JP5490542B2 - フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液の安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液の長期保存安定化方法及び安定化された水溶液に関する。

臨床検査試薬に代表される生化学試薬では、酵素反応を利用して、標的成分から直接又は２次的に生成させた過酸化水素と酸化発色剤との反応により形成された色素を比色定量することにより、標的成分を測定する試薬が多く開発され、市販されている。ここで用いられる酸化発色剤としては、４−アミノアンチピリンのようなカップラー試薬とフェノール系やアニリン系のような水素供与体の組み合せからなるものと、カップラー試薬を必要としないロイコ型発色試薬等が知られている。

これらの酸化発色剤のうち、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウムに代表されるフェノチアジン系酸化発色剤は、分子吸光係数が高いことから、高感度の測定が可能である（特許文献１）。
特開昭６３−２４６３５６号公報

しかしながら、フェノチアジン系酸化発色剤を水溶液の状態で保存した場合、自動的に酸化されて着色してしまい、ブランク値が上昇してしまうという問題がある。この自動酸化は、当該水溶液にプロテアーゼを含有させたときにさらに増強されることが判明した。臨床検査試薬としては、発色剤及びプロテアーゼを水溶液で供給することが広く行なわれていることから、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼを含有する水溶液の安定化手段が希求されていた。
従って本発明は、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液の安定化方法、及び安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液を提供することにある。

そこで本発明者は、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼの水溶液状態での安定化を図るべく種々検討したところ、特定のキレート剤を用いることにより、当該水溶液中のフェノチアジン系酸化発色剤の自動酸化が顕著に抑制され、長期間安定なフェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液試薬が得られることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤及び（Ｂ）プロテアーゼを含有する水溶液に、（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上のキレート剤を含有させることを特徴とするフェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液の安定化方法を提供するものである。
また、本発明は、（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤、（Ｂ）プロテアーゼ、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上のキレート剤を含有することを特徴とする、安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液を提供するものである。

本発明によれば、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼを含有する水溶液中でのフェノチアジン系酸化発色剤の安定性が顕著に改善される。本発明の安定化されたフェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼ含有水溶液を用いれば、長期保存後もブランク値の上昇が抑えられる結果、校正の間隔を長くすることが可能となる。

各種プロテアーゼ共存下において、プロテアーゼを添加しない場合（対照）の吸光度（６６０ｎｍ）を１００とした時の吸光度の割合を示す。 プロナーゼ共存下において、キレート剤を添加しない場合（対照）の吸光度（６６０ｎｍ）を１００とした時の吸光度の割合を示す。 各種プロテアーゼ共存下において、キレート剤を添加しない場合（対照）の吸光度（６６０ｎｍ）を１００とした時の吸光度の割合を示す。 プロナーゼ共存下において、キレート剤、界面活性剤を添加しない場合（対照）の吸光度（６６０ｎｍ）を１００とした時の吸光度の割合を示す。

本発明は、フェノチアジン系酸化発色剤及びプロテアーゼを含有する水溶液の安定化方法に関する。（Ａ）フェノチアジン系酸化発色剤としては、フェノチアジン骨格を有する一剤式の酸化発色剤が挙げられ、具体的には、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ−６７，和光純薬工業（株）製）、１０−（メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＭＣＤＰ、同仁化学研究所（株）製）、１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３−ジメチルアミノ−７−ヒドロキシ−１０Ｈ−フェノチアジン等が挙げられるが、このうちＤＡ−６７及びＭＣＤＰが特に好ましい。

本発明の水溶液中のフェノチアジン系酸化発色剤の濃度は、通常発色試薬として用いる濃度であれば特に限定されないが、５〜１，０００μＭ、特に１０〜１００μＭが好ましい。

