WO2024070995A1 - アルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法 - Google Patents

アルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法 Download PDF

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WO2024070995A1
WO2024070995A1 PCT/JP2023/034618 JP2023034618W WO2024070995A1 WO 2024070995 A1 WO2024070995 A1 WO 2024070995A1 JP 2023034618 W JP2023034618 W JP 2023034618W WO 2024070995 A1 WO2024070995 A1 WO 2024070995A1
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albumin
carbon atoms
quaternary ammonium
ammonium salt
less carbon
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PCT/JP2023/034618
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吉宏 油屋
正樹 村上
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富士フイルム株式会社
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an albumin measurement reagent and an albumin measurement method using bromocresol purple.
  • Patent Document 1 describes a method for measuring albumin using BCP, in which the glycation ratio of glycated albumin to albumin is calculated, in which the test liquid is pretreated with a protein denaturant and/or a compound having an S-S bond when measuring albumin, and albumin is measured simultaneously or subsequently using bromocresol purple.
  • Patent Document 2 describes measuring albumin using an albumin measurement test strip having a support and a reagent retention layer containing bromocresol purple or the like.
  • Patent Document 3 describes measuring glycated proteins in the presence of aliphatic quaternary ammonium.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an albumin measurement reagent and an albumin measurement method that have improved sensitivity in an albumin measurement reagent and an albumin measurement method that use bromocresol purple.
  • the inventors conducted extensive research to solve the above problems and discovered that by reacting albumin with bromocresol purple in the presence of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with eight or fewer carbon atoms, it is possible to reduce the absorbance of BCP before the reaction and thereby reduce the background.
  • the present invention was completed based on the above findings.
  • the present invention provides the following:
  • a reagent for measuring albumin comprising bromocresol purple and a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • ⁇ 4> The albumin measurement reagent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the alkyl chain having 8 or less carbon atoms is an alkyl chain having 6 or less carbon atoms.
  • ⁇ 5> The albumin measurement reagent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms is a tetrabutylammonium salt.
  • ⁇ 6> The albumin measurement reagent according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the salt is a halide.
  • a method for measuring albumin comprising reacting albumin with bromocresol purple in the presence of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms is 600 or less.
  • ⁇ 10> The method for measuring albumin according to ⁇ 7> or ⁇ 8>, wherein the alkyl chain having 8 or less carbon atoms is an alkyl chain having 6 or less carbon atoms.
  • the quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms is a tetrabutylammonium salt.
  • the salt is a halide.
  • the albumin measurement reagent and albumin measurement method of the present invention can improve the sensitivity of albumin measurement.
  • FIG. 1 shows the results of absorbance measurements in Example 1.
  • FIG. 2 shows the results of absorbance measurement in Comparative Example 1.
  • FIG. 3 shows the results of absorbance measurement in Comparative Example 2.
  • the present invention relates to a reagent for measuring albumin, which comprises bromocresol purple and a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • the present invention further relates to a method for measuring albumin, which comprises reacting albumin with bromocresol purple in the presence of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • the use of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms makes it possible to improve the sensitivity of albumin measurement.
  • Bromocresol Purple may be any commercially available product.
  • the concentration of BCP used is appropriately selected so that the concentration in the solution system during albumin measurement is usually 0.01 to 0.30 mol/L, preferably 0.02 to 0.2 mol/L.
  • quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms In the present invention, a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms is used.
  • the quaternary ammonium salt used in the present invention has four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms and does not contain an aromatic ring.
  • the molecular weight of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 or less carbon atoms is preferably 600 or less, more preferably 550 or less, even more preferably 500 or less, even more preferably 400 or less, and particularly preferably 350 or less.
  • the lower limit of the molecular weight of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 or less carbon atoms is generally 150 or more.
  • the four alkyl chains having 8 or less carbon atoms may be the same or different, but are preferably the same.
  • the alkyl chain having 8 or less carbon atoms is preferably an alkyl chain having 6 or less carbon atoms, more preferably an alkyl chain having 3 to 5 carbon atoms, and particularly preferably an alkyl chain having 4 carbon atoms.
  • quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms a tetrabutylammonium salt is preferred.
  • a halide such as a fluoride, chloride, bromide or iodide
  • a bromide is particularly preferred.
  • tetrabutylammonium bromide is particularly preferred.
  • the concentration of the quaternary ammonium salt with four alkyl chains with eight or less carbon atoms is usually selected appropriately so that the concentration during albumin measurement in a solution system is 0.01 to 0.3 mol/L, preferably 0.01 to 0.1 mol/L.
