JP7056577B2 - ヘモグロビンの糖化率測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヘモグロビンの糖化率の測定方法に関する。より詳しくは、血液等の生体試料中の糖化ヘモグロビンの割合を、酵素反応を利用して測定する方法およびそのための組成物に関する。
糖尿病のマーカーの１つとしてＨｂＡ１ｃなどの糖化ヘモグロビンが利用されている。ＨｂＡ１ｃとはヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基にグルコースが結合した糖化ヘモグロビンのことである。糖尿病マーカーとして糖化ヘモグロビンを用いる際には、ヘモグロビンの糖化率、すなわち全ヘモグロビン濃度に対する糖化ヘモグロビン濃度の比率（以後、「糖化ヘモグロビン比率」とも記載する。）を算出して診断に用いる。例えば全ヘモグロビン濃度に対するＨｂＡ１ｃ濃度の比率（以後、「ＨｂＡ１ｃ比率」とも記載する。）は血中のグルコース量と比較してその量が急激に変動せず、１～２か月前の血糖値とよく相関するので糖尿病の指標として優れているとされている。
現在糖化ヘモグロビン比率の測定法としては高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ラテックス凝集免疫比濁法が普及している。ＨＰＬＣ法はカラム価格が高い、また処理能力が低いという問題がある。またラテックス凝集免疫比濁法は測定に使用する分析装置の反応槽を汚染し、メンテナンスに手間がかかるという問題がある。そこで、これらの問題を解消した酵素法が近年着目されており、普及している。
現在糖化ヘモグロビン比率の測定法としては高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ラテックス凝集免疫比濁法が普及している。ＨＰＬＣ法はカラム価格が高い、また処理能力が低いという問題がある。またラテックス凝集免疫比濁法は測定に使用する分析装置の反応槽を汚染し、メンテナンスに手間がかかるという問題がある。そこで、これらの問題を解消した酵素法が近年着目されており、普及している。
糖化ヘモグロビン比率を測定するに際し酵素法として代表的な方法は、非酵素反応で全ヘモグロビン濃度を測定し、別途、酵素反応で糖化ヘモグロビン濃度を測定後、計算式から糖化ヘモグロビン比率を算出するものである。
全ヘモグロビン濃度の測定法としては国際標準法であるシアンメトヘモグロビン法、塩酸ヘマチン法、アルカリヘマチン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法、Ｈｂ・ｒｅｄ計測法、またはＨｂＣＯ計測法などが挙げられる。
全ヘモグロビン濃度は、濃度既知で全ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて全ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の全ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
一方、糖化ヘモグロビン濃度測定法としては糖化ヘモグロビンまたはその分解産物に酸化還元酵素を反応させて過酸化水素を生成し、さらに該過酸化水素をパーオキシダーゼ存在下で発色基質と反応させて発色量を測定する比色定量法である（特許文献１）。
糖化ヘモグロビン濃度は、濃度既知で糖化ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて糖化ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の糖化ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
例えば糖化ヘモグロビンとしてＨｂＡ１ｃを選択した場合、糖化ＨｂＡ１ｃ比率は上記反応で得られた全ヘモグロビン濃度や糖化ヘモグロビン濃度を以下の計算式に当てはめることで算出できる。
ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値
＝０．０９１５ × ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）／総Ｈｂ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＋２．１５
ＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値＝０．９８０ × ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値 － ０．２４５
したがって、酵素法によるＨｂＡ１ｃ比率測定方法を自動分析機に適用する場合、全ヘモグロビンを測定するチャンネルとＨｂＡ１ｃを測定するチャンネルの２チャンネルが必要となるため、２チャンネル分の試薬が必要となり、煩雑となる。また、２種類の測定を行うことから、ＨｂＡ１ｃ比率の測定処理速度は、１チャンネルを用いて１種類の測定を行う方法と比べて低下する。
全ヘモグロビン濃度の測定法としては国際標準法であるシアンメトヘモグロビン法、塩酸ヘマチン法、アルカリヘマチン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法、Ｈｂ・ｒｅｄ計測法、またはＨｂＣＯ計測法などが挙げられる。
全ヘモグロビン濃度は、濃度既知で全ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて全ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の全ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
一方、糖化ヘモグロビン濃度測定法としては糖化ヘモグロビンまたはその分解産物に酸化還元酵素を反応させて過酸化水素を生成し、さらに該過酸化水素をパーオキシダーゼ存在下で発色基質と反応させて発色量を測定する比色定量法である（特許文献１）。
糖化ヘモグロビン濃度は、濃度既知で糖化ヘモグロビン濃度が異なる２種のキャリブレーターを用いて糖化ヘモグロビン濃度のキャリブレーションカーブを作成し、続いて試料中の糖化ヘモグロビン量を測定し、前記キャリブレーションカーブを用いて算出する。
例えば糖化ヘモグロビンとしてＨｂＡ１ｃを選択した場合、糖化ＨｂＡ１ｃ比率は上記反応で得られた全ヘモグロビン濃度や糖化ヘモグロビン濃度を以下の計算式に当てはめることで算出できる。
ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値
＝０．０９１５ × ＨｂＡ１ｃ濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）／総Ｈｂ濃度（ｍｏｌ／Ｌ）＋２．１５
ＨｂＡ１ｃ（ＪＤＳ）値＝０．９８０ × ＨｂＡ１ｃ（ＮＧＳＰ）値 － ０．２４５
したがって、酵素法によるＨｂＡ１ｃ比率測定方法を自動分析機に適用する場合、全ヘモグロビンを測定するチャンネルとＨｂＡ１ｃを測定するチャンネルの２チャンネルが必要となるため、２チャンネル分の試薬が必要となり、煩雑となる。また、２種類の測定を行うことから、ＨｂＡ１ｃ比率の測定処理速度は、１チャンネルを用いて１種類の測定を行う方法と比べて低下する。
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、酵素法を用いて糖化ヘモグロビン比率を測定する方法を、より簡便、より迅速、及び／又はより正確なものに向上させること、および／または、前記測定方法に用いるためのキャリブレーター、試薬組成物等を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。理論に拘束されることは望まないが、本発明では、スルホ基を持つ化合物をヘモグロビンに接触させることで、ヘモグロビン分子中に含まれる２価の鉄イオンが部分的に酸化されて還元能が所定の割合で弱められ、その還元能が弱められたヘモグロビンが、その量に応じて、糖化ヘモグロビンに対する糖化アミノ酸オキシダーゼなどの酵素反応で発生する過酸化水素の濃度を低下させることで、ペルオキシダーゼ存在下における過酸化水素と発色基質との反応により得られる発色量と糖化ヘモグロビン比率との間で強い相関関係を生じさせていると推測される。そして本発明者らは、この強い相関関係は、キャリブレーターとして２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用い、それらの全ヘモグロビン濃度が所定の比率となるものを用いることで、より相関関係が高められることをも見出した。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
［項１］
以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法：
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程、及び、
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程。
［項２］
前記（５）の工程で用いる糖化ヘモグロビンキャリブレーターとして、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを使用し、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍の濃度である、項１に記載の測定方法。
［項３］
さらに、以下の（６）の工程を含む、項１又は２の測定方法：
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程。
［項４］
さらに、以下の（７）の工程を含む、項１～３のいずれかに記載の測定方法：
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程。
［項５］
前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ベンゼンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、ベンゾチアゾリンスルホン酸、アントラキノンスルホン酸、カンファースルホン酸、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～４のいずれかに記載の測定方法。
［項６］
前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシル、ジアルキルスルホコハク酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～５のいずれかに記載の測定方法。
［項７］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、ロイコ型色原体である、項１～６のいずれかに記載の測定方法。
［項８］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、フェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～７のいずれかに記載の測定方法。
［項９］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン、及び１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンからなる群より選択される少なくとも１種のフェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～８のいずれかに記載の測定方法。
［項１０］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩である、項１～９のいずれかに記載の測定方法。
［項１１］
１チャンネルで実施される、項１～１０のいずれかに記載の測定方法。
［項１２］
以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定キット：
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬、
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬、
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬、
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬、及び、
（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター。
［項１３］
前記（ｅ）の糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度である糖化ヘモグロビンキャリブレーターである、項１２に記載の測定キット。
［項１４］
さらに、以下の（ｆ）の試薬を含む項１２又は１３に記載の測定キット：
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬。
以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法：
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程、及び、
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程。
［項２］
前記（５）の工程で用いる糖化ヘモグロビンキャリブレーターとして、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを使用し、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍の濃度である、項１に記載の測定方法。
［項３］
さらに、以下の（６）の工程を含む、項１又は２の測定方法：
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程。
［項４］
さらに、以下の（７）の工程を含む、項１～３のいずれかに記載の測定方法：
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程。
［項５］
前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ベンゼンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、ベンゾチアゾリンスルホン酸、アントラキノンスルホン酸、カンファースルホン酸、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～４のいずれかに記載の測定方法。
［項６］
前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシル、ジアルキルスルホコハク酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、項１～５のいずれかに記載の測定方法。
［項７］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、ロイコ型色原体である、項１～６のいずれかに記載の測定方法。
［項８］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、フェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～７のいずれかに記載の測定方法。