本発明の水溶液に使用されるプロテアーゼは、例えば血中タンパク質を測定する場合に測定対象であるタンパク質に作用するプロテアーゼであれば、特に限定されない。例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。具体的な例を以下に示す。しかし、これらは１例に過ぎず、なんら限定されるものではない。動物由来のプロテアーゼの例としては、エラスターゼ（Ｅｌａｓｔａｓｅ）、トリプシン（Ｔｒｉｐｓｉｎ）、キモトリプシン（Ｃｈｙｍｏｔｒｉｐｓｉｎ）、ペプシン（Ｐｅｐｓｉｎ）、牛膵臓プロテアーゼ、カテプシン（Ｃａｔｅｐｓｉｎ）、カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）、プロテアーゼタイプ−Ｉ、−ＸＸ（以上、シグマ社製）、アミノペプチダーゼＭ（ＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅＭ）、カルボキシペプチダーゼＡ（ＣａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅＡ）（以上、ベーリンガー・マンハイム社製）、パンクレアチン（Ｐａｎｃｒｅａｔｉｎ：和光純薬社製）等が挙げられる。植物由来のプロテアーゼの例としては、カリクレイン（Ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）、フィシン（Ｆｉｃｉｎ）、パパイン（Ｐａｐａｉｎ）、キモパパイン（Ｃｈｉｍｏｐａｐａｉｎ）、ブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）（以上、シグマ社製）、パパインＷ−４０、ブロメラインＦ（以上、天野エンザイム社製）等が挙げられる。

微生物由来のプロテアーゼの例としては下記（１）〜（１４）が挙げられる。
（１）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属由来プロテアーゼ；ズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、プロテアーゼ−タイプ−ＶＩＩＩ、−ＩＸ、−Ｘ、−ＸＶ、−ＸＸＩＶ、−ＸＸＶＩＩ、−ＸＸＸＩ（以上、シグマ社製）、サーモリシン（ｔｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）（和光純薬工業社製）、オリエンターゼ−９０Ｎ、−１０ＮＬ、−２２ＢＦ、−Ｙ、−５ＢＬ、ヌクレイシン（以上、阪急バイオインダストリー社製）、プロレザー、プロテアーゼ−Ｎ、−ＮＬ、−Ｓ「アマノ」（以上、天野エンザイム社）、ＧＯＤＯ−ＢＮＰ、−ＢＡＰ（以上、合同酒清社精製）、プロチン−Ａ、−Ｐ、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ（以上、大和化成社製）、トヨチームＮＥＰ（東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、ＮＵＥ、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム−ＦＭ、ノボラン（以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、エンチロン−ＮＢＳ、−ＳＡ（以上、洛東化成工業社製）、アルカリプロテアーゼＧＬ４４０、オプティクリーン−Ｍ３７５プラス、−Ｌ１０００、−ＡＬＰ４４０（以上、協和発酵社製）、ナガーゼ（Ｎａｇａｒｓｅ）、ビオプラーゼＡＰＬ−３０、ＳＰ−４ＦＧ、ＸＬ−４１６Ｆ、ＡＬ−１５ＦＧ（以上、ナガセ生化学工業社製）、アロアーゼＡＰ−１０、プロテアーゼＹＢ（以上、ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼ−Ｎ、−７０８９、ベロンＷ（以上、樋口商会社製）、キラザイムＰ−１（ロシュ社製）等。

（２）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプ−ＸＩＩＩ、−ＸＩＸ、−ＸＸＩＩＩ（以上、シグマ社製）、スミチーム−ＭＰ、−ＡＰ、−ＬＰ、−ＦＰ、−ＬＰＬ、エンザイムＰ−３（以上、新日本化学工業株式会社製）、オリエンターゼ−２０Ａ、−ＯＮＳ、−ＯＮ５、テトラーゼＳ（以上、阪急バイオインダストリー社製）、ニューラーゼＡ、プロテアーゼ−Ａ、−Ｐ、−Ｍ「アマノ」（以上、天野エンザイム社）、ＩＰ酵素、モルシンＦ、ＡＯプロテアーゼ（以上、キッコーマン社製）、プロチン−Ｆ、−ＦＮ、−ＦＡ（以上、大和化成社製）、デナプシン２Ｐ、デナチーム−ＳＡ−７、−ＡＰ、デナザイムＡＰ（以上、ナガセ生化学工業社製）、プロテアーゼＹＰ−ＳＳ、パンチダーゼ−ＮＰ−２、−Ｐ（以上、ヤクルト社製）、サカナーゼ（科研ファルマ社製）、フレーバーザイム（ノボノルディスクバイオインダストリー社製）、ベロンＰＳ（樋口商会社製）等。

