CN101171342A - 蛋白质的切断方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过蛋白酶高效地从糖化蛋白质中切断氨基酸或肽的方法。在以R－X所示的化合物的存在下，通过对糖化蛋白质进行蛋白酶处理来切断氨基酸或肽。上述R是碳原子数为9以上的烷基化合物，优选是碳原子数为9～16的直链烷基或直链酰基、碳原子数为10～40且主链碳原子数为9～16的支链烷基或支链酰基、或者被碳原子数为3～8的环烷基取代了的直链碳原子数为4～13的直链烷基，上述X为糖残基。另外，糖化蛋白质优选例如为糖化血红蛋白，且优选通过蛋白酶处理切断β链N末端氨基酸或β链N末端肽。

Description

蛋白质的切断方法及其用途
技术领域
本发明涉及蛋白质的切断方法以及使用了该方法的蛋白质糖化率的测定方法。
背景技术
作为显示生物体状态的指标，一直测定的是各种蛋白质的糖化率。其中，由于血细胞中的血红蛋白(Hb)的糖化率、特别是HbAlc反映着生物体内血糖值的过往情况，因此被作为糖尿病的诊断和治疗等中的重要指标。HbAlc的HbA(α2β2)的β链N末端氨基酸(缬氨酸)上键合有葡萄糖，其糖化率(％)用HbAlc量相对于总Hb量的比例(％)表示。
HbAlc一般通过高效液相色谱法(HPLC)法、免疫法、酶法、电泳法等测定，例如作为HbAlc的参考测定，公开了下述方法：通过蛋白酶Glu-C切断Hb的β链N末端的6肽和作为其糖化物的糖化6肽，通过HPLC对其进行分离精制后，通过毛细管电泳或LC-MS进行定量(非专利文献1)。另外，特别是酶法例如为以下的测定方法。首先，使果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)作用于Hb的糖化部分，产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述Hb的糖化量。在该反应液中进一步添加过氧化物酶(以下称为“POD”)和通过氧化而显色的显色底物，将POD作为催化剂，在过氧化氢和显色底物之间发生氧化还原反应。然后测定上述显色底物的显色程度，求出糖化量，由糖化量和总Hb量可以算出HbAlc(％)。
如上所述，HbAlc的特征在于β链N末端缬氨酸的糖化，因此优选FAOD高效地作用于N末端糖化缬氨酸。但是，由于FAOD难以直接作用于蛋白质，因此通常尝试通过蛋白酶处理来切断Hb的β链N末端以使FAOD作用于其的方法。具体地说，报道了使用内切型和外切型蛋白酶(专利文献1)、丝氨酸羧肽酶(专利文献2)、使α-氨基被糖化了的氨基酸游离的蛋白酶(专利文献3～5)、从α链N末端切断β链N末端的糖化氨基酸或糖化肽的作用较强的蛋白酶(专利文献6)等的方法(专利文献7～10)。另外，还报道了添加尿素后通过煮沸血红蛋白使其改性并利用蛋白酶进行处理的方法。
但是，通过这些方法，蛋白酶处理需要很长时间，难以迅速地进行检查。在用于上述毛细管电泳或LC-MS的蛋白酶处理中，也报道了需要在37℃下处理18个小时。另外，作为蛋白酶处理的短缩化，例如公开了在pH为3的酸性条件下通过酸性蛋白酶Molsin处理1小时左右的例子(专利文献11)，但进行酶反应优选在中性左右进行，并未公开在这种条件下的处理。另外，在测定Hb的β链N末端以外的糖化率时，也与上述HbAlc同样，切断的迅速性存在问题。
非专利文献1：梅本雅夫、“HbAlcの国際標準化に目ざすIFCC法”、臨床検查、Vol.46、No.7、2002年7月
专利文献1：国际公开第1997/013872号小册子
专利文献2：日本特开2001-57897号公报
专利文献3：国际公开第2000/50579号小册子
专利文献4：国际公开第2000/61732号小册子
专利文献5：日本特开2002-315600号公报
专利文献6：日本特开2004-344052号公报
专利文献7：日本特开平5-192193号公报
专利文献8：日本特开平10-33177号公报
专利文献9：日本特开平10-33180号公报
专利文献10：日本特开2004-333452号公报
专利文献11：日本特开2001-95598号公报
发明内容
因此，本发明的目的在于提供通过蛋白酶从蛋白质中高效地切断氨基酸或肽的方法，使用了该方法的蛋白质糖化率的测定方法以及上述方法中使用的促进剂。
本发明是一种通过蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽的方法，其特征在于，在下述式(I)所示的化合物的存在下对蛋白质进行蛋白酶处理。下述式中，R是碳原子数为9以上的烷基或取代烷基，X为糖残基。
R-X(I)
另外，本发明是一种蛋白质的糖化率的测定方法，其特征在于，其包括下述工序：用蛋白酶切断蛋白质的工序、使FAOD作用于所得的蛋白质切断物的糖化部分的工序、以及通过测定上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应来确定蛋白质糖化率的工序，其中，通过本发明的蛋白质切断方法进行上述蛋白质的切断，并使上述FAOD作用于所得氨基酸或肽的糖化部分。
另外，本发明的促进剂是一种对通过蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽进行促进的促进剂，其特征在于，含有上述式(I)所示的化合物。
根据本发明的蛋白质切断方法，虽然机理还不清楚，但通过在上述式(I)所示的化合物(以下也称为“促进化合物”)的存在下对蛋白质进行蛋白酶处理，可以在短时间内切断氨基酸或肽。另外，在糖化率的测定中，可以比以往方法更为迅速地切断各蛋白质的特征部分。因此，如果通过本发明的切断方法处理蛋白质，由于有效地进行蛋白酶处理的短缩化、各糖化蛋白质的特征糖化氨基酸或肽的切断，因此易于使FAOD作用于特征的糖化部分(例如Hb的β链N末端缬氨酸、或者赖氨酸等的糖化部分)，糖化率的测定精度也提高。因此，可以说这种本发明的切断方法和糖化率测定方法在例如糖尿病的诊断和治疗等医疗领域中极为有用。另外，由于上述化合物促进糖化蛋白质的切断是本发明人等首次发现的，因此含有上述式(I)所示的化合物的本发明的促进剂成为在上述医疗领域中极为有用的试剂。
附图说明
图1为表示本发明的实施例中测定HbAlc％与标准试样的HbAlc显示值的相关关系的曲线图。
图2为本发明的其它实施例的HPLC的色谱图，(A)表示使用了HbAlc％＝44％的试样的结果、(B)表示使用了HbAlc％＝0％的试样的结果。
具体实施方式
1.蛋白质的切断方法
以下，说明本发明中使用的下述式(I)所示的促进化合物。
R-X(I)
在上述式(I)中，R是碳原子数为9以上的烷基或取代烷基。作为具体例子，可以列举出碳原子数为9～16的直链烷基或直链酰基、碳原子数为10～40且主链碳原子数为9～16的支链烷基或支链酰基、或者被环烷基取代了的直链烷基(例如环烷基的碳原子数为3～8、除去环烷基的直链的碳原子数为4～13)等。上述环烷基例如可以列举出环己基、环戊基、环丁基等。
在上述式(I)中，X为糖残基，例如优选为单糖或二糖的残基。作为上述单糖，例如可以列举出甘露糖苷、葡萄糖苷、硫代葡糖苷等，作为二糖，例如可以列举出麦芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷、硫代麦芽糖苷(thiomaltoside)等。这些糖的结构可以为α、β、D、L的任一种。另外，键合在糖的环式结构上的氢或OH基的氢例如可以被Na、K、卤素等取代。本发明中，介由R与糖残基的环式结构的键的原子(例如-O-、-S-等)成为糖残基的构成要素。
作为本发明的上述促进化合物的具体例子，例如可以列举出正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酯(β-D-吡喃果糖-α-D-吡喃葡萄糖苷单十二烷酸酯)、正癸基-β-D-麦芽糖苷(正癸基-β-D-麦芽吡喃糖苷)、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷(正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷)、5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷、以及3-氧代十三烷基(oxatridecyl)-α-D-甘露糖苷等。这些化合物的化学式如下所示。
Figure S2006800154713D00051
6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷
Figure S2006800154713D00052
蔗糖单月桂酯              正癸基-β-D-麦芽糖苷
Figure S2006800154713D00053
