性位点并且在3’末端具有相应于细胞质尾的一些重叠序列。第二PCR产物使用引物RL2和RL4,产生120bp的条带,其在细胞质尾的5’末端具有一些重叠的细胞外结构域序列并且在3’末端具有Xba1限制性位点。为了制备最终的PCR产物,将两种PCR产物用作第三次PCR反应的模板并且使用RL1和RL2引物。使用引物RL1和RL2与质粒T4pmV7一起在标准PCR反应中产生全长CD4构建体。
引物:
RL1 5’CGG GAA TTC ACA ATG AAC CGG GGA GTC CC(有义)SEQ ID NO:3
RL2 5’GGC TCT AGA TCA AAT GGG GCT ACA TGT CTT C(反义) SEQ
ID NO:4
RL3 5’G CCT TCG GTG CCG GCA CCT CTG CAC CGG GGT GGA CC(反义)
SEQ ID NO:5
RL4 5’GG TCC ACC CCG GTG CAG AGG TGC CGG CAC CGA AGG C(有义)
SEQ ID NO:6
引物RL1中的限制性位点EcoR1和引物RL2中的限制性位点Xba1为以粗体和下划线突出。在引物RL3和RL4中的细胞外区域以粗体和斜体突出并且细胞质尾为正常字体。
将全长CD4构建体(FLCD4)和具有细胞质结构域而不具有TM区域的可溶CD4构建体(CD4^TM)克隆到pcDNA4/HisMax version C(Invitrogen)的EcoR1和Xba1限制性位点之间。
通过限制性消化和测序鉴别克隆。TM^CD4的插入物和编码的蛋白的完整的核苷酸序列和氨基酸序列分别示于图16(SEQ ID NO:7)和图17中(SEQ ID NO:8)。所详述的序列的变体是预期的,例如得自不同的天然存在的序列或得自1个或多达20个核苷酸修饰或氨基酸修饰的那些变体。在一些实施方案中优选导致保守氨基酸改变的修饰并且这些如在表2和3中所列出。
实施例6
TM^CD4在CD4捕获ELISA和Western免疫印迹中的检测
通过ELISA和Western免疫印迹检测重组TM^CD4(参见图18)。通过各自的pcDNA4/HisMax构建体的转染或模拟转染在293 T细胞中表达全长CD4或TM^CD4,并且使用所描述的方法,通过CD4 ELISA测试细胞裂解物和细胞上清液。结果(参见图18A)表明全长CD4在细胞中有效表达但是没有释放到上清液中,而TM^CD4在细胞中有效表达并且大部分重组蛋白释放到上清液中,允许容易地纯化(如果需要)。用抗CD4的细胞质结构域的定制的MAb 4B4(3μg/ml)通过Western免疫印迹检测培养上清液中的TM^CD4(参见图18B)。
实施例7
在ELISA和快速即席检验测定中作为对照试剂的TM^CD4
连续稀释来自用TM^CD4质粒稳定转染的HEK293细胞的上清液(以1∶5开始稀释)以用于ELISA测定(A)(参见图19),在ELISA中显示出线性反应,证明TM^CD4可作为对照试剂用于在CD4 ELISA测定中评估总的CD4 T细胞数目。例如,在相同的测定中测试四个不同的全血样品(样品IDS72,51,40,49),并且使用所示的回归曲线(红色)或其他方法可以评估与标准相比较的CD4的相对量。为了能够将CD4的量转换为每微升的CD4 T细胞的数目,通过流式细胞术和ELISA多次测试全血的参比样品,并与TM^CD4标准相比较,从而允许确定正确的转换因子(数据未显示)。如图19B中所示,通过免疫层析快速即席检验测定,检测来自两个不同的稳定的HEK293-TM^CD4细胞系克隆(H5和F5)的上清液,表明TM^CD4还可以在此类测定中用作阳性对照试剂或标准。在一些实施方案中,TM^CD4用作抗原用于制备Ab。
实施例8
在CD4T细胞数的评估中使用TM^CD4作为标准的CD4捕获ELISA和流式细胞术之间的强关联
使用重组TM^CD4作为CD4 ELISA的内在测定对照,并且使用基于通过流式细胞术和ELISA平行测定参比样品而确定的转换因子,对于评估的CD4 T细胞数目来说,使用CD4 ELISA与使用CD4流式细胞术相比获得非常紧密的关联。如图20中所示,当大于或小于250个T细胞每微升时,如加框区域中所示,所有的样品都被正确鉴别。在该测定中,在通过ELISA测定全血的CD4 T细胞之前,用CD14磁珠(Dynabeads CD14(Dynal Biotech Cat No 111.49))除去全血中的单核细胞。不除去单核细胞通常也可以获得精确的数目。