［項９］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン、及び１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンからなる群より選択される少なくとも１種のフェノチアジン系のロイコ型色原体である、項１～８のいずれかに記載の測定方法。
［項１０］
上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩である、項１～９のいずれかに記載の測定方法。
［項１１］
１チャンネルで実施される、項１～１０のいずれかに記載の測定方法。
［項１２］
以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定キット：
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬、
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬、
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬、
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬、及び、
（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター。
［項１３］
前記（ｅ）の糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度である糖化ヘモグロビンキャリブレーターである、項１２に記載の測定キット。
［項１４］
さらに、以下の（ｆ）の試薬を含む項１２又は１３に記載の測定キット：
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬。
本発明により、全ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度を別々に測定して値を算出する必要がなくなり、酵素法によって糖化ヘモグロビン比率を測定するにあたり汎用の自動分析機において１チャンネルしか必要とせず、より簡便、より迅速、及び／又はより正確な測定が可能になる。
本発明の実施の形態について詳細に説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。また本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「★～☆」と記載されていれば「★以上、☆以下」を示す。また本明細書中の「および／または」は、いずれか一方または両方を意味する。
本発明において、酵素の活性については、明細書に記載がないものについては、原則として、市販品については容器や添付の説明書・パンフレット等に測定法や単位の記載があればそれに従う。また、文献に記載されたものであれば、その文献に記載されている活性測定方法に従う。
活性の定義（測定方法）がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。
活性の定義（測定方法）がわからない場合や、測定に必要な試薬の入手に制約がある場合などにおいては、当業者の常識に基づいて合理的に適宜基質を選定し、測定条件を決定した上で測定する。
［１．糖化ヘモグロビン比率の測定方法］
本発明の実施態様の一つは、以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法である。
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程
本発明の実施態様の一つは、以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法である。
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程
本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法では、全ヘモグロビン濃度と糖化ヘモグロビン濃度とを別々に測定する必要がない。したがって、汎用の自動分析機において１チャンネルしか必要とせず、より簡便・迅速・正確な測定が可能になる。
［１－１．測定対象、試料等について］
本発明の糖化ヘモグロビン比率測定方法の測定対象となる試料は特に限定されない。例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
本発明の糖化ヘモグロビン比率測定方法の測定対象となる試料は特に限定されない。例えば、全血、血漿、血清、血球等の他に、尿、髄液等の生体試料（すなわち生体から採取された試料）や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。
本発明の測定方法の対象となる糖化ヘモグロビンは特に限定されない。例えば、ヘモグロビンのβ鎖に糖類が結合したものをヘモグロビンＡ１といい、糖の種類によってさらにＡ１ａ１、Ａ１ａ２、Ａ１ｂ、Ａ１ｃに分画される。一般に、ヘモグロビンのβ鎖にフルクトース１－６二リン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ａ１（ＨｂＡ１ａ１）、グルコース－６－リン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ａ２（ＨｂＡ１ａ２）、ピルビン酸が結合したものをヘモグロビンＡ１ｂ（ＨｂＡ１ｂ）、グルコースが結合したものをヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ） と呼ぶ。これらの分画のうち最も多いのがＡ１ｃ分画（ＨｂＡ１ｃ）であり、糖尿病マーカーとしてよく用いられている。本発明では前記の分画のいずれを測定対象としても良いが、好ましくはＨｂＡ１ｃである。
本発明の方法は、糖尿病の診断に応用することができるため、上記の中でも特に全血試料、血球試料に有用である。特に限定されるものではないが、赤血球内の糖化ヘモグロビンを測定する場合には、全血をそのまま溶血したり、全血から分離した赤血球を溶血したりして、この溶血試料を測定用の試料とすればよい。
測定用試料の調製にあたっては、希釈操作を行ってもよい。希釈液には精製水を用いてもよいし、グッド緩衝液やリン酸緩衝液などの緩衝液を用いてもよい。安定化剤としてアミノ酸、酸化合物、サポニンやシクロデキストリンなどの糖類を含んでもよい。その他、アジ化ナトリウムやプロクリンなどの保存剤、ＥＤＴＡなどのキレート剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル類やラウリルトリメチルアンモニウム塩、アルキルベタインなどの界面活性剤など、何らかの成分を含む液を用いてもよい。
試料には、広義には、キャリブレーターも含まれる。
キャリブレーターとしては、特に限定されるものではないが、全血、血球、全血を精製水や試薬に溶解した液、血球を精製水や試薬に溶解した液などが挙げられる。前記溶解のための試薬としては、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いてもよい。これらは、冷蔵または冷凍保存することが好ましく、中でも冷凍保存が好ましい。冷凍保存により凍結されたキャリブレーターは使用の際に解凍して用いればよい。
また、キャリブレーターとして、前記の全血、血球、溶解液などを凍結乾燥させたものを用いることもできる。凍結乾燥されたキャリブレーターは使用の際に再溶解して用いればよい。前記再溶解の際には、例えば、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いることができる。
キャリブレーターとしては、特に限定されるものではないが、全血、血球、全血を精製水や試薬に溶解した液、血球を精製水や試薬に溶解した液などが挙げられる。前記溶解のための試薬としては、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いてもよい。これらは、冷蔵または冷凍保存することが好ましく、中でも冷凍保存が好ましい。冷凍保存により凍結されたキャリブレーターは使用の際に解凍して用いればよい。
また、キャリブレーターとして、前記の全血、血球、溶解液などを凍結乾燥させたものを用いることもできる。凍結乾燥されたキャリブレーターは使用の際に再溶解して用いればよい。前記再溶解の際には、例えば、前記の測定用試料調製の目的で例示されている精製水または希釈液を用いることができる。
［１－２．工程（７）、溶血等について］
本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法は、さらに、以下の（７）の工程を含んでもよい。
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程
工程（７）は、糖化ヘモグロビンを含む試料が全血または血球を含む場合に好ましく用いられる。
工程（７）は、例えば、前記のように工程（１）～（５）に先立って測定用の試料を調製する際に実施することができる。また、工程（７）は、工程（２）～（５）に先立って工程（１）と同時に行ってもよい。また、工程（７）を実施してから工程（２）～（５）に先立って工程（１）を行ってもよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（７）は測定用試料調製時に行うのではなく、試薬添加時に行うこともできる。この場合、最初の試薬添加により開始する第一ステップで行うことが好ましい。
本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法は、さらに、以下の（７）の工程を含んでもよい。
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程
工程（７）は、糖化ヘモグロビンを含む試料が全血または血球を含む場合に好ましく用いられる。
工程（７）は、例えば、前記のように工程（１）～（５）に先立って測定用の試料を調製する際に実施することができる。また、工程（７）は、工程（２）～（５）に先立って工程（１）と同時に行ってもよい。また、工程（７）を実施してから工程（２）～（５）に先立って工程（１）を行ってもよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（７）は測定用試料調製時に行うのではなく、試薬添加時に行うこともできる。この場合、最初の試薬添加により開始する第一ステップで行うことが好ましい。
溶血とは赤血球膜が破壊される現象を指す。正常な全血や、生理食塩水などの等張液に赤血球を浮遊させた場合は溶血せず赤色不透明な懸濁液として観察されるが、溶血を起こすとヘモグロビンが漏出し、赤色透明な溶液に変化する。
溶血方法は、特に制限されず、例えば、全血や血球を蒸留水や低張液に懸濁して浸透圧差を利用して赤血球膜を破壊する方法、界面活性剤を含む試薬に懸濁して赤血球膜を溶解させる方法、超音波による方法、凍結溶解による方法などが挙げられる。中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。
溶血方法は、特に制限されず、例えば、全血や血球を蒸留水や低張液に懸濁して浸透圧差を利用して赤血球膜を破壊する方法、界面活性剤を含む試薬に懸濁して赤血球膜を溶解させる方法、超音波による方法、凍結溶解による方法などが挙げられる。中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法または、浸透圧の差を利用する方法が好ましい。
界面活性剤を用いる前記溶血方法に用いる界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔ－オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、商品名Ｔｗｅｅｎ－２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等が挙げられる。また、ＣＨＡＰＳＯ、ＣＨＡＰＳ等の両イオン性の界面活性剤、コール酸ナトリウムやデオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤、塩化ベンゼトニウムなどの陽イオン性界面活性剤も使用可能である。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が０．５～１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０５～５重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒～１分程度攪拌すればよい。
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２～１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
［１－３．工程（１）、スルホ基を持つ化合物等について］
工程（１）では、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる。
スルホ基を持つ化合物としては、特に限定されないが、例えば、アルキルスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾチアゾリンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、アントラキノンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体などが挙げられる。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩が用いられ、より好ましくはベンゼンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩が用いられる。ここで、塩の種類は限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好ましくはナトリウム塩である。
工程（１）では、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる。
スルホ基を持つ化合物としては、特に限定されないが、例えば、アルキルスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾチアゾリンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、アントラキノンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体などが挙げられる。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ベンゼンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩が用いられ、より好ましくはベンゼンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩が用いられる。ここで、塩の種類は限定されないが、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができ、好ましくはナトリウム塩である。
アルキルスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等が挙げられる。
ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、３－アミノベンゼンスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸ナトリウム、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸一ナトリウム、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。好ましくは、ベンゼンスルホン酸、その誘導体、またはそれらの塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩である。
ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくは、アルキルナフタレンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩である。
スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはスルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等が好ましい例として挙げられる。
カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては（±）－１０－カンファースルホン酸が挙げられる。
ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては４－クロロ－７－クロロスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールが挙げられる。
上記のうち特に好ましくはラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムであり、なかでも好ましくはアルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムである。
ベンゼンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、３－アミノベンゼンスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸ナトリウム、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸２ナトリウム、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸一ナトリウム、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。好ましくは、ベンゼンスルホン酸、その誘導体、またはそれらの塩として、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩である。
ナフタレンスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては、アルキルナフタレンスルホン酸ナトリウム、２－ナフタレンスルホン酸ナトリウム、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。好ましくは、アルキルナフタレンスルホン酸、及びその誘導体、並びにそれらの塩である。
スルホコハク酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としてはスルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、ジアルキルスルホコハク酸ナトリウム等が好ましい例として挙げられる。
カンファースルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては（±）－１０－カンファースルホン酸が挙げられる。
ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、その塩またはそれらの誘導体は特に限定されないが、具体的な例としては４－クロロ－７－クロロスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールが挙げられる。
上記のうち特に好ましくはラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシルナトリウム、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムであり、なかでも好ましくはアルキルジフェニルエーテルスルホン酸ナトリウムである。
上記の化合物の添加濃度は特に限定されないが、処理溶液中の血球濃度が０．０１～１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．０５～５重量％になるように添加することが好ましい。
例えば、工程（１）を工程（７）と同時に行う場合、０．２５～１体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。また、例えば工程（１）を工程（２）と同時に行う場合、０．１～３体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。
例えば、工程（１）を工程（７）と同時に行う場合、０．２５～１体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。また、例えば工程（１）を工程（２）と同時に行う場合、０．１～３体積％の前記化合物を含む試薬にて行うことができる。
工程（１）において糖化ヘモグロビンを含む試料への前記の化合物の接触方法は特に限定されない。例えば試料を調製する際に糖化ヘモグロビンを含む試料へ添加剤を添加すればよい。
その場合、工程（１）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。また、工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（１）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（１）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで供給されていてもよい。
その場合、工程（１）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。また、工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（１）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（１）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで供給されていてもよい。
［１－４．工程（２）、糖化アミノ酸オキシダーゼ等について］
工程（２）では、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる。
本明細書において糖化アミノ酸オキシダーゼとはアマドリ化合物を酸化して過酸化水素を生成する反応を触媒することができる酵素を意味する。糖化アミノ酸オキシダーゼはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、アマドリアーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ、糖化ヘモグロビンオキシダーゼなどと呼ばれることもある。
工程（２）では、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる。
本明細書において糖化アミノ酸オキシダーゼとはアマドリ化合物を酸化して過酸化水素を生成する反応を触媒することができる酵素を意味する。糖化アミノ酸オキシダーゼはフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ、アマドリアーゼ、ケトアミンオキシダーゼ、糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ、糖化ヘモグロビンオキシダーゼなどと呼ばれることもある。
前記のアマドリ化合物としては、例えば、糖化タンパク質の一種である糖化ヘモグロビン、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化ジペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジンが知られている。）、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化ヘキサペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸が知られている。）、糖化ヘモグロビン分解物の一種である糖化アミノ酸などが挙げられる。
本発明の方法に用いる糖化アミノ酸オキシダーゼは特に限定されない。例えば、公知のものとして、アカエトミエラ（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｅｌｌａ）属、アカエトミウム（Ａｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、シエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属、カエトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）属、ゲラシノスポラ（Ｇｅｌａｓｉｎｏｓｐｏｒａ）属、ミクロアスカス（Ｍｉｃｒｏａｓｃｕｓ）、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユウペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、コニオケチジウム（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔｉｄｉｕｍ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属由来酵素およびその改変体などが使用できる。
糖化ヘキサペプチドが反応する糖化アミノ酸オキシダーゼとしては特に限定されないが、ＷＯ０８／１０８３８５で糖化ヘキサペプチドオキシダーゼとして示されているものが挙げられる。
また糖化タンパク質に反応する糖化アミノ酸オキシダーゼとしては特に限定されないが、ＷＯ２０１５／００５２５７、ＷＯ２０１５／００５２５８で糖化ヘモグロビンオキシダーゼとして示されているもの、ＷＯ２０１５／０６０４２９でアマドリアーゼとして示されているものなどが挙げられる。
また糖化タンパク質に反応する糖化アミノ酸オキシダーゼとしては特に限定されないが、ＷＯ２０１５／００５２５７、ＷＯ２０１５／００５２５８で糖化ヘモグロビンオキシダーゼとして示されているもの、ＷＯ２０１５／０６０４２９でアマドリアーゼとして示されているものなどが挙げられる。
また、市販のものでは、ＦＰＯ－３０１（商標）（東洋紡）、ＦＰＯＸ－ＣＥ（商標）（キッコーマン）、ＦＰＯＸ－ＥＥ（商標）（キッコーマン）などを使用することができる。
なお、現時点では本願発明に使用することはできない糖化アミノ酸オキシダーゼであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。あるいは、今後新規に得られた糖化アミノ酸オキシダーゼであって、上記の特性を有する糖化アミノ酸オキシダーゼは、本願発明に使用できる。そして、そのような糖化アミノ酸オキシダーゼを用いて構築した糖化ヘモグロビン比率の測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる条件は、用いる糖化アミノ酸オキシダーゼが測定対象の糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンやそれらの分解産物に作用し過酸化水素を生成する条件であれば、いかなる条件でもよい。
使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの量は試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択される。例えば、一例として糖化アミノ酸オキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは５ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用する酵素の作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の作用時間は、測定対象の糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンやその分解産物に作用し過酸化水素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒以上（好ましくは１分以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分以下（好ましくは６０分以下、さらに好ましくは１０分以下）になるように行うことができる。
また、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際には、作用性を高めるため等の目的で界面活性剤などの変性剤を共存させても良い。
使用する糖化アミノ酸オキシダーゼの量は試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択される。例えば、一例として糖化アミノ酸オキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは５ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用する酵素の作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の作用時間は、測定対象の糖化ペプチド、糖化ヘモグロビンやその分解産物に作用し過酸化水素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒以上（好ましくは１分以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分以下（好ましくは６０分以下、さらに好ましくは１０分以下）になるように行うことができる。
また、糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる際には、作用性を高めるため等の目的で界面活性剤などの変性剤を共存させても良い。
工程（２）において糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば糖化ヘモグロビンを含む試料へ糖化アミノ酸オキシダーゼを添加すればよい。
その場合、工程（１）の説明で述べたとおり工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。したがって、工程（２）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（２）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（２）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよい（例えば、後述の「消去系」を構築する場合にはこの態様が好ましい。）が、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（２）に必要な試薬成分と工程（３）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
