CN101297044B

CN101297044B - 白蛋白变性剂

Info

Publication number: CN101297044B
Application number: CN2006800400309A
Authority: CN
Inventors: 米原聪; 稻村范郎
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2005-10-27
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2026-10-27
Also published as: EP1950309A1; EP1950309B1; US7871789B2; CN101297044A; EP1950309A4; US20090142787A1; JPWO2007049762A1; JP4929181B2; WO2007049762A1

Abstract

本发明提供用于通过蛋白酶高效地分解白蛋白的白蛋白变性剂。其为含有具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐的白蛋白变性剂。在白蛋白变性剂的存在下，利用蛋白酶分解试样中的白蛋白，使所得白蛋白分解物的糖化部分与FAOD发生反应，测定上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应，由此决定糖化白蛋白相对于白蛋白的比例GA(％)。

Description

白蛋白变性剂

技术领域

本发明涉及白蛋白变性剂。

背景技术

血细胞中的糖化白蛋白(GA)由于反映着生物体内血糖值的过去情况(约2～3周)，因此是糖尿病的诊断或治疗等中的重要指标。糖化白蛋白是白蛋白的赖氨酸残基的ε-氨基被糖化，其量(％)用糖化白蛋白量与总白蛋白量的比例(％)来表示。

糖化白蛋白的测定方法一般可以举出高效液相色谱(HPLC)法等，但作为简便且廉价的方法，以下的酶法得到实用。该方法为首先使果糖基氨基酸氧化酶(以下记作“FAOD”)作用于白蛋白的糖化部分而产生过氧化氢。该过氧化氢量对应于上述白蛋白的糖化量。在该反应液中进一步添加通过与过氧化物酶(以下记作“POD”)的氧化而发色的发色底物，从而以POD为催化剂，在过氧化氢和发色底物之间产生氧化还原反应。然后，可以测定上述发色底物的发色程度，求得白蛋白的糖化量，由糖化量和总白蛋白量计算糖化白蛋白的比例(以下也称作“GA(％)”)。

如上所述，由于糖化白蛋白的特征在于赖氨酸残基的ε-氨基的糖化，因此期待FAOD高效地作用于被糖化的赖氨酸残基。由于该FAOD难以直接作用于蛋白质，因此通常通过蛋白酶处理来制备白蛋白的分解物，然后使FAOD作用于该分解物。

但是，血液试样中的白蛋白与经过精制的试剂水平的白蛋白不同，例如由于结合了胆红素或脂蛋白等各种物质，因此难以通过蛋白酶获得FAOD易于作用的片断。因而，在测定血清或血浆等试样中的白蛋白时，有必要在试样中添加大量的蛋白酶来提高反应性(专利文献1)，但由此会产生以下问题。

·由于存在大量的蛋白酶，因此糖化白蛋白的测定中所用的其它试剂中的酶等失活。

·当含有大量的蛋白酶时，仅是该试剂的极少一部分混存在其它测定试剂中，其它试剂中的酶或抗体就会失活，无法使用其它测定试剂。

·为了添加大量的蛋白酶，需要高浓度的蛋白酶溶液，但蛋白酶会自身消化，稳定性降低。

·以测定干燥体系为目的时，难以制备例如制作试验片所必需的高浓度的蛋白酶溶液。

·由于大量的蛋白酶，成本增高。

专利文献1：国际公开第2002/061119号小册子

发明内容

因此，本发明的目的在于提供用于通过蛋白酶来高效地分解白蛋白的白蛋白变性剂。

本发明为一种白蛋白变性剂，其特征在于，其含有具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐。

本发明为一种通过蛋白酶来分解试样中的白蛋白的方法，其特征在于，在本发明的白蛋白变性剂的存在下来进行试样的蛋白酶处理。

另外，本发明的糖化白蛋白的测定方法的特征在于，其包括以下工序：通过蛋白酶来分解试样中的白蛋白的工序、使所得白蛋白分解物的糖化部分与FAOD发生反应的工序、通过测定上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应来决定白蛋白中糖化白蛋白的比例的工序，其中，在上述白蛋白的分解工序中，在本发明的白蛋白变性剂的存在下来进行试样中的蛋白酶处理。

