CN1890379B - 糖化胺的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够进行可靠性优异的糖化胺的测定方法。在试样中添加果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)，将上述试样中存在的与测定对象糖化胺不同且作为非测定对象物的糖化胺除去后，在上述试样中添加蛋白酶使上述测定对象糖化胺分解，并使上述分解物与已经添加的上述FAOD反应，测定该氧化还原反应，由此测定糖化胺的量。

Description

糖化胺的测定方法
技术领域
本发明涉及利用氧化还原反应来测定糖化蛋白质等糖化胺的方法。
背景技术
血球中的糖化血红蛋白(特别是“HbAlc”)，由于其浓度反映生物体血糖值的过去状况，因此被作为糖尿病诊断和治疗等中的重要指标。该HbAlc的测定通常通过免疫学方法、HPLC法等进行。
但是，在全血或血球中，除了作为测定对象的糖化血红蛋白(糖化Hb)以外，还存在作为非测定对象物的糖化胺(例如糖化清蛋白、糖化肽和糖化氨基酸等)等各种糖化物。因此，也测定了这种测定对象物以外的糖化物(非测定对象物)，结果得到了高于真值的测定值，存在着显示假阳性的问题。
为了解决这种问题，在上述免疫学方法中，提出了例如以下的方法。即，在测定对象物与抗测定对象物的抗体的主反应之前，形成非测定对象物与抗非测定对象物抗体的复合物，使非测定对象物的结构变为不对糖化Hb的免疫反应产生影响的结构的方法(例如参照专利文献1)、通过B/F分离，将非测定对象物从试样中分离除去的方法等。另外在HPLC法中，提出了例如对于1个试样准备2根HPLC柱，用第1根柱将非测定对象物从试样中除去，用第2根柱进行测定对象物的分离分析的方法。
然而，如果利用上述免疫学方法，则成本高，而且由于进一步需要与主反应不同的抗体抗原反应，因此存在反应体系的环境设定变得复杂、测定需要很长时间的问题。另外，对于B/F分离，显然操作变得烦杂。而且，由于抗体仅对具有特异性的物质(抗原)起效，因此当试样中所含有的非测定对象物的种类不明确或其种类多样时等，难以充分地排除非测定对象物的影响。另外，即便在HPLC法中，由于使用2根柱，因此也难以回避高成本，而且由于非测定对象物的分离需要时间，因此为了提高测定精度时，在测定时间的缩短上是有限的。
另一方面，近年来在以糖化Hb为代表的各种糖化蛋白质的测定中，利用了氧化还原反应的酶法被广泛使用，可谋求实用化。具体可如下测定。
首先，制备使血球溶血的试样，在该溶血试样中添加蛋白酶，生成糖化Hb分解物。进而在该分解物中添加果糖基氨基酸氧化酶(以下称为“FAOD”)，使其作用于糖化Hb的糖化部分，通过该氧化还原反应产生过氧化氢。该过氧化氢量与上述糖化蛋白质的质量相对应。然后，在该反应液中添加过氧化物酶(以下称为“POD”)和通过氧化而显色的基质，通过酶反应使上述显色性基质显色。通过测定该显色可测定上述过氧化氢量，其结果可决定血球中的糖化Hb。
但是，即便在这种酶法中，与上述相同，可发现作为试样中所含有的非测定对象物的糖化物成为起因，从而显示高于真值的值的问题。因此，为了解决该问题，在酶法中本申请人也提出了下述方法(例如专利文献2)。
即，作为第1方法，提出了预先在试样中添加对测定对象糖化Hb的反应性低的FAOD(分解用FAOD)，由此预先处理非测定对象的糖化物，之后，使用对糖化Hb的反应性高的FAOD(测定用FAOD)对糖化Hb的蛋白酶分解物进行处理，由此测定。
另外，作为第2方法，提出了预先利用对糖化Hb的反应性高的少量FAOD(分解用FAOD)对试样进行前处理后，用蛋白酶对该试样进行处理，再次添加与上述相同的FAOD(测定用FAOD)的方法。在该第2方法中，使分解用FAOD的添加量为少量、详细地说减小前处理用FAOD与测定用FAOD之比，从速度论的观点出发，是为了防止前处理阶段糖化Hb与FAOD的反应。并且，上述第2方法中的蛋白酶的添加不仅为了上述糖化Hb的分解，而且也为了使最初添加的分解用FAOD失活。这是因为，如果最初添加的分解用FAOD残存的话，则通过蛋白酶的添加所生成的糖化Hb分解物会与残存FAOD反应。
但是，如果利用以往的第1酶法，即便预先利用前处理用FAOD对非测定对象物进行前处理，由于用于主反应的测定用FAOD为不同的催化功能，因此该测定用FAOD所作用的非测定对象物成为未被完全处理的状态。因此，虽然可见测定精度的提高，但需要精度的进一步提高。并且，在第1酶法中，由于需要分别使用(1)前处理用FAOD、(2)蛋白酶、(3)测定用FAOD(+POD)的至少3种试剂的3阶段反应，因此测定上耗费时间，试剂的制备也很麻烦。
另一方面，在以往的第2酶法中，如上所述，必须使前处理FAOD的添加量为少量，并且在添加测定用FAOD之前，使前处理用FAOD几乎完全失活是重要的。但是，如果使前处理FAOD的添加量为少量，则为了消化非测定对象物必须确保充分的处理时间，当尝试完全消化时则存在处理时间延长、进而整个测定时间变长的问题。而且，利用前处理FAOD、蛋白酶、测定用FAOD的各处理都不能同时进行，也对测定时间有影响。
专利文献1：日本特开2000-180439号公报
专利文献2：国际公开第03-033729号公开文本
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种糖化胺的测定方法，由此可容易且简单地进行可靠性优异的糖化胺的测定。
为了达成上述目的，本发明的糖化胺测定方法包含：将蛋白酶添加在试样中，通过上述蛋白酶分解上述试样中作为测定对象的糖化胺的工序；在上述试样中添加FAOD，使上述FAOD作用于糖化胺的分解物并进行氧化还原反应的工序；测定上述氧化还原反应的工序；通过上述氧化还原反应的测定结果来决定上述糖化胺的量的工序，该测定方法的特征在于，其还进一步包含在添加上述蛋白酶的分解工序之前，在上述试样中添加上述FAOD，使上述FAOD作用于与上述测定对象糖化胺不同且存在于上述试样中作为非测定对象的糖化胺的工序，以除去上述非测定对象糖化胺的影响，而且，通过在上述分解工序之前添加的FAOD来进行上述分解工序后的上述氧化还原反应。本发明中作为测定对象物的糖化胺也称作“测定对象糖化胺”、作为非测定对象物的糖化胺也称作“非测定对象糖化胺”、对非测定对象糖化胺的FAOD反应也称作“前处理反应”、对测定对象糖化胺的FAOD反应也称作“主反应”。