  • the albumin measurement reagent of the present invention may contain other reagents in addition to bromocresol purple and a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • other reagents include a protein denaturant, an SH reagent, and a buffering agent.
  • the protein denaturant is not particularly limited as long as it has a protein denaturing effect and does not affect the measured albumin value, but examples thereof include urea, guanidine salts such as guanidine hydrochloride and guanidine sulfate, inorganic salts such as sodium fluoride, sodium azide, sodium chloride and potassium chloride, salts of thiocyanates such as ammonium thiocyanate, potassium thiocyanate and sodium thiocyanate, surfactants such as anionic surfactants, nonionic surfactants and amphoteric surfactants, and among these, surfactants, particularly anionic surfactants, are preferred. These may be used alone or in appropriate combination.
  • alkyl sulfate ester surfactants such as sodium lauryl sulfate (SDS) and sodium cetyl sulfate
  • polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate salts such as sodium polyoxyethylene alkyl phenyl ether sulfate
  • polyoxyethylene alkyl ether sulfate salts such as sodium polyoxyethylene alkyl ether sulfate and polyoxyethylene alkyl ether sulfate triethanolamine salt
  • alkyl benzene sulfonates such as sodium lauryl benzene sulfonate and sodium cetyl benzene sulfonate are preferred.
  • sodium lauryl sulfate (SDS) sodium lauryl benzene sulfonate, etc. are preferred. These may be used alone or in appropriate combination.
  • the concentration of the protein denaturant used will vary depending on the type of protein denaturant and the sample being treated, but can be selected without any particular limitations as long as it prevents the effects of coexisting substances contained in the sample and standard and does not affect the measured albumin value.
  • the concentration used when measuring albumin in a solution system is usually selected appropriately to be 0.001 to 10 w/w%, preferably 0.01 to 1 w/w%, and more preferably 0.02 to 0.3 w/w%.
  • SH reagents include disulfides such as 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB), 2,2'-dithiobis(5-nitropyridine) (NPDS), 2,2'-dithiodipyridine (2-PDS), 4,4'-dithiodipyridine (4-PDS), 4,4'-dithiobis(1-azidobenzene) (DTBPA), and oxidized glutathione; oxidizing agents such as iodine, ferricyanide, iodosobenzoic acid, iodates, chlorites, mercury, and zinc; alkylating agents such as iodoacetic acid, chloroacetic acid, iodoacetamide, and chloroacetophenone; maleimides, maleimide derivatives such as N-methylmaleimide, N-ethylmaleimide, and N,N'-p-phenylenedimaleimide; and thiophthal
  • the concentration of the SH reagent used varies depending on the type of SH reagent and the sample being treated, and can be set without any particular restrictions as long as it prevents the effects of coexisting substances contained in the sample and standard and does not affect the measured albumin value.
  • the concentration during albumin measurement in the solution system is usually selected appropriately to be 0.001 to 1 mmol/L, preferably 0.01 to 0.5 mmol/L.
  • any buffer normally used in this field can be used without restriction, such as acetate, glycine, citrate, phosphate, veronal, borate, succinate, tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris), Good's buffers such as 3-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) and 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS).
  • concentration of the buffer may be appropriately selected from the concentration range normally used in this field.
  • the albumin measurement reagent of the present invention contains bromocresol purple, a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms, and optionally other reagents (e.g., a protein denaturant, an SH reagent, a buffer, etc.).
  • the first form of the albumin measurement reagent of the present invention is a one-liquid type that contains bromocresol purple, a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with eight or less carbon atoms, and other reagents that are optionally included in the same reagent.
  • the second form of the albumin measurement reagent of the present invention is a two-liquid type consisting of a first reagent that does not contain bromocresol purple and contains a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 or less carbon atoms, and a second reagent that contains bromocresol purple and a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 or less carbon atoms (here, the first and second reagents may contain other reagents as desired).
  • albumin is measured by reacting it with bromocresol purple in the presence of a quaternary ammonium salt having four alkyl chains each having 8 or less carbon atoms.
  • Samples applicable to albumin measurement include, but are not limited to, serum, plasma, and other samples.
  • the absorbance at wavelengths of 350 to 640 nm, and more preferably the absorbance at wavelengths of 380 to 620 nm, before and after the reaction between bromocresol purple and a quaternary ammonium salt it is possible to measure the absorbance at wavelengths of 580 to 620 nm (particularly at a wavelength of 600 nm), or to measure the absorbance at wavelengths of 380 to 420 nm (particularly at a wavelength of 400 nm).
  • the reaction of albumin with bromocresol purple and the subsequent measurement can be carried out in solution or using a dry analytical element.
  • Method for measuring albumin in solution The measurement of albumin by the method of the present invention may be carried out by a one-liquid method or a two-liquid method.