另外，本发明中，“白蛋白”是指糖化白蛋白和非糖化白蛋白这两者。

使用本发明的白蛋白变性剂时，机理虽然不明，但由于可以将白蛋白变性，因此通过在其存在下进行蛋白酶处理，可以高效地进行白蛋白的分解。因此，例如通过很少的蛋白酶即可实现充分的白蛋白分解，还可以避免如以往那样大量使用蛋白酶所产生的问题。因此，根据使用这种白蛋白变性剂的本发明的白蛋白分解方法以及糖化白蛋白的测定方法，可以比以往更为高效地进行糖化白蛋白的测定，在糖尿病的诊断、治疗等医疗领域中极为有用。另外，具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐可以使白蛋白变性，由此白蛋白的分解可通过蛋白酶高效地进行，这是本发明人等首次发现的。因而，含有上述季铵的本发明的白蛋白变性剂成为在上述医疗领域中极为有用的试剂。

附图说明

图1为表示本发明的实施例中显示白蛋白的分解程度的吸光度的经时变化的曲线。

具体实施方式

本发明的白蛋白变性剂的特征在于，如上所述，其含有具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐(以下也一并称作“季铵”)。

上述烃基的碳原子数为12以上即可，优选为14以上、更优选为16以上。另外，碳原子数的上限并无特别限定。例如优选碳原子数为14～18的烃基。另外，本发明的白蛋白变性剂还可以含有具有碳原子数为12以上的烃基的季铵或其盐的混合物。例如，本发明的白蛋白变性剂优选包括含有具有碳原子数为14以上的烃基的季铵或其盐的混合物的白蛋白变性剂。

上述烃基例如可以举出直链或支链的烷基、直链或支链且具有取代基的烷基、具有取代基的芳基等，上述取代基相互相同或不同，上述取代基例如为卤原子、直链或支链烷基、苯基、羟基、直链或支链C₁～C₆烷氧基，上述芳基例如为苯基或环己基。另外，取而代之，还可以是直链或支链烷基羰基。

季铵的具体例子例如可以举出氯化十八烷基三甲基铵、溴化鲸蜡基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化苄烷铵(C₆H₅-CH₂-N⁺(CH₃)₂-RCl^-；R＝C₈H₁₇～C₁₈H₃₇)、氯化苄基二甲基十四烷基铵、氯化苄氧乙铵((CH₃)₃C-CH₂-C(CH₃)₂-C₆H₄-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-N⁺(CH₃)₂-CH₂-C₆H₅Cl-)、溴化肉豆蔻基三甲基铵、乙酸椰胺(coconut amine acetate)(RNH₂·CH₃COOH；R＝C₈～C₁₈)、氯化十二烷基三甲基铵等。这些化合物可以是任何一种，还可以使用两种以上。

另外，本发明的白蛋白变性剂只要含有上述季铵即可，可以仅由其构成，也可以还含有其它化合物。本发明中，将本发明的白蛋白变性剂如上所述除了上述季铵或其盐之外还含有其它化合物者也称作本发明的白蛋白变性用组合物。其它化合物例如可以举出乙二胺四乙酸(EDTA)、反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸(CyDTA)、O，O’-双(2-氨基乙基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)等螯合剂；乙酰色氨酸等羧酸；MOPS、PIPES、MOPSO、EPPS等磺酸系等缓冲剂。这些物质可以是任意一种，还可以并用两种以上。

本发明的白蛋白变性剂和本发明的白蛋白变性用组合物的形态例如可以是液体、粉体、固体等。本发明的白蛋白变性剂中上述季铵的含量并无特别限定，例如添加于后述的试样或反应液等中时，设定为需要的浓度即可。