上述FAOD为一般名称，其基质特异性随FAOD种类的不同而不同，其为不仅可作用于糖化氨基酸、也可作用于糖化肽和糖化蛋白质的酶。并且，作为上述糖化胺，包括例如糖化蛋白质、糖化肽、糖化氨基酸等，但本发明中所述的“测定对象糖化胺”表示糖化蛋白质或糖化肽。
本发明人等对以糖化Hb为代表的糖化胺的测定方法进行了锐意研究。结果发现，通过预先在试样中添加FAOD来处理非测定对象糖化胺后，添加蛋白酶，使已添加的FAOD作用于利用该蛋白酶生成的测定对象糖化胺的分解物，进而完成本发明。根据该方法，为了预先在试样中添加FAOD来处理非测定对象物，在进行利用蛋白酶的分解反应和主反应时，与FAOD作用的非测定对象物已经被消化。因此，能够防止非测定对象物为起因的假阳性和测定值的上升(高值化)，并能够确保显著优异的测定精度。另外，根据本发明，如果预先通过FAOD处理非测定对象糖化胺，则之后如后所述，利用蛋白酶的测定对象物的分解、氧化还原反应等可随时间进行、也可同时进行。因此，测定中的反应工序数可减少至极少的2个工序，能够进行简单的操作。并且，不仅是临床检查、而且在食品分析等中也广泛适用的以往的酶法中，利用蛋白酶处理样品后，添加主反应的酶是基本形态，例如本发明那样，可在添加蛋白酶之前添加主反应的酶FAOD也是本发明人等首次发现的。因此，如果将这种本发明测定方法适用于例如上述糖化Hb的测定中，则成为糖化Hb的作为糖尿病诊断指标的可靠性也提高、且在临床医疗等领域中有用的方法。
具体实施方式
如上所述，本发明的测定方法包含：在试样中添加蛋白酶，通过上述蛋白酶分解上述试样中作为测定对象的糖化胺的工序；在上述试样中添加FAOD，使上述FAOD作用于糖化胺分解物并进行氧化还原反应的工序；测定上述氧化还原反应的工序；通过上述氧化还原反应的测定结果来决定上述糖化胺的量的工序，该测定方法的特征在于，其还进一步包含在添加上述蛋白酶的分解工序之前，在上述试样中添加上述FAOD，使上述FAOD作用于与上述测定对象糖化胺不同且存在于上述试样中作为非测定对象的糖化胺的工序(前处理工序)，以除去上述非测定对象糖化胺的影响，而且，通过在上述分解工序之前添加的FAOD来进行上述分解工序后的上述氧化还原反应。即，通过在上述分解工序之前、为了作用于上述非测定对象糖化胺而添加的FAOD，进一步可进行上述分解工序后的氧化还原反应。
作为上述测定对象物，只要是可利用上述氧化还原反应的糖化胺则没有特别限制，利用本发明能够进行测定。作为具体的测定对象糖化胺，可列举出糖化Hb、糖化白蛋白等糖化蛋白质、糖化肽，本发明的测定方法尤其对血球内糖化胺、特别是糖化Hb的测定是有用的。
本发明中，上述氧化还原反应工序为例如使FAOD作用于糖化胺分解物而产生过氧化氢的工序，优选测定上述氧化还原反应的工序包含在上述试样中添加氧化酶(例如POD)和通过氧化而显色的基质，并通过上述氧化酶使上述产生的过氧化氢和上述基质发生反应的工序。由于通过该反应而上述基质显色，因此通过该显色量的测定，能够测定上述氧化还原反应。
本发明中，优选上述分解工序、上述氧化还原反应工序、测定上述氧化还原反应的工序同时进行。由此，能够减少测定工序、且可迅速且简单地进行操作。具体地说，例如(1)在上述前处理工序后，在上述试样中同时添加蛋白酶、氧化酶和通过氧化而显色的基质，(2)在上述分解工序之前，将上述氧化酶与上述FAOD同时添加于上述试样中，进而同时将蛋白酶和通过氧化而显色的基质添加于上述试样中，或者(3)在上述分解工序之前，将上述通过氧化而显色的基质与上述FAOD一起添加在上述试样中，进而同时将蛋白酶和氧化酶添加在上述试样中，由此可同时进行上述3个工序。
本发明的测定方法中使用的FAOD优选为催化下述式(1)所示的反应的FAOD，例如可列举出特异性地作用于α-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为“FAOD-α”)、特异性地作用于氨基酸侧链的氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称为“FAOD-S”)、特异性地作用于α-氨基被糖化的糖化胺和氨基酸侧链的氨基被糖化的糖化胺的任一个的FAOD(以下称为“FAOD-αS”)等。
R1-CO-CH2-NH-R2+H2O+O2
→R1-CO-CHO+NH2-R2+H2O2(1)
上述式(1)中，R1为羟基或来源于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。上述糖残基(R1)在反应前的糖为醛糖时为醛糖残基、在反应前的糖为酮糖时为酮糖残基。例如，反应前的糖为葡萄糖时，由于阿马多尔重排，反应后的结构成为果糖结构，此时，糖残基(R1)成为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)例如可表示为-[CH(OH)]n-CH2OH，n为0～6的整数。
上述式(1)中，R2没有特别限制，但糖化胺在为糖化氨基酸或糖化肽(含糖化蛋白质)的情况下、α-氨基被糖化的情况下、除α-氨基以外的氨基(氨基酸侧链的氨基)被糖化的情况下有所不同。
上述式(1)中，α-氨基被糖化时，R2为以下述式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。此时，特异性地催化上述式(1)反应的为上述FAOD-α和FAOD-αS。
-CHR3-CO-R4(2)
上述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以下述式(3)表示。在下述式(3)中，n为大于等于0的整数、R3与上述同样，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可全部相同、也可不同。
-(NH-CR3H-CO)n-OH    (3)