实施例9
在快速即席检验测定中CD4(TM^CD4)的量和信号强度之间的关联
使用重组TM^CD4,与测定中的TM^CD4的量相比,在快速形式中,针对信号强度可以看到明显的剂量-反应曲线(参见图21)。这证明TM^CD4可作为对照试剂用于CD4测定的ELISA和快速即席检验形式的制备,测试和质量控制。本实施例还证明在测试的快速形式中,Chemicon 3706抗细胞质结构域Mab和定制的4B4抗细胞质结构域Mab可以独立地或作为混合物用于捕获cyto CD4。此外,这证明快速形式中信号强度与样品中的细胞结合CD4的量成比例,允许快速即席检验形式用于CD4 T细胞数目的定量或半定量评估。
实施例10
在快速即席检验测定中CD4T细胞的数目和信号强度之间的关联
实际测试快速即席检验测试形式的结果,以所示的每微升的细胞数目使用纯化的T细胞(在测试线反应)(见图22A)。通过用与抗生物素金缀合物直接反应的生物素化的单克隆抗体划条带,制备与500个T细胞/微升和250个T细胞/微升等价的对照线。可观察到(参见图22B)视觉区别允许样品中的CD4T细胞的水平被正确地鉴别为大于或小于250个细胞每微升或大于或小于500个细胞每微升。在Millipore HFP90硝酸纤维素膜上用Chemicon MAb 3706(测试线捕获)以0.5mg/ml划条带进行测试;样品:1%Tx100/PBS中的50μL CD4+ve T细胞;检测:13B8.2-生物素/抗生物素金。显然,任何反应性蛋白可以用作对照线,例如但不限于TM^CD4蛋白,或生物素化的蛋白或抗体或与选择的检测系统反应的其他分子。还显然的是,可以调整对照线和其他测定参数以允许检测任何期望的每微升的细胞水平,例如可用于监测儿科样品的较高的水平(大约2000个细胞每微升或者甚至更高)。
实施例11
全血中CD4 T细胞的快速即席检验测定检测
图23A提供全血CD4快速即席检验测定的一个实施方案的图示。使用本领域公知的方法通过RBC保留垫中的抗血型糖蛋白A(Epiclonanti-N with 0.1% azard Cat No 00992311(HM1)Commonwealth SerumLaboratories(CSL))捕获红细胞,而血浆和白细胞(包括CD4T细胞)流入去污剂浸渍的裂解垫,其中细胞被裂解并释放CD4,其然后流入试纸条以与抗CD4Cyto Mab反应,随后用生物素抗CD4胞外Mab和抗生物素胶体金检测(见图23)。(B)在如A中所示的全血测定中测试包含高CD4 T细胞水平(通过流式细胞术确定为1452/μl)的全血的样品,如通常在裂解垫中具有去污剂(“+TX”),或从裂解垫除去去污剂(“-TX”)。在一些实施方案中,当存在去污剂例如Triton-X100以裂解垫中的T细胞时,仅在快速测试中见到CD4信号(参见图23)。这取决于抗CD4结合试剂的性质并且可以透过细胞膜的试剂与可以透过细胞膜的检验试剂一起不需要细胞裂解。(C)在CD4快速即席检验测定中测定的代表性全血样品的实例。展示通过流式细胞术确定的各个样品的CD4的数量,并且在这一全血形式中可见高CD4T细胞数给出较强的信号而低CD4T细胞数给出弱的信号。
实施例12
除去特定细胞群(单核细胞)以防止在快速即席检验测定中检测它们
单核细胞也包含CD4,在CD4 T细胞中发现其为大约10%的量,并且在基于CD4蛋白的测定中单核细胞的存在在一些情况下由于单核细胞CD4的影响可导致对CD4 T细胞的错误评估。在ELISA形式的测定中,可如上所述在测定前通过在本领域公知的方法中使用为此目的而设计的抗CD14磁珠和强磁体,从全血中除去单核细胞。该方法还可以用于即席检验测定前的全血的预处理,但是为了即席检验测试,要求优选避免样品的加工和处理。还没有被描述过这样的方法,该方法使用与快速即席检验测定中的内容相容的方法除尽特定白细胞类型或其他细胞类型。本发明人已设计出用于有效除去快速即席检验测试的样品垫中的单核细胞的方法。