接着，本发明的白蛋白的分解方法如上所述，其特征在于，在本发明的白蛋白变性剂或本发明的白蛋白变性用组合物的存在下来进行试样的蛋白酶处理。

本发明中，白蛋白变性剂或本发明的白蛋白变性用组合物在试样中的添加顺序并无特别限定，例如可以在蛋白酶的添加前、与添加的同时、添加后的任何时间添加。另外，本发明的白蛋白变性用组合物还可以含有蛋白酶。

上述蛋白酶例如可以使用金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、丝氨酸羧肽酶、蛋白酶K、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、猪胰脏来源的胰蛋白酶、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的蛋白酶、米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的蛋白酶等，优选为内切蛋白酶。作为市售品，例如可以举出金属蛋白酶(爱科来株式会社制)、蛋白酶A“Amano”G(天野Enzyme公司制)、蛋白酶M“Amano”G(天野Enzyme公司制)、蛋白酶S“Amano”G(天野Enzyme公司制)、肽酶R(天野Enzyme公司制)、木瓜蛋白酶M-40(天野Enzyme公司制)、商品名蛋白酶N(Fluka公司制)、商品名蛋白酶N“Amano”(天野制药公司制)、芽孢杆菌(Bacillus)属来源的金属蛋白酶(东洋纺公司制：商品名Toyoteam)等。

蛋白酶处理的反应液中的上述季铵的添加比例并无特别限定，例如为0.02～20mmol/L的范围、优选为0.1～3mmol/L。每1ml血浆试样的季铵的添加比例例如为0.003～4mmol的范围、优选为0.015～0.6mmol。另外，本发明的白蛋白变性剂和本发明的白蛋白变性用组合物中的季铵含量如上所述，并无特别限定，添加于试样中时，优选为可以将蛋白酶处理反应液中的季铵添加比例调整至上述范围内的含量。

上述反应液中蛋白酶的添加比例例如为0.01～20000KU/L的范围、优选为1～1600KU/L、更优选为1～500KU/L。每1ml血浆试样的蛋白酶的添加比例例如为1～8000KU的范围、优选为1～240KU、更优选为1～60KU、进一步优选为1～35KU。这里，KU为10³×U(酶单位)。酶单位U可以使用所用蛋白酶的厂家所提供的酶单位U，或者还可以是下述的U：将1U定义为在30℃下1分钟内分解乳酪蛋白(例如MERCK公司制)而显示相当于1μg的酪氨酸的显色的蛋白酶活性度。即，用适当的酶稀释溶液(例如20mM乙酸缓冲液(pH为7.5)、1mM乙酸钙、100mM氯化钠)适度地(例如达到10～20U)稀释蛋白酶溶液，取该液体1mL置于试管中，加热至30℃。在其中加入预先加热至30℃的底物(0.6％乳酪蛋白)溶液5mL。10分钟后，加入5mL的反应停止液(0.11M三氯乙酸、0.22M醋酸钠、0.33M乙酸)以使反应停止。之后，直接在30℃下继续加热30分钟，使沉淀凝聚，用过滤器(例如东洋滤纸No.131(9cm))过滤，获得滤液。在该滤液2mL中加入5mL的0.55M碳酸钠溶液、1mL的3倍稀释福林试剂(Folins′s reagent)，在30℃下反应30分钟后，测定660nm的吸光度。使用该吸光度和利用L-酪氨酸另外制作的标准曲线来测定蛋白酶的酶活性度。结果，可以将与30℃下1分钟内分解底物(乳酪蛋白)而显示相当于1μg的酪蛋白的显色的蛋白酶活性度相当的蛋白酶量定义为1U。另外，本发明的白蛋白变性用组合物含有蛋白酶时，季铵和蛋白酶的含量如上所述，并无特别限定，添加于试样中时，优选为可以将蛋白酶处理的反应液中季铵和蛋白酶的添加比例调整至上述范围的含量。