その場合、工程（１）の説明で述べたとおり工程（１）と工程（２）とを同時に行うことは可能である。したがって、工程（２）は工程（７）と同時に行ってもよいし、工程（７）の次に行ってもよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（２）に必要な試薬成分は、工程（３）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（２）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよい（例えば、後述の「消去系」を構築する場合にはこの態様が好ましい。）が、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（２）に必要な試薬成分と工程（３）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
［１－５．工程（６）、プロテアーゼ等について］
工程（２）で用いられる前記糖化アミノ酸オキシダーゼの糖化タンパク質に対する反応性が弱いかまたはほとんど無い場合は、さらに、以下の（６）の工程を含んでもよい。
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程
工程（２）で用いられる前記糖化アミノ酸オキシダーゼの糖化タンパク質に対する反応性が弱いかまたはほとんど無い場合は、さらに、以下の（６）の工程を含んでもよい。
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程
本明細書においてプロテアーゼとは糖化ヘモグロビンに作用して糖化ヘモグロビン分解物に分解する反応を触媒することができる酵素を意味する。プロテアーゼはペプチダーゼ、プロテイナーゼなどと呼ばれることもある。
前記の糖化ヘモグロビン分解物としては、糖化ヘモグロビンがプロテアーゼにより、糖化アミノ酸および／または糖化ペプチドに断片化されたものであれば特に限定されない。断片の大きさも特に制限されない。例えば、糖化ジペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジン）、糖化ヘキサペプチド（例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸）、または、糖化アミノ酸などが挙げられる。
本発明の方法に用いるプロテアーゼは特に限定されず、アミノペプチターゼ、ジペプチターゼ、ジペプチジルペプチターゼ、トリペプチジルペプチターゼ、ペプチジルジペプチターゼ、セリンカルボキシペプチターゼ、プロリンカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、金属プロテアーゼ、システイン性カルボキシペプチターゼ、オメガペプチターゼ、セリンエンドペプチターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、スレオニンエンドペプチターゼなどが例示できる。
これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。これらのプロテアーゼを２以上組み合わせて用いてもよい。
これらのプロテアーゼは、市販のものをそのまま用いても良いし、公知文献に記載されたものをその記載にしたがって製造したものを使用しても良い。これらのプロテアーゼを２以上組み合わせて用いてもよい。
本発明に用いるプロテアーゼは、安定性、反応速度（比活性）、入手の容易性などから、以下のものが好ましい。
メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ等が使用できる。
メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来プロテアーゼ等が使用できる。
市販品としては、例えば、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム）、プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム）、パパインＭ－４０（天野エンザイム）、サーモリシン（大和化成）、サモアーゼＰＣ１０（大和化成）、トヨチーム（東洋紡）、プロナーゼ（ロシュ）、プロテアーゼ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．由来（シグマアルドリッチ）、プロテアーゼ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来 Ｔｙｐｅ ＸＩＶ（シグマアルドリッチ）、プロテアーゼＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ ｇｒｉｓｅｕｓ由来 Ｔｙｐｅ ＸＸＩ（シグマアルドリッチ）、アクチナーゼＥ（科研製薬）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（ロシュ）が挙げられる。
なお、現時点では本願発明に使用することはできないプロテアーゼであっても、今後遺伝子工学的または化学的等の方法で改変を加え、上記の特性を有するように改良したものは、本願発明に使用できる。あるいは、今後新規に得られたプロテアーゼであって、上記の特性を有するプロテアーゼは、本願発明に使用できる。そして、そのようなプロテアーゼを用いて構築した糖化ヘモグロビン比率の測定系もまた、本願発明の技術思想に包含される。
糖化ヘモグロビンにプロテアーゼの作用させる条件は、用いるプロテアーゼが測定対象の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビン分解物に分解する条件であれば、いかなる条件でもよい。
使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、プロテアーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が、０．０１ＫＵ／Ｌ以上、一般的には０．１ＫＵ／Ｌ以上、より一般的には５０ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは５００ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が２０００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは１８００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１５００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１３００ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
プロテアーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
プロテアーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の処理時間は、測定対象の糖化ヘモグロビンに作用して糖化ヘモグロビン分解物に分解するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
使用するプロテアーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、プロテアーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が、０．０１ＫＵ／Ｌ以上、一般的には０．１ＫＵ／Ｌ以上、より一般的には５０ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３００ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは５００ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が２０００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは１８００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１５００ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１３００ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
プロテアーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するプロテアーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
プロテアーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の処理時間は、測定対象の糖化ヘモグロビンに作用して糖化ヘモグロビン分解物に分解するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
工程（６）において糖化ヘモグロビンにプロテアーゼを作用させる方法は特に限定されない。例えば糖化ヘモグロビンを含む試料へプロテアーゼを添加すればよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（６）の実施手順の設定は、測定対象に共存する非測定対象物である糖化アミノ酸の影響を排除するため、あらかじめ糖化アミノ酸オキシダーゼを添加して非測定対象物である糖化アミノ酸を消去（消去反応）してから測定対象物である糖化ヘモグロビンの本反応を開始する測定系（以下「消去系」とする）を構築する場合と構築しない場合とで考え方が異なる。
消去系を構築しない場合、工程（６）に必要な試薬成分は、工程（２）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより前の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（６）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよいが、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（６）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
一方、消去系を構築する場合は、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、消去反応を第一ステップで行い、本反応を第二ステップで行うことになるため、工程（６）に必要な試薬成分が揃うのは第二ステップとなり、この時に工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分の両方が全て揃っていればよい。また、この場合は、工程（６）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよく、また、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
一方、消去系を構築する場合は、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、消去反応を第一ステップで行い、本反応を第二ステップで行うことになるため、工程（６）に必要な試薬成分が揃うのは第二ステップとなり、この時に工程（６）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分の両方が全て揃っていればよい。また、この場合は、工程（６）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよく、また、工程（２）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
［１－６．工程（３）、ペルオキシダーゼ、発色基質等について］
工程（３）では、工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる。
工程（３）では、工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる。
本発明の方法に用いるペルオキシダーゼとしては、過酸化水素を発色基質に接触させて発色色素を生成させることができるものであれば特に限定されないが、好適なものとしては、西洋ワサビや微生物などに由来するものが挙げられる。中でも、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。前記ペルオキシダーゼは、高純度かつ低価格のものが商業的に入手可能である。
前記の発色基質としては、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応し、単独で色素を生成する色原体であれば特に限定されない。そのようなものとしてロイコ型色原体、トリフェニルメタン誘導体、フェノチアジン誘導体、ジフェニルアミン誘導体などが挙げられる。好ましくは、ロイコ型色原体が用いられ、より好ましくはフェノチアジン系のロイコ型色原体が用いられる。
具体的には、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４と略称される。）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７と略称される。）、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰと略称される。）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰと略称される。）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡと略称される。）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳと略称される。）、４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）等が挙げられる。
検体由来の共存物の影響を受けにくいという点ではＤＡ－６４が好ましく、感度面ではＤＡ－６７が好ましい。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩）、ＣＣＡＰ（１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）、ＭＣＤＰ（１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）等のフェノチアジン系のロイコ型色原体が用いるのがよく、なかでも好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩）を用いるのがよい。
具体的には、Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ－６４と略称される。）、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩（ＤＡ－６７と略称される。）、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＣＣＡＰと略称される。）、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン（ＭＣＤＰと略称される。）、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡと略称される。）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン（ＴＰＭ－ＰＳと略称される。）、４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）等が挙げられる。