另外，上述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)时，R2可以下述式(4)表示。此时，特异性地催化上述式(1)反应的为上述FAOD-S和FAOD-αS。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)
上述式(4)中，R5表示氨基酸侧链基中被糖化的氨基以外的部分。例如被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-CH2-；例如被糖化的氨基酸为精氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
上述式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以下述式(5)表示。在下述式(5)中，n为大于等于0的整数、R3与上述同样，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可全部相同、也可不同。
-(CO-CR3H-NH)n-H    (5)
在上述式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以下述式(6)表示。下述式(6)中，n为大于等于0的整数，R3与上述同样，表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可全部相同，也可不同。
-(NH-CHR3-CO)n-OH    (6)
作为特异性地作用于上述糖化α-氨基的FAOD-α，例如可列举出市售的商品名为果糖基-氨基酸氧化酶(FAOX-TE)(Kikkoman公司生产)、青霉菌(Penicillium)属来源的FAOD(日本特开平8-336386公报)等。作为特异性地作用于上述氨基酸残基的被糖化的侧链的FAOD-S，例如可列举出镰刀菌(Fusarium)属来源的FAOD(日本生物工学会大会，平成12年度“尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)来源的氨基酸氧化酶的基质特异性的转变；藤原真纪等”)等。作为作用于上述糖化α-氨基和糖化侧链基两者的FAOD-αS，例如可列举出市售的商品名FOD(旭化成公司生产)、赤霉菌(Gibberella)属来源的FAOD(日本特开平8-154672号公报)、镰刀菌属来源的FAOD(日本特开平7-289253号公报)、曲霉菌(Aspergillus)属来源的FAOD(WO99/20039号)等。
这些FAOD可根据测定对象糖化胺的种类进行适当决定。测定对象物如上所述为糖化Hb时，由于可通过测定其β链N末端缬氨酸中α-氨基的糖化程度来计算HbAlc(％)，因此优选使用特异性地作用于糖化α-氨基的FAOD-α。特别是，由于作为FAOD-α的商品名FAOX-TE特异性地作用于α-氨基被糖化的游离“缬氨酸”，因此使得Val从N末端序列变为“Val-His-Leu…”的β链N末端缬氨酸、或N末端序列变为“Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp…”的α链N末端缬氨酸中游离出来，从而适于测定糖化程度。并且还可使用上述FAOD-α、特别是利用通常手段从镰刀菌sp.GL2-1(FERM BP-8451)中得到的FAOD。由于该FAOD-α特异性地作用于α-氨基被糖化的游离Val、Val-Leu、Val-Leu-Ser、Val-His、Val-His-Leu等，因此使得这些序列从α链、β链的N末端游离，从而适于测定糖化量。并且，测定对象物为α-氨基被糖化的氨基酸(糖化Val)和肽(糖化Val-His)，ε-氨基被糖化的氨基酸(糖化Lys)和肽(糖化Lys-Thr、糖化Lys-Ser)等时，优选使用特异性地作用于糖化Lys和糖化Val两者的FAOD-αS。
作为上述蛋白酶，没有特别限制，可使用选自金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、氨基肽酶中的至少一种蛋白酶，但优选根据测定对象糖化胺的种类进行选择。特别优选可选择性地分解测定对象糖化胺的蛋白酶、可特异性地游离FAOD易作用的分解物的蛋白酶。如果是可选择性地分解测定对象糖化胺的蛋白酶，即便例如在试样中存在其它糖化胺(特别是糖化蛋白质、糖化肽)时，由于这些糖化胺难以被分解、也不产生FAOD易作用的分解物，因此测定精度也可进一步提高。具体地说，测定对象物为上述糖化Hb时，优选选择性地分解糖化Hb的蛋白酶，例如可列举出金属蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰脏来源的胰蛋白酶、枯草杆菌(Bacillus subtilis)来源的蛋白酶等，更优选为金属蛋白酶、枯草杆菌来源的蛋白酶，特别优选为金属蛋白酶。
并且，使用上述FAOD-α时，优选可特异性地游离FAOD-α易作用的分解物、例如β链N末端缬氨酸或含有其的肽(例如二肽、三肽等)的蛋白酶，可使用枯草杆菌蛋白酶、链霉蛋白酶、血管紧张素转换酶等。具体地说，例如通过利用枯草杆菌蛋白酶、链霉蛋白酶等处理糖化Hb，能够游离Val-His-Leu的三肽，进而如果利用特异的血管紧张素转换酶处理His-Leu，则可游离糖化缬氨酸(果糖基缬氨酸)。
另外，使用镰刀菌属(例如Fusarium sp.GL2-1(FERM BP-8451))来源的FAOD-α时，优选例如可特异性地游离α链N末端缬氨酸或者含有其的肽(例如二肽、三肽等)的蛋白酶，例如可使用内切蛋白酶ASP-N等。具体地说，例如通过利用上述内切蛋白酶ASP-N处理糖化Hb，则可游离Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp肽，进而通过利用羧基肽酶Y进行处理，可游离糖化Val-Leu。另外，为糖化白蛋白时，可使用例如蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等，白蛋白的种类(例如HSA、BSA等)不受其来源的任何限制，可进行测定。