蛋白酶处理的条件并无特别限定，处理温度例如为10～40℃的范围、优选为25～37℃。处理时间(特别是上限)并无特别限定，例如可以进行0.1～60分钟左右的蛋白酶处理，例如优选处理0.5～5分钟。根据本发明的方法，与未添加本发明的白蛋白变性剂(季铵)的以往方法相比，可以将分析时间缩短至约1/10以下。

上述蛋白酶处理例如优选在缓冲液中进行，可以使用Tris盐酸缓冲液、EPPS缓冲液、PIPES缓冲液、磷酸缓冲液、ADA缓冲液、柠檬酸缓冲液、醋酸缓冲液等。另外，蛋白酶反应液的pH例如为4～10的范围，例如也可以用上述缓冲液来调整pH。

蛋白酶处理时，除了本发明的白蛋白变性剂之外，还可以共存上述化合物。上述化合物的添加比例并无特别限定，例如可以举出以下条件。

接着，本发明的糖化白蛋白测定方法如上所述，其特征在于，包括以下工序：利用蛋白酶来分解试样中的白蛋白的工序、使所得白蛋白分解物的糖化部分与FAOD发生反应的工序、通过测定上述糖化部分和FAOD的氧化还原反应来决定糖化白蛋白相对于白蛋白的比例的工序，其中，在上述白蛋白的分解工序中，在本发明的白蛋白变性剂的存在下来进行试样的蛋白酶处理。

上述FAOD优选为对例如以氨基酸侧链的氨基(ε-氨基)被糖化的糖化胺(例如糖化氨基酸、糖化肽)为底物并产生过氧化氢的反应进行催化的酶。这种催化反应可以以下述式(1)表示。

R¹-CO-CH₂-NH-R²+H₂O+O2

→R¹-CO-CHO+NH₂-R²+H₂O₂ (1)

上述式(1)中，R¹表示羟基或来自于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。上述糖残基(R¹)在反应前的糖为醛糖时为醛糖残基，在反应前的糖为酮糖时为酮糖残基。例如，在反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利重排，反应后的结构成为果糖结构，此时，糖残基(R¹)为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R¹)例如可以用-[CH(OH)]_n-CH₂OH表示，n为0～6的整数。

上述式(1)中，ε-氨基被糖化的糖化胺的R²可以用下述式(2)表示。

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ (2)

上述式(2)中，R⁵表示氨基酸侧链基中除被糖化的氨基以外的部分。例如，被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R⁵为-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，例如被糖化的氨基酸为精氨酸时，R⁵为-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-。

另外，上述式(2)中，R⁶为氢、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(3)表示。另外，下述式(3)中，n为0以上的整数，R³表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全部相同也可以不同。

-(CO-CR³H-NH)_n-H (3)

另外，上述式(2)中，R⁷为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如可以用下述式(4)表示。另外，下述式(4)中，n为0以上的整数，R³与上述同样表示氨基酸侧链基，氨基酸侧链基可以全部相同也可以不同。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH (4)

另外，本发明的FAOD除了上述式(1)所示的ε-氨基被糖化的糖化胺之外，还可以具有以α-氨基被糖化的糖化胺为底物的催化功能。

FAOD中，作为特异性作用于ε-氨基被糖化的糖化胺的FAOD(以下称作“FAOD-S”)，例如可以举出镰刀菌属(Fusarium)来源的FAOD(日本生物工程学会大会平成12年度“尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)来源的氨基酸氧化酶的底物特异性的变化；藤原真纪等”)等。另外，作为作用于ε-氨基被糖化的糖化胺和α-氨基被糖化的糖化胺这两者的FAOD(以下为“FAOD-αS”)，例如可以举出市售的商品名FOD(旭化成公司制)、赤霉属(Gibberella)来源的FAOD(日本特开平8-154672号公报)、镰刀菌属来源的FAOD(日本特开平7-289253号公报)、曲霉菌属(Aspergillus)来源的FAOD(WO99/20039号)等。