该方法利用令人惊讶的观察结果,即通过在薄样品垫中进行磁性分离(通过在样品垫上或下放置磁体),使用弱得多的磁场(廉价的“冰箱磁体(fridge magnet)”)足以使已经与磁珠反应的细胞保留,而无须使用昂贵的强磁体(当在样品管中进行保留时,其在本领域广泛使用)。这将允许,例如在用于各个单独的测定的廉价的,一次性使用的装置中,或在用于进行多次测定的廉价的多次使用的装置或壳(housing)中包含合适的磁体。在一些实施方案中,磁体具有小于约5mm的磁场以便磁场扩展通过免疫层析装置的样品垫但是不通过,例如在1cm或更大直径的试管或容器中的所有细胞悬浮液。合适的磁体的一个实例为铁磁体,其在不存在磁场时保持磁化。在图24中,分别用红外荧光染料标记纯化的单核细胞和纯化的外周血淋巴细胞(PBL,除尽单核细胞)-单核细胞用绿色(Mini CellVue NIR815,PTIResearch,Inc),PBL用红色(Mini CellVue Burgundy,PTI ResearchInc.)。图像展示在Licor Odyssey红外荧光扫描仪上经不同滤光器观察到的相同样品垫:(A)=组合滤光器,(B)=Em800,(C)=Em700。磁体使其中使用它的样品垫的扫描变暗。将1.5×104个单核细胞(与磁珠结合)和2×104个除尽单核细胞的PBL组合并点样到不具有(左)或具有(右)磁体的抗血型糖蛋白A包被的样品垫上。用60ul PBS冲洗样品以允许样品流入吸收垫(此处用于代替实际的裂解垫和硝酸纤维素试纸条,用于举例说明性目的)。在存在磁体的情况下在图(A)和(B)中可以看到保留>80%的单核细胞(绿色),而没有绿色细胞进入吸收垫,同时在存在或不存在磁体的(A)和(C)中证明除尽了单核细胞的PBL流入吸收垫。(D)展示如(A)-(C)中所示的测试的示意图。对本领域技术人员明显的是,在裂解或测定期望的细胞之前,类似的方法可用于在滤器或样品垫形式中选择性保留或富集任何细胞群。
本领域技术人员将认识到本文描述的发明容许除了那些特别描述的变化和改进以外的变化和改进。应理解本发明包括所有此类变化和改进。本发明还包括在本说明书中单独地或共同地涉及或指出的所有步骤,特征,组合物和化合物,以及任意两个或多个所述的步骤或特征的任意的和所有的组合。
表1
序列标识符的总结
SEQUENCE ID NO: | 描述 |
1 | 人CD4细胞质结构域的肽1 |
2 | 人CD4细胞质结构域的肽2 |
3 | 用于产生编码TM^CD4的构建体的引物1 |
4 | 用于产生编码TM^CD4的构建体的引物2 |
5 | 用于产生编码TM^CD4的构建体的引物3 |
6 | 用于产生编码TM^CD4的构建体的引物4 |
7 | 编码TM^CD4的核苷酸序列 |
8 | TM^CD4的氨基酸序列 |
表2
氨基酸的亚分类
亚类 | 氨基酸 |
酸性碱性带电荷的小的极性的/中性的极性的/大的疏水的芳香族的影响链取向的残基 | 天冬氨酸,谷氨酸无环的:精氨酸,赖氨酸;环状的:组氨酸天冬氨酸,谷氨酸,精氨酸,赖氨酸,组氨酸甘氨酸,丝氨酸,丙氨酸,苏氨酸,脯氨酸天冬酰胺,组氨酸,谷氨酰胺,半胱氨酸,丝氨酸,苏氨酸天冬酰胺,谷氨酰胺酪氨酸,缬氨酸,异亮氨酸,亮氨酸,甲硫氨酸,苯丙氨酸,色氨酸色氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸甘氨酸和脯氨酸 |
表3
示例性的和优选的氨基酸取代
原始残基AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheProSerThrTrpTyrVal | 示例性取代Val,Leu,IleLys,Gln,AsnGln,His,Lys,ArgGluSerAsn,His,Lys,Asp,LysProAsn,Gln,Lys,ArgLeu,Val,Met,Ala,Phe,NorleuNorleu,Ile,Val,Met,Ala,PheArg,Gln,AsnLeu,Ile,PheLeu,Val,Ile,AlaGlyThrSerTyrTrp,Phe,Thr,SerIle,Leu,Met,Phe,Ala,Norleu | 优选的取代ValLysGlnGluSerAsnAspProArgLeuIleArgLeuLeuGlyThrSerTyrPheLeu |
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Claims (36)
1.与CD4的细胞质结构域特异性结合的CD4结合抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于评估来自受试者的血液样品中具有CD4的T细胞的数目,所述评估包括:
(i)将样品与能够裂解或透化具有CD4的细胞的试剂接触;
