CN104330554A - 一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法 - Google Patents

一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法，该方法采用免疫磁性纳米颗粒制备免疫层析试纸，检测时，采用过氧化物酶底物显色反应进行结果判定。利用所述免疫层析试纸的检测方法准确可靠，灵敏度大大提高，比一般胶体金检测试纸灵敏度高10-100倍，操作简单，不需要检测仪器，通过肉眼即可得到检测结果。

Description

一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种免疫层析试剂的非诊断性检测方法。
背景技术
目前，快速检测的技术有很多，但是能够在很短时间内就可判断结果的技术却很少，其中，免疫层析技术是一种独特的免疫分析方式，该方法的核心技术是以条状纤维层析材料为固相，通过毛细管作用使样品溶液在层析材料上泳动，并同时使样品中经标记物标记的待测物与包被在层析材料上针对待测物的受体(如抗原或抗体)发生特异性结合而聚集显色。它既有免疫学方法的特异性，又有简便快速不需仪器的特点。
现有技术中的免疫层析试纸检测方法大多采用胶体金标记方法，但胶体金连接了待标记抗体或待标记蛋白之后，很不稳定，很容易因电荷的变化使得抗体脱离，造成每个胶体金的标记抗体量大大减少，从而造成灵敏度的降低；并且胶体金试剂的制备采用氯金酸，试剂成本比较高，导致免疫层析试纸的总体成本比较高。
目前也有采用免疫磁珠进行免疫层析试纸的检测，其原理是利用免疫磁珠的磁性，通过检测磁场信号进行结果的判断，其缺点是必须通过检测仪器进行结果判断，通过检测仪器将磁场信号的生物学信号进一步以电信号方式输出，判断结果，如果没有磁性检测仪，检测结果得不到保证。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法，该方法具有免疫层析试纸和酶联免疫级联放大的两者的优点，既实现快速检测的目的，又有效地提高检测灵敏度，且检测方法操作方便简单，获得检测结果快速，也不需要仪器进行结果的判定；而且试剂成本低。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、通过将标记后的Fe3O4磁性纳米颗粒喷涂于玻璃纤维膜上，制备免疫磁性纳米颗粒结合垫；
(2)、制备包被有检测线和质控线的包被膜；
(3)、处理样品垫；
(4)、组装试纸条：将所述步骤(3)处理后的样品垫、所述步骤(1)制备的免疫磁性纳米颗粒结合垫、所述步骤(2)制备好的包被膜和吸水垫依次贴在底衬卡上，得到免疫层析试纸；
(5)、样品检测：将待检样本加入到步骤(4)中所述免疫层析试纸的样品垫，再将过氧化物酶底物滴加于样品垫，进行结果的判定。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(1)包括：用与待检项目相结合的抗原或抗体标记Fe3O4磁性纳米颗粒，将标记后的磁性纳米颗粒喷涂于玻璃纤维膜上，制备成免疫磁性纳米颗粒结合垫。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(1)中在待检项目相结合的抗原或抗体标记Fe3O4磁性纳米颗粒之前，所述Fe3O4磁性纳米颗粒进行羧基化修饰。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，步骤(2)中，所述检测带包被有与待检项目结合的抗体或抗原，所述质控带包被有与上述磁性纳米颗粒标记的抗原或抗体特异性结合的反应物。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(3)处理样品垫具体为：将含有体积比为0.5％～2％吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述步骤(2)中包被膜为硝酸纤维素膜，所述步骤(3)中样品垫为玻璃纤维膜，所述步骤(4)中吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述过氧化物酶底物为邻苯二胺体系、四甲基联苯胺体系、3.3－二氨基联苯胺体系或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸体系中的任一种。