  • the sample is mixed with a test solution (measurement test solution) of pH 4.5-5.7, preferably pH 5.0-5.5, containing BCP, a quaternary ammonium salt with four alkyl chains of 8 carbon atoms or less, and other reagents used as desired, to develop color, and the absorbance at wavelengths of 350-640 nm is measured after an appropriate period of time has passed.
  • the albumin concentration in the sample can be determined by applying the obtained absorbance to a calibration curve showing the relationship between albumin concentration and absorbance, which is obtained by the same procedure using the same measurement reagent as above and an albumin solution of known concentration as the sample.
  • the temperature during the measurement procedure is usually 15-37°C, preferably 37°C.
  • the following procedure may be used. That is, first, the sample is mixed with a first reagent that does not contain BCP and contains a quaternary ammonium salt with four alkyl chains with eight or less carbon atoms, and the absorbance (absorbance 1) is measured at wavelengths of 350 to 640 nm.
  • this mixture is mixed with a second reagent containing BCP and a quaternary ammonium salt with four alkyl chains each having eight or less carbon atoms to develop color, and after an appropriate period of time, the absorbance (absorbance 2) at wavelengths of 350 to 640 nm is measured.
  • the absorbance difference calculated from absorbance 2 and absorbance 1 is applied to a calibration curve showing the relationship between albumin concentration and absorbance difference, which was obtained by a similar procedure using the same first and second reagents as above, using a sample with a known albumin concentration, and the albumin concentration in the sample can be calculated.
  • the albumin measurement of the present invention using BCP can be carried out using an automatic analyzer, etc.
  • the dry analytical element preferably has a water absorption layer and a spreading layer on a support in this order from the support side, contains bromocresol purple (BCP) and a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 carbon atoms or less (hereinafter abbreviated as quaternary ammonium salt), and the pH of the spreading layer is set near the isoelectric point of globulin.
  • BCP bromocresol purple
  • quaternary ammonium salt a quaternary ammonium salt having four alkyl chains with 8 carbon atoms or less
  • the pH of the spreading layer is specifically in the range of about 3.5 to about 7.0, preferably about 3.5 to about 6.0, more preferably about 3.7 to 6.0.
  • the pH of the spreading layer is particularly preferably in the range of 5.0 to 6.0, and can be set to, for example, about 5.5.
  • BCP may be contained in the water-absorbing layer, the spreading layer, or a layer provided separately from these layers. BCP may be contained in one of the above-mentioned layers, or in two or more layers. Preferably, BCP is contained in the water-absorbing layer.
  • the amount of BCP used is in the range of about 0.2 g to about 5.0 g per m2 , preferably about 0.4 g to about 3.0 g, more preferably about 0.6 g to 2.0 g.
  • the quaternary ammonium salt may be contained in the water absorption layer, the spreading layer, or a layer provided separately from these layers.
  • the quaternary ammonium salt may be contained in one of the above layers, or in two or more layers.
  • the quaternary ammonium salt is contained in the water absorption layer.
  • the amount of the quaternary ammonium salt used is in the range of about 0.001 g to about 0.4 g per m2 , preferably about 0.001 g to about 0.3 g, more preferably about 0.002 g to 0.2 g.
  • Dry analytical elements generally have a structure that includes a support and two or more layers coated on the support.
  • the layers applied onto the support include (1) an absorbent layer composed mainly of a hydrophilic polymer that absorbs water and swells; and (2) a spreading layer that has the effect of spreading the aqueous liquid sample that has been spot-applied onto the upper surface of the dry analytical element laterally without causing the components contained in the aqueous liquid sample to be distributed unevenly, and supplying the sample to the absorbent layer containing the water-absorbing hydrophilic polymer at a nearly constant volume per unit area (metering effect).
  • Intermediate layers such as adhesive layers can also be provided between the support and the layer provided thereon, and between each layer provided on the support.
  • the above-mentioned water absorption layer and spreading layer may be provided as separate layers, but they may also be provided as one layer by giving the same layer two or more of the above-mentioned functions at the same time. In other words, the water absorption layer and spreading layer may be provided as the same layer.
  • the components that may be present in the dry analytical element will be explained in order.
  • the support is preferably a light-transmitting, water-impermeable support.
  • the light-transmitting, water-impermeable support may be any known support used in conventional integrated multilayer analytical elements. Specific examples include smooth, planar supports made of polymers such as polyethylene terephthalate, polycarbonate of bisphenol A, polystyrene, and cellulose esters (e.g., cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose acetate propionate, etc.), transparent with a thickness of about 50 ⁇ m to about 1 mm, preferably about 80 ⁇ m to about 300 ⁇ m, and transmitting electromagnetic radiation with wavelengths in at least a portion of the range of about 200 nm to about 900 nm.