検体由来の共存物の影響を受けにくいという点ではＤＡ－６４が好ましく、感度面ではＤＡ－６７が好ましい。本発明において、より一層効果的に糖化ヘモグロビン比率を得ることができるという観点から、好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩）、ＣＣＡＰ（１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）、ＭＣＤＰ（１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン）等のフェノチアジン系のロイコ型色原体が用いるのがよく、なかでも好ましくは、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩）を用いるのがよい。
使用する発色基質の量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩を、測定完了時の反応液中の濃度が０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは０．００３ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下）となるように加える。他の発色基質を用いる場合、特にフェノチアジン系のロイコ型色原体を発色基質として用いる場合にも、上記と同様の濃度で使用することが可能である。
工程（３）においてペルオキシダーゼを作用させる条件は、用いるペルオキシダーゼが過酸化水素および発色基質に作用し発色色素を生成する条件であれば、いかなる条件でもよい。
使用するペルオキシダーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、ペルオキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、より好ましくは３０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
ペルオキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するペルオキシダーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
ペルオキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の処理時間は、ペルオキシダーゼが過酸化水素および発色基質に作用し発色色素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
使用するペルオキシダーゼの量は、試料中に含まれる測定対象物の含量、あるいは処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、ペルオキシダーゼを、測定完了時の反応液中の濃度が０．１ＫＵ／Ｌ以上（好ましくは１ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは２ＫＵ／Ｌ以上、さらに好ましくは３ＫＵ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１００ＫＵ／Ｌ以下（好ましくは５０ＫＵ／Ｌ以下、より好ましくは３０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは２０ＫＵ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０ＫＵ／Ｌ以下）となるように加える。
ペルオキシダーゼを作用させる際のｐＨは無調整でもよく、使用するペルオキシダーゼの作用に好適なｐＨとなるように、例えば、適当なｐＨ調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等により、反応液中のｐＨが２以上（好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上）となるように、かつ、反応液中のｐＨが９以下（好ましくは８．５以下、さらに好ましくは８以下）となるように調整してもよい。
ペルオキシダーゼを作用させる温度は、例えば、反応液中で２０℃以上（好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上）となるように、かつ、反応液中で７０℃以下（好ましくは６０℃以下、さらに好ましくは５０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下）となるように行うことができる。
この際の処理時間は、ペルオキシダーゼが過酸化水素および発色基質に作用し発色色素を生成するのに充分な時間であればよく、例えば、５秒間以上（好ましくは１分間以上、さらに好ましくは３分以上）となるように、かつ、１８０分間以下（好ましくは６０分間以下、さらに好ましくは１０分間以下）になるように行うことができる。
工程（３）においてペルオキシダーゼを過酸化水素および発色基質に作用させ発色色素を生成させる方法は特に限定されない。例えば、工程（２）の反応により過酸化水素が生成している（または生成することが想定される）反応液へペルオキシダーゼを添加すればよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（３）に必要な試薬成分は、工程（２）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより後の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（３）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよいが、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（３）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（３）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
自動分析機への適用を考慮する場合、工程（３）に必要な試薬成分は、工程（２）に必要な試薬成分が全て揃う試薬添加ステップと同時、またはより後の試薬添加ステップで揃っていればよい。例えば２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用では、工程（３）に必要な試薬成分は最初の試薬添加により開始する第一ステップで揃うように供給されていてもよいが、第二ステップで揃うように供給されてもよい。第二ステップで揃うように供給する場合は、工程（３）に必要な試薬成分は第一ステップと第二ステップとで分けて供給されてもよい。
また、例えば１段階の試薬添加ステップしか設定できない自動分析機への適用においては、工程（３）に必要な試薬成分と工程（２）に必要な試薬成分とが同一ステップで供給されてもよい。
なお、３段階以上の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用についても、上記の原則を考慮して適宜試薬の供給方法を決めればよい。
［１－７．工程（４）、発色量の測定等について］
工程（４）では、工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する。
工程（４）では、工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する。
発色量の測定は、工程（３）開始後の適当な時間範囲で、ペルオキシダーゼを過酸化水素および発色基質に作用させ発色した色素量に起因する吸光度変化量を測定する。
吸光度の測定波長は特に限定されないが、色素によって測定に適する波長が異なる。例えば１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７２７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミンを発色基質として用いた場合は７００ｎｍから８００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７５０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタンを発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては５９１ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）を発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６１７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンを発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７００ｎｍの吸光度を測定すればよい。
吸光度の測定波長は特に限定されないが、色素によって測定に適する波長が異なる。例えば１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩を発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７２７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンを発色基質として用いた場合は６００ｎｍから７００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６６０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミンを発色基質として用いた場合は７００ｎｍから８００ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７５０ｎｍの吸光度を測定すればよい。
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ－３－スルホプロピル－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタンを発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては５９１ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン）を発色基質として用いた場合は５５０ｎｍから６５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては６１７ｎｍの吸光度を測定すればよい。
４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンを発色基質として用いた場合は６５０ｎｍから７５０ｎｍの範囲のうちから選択することが好ましい。一例としては７００ｎｍの吸光度を測定すればよい。
２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機の場合は、例えば、第二ステップが実行されている間のいずれかの時間範囲での吸光度変化量を測定することにより、測定をすることができる。前記のタイミングとしては、特に限定されないが、例えば第二試薬添加直後と第二試薬添加後一定時間経過後（例えば６０秒経過時から６００秒経過時の間の任意のタイミング、好ましくは３００秒後）の時点でそれぞれ吸光度を測定し、その差から吸光度変化量を求めることができる。このほか、種々の公知の吸光度変化量測定法（たとえば１ポイントエンド法、２ポイントエンド法、レート法など）を用いてもよい。これらの方法は、各自動分析機の取扱説明書に従い適宜設定することができる。
［１－８．工程（５）、キャリブレーター、キャリブレーション方法等について］
工程（５）では、糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する。典型的なキャリブレーションカーブとしては、ｘ軸に糖化ヘモグロビン比率、ｙ軸に発色量を取る態様が挙げられる。
工程（５）では、糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する。典型的なキャリブレーションカーブとしては、ｘ軸に糖化ヘモグロビン比率、ｙ軸に発色量を取る態様が挙げられる。
キャリブレーションとは、目的とする測定項目の値（たとえば本発明においては前記糖化ヘモグロビン比率）と測定値（たとえば本発明においては前記発色量）との関係が既知のキャリブレーターを用いて、あらかじめ検量線（キャリブレーションカーブ）を作成しておき、試料の測定値をその検量線に適応させ、当該試料の測定項目の値を得る手段である。キャリブレーターは標準試薬、標準液、較正用試薬と呼ばれることもある。
本発明で使用するキャリブレーターのベース組成は特に限定されない。例えばヒト血液由来の成分を用いてもよいし、人工的に作製したものであってもよい。ヒト血液由来の物であれば全血を用いてもよいし、血球など一部の成分を分離して用いてもよい。
また、これらのキャリブレーターの形状は凍結乾燥、液状、凍結などそれぞれの機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
また、これらのキャリブレーターの形状は凍結乾燥、液状、凍結などそれぞれの機能を損ねない範囲で、特に限定されない。
本発明で使用するキャリブレーターの溶媒は特に制限されないが、蒸留水や緩衝液を使用できる。例えば、グッド緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、酒石酸緩衝液等があげられる。
本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて各種抗菌剤および防腐剤を使用することができる。防腐剤としては、プロクリン（登録商標、スペルコ社）各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、ピペラシリンやイミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて（例えば安定化剤として）、各種糖類、塩類、タンパク質類を使用できる。
塩類としては、特に限定されないが、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、水酸化カリウム、塩化アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
糖類としては、特に限定されないが、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
タンパク質類としては、特に限定されないが、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。
本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて（例えば、試料由来の還元物質の影響回避、ヘモグロビンのメト化やプロテアーゼの反応促進などを目的として）、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加してもよいし、添加しなくてもよい。
本発明で使用するキャリブレーターには、必要に応じて界面活性剤を使用できる。本発明に用いることができる界面活性剤は特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤および／または陽イオン性界面活性剤および／または陰イオン性界面活性剤を用いることができる。
非イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
両性イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
陽イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、ステアリルアミンアセテートなどが挙げられる。