以下示出本发明的糖化白蛋白的测定方法的一例，但并非局限于此。

首先，如上所述，在本发明的白蛋白变性剂的存在下对含有白蛋白的试样进行蛋白酶处理。上述试样的种类并无特别限定，例如可以举出全血、血浆、血清、溶血试样等。

然后，利用FAOD对通过上述蛋白酶处理获得的白蛋白分解物进行处理。由此，FAOD作用于白蛋白分解物中的ε-氨基的糖化部分，如上述式(1)所示生成过氧化氢。

FAOD处理与上述蛋白酶处理同样地优选在缓冲液中进行，上述缓冲液并无特别限定，可以使用与上述蛋白酶处理同样的缓冲液。FAOD处理的条件并无特别限定，反应液的pH例如为6～9，处理温度例如为10～38℃的范围、优选为25～37℃。处理时间也并无特别限定，例如为0.1～60分钟、优选为0.1～5分钟。

FAOD处理的反应液中的FAOD的添加比例例如为0.01～50KU/L的范围、优选为0.2～10KU/L。另外，每1ml血浆试样的FAOD的添加比例例如为0.01～10KU的范围、优选为0.04～1.5KU。

接着，测定上述白蛋白分解物的糖化部分与FAOD的氧化还原反应。该氧化还原反应的测定例如可以通过测定由上述式(1)的反应所产生的过氧化氢量、或在上述反应中所消耗的氧量来进行。

上述过氧化氢量例如可以如下计算：使用通过与过氧化物酶(POD)氧化而发色的底物(以下为“发色底物”)，通过它们与所产生的过氧化氢的反应而使上述发色底物发色，通过该发色程度的测定来计算。另外，过氧化氢量除了使用POD等的酶方法之外，还可以通过电方法等测定。

作为通过上述氧化而发色的底物(发色底物)并无特别限定，例如可以举出10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐(例如商品名DA-67、和光纯药公司制)、N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷六钠盐(例如商品名TPM-PS、同仁化学公司制)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-双(二甲氨基)二苯基胺钠、邻苯二胺(OPD)、组合有Trinder试剂和4-氨基安替比林的底物等。Trinder试剂例如可以举出苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。另外，除了4-氨基安替比林之外，还可以使用氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、甲基苯并噻唑酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑酮腙(SMBTH)等。其中，即使通过上述季胺的还原能力，通过氧化而发色的色素也难以消失，因此优选10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪和TPM-PS。

POD反应与上述蛋白酶处理同样，优选在缓冲液中进行，可以使用上述缓冲液。POD处理的条件并无特别限定，反应液的pH例如为5～9，处理温度例如为10～40℃的范围、优选为25～37℃。处理时间也并无特别限定，例如为0.1～5分钟。

POD反应液中的POD添加比例例如为0.01～600KU/L的范围。上述反应液中发色底物的添加比例例如为0.001～10mmol/L的范围，优选为0.001～2mmol/L。

如此使用发色底物时，例如用分光光度计测定其发色(例如反应液的吸光度)即可。由于过氧化氢量对应于白蛋白的糖化量(糖化白蛋白量)，因此可以由所测定的吸光度计算糖化白蛋白的浓度。然后，由下式可以计算糖化白蛋白浓度相对于试样中总白蛋白浓度的比例(百分率)。该比例一般以GA(％)表示。另外，白蛋白量(浓度)可以通过以往公知的方法或市售的试剂盒来测定。

GA(％)＝(糖化白蛋白浓度/白蛋白浓度)×100

由吸光度计算糖化白蛋白浓度例如可以通过使用对已知糖化白蛋白量和吸光度的关系作图得到的校正曲线来进行。例如，对于糖化白蛋白量已知的白蛋白标准液，与上述同样测定吸光度，制作显示该标准液的测定值和已知糖化白蛋白量的关系的校正曲线。然后，在该校正曲线中代入如上测定的吸光度，从而可以计算糖化白蛋白浓度。