本发明中的测定试样没有特别限制，也可将本发明的测定方法适用于例如全血、血浆、血清、血球、尿、脊髓液等生物体试样，果汁等饮料水、酱油、调味汁等食品类等试样。其中，本发明的测定方法对例如上述全血、血浆、血清、血球等血液试样及其它生物体试样有用。例如，测定作为上述血球成分的糖化胺时，可使全血直接溶血后作为试样使用，也可将红血球从全血中分离出来后使上述红血球溶血作为试样使用。另外，由于在点滴等成分中多含有例如葡萄糖等糖类、各种氨基酸，因此由于从这些成分产生糖化胺，有时患者的血液等中糖化氨基酸一过性地增加。所以，本发明的测定方法对这种点滴后的患者的血液试样等也极为有用。
本发明中，上述氧化还原反应的测定优选为通过上述FAOD的氧化还原反应而产生的、且来源于测定对象糖化胺的过氧化氢量的测定。过氧化氢的量可如下决定：例如通过POD还原来源于测定对象糖化胺的过氧化氢，同时氧化通过氧化而显色的基质(显色性基质)，通过测定显色了的上述基质的显色程度来决定。
此外，POD的添加顺序没有特别限制，例如可在上述蛋白酶的添加前或添加后添加，也可与上述蛋白酶同时添加。显色性基质的添加也同样没有限制。具体例在后叙述。
接着，列举出测定在含有非测定对象物的全血试样中血球中糖化Hb的一例，对本发明测定方法进行说明。另外，在该实施方式中所谓的“糖化氨基酸”，只要没有特别表示，则指在试样中所含有的非测定对象糖化氨基酸，不含作为测定对象物的糖化蛋白质的蛋白酶分解物的糖化氨基酸。
首先，将全血溶血，制备溶血试样。该溶血方法没有特别限定，例如可使用利用表面活性剂的方法、利用超声波的方法、利用渗透压之差的方法、利用冷冻溶解的方法等。其中从操作的简单性等理由出发，优选使用表面活性剂的方法。
作为上述表面活性剂，例如可使用聚氧乙烯-对叔辛基苯基醚(Triton系表面活性剂等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯(Tween系表面活性剂等)、聚氧乙烯烷基醚(Brij系表面活性剂等)等非离子性表面活性剂，具体地说，例如可列举出商品名TritonX-100、商品名Tween-20、商品名Brij35等。利用上述表面活性剂的处理条件可为：通常处理溶液中的血球浓度为1～10体积％时，添加上述表面活性剂以使得上述处理溶液中的浓度变为0.1～1重量％，并在室温下搅拌5秒～1分钟左右。
另外，利用上述渗透压之差时，例如相对于全血的体积添加2～100倍体积量的精制水，使其溶血。
接着，在上述溶血试样中添加FAOD。通过该FAOD的添加，作为上述溶血试样中的非测定对象糖化胺且可成为上述FAOD的基质的物质被分解(前处理工序)。具体地说，通过FAOD所催化的上述式(1)的反应，非测定对象糖化胺的糖化部分伴随着过氧化氢的产生而被分解。这样，由于可与FAOD反应的非测定对象糖化胺在该阶段已经被分解，因此在下个工序中，即便用蛋白酶将糖化Hb分解，在本工序中添加的FAOD与非测定对象物也不会发生反应，而仅使糖化Hb分解物与FAOD反应。另外，也可同时进行该工序和上述溶血处理。
由于该工序中产生的非测定对象来源的过氧化氢因血球中含有的谷胱甘肽过氧化物酶或过氧化氢酶，在产生的同时迅速地消失，因此在现阶段产生的过氧化氢不会对后述糖化Hb来源的过氧化氢的测定(POD反应)产生影响。这样，过氧化氢在产生的同时瞬间被消化，在从例如反应液中含有的Hb与非测定对象物的含有比例、反应速度论的方面出发考虑也是明确的，另外，不对POD反应产生影响，由后述实施例的结果也可明白。
这样，当测定对象糖化胺为以糖化Hb为代表的血球内成分时，由于通过血球中本来就存在的过氧化氢酶等，在非测定对象糖化胺的分解中产生的过氧化氢迅速被分解，因此不用另外添加过氧化氢酶等，操作变得更加简单。当试样中不含血球时(例如血清试样、尿等)，即不含血球中的过氧化氢酶时，也可另外添加过氧化氢酶来除去非测定对象糖化胺来源的过氧化氢。这样，通过上述过氧化氢酶除去过氧化氢时，为了防止在之后进行的FAOD处理中产生的过氧化氢也被除去，优选在测定上述氧化还原反应时添加过剩量的POD和显色性基质，并且，上述POD和显色性基质的添加优选例如在FAOD的添加前进行或与FAOD的添加同时进行。此时，优选相对于上述过氧化氢酶的添加量(U)，添加例如5～100倍活性(U)量的POD。
另外，作为处理由非测定对象糖化胺产生的过氧化氢的方法，还可采用以下的其它方法。例如有在添加蛋白酶之前，使FAOD和POD以及电子供给体共存的方法。由此，在添加蛋白酶之前，由非对象糖化胺产生的过氧化氢通过POD反应发生脱氢，电子被供给给电子供给体。因此，即便之后添加蛋白酶，过氧化氢也已被除去，对测定对象糖化胺的测定没有影响。另外，也可在添加蛋白酶之前添加FAOD、POD及通过氧化而显色的显色剂，预先测定该显色量，利用该显色量进行校正。
FAOD对上述溶血试样的添加量，只要是能够充分进行非测定对象物的处理和后述的糖化Hb分解物的处理的量即可。例如，可由溶血试样中的Hb浓度等适宜决定，但为了迅速除去非测定对象物，优选添加过剩量。具体地说，在反应液中血球浓度为0.3体积％时，例如FAOD为0.1～30U/L的范围、优选为2～10U/L、更优选为3～6U/L。在反应液中全血浓度为0.3体积％时，FAOD为0.1～45U/L的范围、优选为2～15U/L、更优选为3～9U/L。
该FAOD处理的条件没有特别限定，反应温度例如为2～60℃、优选为4～40℃，反应时间例如为1～30分钟、优选为3～5分钟，pH例如为6～9的范围。另外，该处理通常在缓冲液中进行，作为上述缓冲液，没有特别限定，例如可列举出Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液等。
上述溶血工序和FAOD添加工序可分别进行，但从时间的短缩、工序的简单化方面出发，优选同时进行。特别是，考虑到使用了试剂盒的本发明的测定方法的实施，优选同时进行溶血和非测定对象糖化胺的FAOD处理，原因在于由此可减少试剂数。
接着，在添加了上述FAOD的反应液中进一步添加蛋白酶、POD以及通过氧化而显色的基质(显色性基质)。这样，通过上述蛋白酶的添加，糖化Hb被分解以使得之前添加的FAOD容易作用，在该分解物和FAOD之间发生上述式(1)所示的反应，产生糖化Hb来源的过氧化氢。即，通过蛋白酶的添加，利用已经添加的FAOD进行的氧化还原反应自动开始。而且，在产生的同时，上述过氧化氢被POD还原，另一方面，共存的上述显色性基质被氧化，呈现显色。该显色可利用例如分光光度计等作为吸光度进行测定，由此结果可决定过氧化氢量。而且，例如使用该过氧化氢浓度和标准曲线等能够求出试样中的糖化Hb的量(糖化量)。