陰イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、アルケニルコハク酸ジカリウムなどが挙げられる。
本発明で使用するキャリブレーターに用いることができる添加剤の一部は陰イオン性界面活性剤としての機能を併用することもできる。
上記の各成分（試薬中に存在する酵素、発色基質、界面活性剤および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、糖化ヘモグロビン比率の測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。
本発明で使用するキャリブレーターは糖化ヘモグロビン比率で値付けされている。一般には、ヒト血液をプールし、各種測定法によって糖化ヘモグロビン比率の値付けをしたものを使用するが、ヘモグロビンなどのタンパク質やアミノ酸を人工的に糖化したものやその分解産物を前記プール血清などに添加して糖化ヘモグロビン比率を調整することもできる。
本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン比率の値付けは、ＩＦＣＣ、ＮＧＳＰなどの標準物質を用いて、ＨＰＬＣ法、酵素法、ラテックス免疫法など各種測定方法で行うことができる。
ヘモグロビン濃度は、シアンメトヘモグロビン法、塩酸ヘマチン法、アルカリヘマチン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法など、Ｈｂ・ｒｅｄ計測法、ＨｂＣＯ計測法など各種測定法で測定することができる。
本明細書においては、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬を用いたシアンメトヘモグロビン法に従うことが好ましい。具体的には、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（フェリシアン化カリウム２００ｍｇ， シアン化カリウム５０ｍｇ及び炭酸水素ナトリウム１．０ｇを蒸留水に溶かし，１Ｌとしたもの）を調製後、試験管に Ｄｒａｂｋｉｎ試液 ４．５ｍｌとサンプル０．５ｍｌ加え混和後２０分間室温放置し、生成したシアノメトヘモグロビンの吸光度を５４０ｎｍで測定するという方法である。
本明細書においては、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬を用いたシアンメトヘモグロビン法に従うことが好ましい。具体的には、Ｄｒａｂｋｉｎ試薬（フェリシアン化カリウム２００ｍｇ， シアン化カリウム５０ｍｇ及び炭酸水素ナトリウム１．０ｇを蒸留水に溶かし，１Ｌとしたもの）を調製後、試験管に Ｄｒａｂｋｉｎ試液 ４．５ｍｌとサンプル０．５ｍｌ加え混和後２０分間室温放置し、生成したシアノメトヘモグロビンの吸光度を５４０ｎｍで測定するという方法である。
本発明で使用するキャリブレーターの値付け水準数は２水準以上（即ち、糖化ヘモグロビン比率が異なる２種類以上）であれば特に限定されない。好ましくは２水準であるが、３水準以上の多水準（好ましくは５水準以下）でもよい。例えば２水準の値付けがされたキャリブレーターを用いる場合、キャリブレーション時には当該キャリブレーターのほかに、精製水や緩衝液など糖化ヘモグロビンが含まれない試料を用いてキャリブレーターの代用とし、キャリブレーターの２水準と合わせて３水準のキャリブレーションを行うことが可能である。
２水準が好ましい理由は水準が多いほど使用する試薬量が増加し、手間もかかるためである。
２水準が好ましい理由は水準が多いほど使用する試薬量が増加し、手間もかかるためである。
本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン比率は、２水準の場合、低濃度と高濃度の２種類となり、低濃度が３％～７％、高濃度が８％～２０％となることが望ましく、低濃度が３％～６％、高濃度が８％～２０％となることがより望ましい。さらに望ましくは低濃度が３％～６％、高濃度が１０％～２０％、さらにより望ましくは、低濃度が３％～５．５％、高濃度が１０％～２０％、なかでも望ましくは、低濃度が３％～５％、高濃度が１０％～２０％、とりわけ望ましくは低濃度が３％～５％、高濃度が１０％～１８％である。
本発明で使用するキャリブレーターは、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、測定完了時の反応液中における全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のもの（残りの全て）の全ヘモグロビン濃度はその１倍～６倍程度であることが好ましく、その１倍～５倍程度であることがより好ましく、その１～４倍程度であることがさらに好ましく、その１～３．５倍程度であることがさらに好ましく、その１～３倍程度であることがとりわけ好ましい。さらに好ましくは１倍～２．５倍程度、さらに好ましくは１倍～２倍程度、さらに好ましくは１倍～１．５倍程度、特に好ましくは１倍（等濃度）程度である。
なお、全ヘモグロビン濃度の高低の順番は糖化ヘモグロビン比率の高低の順番とは無関係であってもよい。例えば、糖化ヘモグロビン比率が低濃度・中濃度・高濃度の３水準のキャリブレーターの場合、その全ヘモグロビン濃度はどれがもっとも高いものであってもよいし、どれが最も低いものであってもよい。より良好な相関関係が得られる傾向が高いという観点から、糖化ヘモグロビン比率の低いものを全ヘモグロビン濃度の低いものとし、糖化ヘモグロビン比率の高いものを全ヘモグロビン濃度が高いものとすることが好ましい。
なお、全ヘモグロビン濃度の高低の順番は糖化ヘモグロビン比率の高低の順番とは無関係であってもよい。例えば、糖化ヘモグロビン比率が低濃度・中濃度・高濃度の３水準のキャリブレーターの場合、その全ヘモグロビン濃度はどれがもっとも高いものであってもよいし、どれが最も低いものであってもよい。より良好な相関関係が得られる傾向が高いという観点から、糖化ヘモグロビン比率の低いものを全ヘモグロビン濃度の低いものとし、糖化ヘモグロビン比率の高いものを全ヘモグロビン濃度が高いものとすることが好ましい。
本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の全ヘモグロビン濃度の比率を満たすように作製されているものを用いてもよい。
本発明で用いるキャリブレーターの全ヘモグロビン濃度の絶対値は特に限定されないが、好ましくは測定完了時の反応液中の濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは３μｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が５０μｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは８μｍｏｌ／Ｌ以下）となるように設定されていればよい。
本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の全ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
キャリブレーター単独の全ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１０μｍｏｌ／Ｌ～９００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、好ましくは２０μｍｏｌ／Ｌ～７００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、より好ましくは３０μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらに好ましくは、４０μｍｏｌ／Ｌ～３００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらにより好ましくは、５０μｍｏｌ／Ｌ～２５０μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができる。更には、例えば５０μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、２ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の全ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
キャリブレーター単独の全ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１０μｍｏｌ／Ｌ～９００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、好ましくは２０μｍｏｌ／Ｌ～７００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、より好ましくは３０μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらに好ましくは、４０μｍｏｌ／Ｌ～３００μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができ、さらにより好ましくは、５０μｍｏｌ／Ｌ～２５０μｍｏｌ／Ｌ程度とすることができる。更には、例えば５０μｍｏｌ／Ｌ～２００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、２ｍｍｏｌ／Ｌ～５ｍｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
本発明で使用するキャリブレーターの糖化ヘモグロビン濃度の絶対値は特に限定されないが、好ましくは測定完了時の反応液中の濃度が０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上（好ましくは０．０５μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．０３μｍｏｌ／Ｌ以上）となるように、かつ、測定完了時の反応液中の濃度が１５μｍｏｌ／Ｌ以下（好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以下）となるように設定されていればよい。
本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の糖化ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
キャリブレーター単独の糖化ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１μｍｏｌ／Ｌ～４０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができ、好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができる。更には、例えば１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、１００μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
本発明で用いるキャリブレーターは、使用する際に希釈して前記の糖化ヘモグロビン濃度の絶対値を満たすように作製されているものを用いてもよい。
キャリブレーター単独の糖化ヘモグロビン濃度としては特に限定されないが、一例として、１μｍｏｌ／Ｌ～４０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができ、好ましくは、１μｍｏｌ／Ｌ～３０μｍｏｌ／Ｌ程度のキャリブレーターを使用することができる。更には、例えば１μｍｏｌ／Ｌ～２０μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターをそのまま使用してもよいし、１００μｍｏｌ／Ｌ～５００μｍｏｌ／Ｌのキャリブレーターを水や前処理液で希釈して使用してもよい。
［１－９．糖化ヘモグロビン比率の測定方法について、その他の事項］
本発明において、反応は緩衝液中で行われることが好ましい。前記緩衝液としては特に制限されないが、例えば、グッド緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、酒石酸緩衝液等があげられる。
本発明において、反応は緩衝液中で行われることが好ましい。前記緩衝液としては特に制限されないが、例えば、グッド緩衝液、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等、酒石酸緩衝液等があげられる。
本発明において、必要に応じて各種抗菌剤および防腐剤を使用することができる。防腐剤としては、プロクリン（登録商標、スペルコ社）各種、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、ピペラシリンやイミダゾリジニルウレア等が挙げられる。
本発明において、必要に応じて（例えば酵素安定化剤として）、各種糖類、塩類、タンパク質類を使用できる。
塩類としては、特に限定されないが、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、水酸化カリウム、塩化アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
糖類としては、特に限定されないが、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グリセロール、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。
タンパク質類としては、特に限定されないが、血清アルブミン類、グロブリン類または繊維性タンパク質類などの不活性タンパク質を添加することができる。好ましいタンパク質は、ウシ血清アルブミンである。好ましい不活性タンパク質は、酵素分解を起こすプロテアーゼ不純物を含まないものである。
本発明において、必要に応じて（例えば、試料由来の還元物質の影響回避、ヘモグロビンのメト化やプロテアーゼの反応促進などを目的として）、フェロシアン化カリウム等のフェロシアン化物や亜硝酸ナトリウムなどの亜硝酸塩類を添加してもよいし、添加しなくてもよい。
本発明において、必要に応じて界面活性剤を使用できる。本発明に用いることができる界面活性剤は特に限定されない。例えば、非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤および／または陽イオン性界面活性剤および／または陰イオン性界面活性剤を用いることができる。
非イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
両性イオン界面活性剤としては、特に限定されないが、例えばアルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
陽イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、ココナットアミンアセテート、ステアリルアミンアセテートなどが挙げられる。
陰イオン性界面活性剤としては、特に限定されないが、アルケニルコハク酸ジカリウムなどが挙げられる。
本発明に用いることができる添加剤の一部は陰イオン性界面活性剤としての機能を併用することもできる。
上記の各成分（試薬中に存在する酵素、発色基質、界面活性剤および、他の成分）の濃度・条件等は、使用する試薬・酵素等の種類により、反応性および／または安定性などを考慮して適宜決定することが出来る。
その際には、試薬中に存在するそれぞれの成分が互いに干渉しあうことにより、糖化ヘモグロビンの測定や試薬の安定性等に影響が及ぶ可能性についても、考慮することが好ましい。例えば、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用において、第二ステップで、プロテアーゼと糖化アミノ酸オキシダーゼが共存する場合は、できるだけ両酵素の特性を活かせるよう適宜条件決定することができる。