（３）リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプＸＶＩＩＩ（シグマ社製）、ペプチダーゼＲ、ニューラーゼＦ（以上、天野エンザイム社製）、ＸＰ−４１５（ナガセ生化学工業社製）等。
（４）ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）由来プロテアーゼ；ＰＤ酵素（キッコーマン社製）等。
（５）ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプＸＩＶ；別称Ｐｒｏｎａｓｅ、−ＸＸＩ（以上、シグマ社製）、アクチナーゼ−ＡＳ、−ＡＦ（以上、科研ファルマ社製）、タシナーゼ（協和発酵社製）、ａｌｋａｌｏｆｉｌｉｃｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（東洋紡績社製）等。
（６）スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）由来プロテアーゼ；プロテアーゼタイプＸＶＩＩ（シグマ社製）等。

（７）クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）由来プロテアーゼ；クロストリパイン（Ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）、ノンスペシフィック ニュートラルプロテアーゼ（ｎｏｎｓｐｅｓｉｆｉｃｎｕｔｏｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）（以上、シグマ社製）等。
（８）リソバクター（Ｌｙｓｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（シグマ社製）等。
（９）グリフォラ（Ｇｒｉｆｏｌａ）由来プロテアーゼ；メタロエンドペプチダーゼ（Ｍｅｔａｌｌｏｅｍｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ；シグマ社製）等。
（１０）酵母（Ｙｅａｓｔ）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼＡ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡ；シグマ社製）、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣａｒｂｏｘｙｐｅｐｕｔｉｄａｓｅＹ；ロシュ社製）等。

（１１）トリチラチウム（Ｔｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ）由来プロテアーゼ；プロテイナーゼＫ（ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ；シグマ社製）等。
（１２）サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）由来プロテアーゼ；アミノペプチダーゼＴ（ＡｍｉｎｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅＴ；ロシュ社製）等。
（１３）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎｕｓ）由来プロテアーゼ；エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ａｓｐ−Ｎ；和光純薬工業社製）等。
（１４）アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）由来プロテアーゼ；リジルエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌｅｎｄｏｐｅｐｕｔｉｄａｓｅ）、アクロモペプチダーゼ（以上、和光純薬工業社製）等。

これらのプロテアーゼは、本発明水溶液中に例えば、０．００１〜１０ｍｇ／ｍＬ、特に０．０１〜１ｍｇ／ｍＬ含有するのが好ましい。

本発明に使用されるキレート剤は、ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、及びそれらの塩から選ばれる１種以上である。このうち、本発明の効果は、数多くのキレート剤の中でも、この２種のキレート剤に特有のものである。

これらの（Ｃ）キレート剤は、フェノチアジン系酸化発色剤安定化効果の点から、本発明水溶液中に０．０１〜１，０００μＭ、さらに０．１〜１００μＭ、特に０．５〜２０μＭ含有するのが好ましい。

本発明においては、前記特定のキレート剤に加えて、界面活性剤を併用すると、さらにフェノチアジン系酸化発色剤の安定化効果が増強される。

本発明に使用する（Ｄ）界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤の何れでもよく、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリセリン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。

これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等が挙げられる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレングリコールモノラウレート、ポリオキシエチレングリコールモノステアレート、ポリオキシエチレングリコールジステアレート、ポリオキシエチレングリコールモノオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げられる。ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルの具体例としては、例えばテトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルアミンの具体例としては、例えばポリオキシエチレンラウリルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、例えばステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセライド等が挙げられる。脂肪酸アルカノールアミドの具体例としては、例えばラウリン酸ジエタノールアミド等が挙げられる。ショ糖脂肪酸エステルの具体例としては、例えばショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。これらの非イオン性界面活性剤のうち、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが特に好ましい。