(ii)将样品与CD4结合抗体或其抗原结合片段接触,所述的CD4结合抗体或其抗原结合片段与CD4的细胞质结构域结合,并形成CD4-抗体复合物;和
(iii)直接或间接地检测和评估步骤(ii)中形成的CD4-抗体复合物的水平或存在;并且
其中步骤(ii)中形成的CD4-抗体复合物的水平或存在指示受试者中具有CD4的细胞的数目,其中所述抗体或其抗原结合片段在步骤(ii)中不检测缺失细胞质结构域的可溶的CD4,并且由此区别包含细胞质结构域的细胞结合的CD4和缺失细胞质结构域的可溶的CD4。
2.权利要求1的用途,其中步骤(iii)包括将CD4-抗体复合物与第二抗体或其抗原结合片段接触,所述的第二抗体或其抗原结合片段与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三结合伴侣结合,并且检测所述检测标记。
3.权利要求1或2的用途,其中所述评估为酶联免疫吸附测定(ELISA)类型,流式细胞术或层析法。
4.权利要求3的用途,其中所述评估为ELI SA类型或层析法,并且与CD4的细胞质结构域特异性结合的抗体或其抗原结合片段固定于固体支持物上。
5.权利要求1的用途,其中在步骤(ii)中,通过下述将样品与所述CD4结合抗体或其抗原结合片段接触:将样品用于免疫层析装置的样品部分,其中所述样品部分可操作地与所述装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向并流经捕获部分,所述的捕获部分包含与CD4的细胞质结构域特异性结合的抗体或其抗原结合片段,以便只有包含细胞质结构域的CD4,而非不包含细胞质结构域的可溶的CD4,与所述抗体或其片段结合从而形成CD4-抗体复合物;并且其中在步骤(iii)中,通过下述来评估CD4-抗体复合物的水平或存在:将所述装置的捕获部分与第二结合抗体或其抗原结合片段接触,所述的第二结合抗体或其抗原结合片段与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合。
6.权利要求1或5的用途,其中将CD4-抗体复合物的水平或存在与预先确定的对照进行比较,其中所述预先确定的对照为预先确定量的对照,当与可视检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的CD4细胞产生的信号等价的可视内标。
7.权利要求6的用途,其中对照为至少包含细胞质结构域的CD4多肽。
8.权利要求1的用途,其中血液为全血或经稀释的全血或血液衍生物。
9.权利要求1的用途,其中通过将样品与结合至固体支持物的单核细胞特异性试剂接触来除尽血液样品中的单核细胞。
10.权利要求9的用途,其中所述单核细胞特异性试剂为抗CD14抗体。
11.权利要求1的用途,其进一步包括通过将样品与结合至固体支持物的红细胞捕获试剂接触来除尽样品中的红细胞。
12.权利要求11的用途,其中所述红细胞捕获试剂为抗血型糖蛋白抗体。
13.一种用于检测或监测来自受试者的血液样品中具有CD4的T细胞的数目的试剂盒,其中该试剂盒包括:
(i)层析装置,其包括与样品部分可操作地连接的多孔膜,测试部分,缀合部分,吸取部分,任选地对照部分和任选地裂解部分;
(ii)与CD4的细胞质结构域结合的CD4结合抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段固定于一个或多个测试部分和/或包含于缀合部分内;
(iii)对照部分,所述的对照部分包含预先确定量的对照,当与可视检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的细胞产生的信号等价的内标;
(iv)使用所述装置以检测或监测样品或受试者中具有CD4的细胞的水平或存在的说明书。
14.用于检测或监测来自受试者的血液样品中具有CD4的T细胞的数目的试剂盒,其中该试剂盒包括:
(i)层析装置,其包括与样品部分可操作地连接的多孔膜,测试部分,缀合部分,吸取部分,任选地对照部分和任选地裂解部分;
(ii)与CD4的细胞质结构域结合的CD4结合抗体或其抗原结合片段,其中所述抗体或其抗原结合片段固定于一个或多个测试部分和/或包含于缀合部分内;
(iii)对照部分,所述的对照部分包含预先确定量的至少含有细胞质结构域的对照CD4多肽并且当与可视检测标记结合时,其足以产生信号,提供预先确定数目的CD4细胞的可视标准;
(iv)使用所述装置以检测或监测样品或受试者中CD4细胞的水平或存在的说明书。