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述四甲基联苯胺体系包括：四甲基联苯胺和过氧化氢，所述四甲基联苯胺的质量浓度为0.01mg/ml～10mg/ml，所述过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述四甲基联苯胺体系配制方法如下：a)先将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，再将加入蒸馏水定容，获得A液；
b)先配制质量浓度为0.5％～30％的过氧化氢尿素溶液，之后称取柠檬酸、磷酸氢二纳，加入过所述氧化氢尿素溶液，用蒸馏水定容，所述柠檬酸的终浓度为0.1mol/L、所述磷酸氢二纳的终浓度为0.2mol/L，所述过氧化氢尿素的摩尔浓度为0.5m mol/L～2.4m mol/L，获得B液；
c)将上述A液与B液等体积混合获得TMB应用液备用。
如上所述的非诊断性检测方法，优选地，所述制备的免疫层析试纸还包括通过如下方法进行验证：利用所述制备好的试纸条对阴性样品进行检测时，只有质控带显色，对含有待检项目的物质进行检测时，检测带与质控带均显色，免疫层析试纸合格，用于待检项目的检测。
上述对制备的免疫层析试纸做验证试验，有效保证试纸的有效性和准确性，避免假阴性试验结果的出现。
本发明提供一种采用新型免疫层析试纸进行病原检测，采用可以很容易获得的磁性纳米颗粒，磁性纳米颗粒经羧基化修饰后，再进行抗原或抗体标记，标记后形成免疫磁珠，该免疫磁珠比较稳定，能有效结合待检的目标物，不会导致假阴性结果，从而避免出现漏检。判断结果时，利用Fe3O4磁性纳米颗粒具有过氧化物酶的特性，加入过氧化物酶的底物显色后，判断检测结果，通过酶联的级联扩大反应，使灵敏度大大提高，可比胶体金检测灵敏度高10-100倍的数量级，且不需要检测仪器进行结果的检测。本发明的免疫层析试纸制备时，采用成本较低的试剂，使总的检测成本降低。
附图说明
图1是本发明免疫层析试纸检测方法的流程图。
图2是本发明免疫层析试纸检测结果。
图3是胶体金免疫层析试纸检测结果。
具体实施方式
目前有利用四氧化三铁纳米颗粒进行检测，主要是利用其具有磁响应性的功能，对待检目的物进行富集分离的，可有效提高检测率。四氧化三铁纳米颗粒还具有辣根过氧化物酶催化底物变色的特性，但是利用这个特性进行ELISA检测鲜有报道，主要原因可能是一方面考虑到由于四氧化三铁纳米颗粒的量子化尺寸效应等，使它对某种波长的光吸收带有蓝移现象，并对各种波长光的吸收有宽化现象，认为对ELISA检测需要测量吸光度值不是很准确；另一方面，由于四氧化三铁本身具有的颜色，会对后续测定吸光度值有影响，所以认为利用四氧化三铁纳米颗粒具有辣根过氧化物酶的特性进行免疫学方法的检测，尤其是ELISA检测，结果不是很准确、可靠，有一定的技术偏见。
本发明利用四氧化三铁具有辣根过氧化物酶催化的特性，即能催化邻苯二胺体系即含有过氧化氢和邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺体系即含有过氧化氢和四甲基联苯胺(TMB)的溶液、3.3－二氨基联苯胺即含有过氧化氢和3.3－二氨基联苯胺(DAB)的溶液，或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸即含有过氧化氢和2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸(ABTS)的溶液显色的特点，首次将四氧化三铁纳米颗粒利用到免疫层析试纸上进行抗原抗体的检测，利用四氧化三铁可使辣根过氧化物酶底物显色的特性，极大地增强检测信号，使本发明的制备的免疫层析试纸检测灵敏度大大提高，也使四氧化三铁具有辣根过氧化物酶催化的特性，能用于免疫学方法检测成为可能。
本发明利用四氧化三铁磁性纳米颗粒制备检测试纸还有效解决了，采用胶体金材料制备试纸时，胶体金包被不稳定性，灵敏度降低的问题。主要是，本发明制备检测试纸时，对四氧化三铁颗粒进行了羧基化处理，有利于包被，且与包被物形成稳定的结构，并且包被后不会影响包被物的免疫学特性。