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷  正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷
正十六烷基-β-D-麦芽糖苷
Figure S2006800154713D00055
5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷
Figure S2006800154713D00061
十一烷基-β-D-麦芽糖苷
Figure S2006800154713D00062
3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷
其中，优选为上述式(I)的R(烷基链)的碳原子数为12以上的正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酯、十六烷基-β-D-麦芽糖苷等。另外，R的碳原子数相同时(例如碳原子数相同的烷基和酰基)，更优选酰基，从而优选正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(正十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷)。
本发明的糖化蛋白质的切断方法如上所述，是通过蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽的方法，其特征在于，在上述式(I)所示的促进化合物的存在下对蛋白质进行蛋白酶处理。这样，通过在上述促进化合物的存在下进行蛋白酶处理，与不存在时的蛋白酶处理相比，可以更为高效地进行氨基酸或肽的切断。因此，例如处理中所用的蛋白酶的增量也就不需要了。虽然可以这样高效地从蛋白质中切断氨基酸或肽的机理还不清楚，但推测是通过使上述促进化合物共存，从而蛋白质变为易于被蛋白酶处理的结构。另外，本发明中，将切断对象设为“蛋白质”，但也包括部分被糖化了的蛋白质，本发明的切断方法如后所述可以适用于蛋白质的糖化率测定。
本发明中，切断对象的蛋白质并无特别限定，例如优选为血红蛋白(Hb)。通过蛋白酶从Hb中切断的氨基酸或肽没有特别限定，可以根据所用蛋白酶适当地决定。在以后述的糖化率测定为前提时，上述氨基酸通常为β链N末端缬氨酸、赖氨酸或它们的糖化物。β链N末端的糖化缬氨酸(果糖基缬氨酸)的α-氨基被糖化，糖化赖氨酸的ε-氨基被糖化。另外，肽通常为含有β链N末端缬氨酸的肽(以下也称为“β链N末端肽”)、含有赖氨酸的肽(以下也称为“赖氨酸肽”)。切断的肽的长度没有特别限定，可以根据蛋白质的种类或所用蛋白酶适当设定，为Hb时，氨基酸残基数例如为2～6、更优选为2～4、具体地说为果糖基Val-His、果糖基Val-His-Leu、果糖基Val-His-Leu-Thr等。
本发明如上所述，其特征在于，通过在上述促进化合物存在下的蛋白酶处理，可以从蛋白质中高效地切断氨基酸或肽，所使用的蛋白酶的种类并无特别限定。即，可以根据切断对象的蛋白质、切断的氨基酸或肽的种类适当决定蛋白酶。
作为上述蛋白酶，例如可以使用金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸羧肽酶、蛋白酶K(proteinase K)、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰脏来源的胰蛋白酶、枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的蛋白酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的蛋白酶等，优选为内切蛋白酶。作为市售品，例如可以列举出金属蛋白酶(爱科来公司生产)、蛋白酶A“Amano”G(天野酶公司生产)、蛋白酶M“Amano”G(天野酶公司生产)、蛋白酶S“Amano”G(天野酶公司生产)、肽酶R(天野酶公司生产)、木瓜蛋白酶M-40(天野酶公司生产)、商品名蛋白酶N(Fluka公司生产)、商品名蛋白酶N“Amano”(天野制药公司生产)、芽胞杆菌属(Bacillus)来源的金属蛋白酶(东洋纺公司生产：商品名Toyoteam)、内切蛋白酶Glu-C(Roche公司生产)等。
当蛋白质为Hb、切断β链N末端肽时，特别优选特异性地作用于β链N末端并催化N末端肽的切断的蛋白酶(例如日本特开2000-300294号公报、日本特开2004-344052号公报等)。当在上述促进化合物的存在下使用该蛋白酶时，例如即便在蛋白质中β链N末端缬氨酸以外被糖化(例如侧链基团(ε-氨基)被糖化了的赖氨酸或精氨酸等)，也可以极为迅速且特异性地进行β链N末端肽的切断。另外，作为催化β链N末端缬氨酸的切断的蛋白酶，例如可以列举出在国际公开第2000/50579号小册子(日本特许3668801)、国际公开第2000/61732号小册子、日本特开2002-315600号公报等中公开的蛋白酶。
当蛋白质为Hb、切断赖氨酸或含有赖氨酸的肽时，例如优选国际公开第2002/0065 19号小册子所记载的蛋白酶等。当在上述促进化合物的存在下使用该蛋白酶时，可以极为迅速且特异性地进行赖氨酸或含有赖氨酸的肽的切断。
另外，当蛋白质为Hb、蛋白酶切断β链N末端氨基酸或肽、和赖氨酸或赖氨酸肽这两者时，如果在上述促进化合物的存在下进行蛋白酶处理，则任一个切断均被促进，特别是相比较于赖氨酸或赖氨酸肽的切断促进(例如数倍)，可显著地观察到β链N末端的切断促进(数倍～数十倍)。由此，特别是能够获得β链N末端的切断物。因而，即便是同样切断上述两者的蛋白酶，通过促进化合物的并用，也可以获得比赖氨酸或赖氨酸肽更多的β链N末端切断物(例如约10倍以上)，因而可以抑制赖氨酸或赖氨酸肽的影响，从而测定对应于缬氨酸的α位氨基糖化的HbAlc。
本发明的蛋白质切断方法例如通过在含有蛋白质的试样中添加上述促进化合物和蛋白酶而进行。另外，上述促进化合物和蛋白酶的添加顺序并无特别限定，可以同时添加，也可以是以不同顺序分别添加。
上述试样并无特别限定，可以列举出含有目标蛋白质的试样。其中，当如后所述适用于Hb的糖化率测定时，例如可以列举出全血试样、血细胞试样、它们的溶血试样等。全血试样或血细胞试样的溶血方法并无特别限定，例如可以使用利用渗透压差的方法、利用超声波的方法等。利用渗透压差时，可以添加相对于全血(或血细胞)例如为2～100倍体积量的精制水使其溶血。另外，还可以将表面活性剂添加到试样中进行溶血。
上述促进化合物在蛋白酶处理的反应液中的添加比例例如为0.01～200mM的范围、优选为0.4～100mM。上述反应液中的蛋白质浓度(例如Hb浓度)为0.005mM时，上述促进化合物的添加比例例如为0.4～100mM的范围、优选为1～100mM。
上述反应液中蛋白酶的添加比例例如为0.001～300,000KU/L的范围、优选为0.01～30,000KU/L、特别优选为0.1～1000KU/L。上述反应液中的蛋白质浓度(例如Hb)为0.005mM时，蛋白酶的添加比例例如为0.01～300,000KU/L的范围、优选为0.05～30,000KU/L、特别优选为0.1～10,000KU/L。
蛋白酶处理的条件并无特别限定，处理温度例如为10～40℃的范围、优选为25～37℃。处理时间并无限定，特别上限没有限定，例如可以进行蛋白酶处理0.1～60分钟左右。处理时间优选为0.1～45分钟、更优选为0.2～20分钟、特别优选为0.2～5分钟。本发明与以往的方法不同，通过在上述式(I)所示的促进化合物的存在下实施蛋白酶处理，从而迅速地进行氨基酸或肽的切断，因此即便是上述处理时间，也可以充分地进行切断处理。根据以往的方法，例如Hb的β链N末端的切断通常需要2～24小时的蛋白酶处理，因此也可知本发明可以极为迅速地切断。
上述蛋白酶处理例如优选在缓冲液中进行，可以使用Tris-HCl缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。另外，蛋白酶反应液的pH例如为4～10的范围、优选为6～9，例如可以通过上述缓冲液来调整pH。
另外，在本发明的蛋白质的切断方法中，可以在除了上述促进化合物之外还添加有硝基化合物的条件下进行蛋白酶处理。作为该硝基化合物，例如可以列举出亚硝酸或其盐。作为亚硝酸盐，并无特别限定，例如可以列举出亚硝酸钾、亚硝酸戊酯、亚硝酸丁酯、硝化甘油、亚硝酸钠、对硝基氯苯、三硝基甲苯、硝基苯等。蛋白酶处理的反应液中的上述硝基化合物的添加比例并无特别限定，例如上述反应液中的蛋白质浓度(例如Hb浓度)为0.005mM时，上述硝基化合物的添加比例例如优选为0.005mM以上、更优选为0.05～2mM。