  • a known undercoat layer or adhesive layer may be provided on the surface of the support to strengthen adhesion to the water-absorbing layer.
  • the water-absorbing layer is an absorbent layer whose main component is a hydrophilic polymer binder that swells and absorbs water when it comes into contact with water.
  • the water-absorbing layer has the effect of improving the spreading of the aqueous liquid sample in the spreading layer when water in the aqueous liquid sample that is applied to the spreading layer during the analytical operation reaches the upper surface of this layer.
  • the polymer binder used in the water-absorbing layer is a non-proteinaceous hydrophilic polymer that has the property of swelling and absorbing water when it comes into contact with water.
  • non-proteinaceous hydrophilic polymers include polyacrylamide, agarose, acrylamide-N-vinylpyrrolidone copolymers such as those described in JP-A-57-50660 and JP-A-58-77664, methacrylic alcohol-based copolymers such as binary or ternary copolymers of methallyl alcohol and acrylamide or its derivatives, acrylic acid or its derivatives, methacrylic acid or its derivatives, or N-vinyl-2-pyrrolidone (methallyl alcohol-based copolymers can be crosslinked and cured. For example, acrylamide-N-vinyl-2-pyrrolidone-methallyl alcohol ternary copolymers), etc.
  • acrylamide copolymers such as acrylamide-N-vinylpyrrolidone copolymer, or methallyl alcohol-containing copolymers such as acrylamide-N-vinyl-2-pyrrolidone-methallyl alcohol ternary copolymer are preferred.
  • the coating amount of the polymer binder used in the water absorption layer is in the range of about 5 g to about 100 g, preferably about 7 g to about 70 g per m2 . Two or more types of polymer binders can be mixed and used as necessary.
  • the absorbent layer can contain various components that do not adversely affect the capabilities of the BCP.
  • An example of such a component is a nonionic surfactant.
  • Specific examples of nonionic surfactants include those that can be contained in the reagent layer or spreading layer described below. By containing a nonionic surfactant in the absorbent layer, water in the aqueous liquid sample is more likely to be absorbed substantially uniformly into the absorbent layer during the analytical procedure, and liquid contact with the reagent spreading layer becomes rapid and substantially uniform.
  • the absorbent layer can also contain a buffering agent, described below.
  • the water-absorbing layer may contain a crosslinking agent (also called a curing agent or hardener).
  • a crosslinking agent also called a curing agent or hardener.
  • various inorganic and organic crosslinking agents well known in the field of organic polymer chemistry may be used.
  • An example of an organic crosslinking agent for polyvinyl alcohol is dimethylurea
  • an example of an organic crosslinking agent for methallyl alcohol-containing polymers is formaldehyde.
  • the content of the crosslinking agent in the water-absorbing layer may be selected depending on the coating amount of the water-absorbing layer to be crosslinked and cured and the degree of curing, but is generally in the range of about 50 mg/m 2 to about 5000 mg/m 2 in terms of coating amount, preferably about 100 mg/m 2 to about 2000 mg/m 2 .
  • the BCP contained in the water-absorbing layer is treated so as not to migrate to the spreading layer.
  • One example of such treatment is to crosslink and harden the water-absorbing layer using a crosslinking agent as described above.
  • two or more absorbent layers can be provided.
  • a high molecular weight pH buffer or a high molecular weight acid can be contained in the layer close to the reagent spreading layer.
  • high molecular weight acids include known carboxyl group-containing polymers and sulfonic acid group-containing polymers.
  • hydrophilic polymers can be used in the absorbent layer close to the support, in addition to the non-proteinaceous hydrophilic polymers mentioned above.
  • An example of such a hydrophilic polymer is deionized gelatin.
  • the thickness of the absorbent layer when dry is generally about 1 ⁇ m to about 100 ⁇ m, preferably about 3 ⁇ m to about 50 ⁇ m.
  • the spreading layer examples include woven spreading layers (e.g., plain weave fabrics such as broadcloth and poplin) described in JP-A-55-164356 and JP-A-57-66359, knitted spreading layers (e.g., tricot knit, double tricot knit, Milanese knit, etc.) described in JP-A-60-222769, spreading layers made of organic polymer fiber pulp-containing paper described in JP-A-57-148250, membranes described in JP-B-53-21677 and U.S. Pat. No. 3,992,158, etc.
  • woven spreading layers e.g., plain weave fabrics such as broadcloth and poplin
  • knitted spreading layers e.g., tricot knit, double tricot knit, Milanese knit, etc.