在以上糖化白蛋白的测定中，各处理工序可以如上所述分别进行，还可以以例如下述所示的组合同时进行各处理。另外，蛋白酶、FAOD、POD、发色底物的添加顺序也无特别限定。

1：蛋白酶处理+白蛋白分解物的FAOD处理

2：FAOD处理+POD处理

3：蛋白酶处理+FAOD处理+POD处理

另外，本发明的糖化白蛋白的测定方法中，为了降低其它蛋白质带来的影响，例如可以在本发明的白蛋白变性剂或本发明的白蛋白变性用组合物的添加前，将蛋白酶和FAOD添加于试样中(还可以进一步添加POD)，进行作为预处理的蛋白酶处理和FAOD处理。当在试样中存在其它糖化蛋白质时，通过蛋白酶处理，其它糖化蛋白质也被分解，FAOD作用于其分解物，产生过氧化氢，其量也会被测得，从而有时会产生测定误差。这种情况下，预先对试样进行上述预处理时，在添加本发明的变性剂或变性用组合物以使白蛋白变性、促进其分解之前，其它糖化蛋白质已经被预处理用蛋白酶和预处理用FAOD进行了处理，因此可以减少其它糖化蛋白质带来的影响。

预处理用蛋白酶和白蛋白分解用的蛋白酶可以是相同种类、也可以是不同种类。使用相同种类的蛋白酶时，作为预处理用和白蛋白用，可以每次添加于试样中；还可以添加预处理用蛋白酶后放置一定时间，以使其作用于其它蛋白质，然后不添加蛋白酶而添加本发明的白蛋白变性剂或本发明的白蛋白变性用组合物，从而促进白蛋白分解。另外，使用不同种类的蛋白酶时，作为预处理用，例如也可以使用选择性地分解其它糖化蛋白质的蛋白酶。FAOD优选为相同种类，可以直接利用添加于预处理用的FAOD来与白蛋白分解物反应，作为预处理用和白蛋白分解物的处理用，也可以每次添加。

为了简便地进行本发明的糖化白蛋白的测定方法，也可以将上述白蛋白变性剂、酶或底物等作为多个混合试剂而制成试剂盒。下述表1例示出了混合试剂的组合，但并非局限于此。另外，各试剂在试样中按顺序(第1→第2)添加即可。如下述表1所示，本发明的白蛋白变性用组合物既可以成为第1试剂(组合2)、也可以成为第2试剂(组合1、3～5)。

表1

组合	第1试剂	第2试剂
			(1)	FAOD+POD	蛋白酶+发色底物+季铵
(2)	蛋白酶+季铵	FAOD+POD+发色底物
			(3)	蛋白酶+FAOD+POD	季铵+发色底物
(4)	蛋白酶+FAOD	POD+季铵+发色底物
			(5)	蛋白酶	FAOD+POD+季铵+发色底物

另外，本发明的作为白蛋白变性剂的季铵还可以提高作为发色底物的10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪或其盐(例如商品名DA-67、和光纯药公司制)在液体中的稳定性。因此，也优选将季铵添加于含有发色底物的试剂中。由此，可以提高发色底物的稳定化，且通过添加于试样中，也可以将白蛋白变性，促进利用蛋白酶进行的白蛋白分解。

以下，通过实施例和比较例更加具体地说明本发明，但本发明并非局限于此。

实施例1

在季铵的存在下进行血浆试剂的蛋白酶处理，确认了白蛋白分解效率的提高。

<第1试剂：R1>

Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸) 50mmol/L(pH为8)

FAOD(爱科来株式会社制、以下相同) 2.5KU/L

POD 2KU/L

<第2试剂：R2>

添加剂 0.2g/L

金属蛋白酶(爱科来株式会社制、以下相同) 1300KU/L

发色试剂 0.05mmol/L

(商品名DA-67、和光纯药公司制)