本发明的蛋白质切断方法由于可以这样高效地切断蛋白质的氨基酸或肽，因此在利用上述酶法的蛋白质糖化率的测定方法中是有用的。而且，并不限于酶法，例如在以切断的糖化氨基酸或糖化肽为抗原的免疫法中也是有用的，另外，还可以提高利用HPLC法或电泳法的分离。因此，在蛋白质的糖化率的各种测定方法中作为测定试样的处理工序是极为有用的。另外，Hb如上所述，可以由β链N末端缬氨酸的糖化量求出HbAlc值，另外，可以由赖氨酸的糖化量求出Lys糖化率(GHbLys值)。因此，通过本发明的切断方法，如上所述，如果从Hb中切断β链N末端缬氨酸或含有其的肽、赖氨酸或含有其的肽，则可以更高精度地测定Hb的糖化率。
2.糖化率的测定方法
本发明的蛋白质糖化率的测定方法如上所述，包括：用蛋白酶切断蛋白质的工序、使FAOD作用于所得蛋白质切断物的糖化部分的工序、以及通过测定上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应来确定蛋白质糖化率的工序，上述测定方法的特征在于，通过本发明的蛋白质切断方法进行上述蛋白质的切断，并使上述FAOD作用于所得氨基酸或肽的糖化部分。
(HbAlc的测定方法)
列举出测定糖化Hb的HbAlc的例子来说明本发明的蛋白质糖化率的测定方法。
测定糖化Hb的HbAlc时，通过蛋白酶得到的Hb切断物为β链N末端糖化缬氨酸或含有上述糖化缬氨酸的肽，使FAOD作用于β链N末端缬氨酸的糖化部分即可。切断的氨基酸或肽如上所述，可以通过选择所用蛋白酶的种类来决定。
HbAlc的测定方法中所用的FAOD并无特别限定，优选为作用于α-氨基被糖化了的氨基酸或肽、并对产生α-酮醛和过氧化氢的反应进行催化的酶(以下称为“FAOD-α”)。这种催化反应例如可以用下述式(1)表示。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2
→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2(1)
在上述式(1)中，R1表示羟基或来自于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。上述糖残基(R1)在反应前的糖为醛糖时，为醛糖残基；在反应前的糖为酮糖时，为酮糖残基。例如，在反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多尔重排(Amadori rearrangement)，反应后的结构变为果糖结构，此时，糖残基(R1)变为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n为0～6的整数。
上述式(I)中，R2并无特别限定，例如为下述式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。
-CHR3-CO-R4(2)
上述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基、R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(3)表示。在下述式(3)中，n表示0以上的整数，R3与上述同样地表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以完全相同、也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(3)
作为这种FAOD-α，例如可以使用商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)、商品名FPOX-EE(Kikkoman公司生产)、国际公开第2004/029251号小册子所记载的果糖胺氧化酶、日本特开2004-275013号公报或日本特开2004-275063号公报所记载的果糖胺氧化酶、青霉属(Penicillium)来源的FAOD(日本特开平8-336386号公报)等。
如果使用这种FAOD，例如即便β链N末端缬氨酸以外也被糖化，由于难以作用于缬氨酸的糖化部分以外，因此可以更高精度地测定HbAlc。
另外，FAOD还可以进一步具有上述(1)以外的底物特异性。作为这种FAOD，例如可以列举出作用于上述糖化α-氨基和糖化氨基酸侧链基这两者的FAOD(以下称为“FAOD-αS”)，例如可以列举出市售的商品名FOD(旭化成公司生产)、赤霉属(Gibberella)来源的FAOD(日本特开平8-154672号公报)、镰刀菌属(Fusarium)来源的FAOD(日本特开平7-289253号公报)、曲霉属来源的FAOD(WO99/20039)等。在为这种FAOD时，例如通过适当选择蛋白酶的种类，并与特异性地切断β链N末端的氨基酸或肽的蛋白酶组合，可以抑制对其它糖化部位的作用。
在HbAlc测定方法中，上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应的测定例如可以列举出通过上述反应产生的过氧化氢量的测定、被上述反应所消耗的氧量的测定。上述过氧化氢量例如可以如下进行：使用过氧化物酶(POD)和通过氧化而显色的底物，利用它们与过氧化氢的反应使底物显色，通过测定该显色程度而进行。
作为上述通过氧化而显色的底物(显色底物)，并无特别限定，例如可以列举出N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-硫代丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(例如商品名TPM-PS、同仁化学公司生产)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲胺基)吩噻嗪或其盐(例如商品名DA-67、和光纯药公司生产)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲胺基)二苯基胺钠、邻苯二胺(OPD)、组合有Trinder试剂和4-氨基安替比林的底物等。作为Trinder试剂，例如可以列举出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了4-氨基安替比林之外，还可以使用氨基安替比林衍生物、香草二胺磺酸、甲基苯并噻唑酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑酮腙(SMBTH)等。
以下列举出HbAlc测定方法的具体例子，但并不局限于此。
首先，与上述同样，在上述式(I)所示的促进化合物的存在下对含有Hb的试样进行蛋白酶处理。
然后，用FAOD处理通过上述蛋白酶处理获得的β链N末端氨基酸或肽片断。通过上述蛋白酶处理，例如从Hbβ链N末端切断果糖基Val-His时，通过该FAOD处理，键合在Val的α-氨基上的糖游离，生成α-酮醛(糖残基)、Val-His和过氧化氢。
FAOD处理优选与上述蛋白酶处理同样地在缓冲液中进行，作为上述缓冲液，并无特别限定，可以使用与上述蛋白酶处理相同的缓冲液。FAOD处理的条件并无特别限定，反应液的pH例如为6～9，处理温度例如为10～38℃的范围、优选为25～37℃。处理时间也并无特别限定，例如为0.1～60分钟、优选为0.1～5分钟。
FAOD处理的反应液中的FAOD的添加比例例如为0.01～50KU/L的范围、优选为0.5～10KU/L。
接着，使用POD和上述显色底物测定通过上述FAOD处理生成的过氧化氢的量。过氧化氢量除了使用POD等的酶方法之外，还可以通过电方法等测定。
POD反应优选与上述蛋白酶处理同样地在缓冲液中进行，可以使用上述缓冲液。POD处理的条件并无特别限定，反应液的pH例如为5～9，处理温度例如为10～40℃的范围、优选为25～37℃。处理时间也并无特别限定，例如为0.1～5分钟。
POD反应液中的POD的添加比例例如为0.01～300KU/L的范围、优选为0.5～40KU/L。另外，上述反应液中的显色底物的添加比例例如为0.001～10mM的范围、优选为0.005～2mM。
如此使用显色底物时，例如可以使用分光光度计测定其显色(例如反应液的吸光度)。由于过氧化氢量对应于Hb的β链N末端缬氨酸的糖化量(糖化浓度：HbAlc浓度)，因此可以由测定的吸光度算出缬氨酸的糖化量。然后，如下述式所示，通过算出该Hb的β链N末端缬氨酸的糖化量与试样中的总Hb量(Hb浓度)之比(百分比)，可以求出HbAlc(％)。另外，Hb量可以通过以往公知的方法或市售的试剂盒测定。
HbAlc％＝(β链N末端缬氨酸的糖化量/Hb量)×100
由吸光度计算Hb糖化量例如通过使用对Hb的β链N末端的已知糖化量和吸光度的关系作图得到的标准曲线而进行。例如对于β链N末端糖化量已知的Hb标准液，与上述同样地进行吸光度测定，作成表示该标准液的测定值与已知糖化量的关系的标准曲线。然后，通过在该标准曲线中代入如上测定的吸光度，可以算出β链N末端的糖化量。