该处理通常在上述缓冲液中进行，条件可根据所用蛋白酶的种类、测定对象的糖化蛋白质的种类及其浓度等进行适宜决定。
上述反应液中的蛋白酶浓度，在血球浓度为0.3体积％时，例如为10KU/L～300MU/L的范围、优选为1MU/L～60MU/L、更优选为5MU/L～30MU/L，上述反应液中的全血浓度为0.3体积％时，为10KU/L～150MU/L的范围、优选为1MU/L～30MU/L、更优选为5MU/L～15MU/L。
上述反应液中的POD浓度优选例如为过剩量。如果POD为过剩量，则能够在产生的同时与过氧化氢迅速地反应，这是因为例如能够充分抑制由试样中的过氧化氢酶产生的影响。作为具体例，反应液中的血球浓度为0.3体积％时，例如为0.01KU/L～4MU/L的范围、优选为0.1KU/L～200KU/L、更优选为5KU/L～100KU/L，当上述反应液中的全血浓度为0.3体积％时，为0.01KU/L～2MU/L的范围、优选为0.1KU/L～100KU/L、更优选为5KU/L～50KU/L。上述反应液中的显色性基质的浓度，在血球浓度为0.3体积％时，例如为0.01～300μmol/L的范围、优选为1～100μmol/L、更优选为5～30μmol/L。
该处理条件没有特别限制，反应温度例如为2～60℃、优选为4～40℃，反应时间例如为1～30分钟、优选为3～10分钟，pH例如为6～9的范围。
作为上述显色性基质，例如可列举出N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠、对苯二胺(OPD)、组合Trinder’s试剂和4-氨基安替比林的基质等。作为上述Trinder’s试剂，可以列举出例如苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。除了上述氨基安替比林之外，还可使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)等。在这种显色性基质中，如上所述，特别优选为N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲基氨基)二苯胺钠。
在本发明中，在上述蛋白酶的添加后，也可在上述试样中添加POD和显色性基质，分别进行蛋白酶处理和POD处理，但由于下述理由，优选同时进行上述两处理。即，第1原因为，如果与蛋白酶一起添加POD和显色性基质，则产生的过氧化氢瞬间与POD反应、不必担心如上所述被过氧化氢酶除去；第2原因为，如果将上述两处理作为1个工序，则能够更简单且迅速地进行测定。第3原因为，如果考虑使用了试剂盒的测定，则可根据工序数来减少试剂数，因此可降低成本。特别是，在以往的第2酶法中，一般至少需要分解用FAOD处理、蛋白酶处理和测定用FAOD处理这样3个工序或更多个工序的处理，而从以往的第1酶法中测定用FAOD的稳定性方面看，由于必须将蛋白酶和测定用FAOD作为分别的试剂进行制备，因此所用试剂必须至少为3试剂系统。但是，根据本发明，能够以极少的工序数进行反应，即将非测定对象物的除去作为1个工序(也可含有溶血处理)、将蛋白酶处理和POD处理作为1个工序的2个工序。因此，能够利用含有FAOD的试剂(也可含有溶血试剂)、含有蛋白酶和POD及显色性基质的试剂的2个试剂系统实现测定。这样，利用2个试剂系统的测定成为可能，从成本方面、简单性方面出发也极为有用。
此外，为了同时进行蛋白酶处理和POD处理，如上所述，例如可使上述FAOD作用于上述非测定对象糖化胺后，在上述试样中同时添加蛋白酶、POD和显色性基质。另外，除此之外，还可以在上述分解工序之前，与FAOD一起将POD添加在试样中，进而在试样中同时添加蛋白酶和显色性基质。另外，也可在上述分解工序之前，与FAOD一起将显色性基质添加在上述试样中，进而同时在试样中添加蛋白酶和POD，由此进行。在这种情况下，在进行溶血处理时，可与上述FAOD一起进一步添加溶血试剂。
上述过氧化氢量除了利用使用了上述POD等的酶的方法进行测定之外，还可使用例如电的方法进行测定。
另外，在本发明中，为了进一步提高测定精度，在利用蛋白酶进行的分解工序之前，还可进一步添加各种添加剂。作为上述添加剂，可列举出例如四唑鎓化合物。通过添加上述四唑鎓化合物，如可得到下述各种效果。通常，由于血液试样等中存在抗坏血酸等还原物质，因此会引起通过氧化而显色的基质被还原从而显色消失的问题，但通过四唑鎓化合物的添加，可回避这种问题，能够进一步提高测定精度。另外，通过四唑鎓化合物的添加，还具有促进测定对象糖化胺的分解，从而FAOD有效作用于分解物的效果。
作为上述四唑鎓化合物，其种类没有特别限制，例如可列举出2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓及其盐(例如单钠盐)等。
另外，也可与上述四唑鎓化合物同样地使用WO03/107011所公开的磺酸化合物、硝基化合物等。作为具体例，可列举出月桂硫酸钠(SLS)、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)、月桂硫酸锂(LiLS)、4-氨基偶氮苯-4’-磺酸钠(ABSA)、4-氨基-4’-硝基均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠(ANDS)、4，4’-二偶氮均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠(DADS)、N-环己基-2-氨基乙磺酸、N-环己烷-3-氨基丙磺酸、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)、红菲绕啉等，2，4-二硝基苯酚(2，4-DNP)、2，5-二硝基苯、2，6-二硝基苯、4，6-二硝基-2-甲基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、2-氨基-5-硝基苯酚、2-氨基-4-硝基苯酚、对硝基苯酚(p-NP)、2，4-二硝基苯胺(2，4-DNA)、对硝基苯胺(p-NA)、亚硝酸钠(NaNO2)、亚硝酸钾(KNO2)、4-氨基-4’-硝基均二苯乙烯-2，2’-二磺酸二钠(ANPS)、硝基苯等。