上記の決定は、必ずしも最適解である必要はなく、目的や状況に応じて、糖化ヘモグロビンの測定に関して実用上十分な性能が担保されていれば差し支えない。
［２．糖化ヘモグロビン比率の測定キット］
本発明の実施態様の一つは、以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む糖化ヘモグロビン比率の測定キットである。
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬
（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター
本発明の実施態様の一つは、以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む糖化ヘモグロビン比率の測定キットである。
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬
（ｅ）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター
本発明のキットにおいては、さらに以下の（ｆ）を含んでもよい。
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬
本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定キットの構成は特に限定されない。例えば、糖化アミノ酸オキシダーゼ、緩衝液、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、発色基質、酵素反応を妨害するイオンを捕捉するキレート試薬、過酸化水素の定量の妨害物質であるアスコルビン酸を消去するアスコルビン酸オキシダーゼ、界面活性剤、安定化剤、賦形剤、抗菌剤、防腐剤および本発明にかかる測定方法を紙などの記録媒体に記載した取り扱い説明書などが含まれていてもよい。
本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定キットは、本発明の糖化ヘモグロビン比率の測定方法に利用し得るものである。よって、本発明のキットは、本発明の測定方法の実施に用いられる物品により構成されていてもよい。上記物品の説明については、本発明の測定方法の項における説明を援用することができる。
本発明のキットは、自動分析機の態様に合わせ、いくつかの部分から構成されていても良い。例えば、２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機に適用できるようなキットの場合は、第一試薬および第二試薬の２つの部分から構成すればよい。
キットの保存安定性を考慮した場合、２を超える部分からなる構成とし、使用直前に第一試薬および第二試薬の２つを用意できるようにキットを構成しても良い。
キットの保存安定性を考慮した場合、２を超える部分からなる構成とし、使用直前に第一試薬および第二試薬の２つを用意できるようにキットを構成しても良い。
２段階の試薬添加ステップを設定することが可能な自動分析機への適用において、消去系を構築する場合は、本発明の糖化ヘモグロビン比率測定キットは、２つの部分から構成され、第一試薬に糖化アミノ酸オキシダーゼを含み、第二試薬にプロテアーゼを含むことが好ましい。このような形態の試薬には、第一試薬にさらにカタラーゼ、パーオキシダーゼおよび色素のうちいずれか１つ以上を含ませることができる。
本発明のキットは、上記構成に加えてさらに試料の前処理剤を含んでも良い。前処理剤の形態は特に限定されない。前処置の目的は特に限定されないが、希釈、溶血などが挙げられる。スルホ基を持つ化合物を前処理剤に含ませ、前処理の際に、糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程（工程（１））を行っても良い。
上記で説明したキットについて、スルホ基を持つ化合物、糖化アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質およびプロテアーゼの、前処理剤、第一試薬および第二試薬への配分例を表１に例示する。
表中、Ａはスルホ基を持つ化合物、Ｂは糖化アミノ酸オキシダーゼ、Ｃはペルオキシダーゼ、Ｄはペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質、Ｆはプロテアーゼをそれぞれ示す。
表中、Ａはスルホ基を持つ化合物、Ｂは糖化アミノ酸オキシダーゼ、Ｃはペルオキシダーゼ、Ｄはペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質、Ｆはプロテアーゼをそれぞれ示す。
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
２．試料
血球 １０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
測定機種 日立７１８０
分析法／測定ポイント ２ポイントエンド（１０）１６－３４
このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
測定波長（ｎｍ）（副／主） ８００／６６０
液量比 試料／Ｒ１／Ｒ２ １０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
反応温度 ３７℃
ＡＢＳ ＬＩＭＩＴ ３２０００増加
キャリブレーション ０．０－１００００吸光度打出し
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
２．試料
血球 １０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
測定機種 日立７１８０
分析法／測定ポイント ２ポイントエンド（１０）１６－３４
このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
測定波長（ｎｍ）（副／主） ８００／６６０
液量比 試料／Ｒ１／Ｒ２ １０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
反応温度 ３７℃
ＡＢＳ ＬＩＭＩＴ ３２０００増加
キャリブレーション ０．０－１００００吸光度打出し
上記の測定結果を、以下のキャリブレーションカーブＡ～Ｄ（ｘ軸：ＨｂＡ１ｃ比率、ｙ軸：発色量）と対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。ここでＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
キャリブレーションカーブＡは、キャリブレーター１（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載） ６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．９３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター２（Ｈｂ ６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ７．３４μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＢは、キャリブレーター３（Ｈｂ ７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ３．４９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター４（Ｈｂ ７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ８．７５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＣは、キャリブレーター５（Ｈｂ ５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．５２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター６（Ｈｂ ５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ６．３２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＤは、キャリブレーター７（Ｈｂ ５０．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．２１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター８（Ｈｂ ９７．６μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １０．８３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＡは、キャリブレーター１（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載） ６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．９３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター２（Ｈｂ ６６．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ７．３４μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＢは、キャリブレーター３（Ｈｂ ７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ３．４９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター４（Ｈｂ ７８．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ８．７５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＣは、キャリブレーター５（Ｈｂ ５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．５２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター６（Ｈｂ ５６．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ６．３２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＤは、キャリブレーター７（Ｈｂ ５０．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２．２１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率６．２％）と、キャリブレーター８（Ｈｂ ９７．６μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １０．８３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１２．３％）とを用いて作成した。
［ＨＰＬＣ法（対照）］
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
図１～図４に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記キャリブレーションカーブＡ～Ｄを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（１）～（４）のとおりであった。
（１）Ｙ＝１．０４２Ｘ＋０．３０７２ 、Ｒ２＝０．９９５
（２）Ｙ＝０．９７２１Ｘ＋０．６０８３ 、Ｒ２＝０．９９５
（３）Ｙ＝１．１１６２Ｘ－０．０１５６ 、Ｒ２＝０．９９５
（４）Ｙ＝０．８７１６Ｘ＋１．４１２３ 、Ｒ２＝０．９９５
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。
（１）Ｙ＝１．０４２Ｘ＋０．３０７２ 、Ｒ２＝０．９９５
（２）Ｙ＝０．９７２１Ｘ＋０．６０８３ 、Ｒ２＝０．９９５
（３）Ｙ＝１．１１６２Ｘ－０．０１５６ 、Ｒ２＝０．９９５
（４）Ｙ＝０．８７１６Ｘ＋１．４１２３ 、Ｒ２＝０．９９５
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。
［実施例２］［比較例１］
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
表２記載の添加剤 ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
２．試料
血球 １０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
実施例１記載の方法で実施した。
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
表２記載の添加剤 ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．３） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
２．試料
血球 １０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
実施例１記載の方法で実施した。
上記の測定結果を、実施例１記載のキャリブレーター１及びキャリブレーター２で作成したキャリブレーションカーブと、表２記載の試薬Ａ～Ｅを用いて作成したキャリブレーションカーブと対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
比較例として、実施例１記載のキャリブレーター１及びキャリブレーター２で作成したキャリブレーションカーブと、試薬Ｆ、Ｇを用いて作成したキャリブレーションカーブと対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
これらにおいて、ＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
比較例として、実施例１記載のキャリブレーター１及びキャリブレーター２で作成したキャリブレーションカーブと、試薬Ｆ、Ｇを用いて作成したキャリブレーションカーブと対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
これらにおいて、ＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
［ＨＰＬＣ法（対照）］
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
図５～図１１に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記試薬Ａ～Ｇを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（５）～（１１）のとおりであった。
（５）Ｙ＝０．９７３３Ｘ＋１．９１２７ 、Ｒ２＝０．９８８６
（６）Ｙ＝１．００１１Ｘ＋０．９０４５ 、Ｒ２＝０．９９８２
（７）Ｙ＝０．９９４７Ｘ＋０．８１７５ 、Ｒ２＝０．９８７４
（８）Ｙ＝１．０５６２Ｘ＋０．２３３２ 、Ｒ２＝０．９７８１
（９）Ｙ＝１．１７１９Ｘ－０．３９９９ 、Ｒ２＝０．９８３０
（１０）Ｙ＝－０．１８０５Ｘ＋６．４５６ 、Ｒ２＝０．０６９２