<第2试剂中的添加剂>

实施例

氯化十八烷基三甲基铵^*1(NACALAITESQUE公司制)

氯化十八烷基三甲基铵^*2(商品名CORTAMINE 86P conc：花王公司制)

溴化鲸蜡基三甲基铵

溴化十六烷基三甲基铵

氯化苄烷铵

氯化苄基二甲基十四烷基铵

氯化苄氧乙铵

溴化肉豆蔻基三甲基铵(NACALAITESQUE公司制)

乙酸椰胺(商品名ACETAMIN 24：花王公司制)

氯化十二烷基三甲基铵(商品名CORTAMINE 24P：花王公司制)

溴化十二烷基三甲基铵

比较例

溴化苄基三乙基铵

溴化苄基三甲基铵

氯化四乙基铵

AMIPOL(甜菜碱型两性表面活性剂)(商品名AMIPOL：日华化学公司制)

<血浆试样>

用精制水稀释健康人的血浆，达到规定的稀释倍率(0倍、2倍、4倍)，作为试样。根据试样中血浆的含有率，将未稀释的试样记为[1.0]、将2倍稀释的试样记为[0.5]、将4倍稀释的试样记为[0.25]、将对照的精制水记为[0]。

<测定方法>

将血浆试样1.2μL和上述第1试剂(R1)78μL混合，在37℃下孵育5分钟后，添加上述第2试剂(R2)26μL，在37℃下进行蛋白酶处理和发色反应。然后，通过生物化学自动分析装置(商品名JCA-BM8：日本电子公司制、以下相同)来测定刚添加第2试剂前的反应液在波长658nm的吸光度(A₀)和添加第2试剂5分钟后的反应液在波长658nm的吸光度(A₅)，并求得其差(A₅-A₀)。将它们的结果示于下述表2。另外，将使用氯化十八烷基三甲基铵作为第2试剂的添加剂时的吸光度的经时变化示于图1中。

表2

单位：ΔAbs

如上述表2所示，使用具有碳原子数为12以上的烃基的季铵盐的实施例1与使用上述范围以外的季铵或表面活性剂的比较例1相比，可以特别更加高效地进行白蛋白的分解。另外，比较例1中，根据血浆试样的种类(血浆的含有率)不同，基本未见吸光度的差别。与此相对，在实施例1中，结果是，稀释倍率越低、即试样中的血浆含有率越高，则显示越高的吸光度，试样中的血浆含有率与吸光度增加显示了相关关系。由此可知，通过实施例1的季铵，白蛋白发生变性、利用蛋白酶进行的分解高效地进行。而且，如图1所示，使用氯化十八烷基三甲基铵的实施例中，在刚添加第2试剂后，与对照相比，可见吸光度的增加。即，添加季铵时，利用蛋白酶的分解迅速地进行。由此可知，季铵的添加时间并无特别限定，只要在蛋白酶处理时共存即可。

(比较例2)

另外，使用各种表面活性剂(下述表3记载)作为添加剂，确认了利用蛋白酶进行的白蛋白分解的效率有所提高。

<第1试剂>

MOPS 30mmol/l(pH为7.5)

FAOD 10KU/L

POD 2KU/L

表面活性剂 2g/L或10g/L

<第2试剂>

金属蛋白酶 10000KU/L

发色试剂 0.05mmol/L

(商品名TPM-PS、同仁化学公司制)

CaCl₂ 5mmol/L

MOPS 150mmol/L(pH为7.5)

<血浆试样>

用精制水稀释健康人的血浆，达到规定的稀释倍率(0倍、1/3倍、2倍、4倍)，作为试样。根据试样中的血浆含有率，将未稀释的试样记为[1.0]、将1/3倍稀释的试样记为[0.75]、将2倍稀释的试样记为[0.5]、将4倍稀释的试样记为[0.25]、将对照的精制水记为[0]。