  • spreading layers made of organic polymer fiber pulp-containing paper described in JP-A-57-148250
  • Non-fibrous isotropic porous spreading layers such as a continuous microvoid-containing porous layer in which run filters (brush polymer layers), polymer microbeads, glass microbeads, and diatomaceous earth are held in a hydrophilic polymer binder
  • non-fibrous isotropic porous spreading layers consisting of a continuous microvoid-containing porous layer (three-dimensional lattice-shaped granular structure layer) in which polymer microbeads described in JP-A-55-90859 are bonded in a point-contact manner with a polymer adhesive that does not swell in water can be used.
  • polymers with high affinity for globulin include acrylics (polyacrylamide, etc.) and celluloses (carboxymethylcellulose, hydroxymethylcellulose, etc.).
  • the polymer having a high affinity for globulin may be a hydrophilic vinyl polymer or copolymer, such as polyvinyl alcohol, polyvinyl ether, polyvinylpyrrolidone, etc.
  • the coating amount of the hydrophilic polymer is in the range of about 0.1 g/ m2 to about 30 g/ m2 , preferably about 0.5 g/ m2 to about 20 g/ m2 .
  • the absorbent layer and spreading layer may contain, together with the BCP and quaternary ammonium salt, an organic acid or an acidic pH buffer (hereinafter sometimes referred to as a buffer) containing an organic acid that can maintain the pH value of the area where an aqueous liquid sample (e.g., biological fluids such as whole blood, plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid, and urine) is spotted and spread during the analytical procedure within the range of about 3.5 to about 7.0, preferably about 3.5 to about 6.0, and more preferably about 3.7 to about 6.0.
  • an aqueous liquid sample e.g., biological fluids such as whole blood, plasma, serum, lymph, cerebrospinal fluid, and urine
  • organic acid at least one organic acid selected from the group consisting of hydroxycarboxylic acids and dicarboxylic acids is used.
  • hydroxycarboxylic acids include malic acid, lactic acid, succinic acid, malonic acid, citric acid, and tartaric acid, which are described in JP-A-57-50660, JP-A-61-243364, and JP-A-62-27664.
  • dicarboxylic acids include malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, pimelic acid, and 3,3-dimethylglutaric acid. Of these, malic acid is preferred.
  • the content of the buffer in the water absorption layer or spreading layer is in the range of about 30 milliequivalents to about 500 milliequivalents per m2 , preferably about 50 milliequivalents to about 300 milliequivalents. In the case of malic acid, the content is in the range of about 0.5 g to about 35 g per m2 , preferably about 0.5 g to about 20 g.
  • the buffer is preferably dispersed in the hydrophilic polymer together with the reagent, and is dispersed and held in the water absorption layer, reagent layer and/or spreading layer.
  • Methods for incorporating a hydrophilic polymer that disperses and retains BCP, a quaternary ammonium salt, and a buffering agent in the reagent layer or spreading layer include a method in which an aqueous solution, an aqueous-organic solvent mixed solvent solution, or an organic solvent solution (examples of organic solvents: aliphatic alcohols such as methanol, ethanol, and isopropyl alcohol; dialkyl ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; dialkyl ethers such as dimethyl ether; aliphatic cyclic ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; acetonitrile; hexane; ⁇ -methoxyethanol; ethylene glycol, etc.) containing BCP, a quaternary ammonium salt, and a polymer is applied or sprayed substantially uniformly onto the spreading layer by a known method and then dried, as well as a method in
  • a solvent that dissolves the three components from among those that do not dissolve the hydrophilic polymer layer of the water-absorbing layer and that can dissolve or disperse the three components.
  • the BCP, the quaternary ammonium salt, and the polymer are uniformly contained and retained in the spreading layer, and the release rate of BCP when an aqueous liquid sample is dropped can be controlled. In addition, the spreading of the aqueous liquid sample can be made uniform.
  • the surfactant any of anionic surfactants, cationic surfactants, nonionic surfactants, and amphoteric surfactants can be used, but nonionic surfactants are preferred.
  • nonionic surfactants include p-octylphenoxypolyethoxyethanol, p-nonylphenoxypolyethoxyethanol, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, p-nonylphenoxypolyglycidol, and octyl glucoside. Of these, polyoxyethylene oleyl ether is preferred.
  • the content of the nonionic surfactant in the spreading layer is in the range of about 20 mg to about 10 g per 1 m2 , preferably about 30 mg to about 5.0 g.
  • the dry analytical element can be prepared by a method known to those skilled in the art.