陽イオン性界面活性剤としては、例えば脂肪族アミン塩、脂肪族４級アンモニウム塩等が挙げられる。このうち、脂肪族アミン塩としては、モノラウリルアミン、モノステアリルアミン、ジステアリルアミン、トリステアリルアミン等の高級脂肪族アミン等と、塩酸、硫酸等の無機酸或いは酢酸、乳酸、クエン酸等の低級カルボン酸等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルアミン酢酸塩、ステアリルアミン酢酸塩等が挙げられる。脂肪族４級アンモニウム塩としては、ラウリルトリメチルアンモニウム、ステアリルトリメチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ジデシルジメチルアンモニウム、ベンジルメチルテトラデシルアンモニウム等の高級脂肪族アンモニウム等と塩素、臭素等の塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルトリメチルアンモニウムクロライド、ステアリルトリメチルアンモニウムクロライド、セチルトリメチルアンモニウムクロライド、ジデシルジメチルアンモニウムクロライド、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロライド等が挙げられる。これらの陽イオン性界面活性剤のうち、脂肪族４級アンモニウム塩が特に好ましい。

陰イオン性界面活性剤としてはカルボン酸塩、スルホン酸塩、硫酸エステル塩、リン酸エステル塩等が挙げられる。このうち、カルボン酸塩としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等との塩等が挙げられ、具体的には例えばオレイン酸カリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニンナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナトリウム等が挙げられる。スルホン酸塩としては、ラウリルベンゼンスルホン酸等のアルキルベンゼンスルホン酸、ジプロピルナフチレンスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸等のナフタレンスルホン酸、ジオクチルスルホコハク酸等のスルホコハク酸等と、ナトリウム等の塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ジプロピルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジブチルナフタレンスルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等が挙げられる。硫酸エステル塩としては、ラウリル硫酸エステル等の高級アルコール硫酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸エステル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステルと、ナトリウム、アンモニウム等との塩等が挙げられ、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等の高級アルコール硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩等が挙げられる。リン酸エステル塩としては、モノステアリルリン酸エステル、モノラウリルリン酸エステル、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸等と、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩等が挙げられ、具体的には例えばモノステアリルリン酸ナトリウム、モノラウリルリン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンラウリルエーテルリン酸カリウム等が挙げられる。

これらの陰イオン性界面活性剤のうち、スルホン酸塩、硫酸エステル塩が好ましい。

両性界面活性剤としては、例えばカルボキシベタイン類、スルホベタイン類、グリシン類、アラニン類、２−アルキルイミダゾリンの誘導体類、アミンオキサイド類等が挙げられる。このうちカルボキシベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ’−カルボキシメチル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミンナトリウム等が挙げられる。スルホベタイン類の具体例としては、ラウリン酸アミドプロピルヒドロキシスルホベタイン等が挙げられる。グリシン類の具体例としては、ラウリルジアミノエチルグリシンナトリウム等が挙げられる。２−アルキルイミダゾリンの誘導体類の具体例としては、２−ラウロイル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン等が挙げられる。アミンオキサイド類の具体例としては、ラウリルジメチルアミンオキサイド等が挙げられる。これらの両性界面活性剤のうち、ラウリルベタイン類が特に好ましい。

これらの（Ｄ）界面活性剤は１種又は２種以上を用いることができ、本発明水溶液中に、フェノチアジン系酸化発色剤の安定化の点から０．１〜５（ｗ／ｖ）％、特に０．５〜２（ｗ／ｖ）％含有するのが好ましい。

本発明の水溶液には、ｐＨを調整するため緩衝剤を配合していてもよい。このような緩衝剤としては、ｐＨを５〜８に維持することができるリン酸、グリシン、トリス、グッド等の緩衝剤を挙げることができる。より好ましくは、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳが挙げられる。これらの緩衝剤の濃度は１〜１，０００ｍＭ、さらに２０〜２００ｍＭが好ましい。

本発明の安定化された水溶液には、さらに目的に応じて、酵素、酵素活性化剤、抗体、防腐剤等を配合することができる。

本発明の水溶液は、フェノチアジン系酸化発色剤の自動酸化が抑制されているので、プロテアーゼを使用するあらゆる種類の酸化発色系の比色定量試薬として使用できる。好ましくは、プロテアーゼと酵素反応を利用して、標的成分から直接又は２次的に過酸化水素を生成させる反応系に広く利用することができる。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