另外，通过对样品垫处理方式的研究，发现采用本发明处理方法，可有效地避免非特异性反应，降低假阳性的检出率。
本发明对TMB应用液中TMB的含量和H2O2的含量，进行了进一步的研究，研究表明TMB含量在0.01mg/ml～10mg/ml，过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L，四氧化三铁纳米颗粒制备的检测试纸显色效果较佳。
常规ELISA采用的底物为TMB显色液，反应时，首先需要加入含有TMB的A液，再加入含有H2O2的B液，进行反应，一般A液与B液是分开存放或是现用现配，因TMB溶液与单独的H2O2溶液混合一起后，存放一段时间容易产生浑浊或沉淀，长期存放会影响检测结果，一般采用H2O2溶液时最好现配现用。
本发明对TMB应用液的配制方法进一步进行改进，研究发现采用过氧化氢水溶液和过氧化氢尿素的效果相同，但采用过氧化氢尿素配制的溶液比采用H2O2配制的溶液更加稳定，过氧化氢尿素的水溶液具有尿素和H2O2性质。
本发明配制的TMB应用液可直接使用，但需要4℃避光存放。优选地，配制的方法如下：
1.底物液A：TMB200mg，溶于二甲基亚砜100ml，加双蒸水至1000ml。
2.底物B：先配制重量浓度为1％过氧化氢尿素待用，称取Na2HPO414.21g，柠檬酸9.607g，加入1％过氧化氢尿素2.4ml，加双蒸水至500ml。
3.将底物液A和底物B按1：1混合即成TMB应用液。
这种方法简单、方便、节约试剂，同时过氧化氢尿素较过氧化氢稳定，更能够确保试验的准确性。
本发明中所指的蒸馏水可以是一次蒸馏水，也可以是二次蒸馏水、三次蒸馏水或超纯水。
下面对本发明作详细的说明。以下具体实施例中所用的试剂，如无特别说明均为常规试剂，百分比含量如无特别说明均为重量百分比。
森林脑炎抗原、森林脑炎抗原免疫的兔血清、森林脑炎抗体由中国检验检疫科学研究院卫生检疫研究所提供。
实施例1 森林脑炎抗体免疫层析检测方法
结合图1，对本发明制备的免疫层析检测方法具体的优选的实施方式如下：
1、制备免疫磁性纳米颗粒结合垫，采用SPA标记磁性纳米颗粒
取100μL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液加700μL水，200μL 25％的戊二醛溶液，摇晃3h；1ml水洗1-2次，用pH＝7.4的PBS洗2次，即将四氧化三铁磁性纳米颗粒进行羧基化处理；加入500μL，2mg/ml的SPA，摇晃3h，pH值7.6；加入500μL，含0.5％的BSA溶液，摇晃30分钟，进行封闭；加入含0.01％吐温-20浓度为0.01M、pH＝7.4的PBS，洗3-4次；加入1mL重悬液，其中重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖，混匀，喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥4h。
2、包被膜的制备
将森林脑炎重组抗原和羊抗兔IgG用PBS溶液分别稀释至1mg/mL和0.8mg/mL，用喷膜机将森林脑炎重组抗原和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，置于37℃干燥过夜。
3、处理样品垫
将含1％吐温20、pH＝7.4的PBS，喷涂于玻璃纤维膜上，获得样品垫。
4、组装试纸条
将上述制备好的样品垫、磁性纳米颗粒结合垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，切成宽度为0.4cm的条，装壳，吸水垫可选用吸水纸也可选用纯棉绒浆滤纸。
5、试纸条的验证
为保证所制备的试纸条检测结果的准确、可靠，对试纸条进行验证。具体步骤如下：将阴性兔血清取80μL滴加在免疫层析试纸的样品垫上，2分钟后取50μL TMB应用液(采用上述方法配置)滴加在样品垫上，10--15min后判断结果，应仅质控带出现棕黄色；将森林脑炎重组抗原免疫的兔血清取80μL滴加在另一免疫层析试纸的样品垫上，并且在2分钟后，取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，质控带和阳性检测条带30s内加深，10min后判断结果，质控带和检测带均出现棕黄色条带，试纸条合格，可进行森林脑炎抗体的检测。