此外，为了进一步提高上述四唑鎓化合物的效果，优选例如与表面活性剂一起添加到上述试样中。作为上述表面活性剂，没有特别限制，可列举出TritonX-100、TWEEN20等所代表的非离子性表面活性剂；十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、CHAPS等所代表的阴离子表面活性剂；苯扎氯铵等所代表的阳离子表面活性剂等。除此之外，还可将尿素等用作添加物。
通常在求糖化胺(特别是糖化蛋白质)的糖化率时，分别测定蛋白质的量和蛋白质的糖化量，由两者计算糖化率。本发明的测定方法中，测定对象糖化胺为糖化Hb时，Hb的测定也可用以往公知的方法进行，例如，也可以在上述试样中添加四唑鎓化合物、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸锂、叠氮化钠等，通过将上述Hb变性使其稳定，测定其吸光度，由此求得(例如参照WO 02/27330)。另外，当测定对象糖化胺为糖化白蛋白时，可使用对甲酚、溴甲酚绿等公知的物质来测定白蛋白的量。
本发明的测定试剂盒为用于上述本发明测定方法中的、由第1试剂和第2试剂构成的2试剂系统试剂盒，其特征在于，上述第1试剂至少包含FAOD、第2试剂至少包含蛋白酶，而且POD和通过氧化而显色的基质的任一个包含在上述第1试剂中、另一个包含在上述第2试剂中，或者上述POD和上述基质两个都包含在上述第2试剂中。
本发明的测定试剂盒中的第1试剂和第2试剂的组合(A～C)的具体例如下所示。
(A)第1试剂：FAOD
第2试剂：蛋白酶+POD+显色性基质
(B)第1试剂：FAOD+POD
第2试剂：蛋白酶+显色性基质
(C)第1试剂：FAOD+显色性基质
第2试剂：蛋白酶+POD
为了进一步提高测定精度，本发明的试剂盒中，例如上述第1试剂还进一步包含上述在分解工序前可添加于试样中的四唑鎓化合物、磺酸化合物、硝基化合物、表面活性剂等添加物。在将血球溶血时，在上述第1试剂中还可进一步含有溶血试剂。各试剂中各成分的含量没有特别限制，可在将这些成分添加在反应体系时，反应液中的浓度变为上述浓度的范围内适当设定。
这种本发明的试剂盒例如可通过首先在试样中添加上述第1试剂，之后添加上述第2试剂来实施本发明的测定方法。添加上述第1试剂后的处理条件(例如温度和处理时间等)、以及添加第2试剂后的处理条件如前所述。
实施例1
(I)在血球试样中添加作为非测定对象糖化胺的各种糖化氨基酸，测定血球中的HbAlc。
血球试样
离心分离健康人的血液(3000G、10分钟)，在回收的血球中添加下述糖化氨基酸水溶液和水，制备血细胞比容值为60％的全血试样。全血试样中的上述糖化氨基酸水溶液的添加比例为0体积％、1体积％、3体积％。上述糖化氨基酸水溶液为含有16种糖化氨基酸(果糖基异亮氨酸、果糖基亮氨酸、果糖基赖氨酸、果糖基蛋氨酸、果糖基苯基丙氨酸、果糖基苏氨酸、果糖基色氨酸、果糖基缬氨酸、果糖基酪氨酸、果糖基精氨酸、果糖基组氨酸、果糖基丙氨酸、果糖基天冬氨酸、果糖基脯氨酸、果糖基丝氨酸、果糖基甘氨酸)的溶液，各糖化氨基酸的浓度分别约为0.02～0.4w/v％。
(实施例1)
以下所示的操作使用自动分析器(商品名JCA-BM8、日本电子公司生产)进行。首先，在0.58μL上述血球试样中添加15μL精制水。添加精制水是为了对在后述比较例中添加的试剂a(15μL)进行容量校正。接着，在上述血球试样中添加74μL下述第1试剂，在37℃下培育约4分钟，之后测定混合溶液的吸光度(第一测定)。接着，约1分钟后在上述混合溶液中添加18.5μL下述第2试剂，在37℃下培育3分钟，之后测定该反应液的吸光度(第二测定)。吸光度测定都在主波长为700nm、副波长为570nm处进行。第1测定的吸光度乘以89.58/108.08，进行用量校正，求出第二测定的吸光度和上述第1测定的校正吸光度之差(ΔAbs.)。将血球试样中糖化氨基酸溶液的添加量为0体积％时的ΔAbs.作为100％，求出各血球试样的ΔAbs.相对值(％)。将该结果作为实施例1，示于下述表1。将该ΔAbs.作为血液试样的HbAlc浓度，在后进行考察。
第1试剂
硼酸(Nacalai Tesque公司生产)                    1mmol/L
赤霉菌属来源的FAOD(ARKRAY公司生产)              5KU/L
四唑鎓化合物(商品名WST-3、同仁化学公司生产)     1.7mmol/L
NaN3(Nacalai Tesque公司生产)                    0.66mmol/L
聚氧乙烯月桂醚(日光化学公司生产)                1g/L
第2试剂
Tris-HCl缓冲液                                    300mmol/L
POD(东洋纺公司生产)                               67KU/L
显色性基质(商品名DA-64、和光纯药工业公司生产)     71.3μmol/L
CaCl2(Nacalai Tesque公司生产)                     12.5mmol/L
NaCl(Nacalai Tesque公司生产)                      200mmol/L
金属蛋白酶                                        10MU/L
(比较例1)
该例为利用第1FAOD将非测定对象糖化胺分解后，使用不同的第2FAOD与测定对象HbAlc发生氧化还原反应，进行上述HbAlc测定的现有方法。