15.权利要求13或14的试剂盒,其中所述试剂盒使用反向或侧向流动免疫层析。
16.权利要求13或14的试剂盒,其中缀合部分包含可视检测标记。
17.权利要求14的试剂盒,其中所述CD4多肽为缺失跨膜结构域的重组CD4。
18.权利要求13或14的试剂盒,其中样品垫包含红细胞捕获试剂。
19.权利要求18的试剂盒,其中所述红细胞捕获试剂是抗血型糖蛋白A抗体。
20.权利要求13或14的试剂盒,其中样品垫包含单核细胞特异性试剂。
21.权利要求20的试剂盒,其中所述单核细胞特异性试剂为抗CD14磁珠。
22.权利要求13或14的试剂盒,其进一步包括磁体。
23.权利要求22的试剂盒,其中磁体连接到样品垫或能够与样品垫接触的免疫层析装置的部分。
24.缺失跨膜结构域的重组CD4在制备用于定量来自受试者的样品中的CD4T细胞的数目的固体支持物或试剂盒中的用途。
25.一种用于评估来自受试者的血液样品中CD4T细胞的水平或存在的非诊断目的的方法,该方法包括:
(i)将样品与能够裂解或透化具有CD4的细胞的试剂接触;
(ii)将样品与CD4结合抗体或其抗原结合片段接触,所述的CD4结合抗体或其抗原结合片段与CD4的细胞质结构域特异性结合,并形成CD4-抗体复合物;和
(iii)直接或间接地检测和评估步骤(ii)中形成的CD4-抗体复合物的水平或存在;
其中步骤(ii)中形成的包含CD4细胞质结构域的CD4-抗体复合物的水平或存在指示受试者中具有CD4的细胞的数目,其中所述抗体或其抗原结合片段在步骤(ii)中不检测缺失细胞质结构域的可溶的CD4,并且由此区别包含细胞质结构域的细胞结合的CD4和缺失细胞质结构域的可溶的CD4。
26.权利要求25的方法,其中步骤(iii)包括将CD4-抗体复合物与第二抗体或其抗原结合片段接触,所述的第二抗体或其抗原结合片段与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三结合伴侣结合,并且检测所述检测标记。
27.权利要求25或26的方法,其中所述方法为酶联免疫吸附测定(ELISA)类型,流式细胞术或层析法。
28.权利要求27的方法,其中所述方法为ELISA或层析法,并且与CD4的细胞质结构域特异性结合的CD4结合抗体或其抗原结合片段固定于固体支持物上。
29.一种用于评估来自受试者的血液样品中CD4T细胞的水平或存在的非诊断目的的方法,该方法包括:a)将测试样品用于免疫层析装置的样品部分,其中所述样品部分可操作地与所述装置的捕获部分连接并且其中测试样品的组分从样品部分流向并流经捕获部分,所述的捕获部分包含与CD4的细胞质结构域特异性结合的抗体或其抗原结合片段,以便只有包含细胞质结构域的CD4,而非不包含细胞质结构域的可溶的CD4,与所述抗体或其片段结合从而形成CD4-抗体复合物;b)通过下述来评估CD4-抗体复合物的水平或存在:将所述装置的捕获部分与第二结合抗体或其抗原结合片段接触,所述的第二结合抗体或其抗原结合片段与CD4结合,包括与细胞质或细胞外结构域结合并且其包含检测标记或其能够与包含检测标记的第三或随后的结合伴侣结合;评估所述检测标记的存在,其中至少包含细胞质结构域的结合的CD4的水平或存在指示受试者中具有CD4的细胞的数目,其中所述方法不检测缺失细胞质结构域的可溶的CD4,并且由此区别包含细胞质结构域的细胞结合的CD4和缺失细胞质结构域的可溶的CD4。
30.权利要求29的方法,其中将CD4-抗体复合物的水平或存在与预先确定的对照进行比较,其中所述预先确定的对照为预先确定量的对照,当与可视检测标记结合时,其足以产生信号,提供与由预先确定数目的CD4细胞产生的信号等价的可视内标。
31.权利要求30的方法,其中对照为至少包含细胞质结构域的CD4多肽。
32.权利要求25或29的方法,其中血液为全血或经稀释的全血或血液衍生物。
33.权利要求25或29的方法,其还包括通过将样品与结合至固体支持物的单核细胞特异性试剂接触来除尽样品中的单核细胞。
34.权利要求33的方法,其中所述单核细胞特异性试剂为抗CD14抗体。
35.权利要求25或29的方法,其还包括通过将样品与结合至固体支持物的红细胞捕获试剂接触来除尽样品中的红细胞。
36.权利要求35的方法,其中所述红细胞捕获试剂为抗血型糖蛋白抗体。
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