参考例
キレート剤を添加しない場合のプロテアーゼによるＤＡ−６７の吸光度の上昇（着色）を確認するため、ＤＡ−６７を２０μＭ、及びプロナーゼ、アクチナーゼＥ（ＥＣ ３．４．２４．３１、ストレプトマイセス グリセウス由来、科研ファルマ製）、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ（アスペルギルス オリーゼ由来、シグマ社Ｐ４０３２）、プロテアーゼタイプＸＶ（ＥＣ ３．４．２４．３２、バチルス ポリミキサ由来、シグマ社Ｐ５６４７）、α−キモトリプシン（ＥＣ ３．４．２４．１、ウシ膵臓由来、和光純薬工業社）を各０．２ｍｇ／ｍＬ含有する水溶液を、４５℃で２日保存後、自動分析装置Ｈ７１７０で６６０ｎｍの吸光度を測定した。プロテアーゼを含有しない場合の吸光度を１００とした時の吸光度の割合を図１に示す。

実施例１
フェノチアジン系酸化発色剤１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン（ＤＡ−６７）を２０μＭ、及びプロナーゼ（ストレジストプトマイセス グリセウス由来，ロシュ社）０．２ｍｇ／ｍＬ含有する水溶液に、１０μＭになるように各種キレート剤を添加して、４５℃で２日保存後、自動分析装置Ｈ７１７０で６６０ｎｍの吸光度を測定した。キレート剤を添加しない場合（対照）の吸光度を１００とした時の吸光度の割合を図２に示す。

図１から、４５℃２日保存によるフェノチアジン系酸化発色剤溶液の吸光度の上昇（着色）は、プロテアーゼにより増強され、その度合がプロテアーゼの製品によって異なり、アクチナーゼＥ、プロナーゼで特に大きいことがわかる。一方、図２から明らかなように、プロナーゼによる着色は、ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＣｙＤＴＡ）及びジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を添加した場合に、特に顕著に抑制できることがわかる。

実施例２
プロナーゼに代えて、アクチナーゼＥ、プロテアーゼタイプＸＸＩＩＩ、あるいはプロテアーゼタイプＸＶを用いた場合の結果を図３に示す。尚、図３は、各プロテアーゼ共存下においてキレート剤を添加しない場合（対照）の吸光度をそれぞれ１００とした時の吸光度の割合を示している。
図３から明らかなように、ＣｙＤＴＡ及びＤＴＰＡを添加した場合に、他のキレート剤と比較して着色が抑制されており、着色の度合が大きいアクチナーゼＥ、プロナーゼ存在下では特に顕著であることがわかる。

実施例３
実施例１において、さらに１（ｗ／ｖ）％ラウリルベタイン（アンヒトール２４Ｂ、花王（株）製）を添加して、４５℃で２日保存後、自動分析装置Ｈ７１７０で６６０ｎｍの吸光度を測定した。キレート剤、界面活性剤を添加しない場合（対照）の吸光度を１００とした時の吸光度の割合を図４に示す。
図４から、さらに界面活性剤を併用することにより、着色防止効果がさらに向上することがわかる。

Claims (4)

1. （Ａ）１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン及び１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３−ジメチルアミノ−７−ヒドロキシ−１０Ｈ−フェノチアジンから選ばれるフェノチアジン系酸化発色剤及び（Ｂ）プロテアーゼを含有する水溶液に、（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上のキレート剤を含有させることを特徴とする前記フェノチアジン系酸化発色剤及び前記プロテアーゼ含有水溶液の安定化方法。
2. さらに、（Ｄ）界面活性剤を含有させる請求項１記載の安定化方法。
3. （Ａ）１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−（メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン及び１０−（Ｎ−メチルカルバモイル）−３−ジメチルアミノ−７−ヒドロキシ−１０Ｈ−フェノチアジンから選ばれるフェノチアジン系酸化発色剤、（Ｂ）プロテアーゼ、並びに（Ｃ）ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸及びそれらの塩から選ばれる１種以上のキレート剤を含有することを特徴とする、安定化された前記フェノチアジン系酸化発色剤及び前記プロテアーゼ含有水溶液。
4. さらに、（Ｄ）界面活性剤を含有する請求項３記載の水溶液。

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