  • the dry analytical element is preferably cut into square pieces with sides of about 15 mm to about 30 mm or similar shapes and placed in a slide frame as described in JP-B-57-28331, JP-A-56-142454, JP-A-57-63452, JP-A-58-32350, JP-T-58-501144, etc., and used as a chemical analysis slide from the viewpoints of production, packaging, transportation, storage, measurement operation, etc.
  • it can be placed in a cassette or magazine in the form of a long tape, or the pieces can be attached to or placed in a card with an opening.
  • Quantitative analysis of albumin in a liquid sample can be performed by performing the operations described in the above-mentioned patent specifications using a dry analytical element. For example, about 5 ⁇ L to about 30 ⁇ L, preferably about 8 ⁇ L to about 15 ⁇ L, of an aqueous liquid sample such as whole blood, plasma, serum, lymph, or urine is spotted on the spreading layer and incubated at a substantially constant temperature in the range of about 20° C.
  • an aqueous liquid sample such as whole blood, plasma, serum, lymph, or urine
  • the optical density of the reagent spreading layer is measured by reflection photometry using light at or near the absorption maximum wavelength of the albumin-BCP bond, and the albumin content in the liquid sample can be determined by the principle of colorimetric measurement using a previously prepared calibration curve.
  • Measurement operations can be performed with extremely simple operations using chemical analysis devices described in JP-A-60-125543, JP-A-60-220862, JP-A-61-294367, JP-A-58-161867, etc., and highly accurate quantitative analysis can be performed.
  • Example 1 With reference to Example 1 of Japanese Patent No. 3266079, a mixed solution containing 35 mmol/L BCP, 166 mmol/L succinic acid, 60 mmol/L SDS (sodium dodecyl sulfate), and 10 mmol/L DTNB (dithiobis(2-nitrobenzoic acid)) was prepared. To this solution, 20 mmol/L tetrabutylammonium bromide (also referred to as TBA/Br) was added to prepare test solution A.
  • TBA/Br tetrabutylammonium bromide
  • the test solution A to which physiological saline was added was defined as background, and the difference in absorbance between this and a solution to which an aqueous solution of 10 g/L of ALB was added was calculated.
  • the results of absorbance measurements are shown in Figure 1.
  • the unit of absorbance is a.u. (arbitrary unit) (similar to Figures 2 and 3).
  • Before the reaction is the background, and after the reaction is the result of adding 10 g/L of ALB.
  • a decrease in absorbance before the reaction was observed due to tetrabutylammonium bromide, and the difference in OD value before and after the reaction was 9.92, indicating high detection sensitivity (wavelength 600 nm).
  • Example 1 ⁇ Comparative Example 1>
  • test solution A was prepared without adding tetrabutylammonium bromide, and the difference in absorbance between the background and a solution to which an aqueous solution of 10 g/L of ALB had been added was determined.
  • the results of absorbance measurements are shown in Figure 2.
  • the results before the reaction are background, and the results after the reaction are those with 10 g/L ALB added. Since no tetrabutylammonium bromide was added, the decrease in absorbance before the reaction was small, and the difference in OD value before and after the reaction was 6.19 (wavelength 600 nm).
  • Example 2 a test solution B was prepared by adding a long-chain alkyl group quaternary ammonium chloride (cetyldimethylbenzylammonium chloride, CMBA) instead of tetrabutylammonium bromide, and the difference in absorbance between the background and a solution to which an aqueous solution of 10 g/L of ALB had been added was determined.
  • CMBA cetyldimethylbenzylammonium chloride
  • Figure 3 A decrease in absorbance was observed before the reaction, but no increase in absorbance was observed after the reaction, and the difference in OD value before and after the reaction was 1 or less (wavelength 600 nm).