除了添加试剂a-1(15μL)代替上述精制水、添加下述试剂b(74μL)代替上述第1试剂、添加下述试剂c代替上述第2试剂之外，与上述实施例1同样操作，进行吸光度的测定，求出ΔAbs.，并计算相对值(％)。将这些结果示于下述表1。作为下述试剂a-1中的第1FAOD，使用商品名FAOX-TE(Kikkoman公司生产)，作为下述试剂c中的第2FAOD，使用赤霉菌属来源的FAOD(ARKRAY公司生产)。比较例1中的上述试剂a-1为在血球的溶血和非测定对象糖化胺的分解中使用的试剂，试剂b为在HbAlc的分解中使用的试剂，试剂c为在与HbAlc分解物的氧化还原反应和显色反应中使用的试剂。
试剂a-1
聚氧乙烯月桂醚(日光化学公司生产)                    12g/L
CHES(同仁化学公司生产)                              80mmol/L
MOPS(同仁化学公司生产)                              30mmol/L
第1FAOD                                             0.3KU/L
试剂b
MES(同仁化学公司生产)                               1mmol/L
四唑鎓化合物(商品名WST-3、同仁化学公司生产)         1.7mmol/L
NaN3(Nacalai Tesque公司生产)                        0.66mmol/L
CaCl2(Nacalai Tesque公司生产)                       2.5mmol/L
NaCl(Nacalai Tesque公司生产)                        50mmol/L
金属蛋白酶                                          10MU/L
试剂c
Tris-HCl缓冲液                                      300mmol/L
第2FAOD                                             17.4KU/L
POD(东洋纺公司生产)                                 67KU/L
显色性基质(商品名DA-64、和光纯药公司生产)           71.3μmol/L
(比较例2)
该例为在用FAOD将非测定对象糖化胺分解后，利用蛋白酶使上述FAOD失活，进而添加相同的FAOD，与测定对象HbAlc的分解物发生氧化还原反应，进行上述HbAlc测定的现有方法。
除了使用将上述比较例1中的上述试剂a-1的第1FAOD替换为赤霉菌属FAOD(ARKRAY公司生产)的试剂a-2之外，与上述比较例1同样操作，进行吸光度的测定，求出ΔAbs.，并计算相对值(％)。将这些结果示于下述表1。在比较例2中，试剂a-2和试剂c使用相同的FAOD，试剂b为在HbAlc的分解和试剂a-2的FAOD失活中使用的试剂。
(比较例3)
作为比较例3，不在上述比较例1的试剂a-1中添加FAOD、而是使用用精制水进行了用量校正的试剂a-3，除此之外，与上述比较例1同样操作，进行吸光度的测定，求出ΔAbs.，并计算相对值(％)。
表1
Figure S04836561120060614D000201
X：血球试样中上述糖化氨基酸水溶液的添加比例(体积％)
如上述表1所示，使用了FAOD无添加的试剂a-3的比较例3，由于在使用对HbAlc的FAOD的氧化还原反应之前，预先添加于试样中的糖化氨基酸未被分解，因此可见随着糖化氨基酸溶液的添加比例的增加，ΔAbs.的相对值显著上升。特别是，糖化氨基酸溶液的添加比例为3体积％时，ΔAbs.显示约为75倍的值。另外，对于在上述氧化还原反应之前，利用FAOD来处理添加的糖化氨基酸的比较例1和2，与比较例3相比更受到抑制，但ΔAbs.的相对值的上升显著，当糖化氨基酸溶液的添加比例为3体积％时，ΔAbs.在比较例1中显示约为3倍的值，在比较例2中显示约为9.5倍的值。与此相对，实施例1中即便增加糖化氨基酸溶液的添加比例，ΔAbs.的相对值也没有显著的变化，显示基本一定的值，即便糖化氨基酸溶液的添加比例为3体积％时，ΔAbs.仅变化了1成左右。由这种结果可知，根据实施例，即便作为非测定对象物的糖化氨基酸是高浓度，也能进行非常有效的处理，由此能够高精度地测定测定对象糖化胺。
(II)进一步改变实施例1中试剂1的FAOD浓度，进行与上述实施例1同样的吸光度测定，计算ΔAbs.的相对值(第1试剂中FAOD的浓度：3、5、10KU/L)。另外，分别对比较例1改变试剂a-1的FAOD浓度、对比较例2改变试剂a-2的FAOD浓度，同样计算ΔAbs.的相对值(上述试剂a-1和试剂a-2的FAOD浓度：0.3、3、30KU/L)。它们的结果示于下述表2。在下述表2中，FAOD浓度在实施例中表示第1试剂中的浓度、在比较例1中表示试剂a-1中的浓度、在比较例2中表示试剂a-2中的浓度、在比较例3中表示试剂a-3中的浓度。
表2
如上述表2所示，相对于未处理的比较例3，在比较例1中，通过增加试剂a-1中的FAOD浓度，提高了除去添加于试样中的糖化氨基酸的能力。但是，如上所述，用于除去糖化氨基酸的试剂a-1的FAOD和用于与测定对象HbAlc的氧化还原反应的试剂c的FAOD，在催化功能上不同，因此试剂c的FAOD所作用的糖化氨基酸残存，不能进一步抑制吸光度的上升。另外，在比较例2中，如果增加试剂a-2的FAOD浓度，则除去糖化氨基酸的能力提高，但进一步增加FAOD浓度时，即便通过试剂b添加蛋白酶，相反地上述FAOD不会失活而大量地残存。因此，在添加试剂c之前，残存FAOD与Hb分解物反应，并且，为了成为3试剂系统，由残存FAOD产生的过氧化氢也不能迅速地与POD反应，结果相反地吸光度下降。与此相对，实施例1即便改变FAOD的添加比例，也未特别发现与此相伴的吸光度变化，因此测定体系不受FAOD添加量的影响，能够以充分的精度进行测定。
实施例2
对本发明中的2试剂系统试剂盒的变量进行确认。
(试样)
使用1.8mL精制水溶解被冷冻干燥的糖化血红蛋白对照血液，制备试样。作为上述冷冻干燥品，使用了低浓度(Hb＝2.4g/L、HbAlc％＝4.3％)、中浓度(Hb＝3.5g/L、HbAlc％＝9.0％)、高浓度(Hb＝3.1g/L、HbAlc％＝11.7％)3种。
(试剂)