6、样品检测
在进行森林脑炎抗体的检测时，取80μL血清样品滴加在样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检血清样品中不含有森林脑炎抗体；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待检血清样品中含有森林脑炎抗体；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。
实施例2 森林脑炎抗体的纳米磁珠免疫层析试纸与胶体金免疫层析试纸的灵敏度检测比较
采用实施例1制备的试纸条分别检测森林脑炎抗体血清，用胎牛血清稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同时将胎牛血清作为阴性对照，取80μL血清样品加样孔内，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min判断结果。
采用常规方法制备胶体金免疫层析试纸，其中采用SPA标记胶体金颗粒，硝酸纤维素膜上的检测带包被有森林脑炎重组抗原，质控带包被羊抗兔IgG，利用制备的胶体金免疫层析试纸对森林脑炎抗体血清进行检测，同样采用用胎牛血清稀释为1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000，同时将胎牛血清作为阴性对照，取80μL血清样品加样孔内，10min后判断结果。
纳米磁珠免疫层析试纸检测结果如图2所示，图3为胶体金免疫层析试纸检测结果图，其中图中注：C：质控带；T：检测带；1-7：森林脑炎阳性血清稀释浓度：1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000；7：阴性对照。试验结果表明，作为阴性对照的胎牛血清均为阴性，制备的纳米磁珠免疫层析试纸可检测出稀释至1:100000的森林脑炎抗体，而胶体金免疫层析试纸仅可检测出稀释至1:10000的森林脑炎抗体，灵敏度相差10倍。
实施例3 森林脑炎抗原免疫层析检测方法
1、制备免疫磁性纳米颗粒结合垫，采用森林脑炎抗体标记磁性纳米颗粒
取100μL Fe3O4磁性纳米颗粒溶液加700μL水，200μL 25％的戊二醛溶液，摇晃3h；1ml水洗1-2次，用pH＝7.4的PBS洗2次，即将四氧化三铁磁性纳米颗粒进行羧基化处理；加入500μL，2mg/ml的森林脑炎抗体，摇晃3h，pH值7.4；加入500μL，含0.3％的BSA溶液，摇晃30分钟，进行封闭；加入含0.01％吐温-20浓度为0.01M、pH＝7.4的PBS，洗3-4次；加入1mL重悬液，其中重悬液中含有重量百分比为0.1％的Tris碱、1％的BSA和5％的蔗糖，混匀，喷涂于玻璃纤维膜上，37℃干燥4h。
2、包被膜的制备
将森林脑炎抗体和羊抗兔IgG用PBS溶液分别稀释至1.2mg/mL和0.8mg/mL，用喷膜机将森林脑炎抗体和羊抗兔IgG包被于硝酸纤维素膜上作为检测带和质控带，置于37℃干燥。
3、处理样品垫
将含1％吐温20、pH＝7.4的PBS，喷涂于玻璃纤维膜上，获得样品垫。
4、组装试纸条
将上述制备好的样品垫、磁性纳米颗粒结合垫、包被后的硝酸纤维素膜、吸水垫依次贴在底衬卡上，切成宽度为0.4cm的条，装壳，吸水垫可选用吸水纸。
5、试纸条的验证
为保证所制备的试纸条检测结果的准确、可靠，对试纸条进行验证。具体步骤如下：将不含森林脑炎抗原的0.1M的PB溶液80μL滴加在免疫层析试纸的样品垫上，2分钟后取50μL TMB应用液(采用上述方法配置)滴加在样品垫上，10--15min后判断结果，应仅质控带出现棕黄色；将含森林脑炎抗原的0.1M的PB溶液80μL滴加在另一免疫层析试纸的样品垫上，并且在2分钟后，取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，质控带和阳性检测条带30s内加深，10min后判断结果，质控带和检测带均出现棕黄色条带，试纸条合格，可进行森林脑炎抗原的检测。
6、样品检测