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Abstract

本発明は、ブロモクレゾールパープルを用いたアルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法において、感度を向上させたアルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法を提供することを課題とする。本発明によれば、ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩とを含む、アルブミン測定試薬；並びにアルビミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることを含む、アルブミンの測定方法が提供される。

Description

アルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法
　本発明は、ブロモクレゾールパープルを用いた、アルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法に関する。
　血清アルブミンの測定法としては、例えば抗アルブミン血清を用い、試料中に存在するアルブミンとの反応により生じる抗原抗体複合物に由来する光散乱強度の変化を測定する、免疫学的測定法があるが、免疫学的測定法は操作が煩雑である。そのため、日常的な検査法としては、ブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）法、及びブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）法などの色素結合法が広く普及している。ＢＣＧおよびＢＣＰはともにスルホフタレイン系に属するトリフェニルメタン型のｐＨ指示薬であるが、ＢＣＧはアルブミンのみならずグロブリン存在下でも発色するため、アルブミンに対する特異性が低いという欠点を有している。一方、ＢＣＰはグロブリンによっては発色せず、ＢＣＧよりもアルブミンに対する特異性が高い。
　ＢＣＰを用いたアルブミンの測定方法として、例えば、特許文献１には、アルブミンに対する糖化アルブミンの糖化割合を算出する糖化アルブミン測定方法において、アルブミン測定の際、被検液を、蛋白質変性剤及び／またはＳ－Ｓ結合を有する化合物にて前処理を行い、同時若しくは続いてブロモクレゾ－ルパープルを用いてアルブミンを測定することが記載されている。また、特許文献２には、支持体と、ブロムクレゾールパープルなどを含む試薬保持層とを有するアルブミン測定用試験片を用いてアルブミンを測定することが記載されている。
　一方、特許文献３には、脂肪族４級アンモニウムの存在下において糖化タンパク質を測定することが記載されている。
特開２００８－２７８８９８号公報 特開２０２２－８５８７６号公報 国際公開ＷＯ２００７／０７２９４１号公報
　上記の通りＢＣＰを用いたアルブミンの測定方法は知られているが、ＢＣＰは、ＢＣＧと比べてバックグラウンドが大きく、反応後による吸光度変化は小さくなる。このことは、感度低下や同時再現性の悪化を招くことになる。本発明は、ブロモクレゾールパープルを用いたアルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法において、感度を向上させたアルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法を提供することを解決すべき課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、アルブミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることによって、反応前のＢＣＰの吸光度を低下させてバックグラウンドを低下できることを見出した。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩とを含む、アルブミン測定試薬。
＜２＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量が６００以下である、＜１＞に記載のアルブミン測定試薬。
＜３＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖が、同一である、＜１＞又は＜２＞に記載のアルブミン測定試薬。
＜４＞　炭素数８以下のアルキル鎖が、炭素数６以下のアルキル鎖である、＜１＞又は＜２＞に記載のアルブミン測定試薬。
＜５＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩が、テトラブチルアンモニウム塩である、＜１＞又は＜２＞に記載のアルブミン測定試薬。
＜６＞　塩がハロゲン化物である、＜１＞又は＜２＞に記載のアルブミン測定試薬。
＜７＞　アルビミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることを含む、アルブミンの測定方法。
＜８＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量が６００以下である、＜７＞に記載のアルブミンの測定方法。
＜９＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖が、同一である、＜７＞又は＜８＞に記載のアルブミンの測定方法。
＜１０＞　炭素数８以下のアルキル鎖が、炭素数６以下のアルキル鎖である、＜７＞又は＜８＞に記載のアルブミンの測定方法。
＜１１＞　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩が、テトラブチルアンモニウム塩である、＜７＞又は＜８＞に記載のアルブミンの測定方法。
＜１２＞　塩がハロゲン化物である、＜７＞又は＜８＞に記載のアルブミンの測定方法。
＜１３＞　ブロモクレゾールパープルと４級アンモニウム塩との反応の前後において、波長３５０～６４０nmの吸光度を測定する、＜７＞又は＜８＞に記載のアルブミンの測定方法。
　本発明のアルブミン測定試薬およびアルブミンの測定方法によれば、アルブミン測定の感度を向上させることができる。
図１は、実施例１の吸光度の測定結果を示す。 図２は、比較例１の吸光度の測定結果を示す。 図３は、比較例２の吸光度の測定結果を示す。
　以下、本発明について詳細に説明する。
　本明細書において「～」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
　本発明は、ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩とを含む、アルブミン測定試薬に関する。本発明はさらに、アルビミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることを含む、アルブミンの測定方法に関する。
　本発明においては、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩を使用することによって、アルブミン測定の感度を向上させることが可能になった。
＜ブロモクレゾールパープル＞
　ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ）としては、通常市販されているものを使用することができる。ＢＣＰの使用濃度としては、溶液系におけるアルブミン測定時の濃度として、通常０．０１～０．３０ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２～０．２ｍｏｌ／Ｌとなるように適宜選択して用いられる。
＜４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩＞
　本発明においては、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩を使用する。
　本発明において使用する４級アンモニウム塩は、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有するものであり、芳香環を含まないものである。