另外，当如下进行时，可以使用与通过上述式(I)所示的促进化合物进行过处理的相同试样来更为正确地测定Hb量，且更为正确地求得HbAlc值。即，本发明的测定方法中，在利用蛋白酶切断Hb之前，在含有上述Hb的试样中添加上述式(I)所示的促进化合物，测定添加有上述促进化合物的试样的光学变化量，由该光学变化量算出上述试样中的Hb量。另外，通过蛋白酶切断添加有上述化合物的试样中的Hb后，通过测定上述糖化部分与FAOD的氧化还原反应来测定Hb的糖化量。然后，优选由上述Hb量和上述糖化量求出HbAlc值(HbAlc％)。
该方法中，在添加蛋白酶之前，在含有Hb的试样中添加上述式(I)所示的促进化合物，例如进行上述试样的吸光度测定。然后，可以由测定的吸光度和事先准备的标准曲线求出Hb量。这样，当通过上述化合物处理Hb时，可以容易且正确地求出Hb的量。该机理还不清楚，但推测是由于通过上述式(I)所示的促进化合物，血红蛋白的结构发生变化，从而不稳定的Hb被稳定化。上述标准曲线例如可以利用上述方法测定作为已知Hb量(Hb浓度)的多个含有Hb的试样，并由这些测定值和已知Hb量而作成。另外，吸光度的测定波长并无特别限定，例如为400～660nm的范围，利用上述化合物进行的试样处理时间例如为0.2～30分钟的范围。通过该方法测定Hb时，除了在添加上述化合物后、且添加蛋白酶前进行吸光度测定之外，与上述同样操作，接着进行蛋白酶处理等，可以求出HbAlc浓度，因此成为更简单的测定方法。
(GHbLys的测定方法)
作为本发明的糖化率的测定方法，另外还可以列举出例如糖化Hb的GHbLys(Lys糖化率)的测定。上述HbAlc由于缓慢地应答血糖值的变动，因此如果不持续数小时左右的高血糖，则无法确认HbAlc的上升。与此相对，GHbLys即便对数十分钟左右的高血糖状态也可灵敏地反应。因此，如果测定GHbLys，例如可以检测血糖值变高的饭后1～2小时的高血糖。因而，GHbLys成为高血糖的指标，其测定在临床领域中变得极为有用。
测定糖化Hb的GHbLys时，利用蛋白酶得到的Hb切断物为ε-氨基被糖化了的赖氨酸或含有其的糖化肽，只要使FAOD作用于赖氨酸的糖化部分即可。另外，切断的氨基酸或肽如上所述，可以通过选择所用蛋白酶的种类来决定。
GHbLys的测定方法中使用的FAOD并无特别限定，优选至少作用于氨基酸侧链的氨基(例如ε-氨基)被糖化了的氨基酸或肽、并对下述式(1’)所示的反应进行催化的酶(FAOD-S)。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2
→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2(1’)
上述式(1’)中，除了R2以外与上述式(1)相同。上述式(1’)中，R2可以用下述式(4’)表示。在下述式(4’)中，“-(CH2)4-”表示赖氨酸侧链基团中被糖化了的氨基以外的部分。
-(CH2)4-CH(NH-R6)-CO-R7(4’)
上述式(4’)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(5’)表示。下述式(5’)中，n为0以上的整数，R3与上述同样地表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全部相同，也可以不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H(5’)
上述式(4’)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(4’)表示。下述式(6’)中，n为0以上的整数，R3与上述同样地表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全部相同，也可以不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH(6’)
作为特异性地作用于上述糖化了的氨基酸侧链的FAOD-S，例如可以列举出镰刀菌属来源的FAOD(日本生物工学会大会平成12年度“Fusariumoxysporum由来アミノ酸オキシダ一ぜの基質特異性の変换；藤原真纪等”)等。
另外，FAOD还可以进一步具有上述(1’)以外的底物特异性。作为这种FAOD，可以列举出上述FAOD-αS。在为这种FAOD时，例如如国际公开第2002/0065 19号小册子所记载的蛋白酶等那样，选择不生成N末端的α位氨基被糖化了的糖化氨基酸的蛋白酶(例如将赖氨酸或含有赖氨酸的肽特异性地进行切断的蛋白酶)，通过与其组合，从而可以抑制对其它糖化部位的作用。
GHbLys的测定首先在上述促进化合物的存在下进行试样的蛋白酶处理，切断赖氨酸或含有赖氨酸的肽，利用上述FAOD对其进行处理。然后，通过与上述相同的方法求出Hb的赖氨酸糖化量，如下述式所示，通过算出该Hb的赖氨酸糖化量和试样中的总Hb量之比(百分比)，可以求出GHbLys(％)。
GHbLys％＝(Lys糖化量/Hb量)×100
由吸光度计算Lys糖化量例如通过使用将Hb的赖氨酸已知糖化量和吸光度的关系作图得到的标准曲线而进行。例如，对于Lys糖化量已知的Hb标准液，与上述同样地测定吸光度，从而作成表示该标准液的测定值和已知糖化量的关系的标准曲线。然后，通过在该标准曲线中代入如上测定的吸光度，可以算出Lys糖化量。
(HbAlc和GHbLys的测定)
上述Hb的两种糖化率(HbAlc和GHbLys)也可以通过利用FAOD的底物特异性，使用相同的试样来连续地测定。即，在上述促进化合物的存在下，对含有Hb的试样进行蛋白酶处理，从而切断β链N末端缬氨酸或β链N末端肽、以及赖氨酸或含有赖氨酸的肽。然后，首先用特异性地作用于α-氨基的糖化部分(例如缬氨酸的糖化部分)、且难以作用于氨基酸侧链的糖化部分的FAOD-α进行处理，从而测定HbAlc。之后，进一步用特异性地作用于氨基酸侧链的糖化部分(赖氨酸侧链的糖化部分)、且难以作用于α-氨基的糖化部分的FAOD-S进行处理，从而可以测定GHbLys。另外，FAOD的处理顺序并不限定于此，例如也可以在通过利用FAOD-S进行处理而测定GHbLys后，通过用FAOD-α进行处理来测定HbAlc。
使用全血试样测定HbAlc或GHbLys之类的血细胞内蛋白质的糖化率时，如上所述，通过使用上述促进化合物，还可以获得以下的效果。在进行血细胞内蛋白质的糖化率测定时，全血试样是实施溶血处理后作为溶血试样使用的。此时，溶血试样中共存有血清中的糖化蛋白质(例如糖化白蛋白)，但如果在上述促进化合物的存在下进行蛋白酶处理，虽然机理还不清楚，但上述糖化Hb的切断被促进，而糖化白蛋白的切断被抑制。因此，例如还可以避免糖化白蛋白等混存、从而FAOD也作用于其糖化部位的问题。另外，这种问题例如在蛋白酶既作用于Hb又作用于白蛋白、且之后添加的FAOD均作用于任一蛋白质切断物的情况下发生。因此，该问题也可以通过选择对上述目标蛋白质的目标部位(FAOD作用的糖化氨基酸或糖化肽)进行选择性地切断的蛋白酶而消除。
在以上的本发明的糖化率的测定中，各处理工序如上所述可以分别进行，例如还可以通过以下所示组合同时进行各处理。另外，蛋白酶、FAOD、POD、显色底物的添加顺序也并无特别限定。
1：溶血处理+蛋白酶处理
2：蛋白酶处理+FAOD处理
3：FAOD处理+POD处理
4：蛋白酶处理+FAOD处理+POD处理
另外，本发明的蛋白质切断促进剂如上所述，为对利用蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽进行促进的促进剂，其特征在于，含有上述式(I)所示的促进化合物。
本发明的蛋白质切断促进剂只要含有上述化合物即可，还可以仅为该化合物，还可以含有对β链N末端肽等的切断没有影响的其它物质。作为其它物质，例如可以列举出亚硝酸之类的硝基化合物。另外，本发明的促进剂中的上述化合物的浓度并无特别限定，只要是添加于试样中时达到上述浓度的浓度即可。
以下通过实施例和比较例进一步具体地说明本发明，但本发明并不局限于这些。
实施例1
在上述式(I)所示的各种化合物的存在下进行Hb的切断，通过酶法测定HbAlc。测定所使用的试样、试剂和测定方法如下所示。另外，作为下述第1试剂(R1-1)的化合物，使用下述No.1～9的化合物，No.10为未添加化合物(精制水)。
表1
(第1试剂：R1-1)
  化合物(No.1～9)                8.2g/L
  三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)  50mmol/L(pH为8)
  FAOD*                          2.5KU/L
  POD                            20KU/L
                                                                        
  FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
(化合物：No.1～10)
化合物                           上述式(I)R的碳原子数
                                                             
No.1正十二烷基-β-D-麦芽糖苷       12
No.2蔗糖单月桂酯                   12
No.3正癸基-β-D-麦芽糖苷           10
No.4 6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷    12
No.5正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷       9
No.6正辛基-β-D-麦芽糖苷           8
No.7正庚基-β-D-硫代葡糖苷         7
No.8胆酸
No.9聚氧乙烯烷基醚(商品名Brij 98)
No.10精制水(对照)
(第2试剂：R2-1)
金属蛋白酶(爱科来公司生产)    1300KU/L
CaCl2                         5mmol/L
MOPS                          150mmol/L(pH为7.5)
显色试剂                      0.25mmol/L
(商品名TPM-PS、同仁化学公司生产、以下相同)
(试样)
(1)HbA0试样
将健康人的Hb供于强阳离子交换柱(商品名POROS-HS50：Applied Biosystems公司生产)，通过常规方法精制回收HbA0的级分。该试样的HbAlc％为0％、血红蛋白浓度为2g/L。
(2)低HbAlc试样
在糖尿病患者的血细胞中加入等量的精制水以使血细胞溶血，通过离心分离除去血细胞膜后制成试样。该试样的HbAlc％为12％、血红蛋白浓度为2g/L。
(3)高HbAlc试样
将健康人的Hb供于强阳离子交换柱(商品名POROS-HS50：Applied Biosystems公司生产)，精制回收HbAlc的级分。该试样的HbAlc％为30％、血红蛋白浓度为2g/L。
另外，上述各试样的HbAlc％利用测定装置(商品名HA-8160：爱科来公司生产)测定，血红蛋白浓度利用常规方法的碱性高铁血红素法测定。
(方法)
将上述各试样15μL和各第1试剂(R1-1)76μL混合后在37℃下孵育5分钟，然后进一步添加第2试剂(R2-1)26μL，在37℃下进行蛋白酶处理和显色反应。然后，利用生物化学自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司生产、以下相同)测定刚要添加第2试剂前的反应液在波长571nm的吸光度(A0)、和添加第2试剂1.5分钟后的反应液在波长571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。将它们的结果示于下述表2中。
表2
    化合物No.                    吸光度(Abs.)
    HbA0HbAlc％＝0     低HbAlcHbAlc％＝12％    高HbAlcHbAlc％＝40％
    1     0.010     0.016    0.027
    2     0.010     0.020    0.028
    3     0.011     0.020    0.022
    4     0.008     0.016    0.022
    5     0.011     0.018    0.020
    6     0.001     0.002    0.002
    7     0.003     0.004    0.003
    8     0.003     0.002    0.004
    9     0.004     0.006    0.005
    10     0.001     0.001    0.002
如上述表2所示，当使用上述式(I)所示的化合物(No.1～5)时，随着各试样中HbAlc％的增加，吸光度增加。这表明，作为HbAlc特征的β链N末端肽在短时间(5分钟)内被切断，且FAOD发挥了作用。与此相对，当使用上述式(I)中R(直链烷基)的碳原子数小于9的化合物(No.6和7)、胆酸(No.8)、没有糖残基的普通表面活性剂(No.9)时，且在不存在上述(I)所示的化合物(No.10)时，未观察到随着各试样中HbAlc％增加的吸光度增加。即，在短时间内不能高效地进行N末端肽的切断。
实施例2
调制在实施例1的第1试剂(R1-1)中进一步添加有NaNO2的第1试剂(R1-2)，与上述实施例1同样操作并测定吸光度。将其结果示于下述表4中。另外，使用了第1试剂(R1-1)的实施例1的结果也一并示于下述表4中。
表3
(第1试剂：R1-1～1-2)
                                         R1-1  R1-2
                                                           
化合物(No.1-8)        8.2g/L             ○    ○
三(羟甲基)甲基甘氨酸  50mmol/L(pH为8)    ○    ○
NaNO2                 14mmol/L           -     ○
FAOD*                 2.5KU/L            ○    ○
POD                   20KU/L             ○    ○
                                                                
FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
表4
No.         R1-1(未添加NaNO2)       R1-2(添加NaNO2)
        吸光度(Abs.)       吸光度(Abs.)
  HbA0HbAlc％＝0    高HbAlcHbAlc％＝40％   HbA0HbAlc％＝0  高HbAlcHbAlc％＝40％
    1   0.010    0.027   0.002  0.080
    2   0.010    0.028   0.003  0.081
    3   0.011    0.022   0.003  0.050
    4   0.008    0.022   0.003  0.056
    5   0.011    0.020   0.003  0.044
    6   0.001    0.002   0.002  0.006
    7   0.003    0.003   0.004  0.004
    8   0.003    0.004   0.002  0.003
    9   0.004    0.005   0.004  0.012
    10   0.001    0.002   0.002  0.003
如上述表4所示，通过进一步添加亚硝酸，可见吸光度的进一步增加。由此结果可知，通过在上述式(I)所示的化合物的基础上并存亚硝酸，可以更进一步地促进β链N末端肽的切断。
实施例3
使用HbAlc的标准物质，确认本发明的HbAlc测定方法的测定精度。
(试样)
作为标准物质，使用HbAlc测定用实验试样标准物质(JDS HbAlcLot2：福祉·医疗技术振兴会生产)、认证HbAlc校准液(calibrator)(HbAlc标准化IFCC，Working Group生产)和认证HbAlc对照(HbAlc标准化IFCC，Working Group生产)，用精制水将它们稀释25倍后作为标准试样。
(方法)
将上述各标准试样13μL和第1试剂(R1-3)78μL混合后在37℃下孵育5分钟，然后进一步添加与上述实施例1相同的第2试剂(R2-1)26μL，在37℃下进行蛋白酶处理和显色反应。然后，利用上述生物化学自动分析装置测定刚要添加第2试剂前的反应液在波长571nm的吸光度(A0)、和添加第2试剂1.5分钟后的反应液在波长571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。然后由该吸光度差，如下所述算出HbAlc％，从而确认了该计算结果与上述标准试样的HbAlc％显示值的相关关系。由上述吸光度差求得的HbAlc％和显示值的结果示于下述表6和图1的曲线中。
(HbAlc％的计算方法)
在标准试样的Hb浓度的显示值上乘以HbAlc％的显示值，由此计算HbAlc浓度。将该值作为HbAlc浓度的显示值。由该标准试样的HbAlc浓度显示值与标准试样的吸光度差求出一次相关式(linearcorrelation function)，将其作为标准曲线。然后，用该标准曲线由吸光度差(A1.5-A0)求出HbAlc浓度，通过将该HbAlc浓度除以Hb浓度并乘以100而求得HbAlc％。另外，Hb浓度如下计算。首先使用刚要添加第2试剂前的反应液在波长571nm的吸光度(A0)，求出与Hb浓度的显示值的一次相关式，制作标准曲线。然后使用该标准曲线，由A0算出Hb浓度。
表5
(第1试剂：R1-3)
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷    10g/L
MOPS                        50mmol/L(pH为7.5)
NaNO2                       14mmol/L
FAOD*                       2.5KU/L
POD                         10KU/L
                                              
FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
表6
标准试样     标准试样的显示值HbAlc％     由吸光度算出的值HbAlc％
    JDS Lot2 Level 1     2.57     2.43
    JDS Lot2 Level 2     4.01     3.94
    JDS Lot2 Level 3     6.08     6.18
    JDS Lot2 Level 4     8.81     8.33
    JDS Lot2 Level 5     11.75     12.20
    IFCC校准液Level 1     3.16     3.03
    IFCC校准液Level 2     4.13     3.91
    IFCC校准液Level 3     5.08     5.11
    IFCC校准液Level 4     6.34     6.52
    IFCC校准液Level 5     7.52     7.53
    IFCC校准液Level 6     8.74     9.07
    IFCC校准液Level 7     9.89     9.79
    IFCC校准液Level 8     12.03     11.42
    IFCC对照低     3.10     3.33
    IFCC对照中     5.10     5.41
    IFCC对照高     7.50     7.63
如图1所示，由吸光度算出的值与标准试样的显示值的相关系数高达0.995，显示了极为优异的相关关系。由此结果可以说，通过本发明的测定方法，可以正确地测定HbAlc％。
实施例4
在正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的存在下对Hb进行蛋白酶处理，确认N末端二肽(果糖基-Val-His)是否被切断。
表7
(第1试剂：R1-4)
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷    10g/L
MOPS                        50mmol/L(pH为7.5)
NaNO2                       14mmol/L
(第2试剂：R2-4)
金属蛋白酶(爱科来公司生产)  1300KU/L
CaCl2                       5mmol/L
MOPS                        150mmol/L(pH为7.5)
(试样)
使用商品名Hemoglobin Alc P186-4(HbAlc％＝44％、SCIPAC公司生产)、商品名Hemoglobin(基本上无HbAlc)P2111-3(HbAlc％＝0％、SCIPAC公司生产)。
(HPLC)
HPLC柱使用商品名YMC PACK ODS-AM 250×6.0(YMC公司生产)，洗脱液分别使用A液(体积比KH2PO4∶甲醇＝100∶2)和B液(体积比KH2PO4∶甲醇＝100∶100)。样品量为100μL、检测波长为215nm、洗脱液的流速为1mL/分钟，从开始洗脱到2分钟使用A液(100％)，之后用10分钟时间使B液的体积比例上升至100％，、进而使用15分钟B液(100％)。作为HPLC的标准试样，使用Val-His(Bachem公司生产)以及通过常规方法由上述Val-His和葡萄糖调制的果糖基-Val-His。另外，Val-His的保留时间约为6.4分钟、果糖基-Val-His的保留时间约为10.3分钟。
将上述各试样520μL和第1试剂(R1-4)1560μL混合后在37℃下孵育5分钟，然后进一步添加上述第2试剂(R2-4)520μL，在37℃下进行1分钟的蛋白酶处理。将该反应液移至Ultrafree-4超滤器(分子量5000：Millipore公司生产)进行离心过滤(4℃、3000rpm、20分钟)，将所得滤液作为样品供于HPLC。其结果示于图2中。图2为样品的色谱图，图2(A)表示使用了HbAlc％＝44％的试样的结果，图2(B)表示使用了HbAlc％＝0％的试样的结果。
当对表示HbAlc＝44％的试样结果的图2(A)和表示HbAlc％＝0％的试样结果的图2(B)进行比较时，可以检测到果糖基-Val-His(F-VH)的峰高于Val-His(VH)的峰。由此可知，相比于HbAlc的N末端，被糖化了的Val-His(果糖基-Val-His)在极短时间(1分钟)内被高效地切断。
实施例5
作为化合物，研究了十二烷基麦芽糖苷类。另外，作为下述第1试剂(R1-5)中的化合物，使用下述表所示的化合物(No.1～6)。
表8
(第1试剂：R1-5)
化合物(No.1～6)         5.2g/L
三(羟甲基)甲基甘氨酸    50mmol/L(pH为8)
NaNO2                   3mmol/L
DTPA                    0.2g/L
POD                     20KU/L
(化合物：No.1～6)
化合物                  上式(I)R的碳原子数
                                                     
No.1辛基-β-D-麦芽糖苷             8
No.2 5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷    11
No.3十一烷基-β-D-麦芽糖苷         11
No.4十二烷基-β-D-麦芽糖苷         12
No.5十六烷基-β-D-麦芽糖苷         16
No.6 3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷  10
(第2试剂：R2-5)
金属蛋白酶(爱科来公司生产)    1300KU/L
CaCl2                         5mmol/L
MOPS                          150mmol/L
TPM-PS                        0.25mmol/L
(第3试剂：R3-5)
FAOD**                        52KU/L
FAOD*                         13KU/L
MOPS                          20mmol/L
                                                       
FAOD**：商品名FAOD3(爱科来公司生产、以下相同)
FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
(试样)
从由健康者采集的全血和由糖尿病患者采集的全血中分别回收血细胞，加入等量的精制水使血细胞溶血，通过离心分离除去血细胞膜后作为试样。健康者来源的试样的HbAlc％＝3.5％，糖尿病患者来源的试样的HbAlc％＝8.5％。
(方法)
将上述各试样13μL和各第1试剂(R1-5)78μL混合后在37℃下孵育5分钟，然后进一步添加上述第2试剂(R2-5)26μL，在37℃下进行4分钟的蛋白酶处理。进一步添加第3试剂(R3-5)15μL后进行显色反应。利用上述生物化学自动分析装置测定刚要添加第3试剂前的反应液在波长571nm的吸光度(A0)、和添加第3试剂1.5分钟后的反应液在波长571nm的吸光度(A1.5)，求得其差(A1.5-A0)。将它们的结果示于下述表9中。
表9
化合物No.        吸光度(Abs.)
    健康者     糖尿病患者
    1     C8     0.013     0.015
    2     C11     0.031     0.040
    3     C11     0.034     0.047
    4     C12     0.033     0.045
    5     C16     0.021     0.031
    6     C10     0.020     0.030
如上述表9所示，当使用直链烷基的碳原子数小于9的化合物(No.1)时，尽管健康者试样和糖尿病患者试样的HbAlc值不同，但也只得到了同等程度的吸光度。这表明未能高效地切断β链N末端肽。与此相对，当使用上述式(I)所示的化合物(No.2～6)时，两试样间可见吸光度差，可知高效地切断了β链N末端。
实施例6
对与正十二烷基-β-D-麦芽糖苷组合的蛋白酶种类进行研究。
表10
(第1试剂：R1-6)
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷  4.8g/L
三(羟甲基)甲基甘氨酸      50mmol/L(pH为8)
NaNO2                     14mmol/L
FAOD*                     10KU/L
POD                       20KU/L
                                          
FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
(第2试剂：R2-6)
蛋白酶                    规定量
CaCl2                     5mmol/L
MOPS                      150mmol/L
TPM-PS                    0.25mm
作为上述第2试剂(R2-6)中的蛋白酶，使用了以下物质(No.1-6)。
No.1金属蛋白酶(爱科来公司生产)         1300KU/L
No.2蛋白酶A“Amano”G(天野酶公司生产)  0.1g/L
No.3蛋白酶M“Amano”G(天野酶公司生产)  0.1g/L
No.4蛋白酶S“Amano”G(天野酶公司生产)  0.1g/L
No.5肽酶R(天野酶公司生产)              0.1g/L
No.6木瓜蛋白酶M-40(天野酶公司生产)     0.1g/L
(试样)
(1)HbA0试样
用精制水将商品名Hemoglobin(基本上无HbAlc)P2111-3(HbAlc％＝0％、SCIPAC公司生产)稀释25倍(体积)后作为试样。该试样的HbAlc％为0％。
(2)低HbAlc试样
在糖尿病患者的血细胞中加入25倍体积量的精制水，使其溶血，作为试样。该试样的HbAlc％为8.5％。
(3)高HbAlc试样
用精制水将商品名Hemoglobin Alc P186-4(HbAlc％＝44％、SCIPAC公司生产)稀释25倍(体积)后作为试样。该试样的HbAlc％为44％。
(方法)
将上述各试样13μL和第1试剂(R1-6)78μL混合后在37℃下孵育5分钟，然后添加第2试剂(R2-6)26μL，在37℃下进行蛋白酶处理和显色反应。然后，利用上述生物化学自动分析装置测定刚要添加第2试剂前的反应液在波长571nm的吸光度(A0)、和添加第2试剂10分钟后的反应液在波长571nm的吸光度(A10)，求得其差(A10-A0)。将它们的结果示于下述表11中。
表11
  蛋白酶No.                 吸光度(Abs.)
  HbA0HbAlc％＝0     低HbAlcHbAlc％＝8.5％    高HbAlcHbAlc％＝44％
  1   0.020     0.030    0.034
  2   0.015     0.016    0.025
  3   0.026     0.017    0.038
  4   0.013     0.015    0.026
  5   0.013     0.011    0.025
  6   0.014     0.016    0.026
如上述表11所示，随着各试样的HbAlc％的增加，吸光度增加，因此可知可以使用各种蛋白酶。
实施例7
在十二烷基-β-D-麦芽糖苷的存在下进行Hb的蛋白酶处理，使用所得片断，通过免疫法测定HbAlc。
表12
(蛋白酶试剂)
                                         试剂A  试剂B
                                                                             