（１１）Ｙ＝０．５９３Ｘ＋１．７６９９ 、Ｒ２＝０．３０８０
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった（（５）～（９））。一方、比較例では相関性は認められなかった（（１０）～（１１））。
（５）Ｙ＝０．９７３３Ｘ＋１．９１２７ 、Ｒ２＝０．９８８６
（６）Ｙ＝１．００１１Ｘ＋０．９０４５ 、Ｒ２＝０．９９８２
（７）Ｙ＝０．９９４７Ｘ＋０．８１７５ 、Ｒ２＝０．９８７４
（８）Ｙ＝１．０５６２Ｘ＋０．２３３２ 、Ｒ２＝０．９７８１
（９）Ｙ＝１．１７１９Ｘ－０．３９９９ 、Ｒ２＝０．９８３０
（１０）Ｙ＝－０．１８０５Ｘ＋６．４５６ 、Ｒ２＝０．０６９２
（１１）Ｙ＝０．５９３Ｘ＋１．７６９９ 、Ｒ２＝０．３０８０
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった（（５）～（９））。一方、比較例では相関性は認められなかった（（１０）～（１１））。
［実施例３］
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
界面活性剤 １ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
２．試料
血球 ３０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
測定機種 日立７１８０
分析法／測定ポイント ２ポイントエンド（１０）１６－３４
このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
測定波長（ｎｍ）（副／主） ８００／６６０
液量比 試料／Ｒ１／Ｒ２ １０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
反応温度 ３７℃
ＡＢＳ ＬＩＭＩＴ ３２０００増加
キャリブレーション ０．０－１００００吸光度打出し
以下の方法によりＨｂＡ１ｃ比率を求めた。
１．試薬
第一試薬（Ｒ１）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
ＣａＣｌ２ ０．７１ｇ／Ｌ
界面活性剤 １ｇ／Ｌ
プロテアーゼ １００ＫＵ／Ｌ
ＤＡ－６７ １６ｍｇ／Ｌ
ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム ３ｇ／Ｌ
第二試薬（Ｒ２）
ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５） １００ｍＭ
糖化アミノ酸オキシダーゼ ５ＫＵ／Ｌ
ペルオキシダーゼ ３．７ＫＵ／Ｌ
２．試料
血球 ３０検体
測定前に精製水で３０倍希釈
３．測定パラメーター
測定機種 日立７１８０
分析法／測定ポイント ２ポイントエンド（１０）１６－３４
このパラメーターを用いた場合、測定に要する時間は、第一反応約３００秒、第二反応約３００秒の計約６００秒である。
測定波長（ｎｍ）（副／主） ８００／６６０
液量比 試料／Ｒ１／Ｒ２ １０μＬ／１２０μＬ／４０μＬ（Ｓ：Ｒ１：Ｒ２＝１：１２：４）
反応温度 ３７℃
ＡＢＳ ＬＩＭＩＴ ３２０００増加
キャリブレーション ０．０－１００００吸光度打出し
上記の測定結果を、以下のキャリブレーションカーブＥ～Ｈ（ｘ軸：ＨｂＡ１ｃ比率、ｙ軸：発色量）と対比してＨｂＡ１ｃ比率を求めた。ここでＨｂＡ１ｃ比率は、ＮＧＳＰ値として算出される値である。
キャリブレーションカーブＥは、キャリブレーター９（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載） ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ７．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１０（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＦは、キャリブレーター１１（Ｈｂ ４２１．１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １４．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１２（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＧは、キャリブレーター１３（Ｈｂ ６３４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２１．２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１４（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＨは、キャリブレーター１５（Ｈｂ ８３３．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２７．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１６（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＥは、キャリブレーター９（ヘモグロビン（以下Ｈｂと記載） ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ７．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１０（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＦは、キャリブレーター１１（Ｈｂ ４２１．１μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １４．０μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１２（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＧは、キャリブレーター１３（Ｈｂ ６３４．９μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２１．２μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１４（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
キャリブレーションカーブＨは、キャリブレーター１５（Ｈｂ ８３３．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ ２７．８μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率５．２％）と、キャリブレーター１６（Ｈｂ ２１０．５μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ １９．３μｍｏｌ／Ｌ、ＨｂＡ１ｃ比率１０．５％）とを用いて作成した。
［ＨＰＬＣ法（対照）］
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
アークレイ社製ＨＡ８１７０を用いて通法に従い測定を実施した。
図１２～図１５に本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関データを示す。上記キャリブレーションカーブＥ～Ｈを用いたときのＨＰＬＣ法との相関式はそれぞれ次の（１２）～（１５）のとおりであった。
（１２）Ｙ＝１．０１５Ｘ－０．３３８ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１３）Ｙ＝０．９７４７Ｘ＋０．０５７７ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１４）Ｙ＝０．９１４３Ｘ＋０．６５１７ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１５）Ｙ＝０．７９５８Ｘ＋１．８１５７ 、Ｒ２＝０．９９４５
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。なかでも、糖化ヘモグロビンキャリブレーターの全ヘモグロビン濃度比率が、１：１～３程度となる場合に、特に高い相関性を示すことが明らかとなった。
（１２）Ｙ＝１．０１５Ｘ－０．３３８ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１３）Ｙ＝０．９７４７Ｘ＋０．０５７７ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１４）Ｙ＝０．９１４３Ｘ＋０．６５１７ 、Ｒ２＝０．９９４５
（１５）Ｙ＝０．７９５８Ｘ＋１．８１５７ 、Ｒ２＝０．９９４５
このように、本発明の方法とＨＰＬＣ法との相関はきわめて良好であった。なかでも、糖化ヘモグロビンキャリブレーターの全ヘモグロビン濃度比率が、１：１～３程度となる場合に、特に高い相関性を示すことが明らかとなった。
なお、上記開示した実施形態および実施例はすべて例示であり制限的なものではない。また、実施形態および実施例に開示された内容を組み合わせた実施形態及び実施例も本発明の範囲に含まれる。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲によって有効であり、特許請求の範囲の記載と均等の意味および範囲内のすべての変更・修正・置き換え等を含むものである。
本発明は、糖尿病マーカーなどとして有用な糖化ヘモグロビン比率の測定など、診断や医療などの分野に貢献する。
Claims (14)
- 以下の（１）～（５）の工程を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定方法：
（１）糖化ヘモグロビンを含む試料にスルホ基を持つ化合物を接触させる工程、
（２）糖化ヘモグロビンを含む試料に糖化アミノ酸オキシダーゼを作用させて過酸化水素を生成させる工程、
（３）工程（２）で生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ存在下に発色基質に接触させて発色色素を生成させる工程、
（４）工程（３）で得られた発色色素の発色量を測定する工程、及び、
（５）糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを用いてあらかじめ作成した糖化ヘモグロビン比率と発色量のキャリブレーションカーブに工程（４）で得られた発色量を適応し、糖化ヘモグロビン比率を算出する工程であって、ここで用いる糖化ヘモグロビンキャリブレーターとして２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターを使用し、該２水準以上の糖化ヘモグロビンキャリブレーターは全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度であることを特徴とする、工程。 - 前記（５）の工程で用いる２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～３倍の濃度であることを特徴とする、請求項１に記載の測定方法。
- さらに、以下の（６）の工程を含む、請求項１又は２の測定方法：
（６）糖化ヘモグロビンをプロテアーゼの作用により糖化ヘモグロビン分解物に分解する工程。 - さらに、以下の（７）の工程を含む、請求項１～３のいずれかに記載の測定方法：
（７）糖化ヘモグロビンを含む試料を溶血させる工程。 - 前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ベンゼンスルホン酸、アルキルスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸、ベンゾチアゾリンスルホン酸、アントラキノンスルホン酸、カンファースルホン酸、ベンゾオキサジアゾールスルホン酸、及びそれらの誘導体、並びにそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１～４のいずれかに記載の測定方法。
- 前記（１）の工程で用いるスルホ基を持つ化合物が、ドデシルベンゼンスルホン酸、３－アミノベンゼンスルホン酸、アルキルジフェニルエーテルスルホン酸、４－アミノアゾベンゼン－４’－スルホン酸、４－アミノ－４’－ニトロスチルベン－２，２’－ジスルホン酸、４，４’－ジアゾスチルベンゼン－２，２’－ジスルホン酸、スルファニル酸、５－スルホイソフタル酸、５－アミノ－２－クロロトルエン－４－スルホン酸、アルキルナフタレンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、８－アミノ－１－ナフタレンスルホン酸、ドデシルナフタレンスルホン酸、スルホコハク酸ジ－２－エチルヘキシル、ジアルキルスルホコハク酸、及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物である、請求項１～５のいずれかに記載の測定方法。
- 上記（３）の工程で用いる発色基質が、ロイコ型色原体である、請求項１～６のいずれかに記載の測定方法。
- 上記（３）の工程で用いる発色基質が、フェノチアジン系のロイコ型色原体である、請求項１～７のいずれかに記載の測定方法。
- 上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩、１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン、及
び１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジンからなる群より選択される少なくとも１種のフェノチアジン系のロイコ型色原体である、請求項１～８のいずれかに記載の測定方法。 - 上記（３）の工程で用いる発色基質が、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン ナトリウム塩である、請求項１～９のいずれかに記載の測定方法。
- １チャンネルで実施される、請求項１～１０のいずれかに記載の測定方法。
- 以下の（ａ）～（ｅ）の試薬を含む、糖化ヘモグロビン比率の測定キット：
（ａ）スルホ基を持つ化合物を含有する試薬、
（ｂ）糖化アミノ酸オキシダーゼを含有する試薬、
（ｃ）ペルオキシダーゼを含有する試薬、
（ｄ）ペルオキシダーゼ存在下に過酸化水素と接触して発色色素を生成する発色基質を含有する試薬、及び、
（ｅ）２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターであって、該２水準以上の糖化ヘモグロビンキャリブレーターは全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～６倍の濃度であることを特徴とする、２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーター。 - 前記（ｅ）２水準以上の糖化ヘモグロビン比率で値付けされた糖化ヘモグロビンキャリブレーターが、全ヘモグロビン濃度が最も低いものを１とすると他のものの全ヘモグロビン濃度がその１倍～３倍の濃度であることとを特徴とする、請求項１２に記載の測定キット。
- さらに、以下の（ｆ）の試薬を含む請求項１２又は１３に記載の測定キット：
（ｆ）プロテアーゼを含有する試薬。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP2018554232A Active JP7056577B2 (ja) | 2016-11-30 | 2017-11-30 | ヘモグロビンの糖化率測定方法 |
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