在进行森林脑炎抗体的检测时，取80μL血清样品滴加在样品垫上，并且在2分钟后取50μL TMB应用液滴加在样品垫上，10min判断结果。若仅质控带出现棕黄色，结果为阴性，说明待检样品中不含有森林脑炎抗原；若质控带和检测带均出现棕黄色，结果为阳性，说明待检样品中含有森林脑炎抗原；若两条带都没有显色或者只有检测带显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。
在以上实施列中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种免疫层析试纸的非诊断性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、通过将标记后的Fe3O4磁性纳米颗粒喷涂于玻璃纤维膜上，制备免疫磁性纳米颗粒结合垫；
(2)、制备包被有检测线和质控线的包被膜；
(3)、处理样品垫；
(4)、组装试纸条：将所述步骤(3)处理后的样品垫、所述步骤(1)制备的免疫磁性纳米颗粒结合垫、所述步骤(2)制备好的包被膜和吸水垫依次贴在底衬卡上，得到免疫层析试纸；
(5)、样品检测：将待检样本加入到步骤(4)中所述免疫层析试纸的样品垫，再将过氧化物酶底物滴加于样品垫，进行结果的判定。
2.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：用与待检项目相结合的抗原或抗体标记Fe3O4磁性纳米颗粒，将标记后的磁性纳米颗粒喷涂于玻璃纤维膜上，制备成免疫磁性纳米颗粒结合垫。
3.如权利要求2所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中在待检项目相结合的抗原或抗体标记Fe3O4磁性纳米颗粒之前，所述Fe3O4磁性纳米颗粒进行羧基化修饰。
4.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测带包被与待检项目结合的抗体或抗原，所述质控带包被与上述磁性纳米颗粒标记的抗原或抗体特异性结合的反应物。
5.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述步骤(4)处理样品垫具体为：将含有体积比为0.5％～2％吐温20、pH＝7.2～7.6的PBS，喷涂于样品垫上，烘干或自然干燥后待用。
6.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中包被膜为硝酸纤维素膜，所述步骤(3)中样品垫为玻璃纤维膜，所述步骤(4)中吸水垫为吸水纸或纯棉绒浆滤纸。
7.如权利要求1所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述过氧化物酶底物为邻苯二胺体系、四甲基联苯胺体系、3.3－二氨基联苯胺体系或2.2'-边氮基-双3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸体系中的任一种。
8.如权利要求7所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述四甲基联苯胺体系包括：四甲基联苯胺和过氧化氢，所述四甲基联苯胺的质量浓度为0.01mg/ml～10mg/ml，所述过氧化氢的摩尔浓度为0.25m mol/L～1.2m mol/L。
9.如权利要求8所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述四甲基联苯胺体系配制方法如下：a)先将四甲基联苯胺溶于二甲基亚砜，再将加入蒸馏水定容，获得A液；
b)先配制质量浓度为0.5％～30％的过氧化氢尿素溶液，之后称取柠檬酸、磷酸氢二纳，加入过所述氧化氢尿素溶液，用蒸馏水定容，所述柠檬酸的终浓度为0.1mol/L、所述磷酸氢二纳的终浓度为0.2mol/L，所述过氧化氢尿素的摩尔浓度为0.5m mol/L～2.4m mol/L，获得B液；
c)将上述A液与B液等体积混合获得TMB应用液备用。
10.如权利要求1-9中任一项所述的非诊断性检测方法，其特征在于，所述制备的免疫层析试纸还包括通过如下方法进行验证：利用所述制备好的试纸条对阴性样品进行检测时，只有质控带显色，对含有待检项目的物质进行检测时，检测带与质控带均显色，免疫层析试纸合格，用于待检项目的检测。
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