十二烷基-β-D-麦芽糖苷   5g/L             -     ○
Tris-HCl                 20mmol/L(pH为7)  ○    ○
蛋白酶*                  0.2mg/L          ○    ○
                                                                              
蛋白酶*：商品名内切蛋白酶Glu-C(Roche公司生产)
胶乳试剂：商品名COBAS试剂HbAlc、R2(Roche公司生产)
凝集试剂：商品名COBAS试剂HbAlc、R3(Roche公司生产)
溶血试剂：商品名HbAlc溶血试剂“ROCHE”(Roche公司生产)
(标准试样、血细胞试样)
将作为Hb的β链N末端的肽序列(6残基：Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu)、且通过常规方法将Val的α-氨基糖化了的产物作为标准物质，将其溶解在溶血试剂中使其达到6μmol/L，从而调制了标准试样。另外，作为血细胞试样，使用了糖尿病患者的血细胞(HbAlc％＝11.6％、HbAlc％浓度5.10μmol/L、Hb浓度＝2.2mmol/L)。
将试样(标准试样、血细胞试样)10μL和蛋白酶试剂(试样A(-)、试剂B(+))500μL混合以调制溶血试样，将其在37℃下处理规定时间(10分钟、150分钟、270分钟)。在处理后的溶血试样30μL中加入精制水120μL以调制稀释液，在上述稀释液2μL中加入上述胶乳试剂80 μL，并在37℃下处理5分钟，然后进一步添加凝集试剂16μL。然后，对该反应液测定添加上述凝集试剂后30秒～60秒的吸光度变化(波长545nm)。然后，按照试剂盒(COBAS试剂HbAlc)的使用说明书，由吸光度算出HbAlc浓度。另外，使用精制水代替试样作为对照，并同样地测定吸光度。将它们的结果示于下述表13中。在下述表中，(+)表示添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷、(-)表示未添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷。
表13
(A)标准试样
      蛋白酶处理时间10分钟
    试剂A(-)     试剂B(+)
精制水(Abs.)     0.594     0.596
标准试样(Abs.)     0.475     0.482
与精制水之差(Abs.)     0.119     0.116
(B)血细胞试样
                           蛋白酶处理时间
  10分钟后   150分钟后   270分钟后
  试剂A(-)   试剂B(+)   试剂A(-)   试剂B(+)   试剂A(-)   试剂B(+)
精制水(Abs.)   0.594   0.596   0.594   0.596   0.594   0.596
血细胞试样(Abs.)   0.586   0.564   0.580   0.517   0.575   0.497
与精制水之差(Abs.)   0.008   0.032   0.014   0.078   0.019   0.099
浓度换算值(μmol/L)   0.40   1.66   0.70   4.03   0.96   5.07
如上述表13(B)所示，使用添加有十二烷基-β-D-麦芽糖苷的试剂B(+)时，血细胞试样和精制水的吸光度之差随着蛋白酶处理时间的增加而增加。另外，使用上述表13(A)所示的标准试样的结果(吸光度差)，由处理270分钟时的吸光度差换算的HbAlc浓度为5.07μmol/L，与预先求得的糖尿病患者试样的HbAlc浓度(5.1μmol/L)基本一致，因此可知通过270分钟的处理，完全地切断了β链N末端肽。与此相对，使用未添加十二烷基-β-D-麦芽糖苷的试剂A(-)时，随着蛋白酶处理时间的增加可见缓慢的吸光度上升，但进行了270分钟蛋白酶处理时的HbAlc浓度换算值为0.96μmol/L，只是预先求得的糖尿病患者试样的HbAlc浓度的约1/5左右。由该结果可知，通过本发明的Hb切断方法，可以高效地切断β链N末端，且在利用免疫法进行的HbAlc测定中也是有效的。
实施例8
对于使用申请人另外申请的四唑鎓化合物来促进利用蛋白酶的切断的方法(WO02/027012)、和使用本发明的促进化合物的方法，比较HbAlc测定中的效果。作为上述四唑鎓化合物，使用了2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓单钠盐(商品名WST-3、同仁化学研究所公司生产)。
另外，作为上述第1试剂(R1-8)中的化合物，使用正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(化合物No.1)作为实施例、使用WST-3(化合物No.2)作为参考例。将未添加化合物者(No.3：精制水)作为比较例。
表14
(第1试剂：R1-8)
化合物(No.1～2)    规定量
PIPES              30mmol/L(pH为7)
FAOD*              1.5KU/L
POD                10KU/L
                                             
FAOD*：商品名FPOX-CE(Kikkoman公司生产)
(化合物：No.1-3)
化合物
                                                   
No.1  正十二烷基-β-D-麦芽糖苷    2.5g/L
No.2  WST-3                       2mmol/L
No.3  未添加(精制水)
(第2试剂：R2-8)
金属蛋白酶(爱科来公司生产)        4000KU/L
CaCl2                             5mmol/L
Tris                              200mmol/L
MES                               30mmol/L(pH为5.5)
显色试剂                          0.25mmol/L
(商品名DA-67、和光纯药公司生产、以下相同)
(试样)
将用精制水稀释健康人全血31倍的产物和用精制水稀释下述商品31倍的产物作为试样。作为试样的对照，使用了精制水。
IFCC control Barcelona，Low HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝3.2％)
IFCC control Barcelona，Medium HbAlc，Medium Hemoglobin(HbAlc％＝5.1％)
IFCC control Barcelona，High HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝7.5％)
(方法)
将上述各试样6.5μL和精制水6.5μL混合，进而混合各第1试剂(R1-8)78μL。在37℃下孵育该混合液5分钟后，添加第2试剂(R2-8)19.5μL，在37℃下进行蛋白酶处理和显色反应。然后，利用生物化学自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司生产)测定刚要添加第2试剂前的反应液在波长658nm的吸光度(A0)、和添加第2试剂5分钟后的反应液在波长658nm的吸光度(A5)，求得其差(A5-A0)。将它们的结果示于下述表15中。下述表15中，括号内的数值表示与试样对照(精制水)的结果之差。
表15
   化合物No.                          吸光度(Abs.)
精制水   健康人全血   IFCC低3.2％   IFCC中5.1％   IFCC高7.5％
   1正十二烷基β-D-麦芽糖苷 0.011   0.029(0.018)   0.025(0.014)   0.037(0.026)   0.050(0.039)
   2WST-3 0.029   0.026(-0.003)   0.025(-0.004)   0.026(-0.003)   0.026(-0.003)
   3未添加 0.014   0.015(0.001)   0.014(0.000)   0.015(0.001)   0.015(0.001)
如上述表15所示，未添加促进化合物的比较例(No.3)未见吸光度的增加，而根据使用了正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的实施例(No.1)，随着各试样中HbAlc％的增加，吸光度增加。这表明，作为HbAlc特征的β链N末端肽在短时间(5分钟)内被切断，且FAOD发挥了作用。另外，添加了WST-3的参考例(No.2)中，通过5分钟的极短时间的处理，未见随着HbAlc％增加的吸光度增加。由以上结果可知，根据正十二烷基-β-D-麦芽糖苷，可以比以往技术大大缩短切断所需要的时间。
实施例9
在正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的存在下进行Hb的切断，通过酶法连续地测定HbAlc和GHbLys。另外，FAOD组合使用了特异性地作用于α位被糖化了的肽(β链N末端肽)的FPOX-CE(商品名；Kikkoman公司生产)和特异性地作用于ε位被糖化了的肽(赖氨酸肽)的FAODL(商品名；爱科来公司生产)。
表16
(第1试剂：R1-9)
FPOX-CE                       1.5KU/L
POD                           10KU/L
PIPES                         30mmol/L(pH为7)
正十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷    2.5g/L
(第2试剂：R2-9)
金属蛋白酶(爱科来公司生产)    4000KU/L
CaCl2                         5mmol/L
Tris                          200mmol/L
MES                           30mmol/L(pH为5.5)
显色试剂                      0.03mmol/L
(商品名DA-67、和光纯药公司生产)
(第3试剂：R3-9)
FAODL                         20KU/L
PIPES                         20mmol/L(pH为7)
(试样)
将用下述稀释液稀释健康人全血31倍的产物和用下述稀释液稀释下述商品31倍的产物作为试样。作为试样的对照，使用了精制水。
IFCC control Barcelona，Low HbAlc，Normal Hemoglobin(HbAlc％＝3.2％)
IFCC control Barcelona，Medium HbAlc，Medium Hemoglobin(HbAlc％＝5.1％)
IFCC control Barcelona，High HbAlc，Normal  Hemoglobin(HbAlc％＝7.5％)
(稀释液)
PIPES                     30mmol/L(pH为7)
正十二烷基-β-D-麦芽糖苷  0.5g/L
KNO2                      3mM
(方法)
将上述各试样6.5μL和精制水6.5μL混合，进而混合各第1试剂(R1-9)78μL。在37℃下孵育该混合液5分钟后，添加第2试剂(R2-8)19.5μL，在37℃下进行4分钟蛋白酶处理和第1阶段的显色反应。该反应后，进一步添加第3试剂(R3-9)19.5μL，进行第2阶段的显色反应(37℃、6分钟)。然后，利用生物化学自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司生产)测定刚要添加第2试剂前的反应液在波长658nm的吸光度(A0)、添加第2试剂4分钟后(刚要添加第3试剂前)的反应液在波长658nm的吸光度(A4)、以及添加第3试剂6分钟后的反应液在波长658nm的吸光度(A10)、，求得其差(A4-A0)和(A10-A4)。
将它们的结果示于下述表17中。表17中，(A4-A0)的吸光度对应HbAlc、(A10-A4)的吸光度对应GHbLys。括号内的数值表示与试样对照(精制水)的结果之差。
表17
  实施例9-1                             吸光度(Abs.)
精制水 健康人全血   IFCC低3.2％   IFCC中5.1％   IFCC高7.5％
第1试剂FPOX-CE(A4-A0) 0.061   0.073(0.012)   0.072(0.011)   0.082(0.021)   0.095(0.034)
第2试剂FAODL(A10-A4) 0.039   0.042(0.010)   0.041(0.008)   0.048(0.017)   0.055(0.030)
如上可知，FPOX-CE与β链N末端肽反应，FAODL与ε位糖化赖氨酸肽反应、但不与β链N末端肽反应。因此，通过在正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的存在下进行蛋白酶处理，从而从Hb中切断β链N末端肽和ε位糖化赖氨酸肽，通过使用底物特异性不同的两种FAOD，可以连续地对它们进行测定。因而，若观察表17的结果，可确认各FAOD处理后的吸光度随着各试样的HbAlc％的增加而增加。因此，通过本实施例的方法，可以连续地测定两种糖化率。
如上所述，根据本发明的蛋白质切断方法，由于例如可以迅速地切断作为HbAlc特征部分的β链N末端肽等，因此可以精度良好地确定蛋白质的糖化量。因而，本发明的蛋白质的切断方法、糖化量的测定方法在临床检查领域等中是极为有用的。