<测定方法>

将血浆试样1.2μL和上述第1试剂78μL混合，在37℃下孵育5分钟后，添加上述第2试剂26μL，在37℃下孵育5分钟。然后，通过上述生物化学自动分析装置来测定刚添加第2试剂前的反应液在波长658nm的吸光度(A₀)和添加第2试剂5分钟后的反应液在波长658nm的吸光度(A₅)，并求得其差(A₅-A₀)。将它们的结果示于下述表3。

表3

单位：ΔAbs

如上述表3所示，即便使各种表面活性剂与蛋白酶共存，也可以确认白蛋白分解的效率有所提高。

如上所述，根据本发明的白蛋白变性剂，通过在其存在下进行蛋白酶处理，可以高效地进行白蛋白的分解。因此，例如以较少的蛋白酶即可实现充分的白蛋白分解，也可以避免以往大量使用蛋白酶所导致的问题。因此，根据使用这种白蛋白变性剂的本发明的白蛋白分解方法和糖化白蛋白的测定方法，可以比以往更高效地进行糖化白蛋白的测定，在糖尿病的诊断或治疗等医疗领域中极为有用。

Claims

1.含有具有碳原子数为14～18的烃基的季铵盐的白蛋白变性剂在制备全血、血浆、血清、溶血来源的糖化白蛋白和非糖化白蛋白用的变性剂中的用途，其中，所述白蛋白变性剂含有选自氯化十八烷基三甲基铵、溴化鲸蜡基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化苄烷铵、氯化苄基二甲基十四烷基铵、氯化苄氧乙铵、以及溴化肉豆蔻基三甲基铵中的至少一种季铵盐；其中所述氯化苄烷铵是C₆H₅-CH₂-N⁺(CH₃)₂-RCl^-，其中R＝C₈H₁₇～C₁₈H₃₇。

2.含有具有碳原子数为14～18的烃基的季铵盐的混合物的白蛋白变性剂在制备全血、血浆、血清、溶血来源的糖化白蛋白和非糖化白蛋白用的变性剂中的用途，其中，所述白蛋白变性剂含有选自氯化十八烷基三甲基铵、溴化鲸蜡基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化苄烷铵、氯化苄基二甲基十四烷基铵、氯化苄氧乙铵、以及溴化肉豆蔻基三甲基铵中的至少一种季铵盐；其中所述氯化苄烷铵是C₆H₅-CH₂-N⁺(CH₃)₂-RCl^-，其中R＝C₈H₁₇～C₁₈H₃₇。

3.含有权利要求1所述的白蛋白变性剂的白蛋白变性用组合物，其还含有蛋白酶，且所述蛋白酶的含量是每0.02～20mmol所述季铵盐为1～1600000U。

4.含有权利要求1所述的白蛋白变性剂的白蛋白变性用组合物，其还含有蛋白酶，且所述蛋白酶的含量是每0.02～20mmol所述季铵盐为1～500000U。

5.含有权利要求1所述的白蛋白变性剂的白蛋白变性用组合物，其还含有蛋白酶，且通过在每1ml试样中添加0.003～4mmol的所述季铵盐和1～60000U的所述蛋白酶来使用。

6.含有权利要求1所述的白蛋白变性剂的白蛋白变性用组合物，其还含有蛋白酶，且通过在每1ml试样中添加0.003～4mmol的所述季铵盐和1～35000U的所述蛋白酶来使用。

7.权利要求1所述的白蛋白变性剂在非诊断目的的全血、血浆、血清、溶血来源的糖化白蛋白的测定中的用途。

8.用于分解全血、血浆、血清、溶血来源的糖化白蛋白的分解方法，其包括在含有所述白蛋白的试样中添加蛋白酶的工序；和在所述蛋白酶的添加前、添加的同时或添加后添加权利要求1所述的白蛋白变性剂的工序，且所述季铵盐的添加比例为0.02～3mmol/L、所述蛋白酶的添加比例为1～500KU/L。