分别将下述表3所示的第1试剂(2-1、2-2、2-3)和第2试剂(2-1、2-2、2-3)按照下述表4所示的组合进行使用。
表3
第1试剂    2-1    2-2    2-3
Figure S04836561120060614D000221
第2试剂    2-1    2-2    2-3
(测定方法)
将13μL的上述试样与76μL第1试剂混合，在37℃下培育5分钟。接着混合28μL第2试剂，在37℃下培育10分钟后，通过上述自动分析器测定波长为751nm的吸光度。其结果示于下述表4。
表4
  实施例   2-1   2-2   2-3
  第1试剂   2-1   2-2   2-3
  第2试剂   2-1   2-2   2-3
  吸光度低浓度   0.010   0.011   0.013
  中浓度   0.015   0.015   0.017
  高浓度   0.018   0.018   0.020
如上述表4所示，在第1试剂中含有POD和显色性基质的实施例2-1、在第2试剂中含有显色性基质的实施例2-2、以及在第2试剂含有POD和在第1试剂中含有显色性基质的实施例2-3，分别显示同样的结果，对应于试样中的HbAlc(％)吸光度上升。
如上所述，根据本发明的测定方法，即便在试样中含有与FAOD反应的非测定对象的糖化胺时，也能够充分地排除其影响，因此能够实现测定精度优异的糖化胺测定。特别是，在以往的测定方法中，为了除去非测定对象糖化胺，通常需要3个工序或更多个工序的处理，而根据本发明的测定方法，如上所述，即便仅用2个工序处理，也显示比以往更优异的除去影响的能力。因此，例如如果适用于红血球中糖化Hb的测定，则测定精度比以往有所提高，且作为糖尿病诊断等指标物质的重要性也进一步提高。

Claims (17)

1.一种糖化蛋白质或糖化肽的测定方法，其包含：在生物体试样中添加金属蛋白酶，并通过所述金属蛋白酶分解所述生物体试样中作为测定对象的糖化蛋白质或糖化肽的工序；在所述生物体试样中添加赤霉菌属来源的果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)，并使所述FAOD作用于糖化蛋白质或糖化肽的分解物而进行氧化还原反应的工序；测定所述氧化还原反应的工序；通过所述氧化还原反应的测定结果来决定所述糖化蛋白质或糖化肽的量的工序，该测定方法的特征在于，在添加所述金属蛋白酶之前添加所述FAOD，通过在所述金属蛋白酶之前添加的所述FAOD，在分解工序前、在四唑鎓化合物的存在下除去与所述测定对象糖化蛋白质或糖化肽不同且存在于所述生物体试样中的糖化氨基酸，并在所述分解工序后进行所述氧化还原反应，其中，所述生物体试样是血球试样。
2.如权利要求1所述的测定方法，其中同时进行所述分解工序、所述氧化还原工序和测定所述氧化还原反应的工序。
3.如权利要求1所述的测定方法，其中所述氧化还原反应工序为使所述FAOD作用于所述糖化蛋白质或糖化肽的分解物从而产生过氧化氢的工序。
4.如权利要求3所述的测定方法，其中测定所述氧化还原反应的工序包含：在所述生物体试样中添加氧化酶和通过氧化而显色的基质，并利用所述氧化酶使所述产生的过氧化氢与所述基质发生反应的工序。
5.如权利要求4所述的测定方法，其中在使所述FAOD作用于所述糖化氨基酸的工序后，在所述生物体试样中同时添加蛋白酶、氧化酶和通过氧化而显色的基质，由此同时进行所述分解工序、所述氧化还原反应工序和所述氧化还原反应的测定工序。
6.如权利要求4所述的测定方法，其中在所述分解工序之前将所述氧化酶与所述FAOD一起添加在所述生物体试样中，进而在所述生物体试样中同时添加蛋白酶和通过氧化而显色的基质，由此在使所述FAOD作用于所述糖化氨基酸的工序后，同时进行所述分解工序、所述氧化还原工序和所述氧化还原反应的测定工序。
7.如权利要求4所述的测定方法，其中在所述分解工序之前将所述通过氧化而显色的基质与所述FAOD一起添加在所述生物体试样中，进而在所述生物体试样中同时添加蛋白酶和氧化酶，由此在使所述FAOD作用于所述糖化氨基酸的工序后，同时进行所述分解工序、所述氧化还原反应工序和所述氧化还原反应的测定工序。
8.如权利要求4所述的测定方法，其中所述氧化酶为过氧化物酶。
9.如权利要求1所述的测定方法，其中所述FAOD为特异性地作用于氨基酸残基的被糖化的α-氨基的酶、特异性地作用于氨基酸残基的被糖化的侧链的酶或者特异性地作用于氨基酸残基的被糖化的α-氨基和氨基酸残基的被糖化的侧链的酶。
10.如权利要求1所述的测定方法，其中所述糖化蛋白质或糖化肽为血球内糖化胺。
11.如权利要求1所述的测定方法，其中所述糖化蛋白质或糖化肽为糖化血红蛋白。
12.如权利要求1所述的测定方法，其中所述四唑鎓化合物含有2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓或其盐。
13.如权利要求1所述的测定方法，其中在所述分解工序前，在所述生物体试样中进一步添加表面活性剂。
14.如权利要求13所述的测定方法，其中所述表面活性剂为两性表面活性剂、阴离子性表面活性剂和阳离子性表面活性剂之中的至少一种。
15.一种在权利要求1所述的测定方法中使用的试剂盒，其特征在于，其由第1试剂和第2试剂构成，所述第1试剂至少含有果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)和四唑鎓化合物，所述第2试剂至少含有蛋白酶，而且，过氧化物酶和通过氧化而显色的基质之中的任一个包含在所述第1试剂中、另一个包含在所述第2试剂中、或者所述过氧化物酶和所述基质两者都包含在第2试剂中。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述四唑鎓化合物含有2一(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓或其盐。
17.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第1试剂进一步含有表面活性剂。
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