Claims (25)

1.蛋白质的切断方法，其通过蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽，其特征在于，在下述式(I)所示的化合物的存在下对蛋白质进行蛋白酶处理，
R-X(I)
所述式中，R是碳原子数为9以上的烷基或取代烷基，X为糖残基。
2.根据权利要求1所述的切断方法，其中，所述式(I)中，R是碳原子数为9～16的直链烷基或直链酰基、碳原子数为10～40且主链碳原子数为9～16的支链烷基或支链酰基、或者被碳原子数为3～8的环烷基取代了的直链碳原子数为4～13的直链烷基。
3.根据权利要求1所述的切断方法，其中，所述式(I)中，X为单糖或二糖的糖残基。
4.根据权利要求3所述的切断方法，其中，所述式(I)中，X为选自甘露糖苷、麦芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷和硫代麦芽糖苷中的至少一种糖残基。
5.根据权利要求1所述的切断方法，其中，所述化合物为选自6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酯、正癸基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷、5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷和十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷中的至少一种化合物。
6.根据权利要求1所述的切断方法，其中，所述蛋白质为血红蛋白。
7.根据权利要求1所述的切断方法，其中，从血红蛋白中切断的氨基酸为选自β链N末端缬氨酸、赖氨酸及它们的糖化物中的至少一种，从血红蛋白中切断的肽为选自含有β链N末端缬氨酸的肽、含有β链N末端糖化缬氨酸的肽、含有赖氨酸的肽及含有糖化赖氨酸的肽中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的切断方法，其中，从蛋白质中切断的肽是氨基酸残基数为2～6的肽。
9.根据权利要求1所述的切断方法，其中，在所述化合物和硝基化合物的存在下对蛋白质进行蛋白酶处理。
10.根据权利要求9所述的切断方法，其中，所述硝基化合物为亚硝酸或其盐。
11.蛋白质糖化率的测定方法，其特征在于，其包括下述工序：用蛋白酶切断蛋白质的工序、使果糖基氨基酸氧化酶作用于所得蛋白质切断物的糖化部分的工序、以及通过测定所述糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶的氧化还原反应来确定蛋白质糖化率的工序，其中，通过权利要求1所述的蛋白质切断方法进行所述蛋白质的切断，并使所述果糖基氨基酸氧化酶作用于通过所述切断工序获得的氨基酸或肽的糖化部分。
12.根据权利要求11所述的测定方法，其中，蛋白质为血红蛋白。
13.根据权利要求12所述的测定方法，其中，血红蛋白的糖化率为HbAlc值。
14.根据权利要求13所述的测定方法，其中，所述蛋白质切断物为β链N末端缬氨酸或含有β链N末端缬氨酸的肽，且使果糖基氨基酸氧化酶作用于β链N末端缬氨酸的糖化部分。
15.根据权利要求12所述的测定方法，其中，血红蛋白的糖化率为赖氨酸糖化率。
16.根据权利要求15所述的测定方法，其中，所述蛋白质切断物为赖氨酸或含有赖氨酸的肽，且使果糖基氨基酸氧化酶作用于赖氨酸的糖化部分。
17.根据权利要求12所述的测定方法，其测定试样中所含血红蛋白的糖化率，其中，所述试样为全血试样、血细胞试样或它们的溶血试样。
18.根据权利要求12所述的测定方法，其在通过蛋白酶切断血红蛋白之前，在含有血红蛋白的试样中添加所述式(I)所示的化合物，然后测定添加有所述化合物的试样的光学变化量，并由该光学变化量求出所述试样中的血红蛋白量；另外，通过蛋白酶切断添加有所述化合物的试样中的血红蛋白后，通过测定所述切断物的糖化部分与果糖基氨基酸氧化酶的氧化还原反应来测定血红蛋白的糖化量，并由所述血红蛋白量和所述糖化量求得Hb的糖化率。
19.促进剂，其对通过蛋白酶从蛋白质中切断氨基酸或肽进行促进，其特征在于，包含下述式(I)所示的化合物，
R-X(I)
所述式中，R是碳原子数为9以上的烷基或取代烷基，X为糖残基。
20.根据权利要求19所述的促进剂，其中，所述式(I)中，R是碳原子数为9～16的直链烷基或直链酰基、碳原子数为10～40且主链碳原子数为9～16的支链烷基或支链酰基、或者被碳原子数为3～8的环烷基取代了的直链碳原子数为4～13的直链烷基。
21.根据权利要求19所述的促进剂，其中，所述式(I)中，X为单糖或二糖的糖残基。
22.根据权利要求19所述的促进剂，其中，所述式(I)中，X为选自甘露糖苷、麦芽糖苷、吡喃果糖-吡喃葡萄糖苷和硫代麦芽糖苷中的至少一种糖残基。
23.根据权利要求19所述的促进剂，其中，所述化合物为选自6-环己基己基-β-D-麦芽糖苷、蔗糖单月桂酯、正癸基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正壬基-β-D-硫代麦芽糖苷、十六烷基-β-D-麦芽糖苷、5-环己基戊基-β-D-麦芽糖苷、十一烷基-β-D-麦芽糖苷、3-氧代十三烷基-α-D-甘露糖苷和十二烷基-αβ-D-麦芽糖苷中的至少一种化合物。
24.根据权利要求19所述的促进剂，其进一步含有硝基化合物。
25.根据权利要求24所述的促进剂，其中，所述硝基化合物为亚硝酸或其盐。
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