　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量は、好ましくは６００以下であり、より好ましくは５５０以下であり、さらに好ましくは５００以下であり、さらに好ましくは４００以下であり、特に好ましくは３５０以下である。４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量の下限は一般的には１５０以上である。
　４本の炭素数８以下のアルキル鎖が、同一でも、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　炭素数８以下のアルキル鎖は、好ましくは炭素数６以下のアルキル鎖であり、より好ましくは炭素数３～５のアルキル鎖であり、特に好ましくは炭素数４のアルキル鎖である。
　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩としては、テトラブチルアンモニウム塩が好ましい。
　４級アンモニウム塩の塩としては、ハロゲン化物（フッ化物、塩化物、臭化物、ヨウ化物など）が好ましく、臭化物が特に好ましい。
　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩としては、テトラブチルアンモニウムブロミドが特に好ましい。
　４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の使用濃度としては、溶液系におけるアルブミン測定時の濃度として、通常　０.０１～０．３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０.０１～０．１ｍｏｌ／Ｌとなるように適宜選択して用いられる。
＜アルブミン測定試薬＞
　本発明のアルブミン測定試薬は、ブロモクレゾールパープル、および４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、蛋白質変性剤、ＳＨ試薬、緩衝剤などを挙げることができる。
　蛋白質変性剤としては、蛋白質変性作用を有するものであって、アルブミンの測定値に影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えば尿素、例えばグアニジン塩酸塩，グアニジン硫酸塩等のグアニジン塩類、例えばフッ化ナトリウム、アジ化ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類、例えばチオシアン酸アンモニウム、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム等のチオシアン酸塩等の塩類、例えば陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、両性界面活性剤等の界面活性剤等が挙げられ、中でも界面活性剤、特に陰イオン界面活性剤が好ましい。また、これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いてもよい。
　また、陰イオン界面活性剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム（SDS）、セチル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸エステル系界面活性剤、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム，ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸トリエタノールアミン塩等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、例えばラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム，セチルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩等が好ましい。中でもラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が好ましい。これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いてもよい。
　蛋白質変性剤の使用濃度としては、蛋白質変性剤の種類や処理する試料により異なるが、試料及び標準品中に含まれる共存物質の影響を防止し、かつアルブミンの測定値に影響を与えない濃度であれば特に限定されることなく選択することができ、溶液系におけるアルブミン測定時の濃度として通常０．００１～１０ｗ／ｗ％、好ましくは０．０１～１ｗ／ｗ％、より好ましくは０．０２～０．３ｗ／ｗ％となるように適宜選択して用いられる。
　ＳＨ試薬としては、例えば５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、２，２’－ジチオビス（５－ニトロピリジン）（ＮＰＤＳ）、２，２’－ジチオジピリジン（２－ＰＤＳ）、４，４’－ジチオジピリジン（４－ＰＤＳ）、４，４’－ジチオビス（１－アジドベンゼン）（ＤＴＢＰＡ）、酸化型グルタチオン等のジスルフィド体、例えばヨウ素、フェリシアン化物、ヨードソ安息香酸、ヨウ素酸塩、亜塩素酸塩類、水銀、亜鉛等の酸化剤、例えばヨード酢酸、クロロ酢酸、ヨードアセトアミド、クロロアセトフェノン等のアルキル化剤、マレイミド、例えばＮ－メチルマレイミド、Ｎ－エチルマレイミド、Ｎ，Ｎ’－ｐ－フェニレンジマレイミド等のマレイミド誘導体、チオフタルイミド等が挙げられる。これらの中でも特に例えばＤＴＮＢ、２－ＰＤＳ、４－ＰＤＳ等のジスルフィド体、マレイミド、Ｎ－エチルマレイミド等のマレイミド誘導体等が好ましい。また、これらは単独で用いても、適宜組み合わせて用いても何れにても良い。
　ＳＨ試薬の使用濃度としては、ＳＨ試薬の種類や処理する試料により異なり、試料及び標準品中に含まれる共存物質の影響を防止し、且つアルブミンの測定値に影響を与えない濃度であれば特に限定されることなく設定できるが、溶液系におけるアルブミン測定時の濃度として通常０．００１～１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１～０．５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように適宜選択して用いられる。
　緩衝剤としては、例えば酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、例えば３－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等のグッド緩衝剤等、通常この分野で用いられる緩衝剤は何れも制限なく使用可能である。緩衝剤の使用濃度としては、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　本発明のアルブミン測定試薬は、ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩と、所望により他の試薬（例えば、蛋白質変性剤、ＳＨ試薬、緩衝剤など）を含む。
　本発明のアルブミン測定試薬の第一の形態は、ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩と、所望により含まれる他の試薬とを同一の試薬中に含む一液型である。
　本発明のアルブミン測定試薬の第二の形態は、ブロモクレゾールパープルを含まず、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩を含む第一試薬と、ブロモクレゾールパープルと４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩を含む第二試薬とから構成される２液型（ここで、第一試薬および第二の試薬には、所望により含まれる他の試薬が含まれていてもよい）である。
＜アルブミンの測定方法＞
　本発明においては、アルビミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることによって、アルブミンを測定する。
　アルブミンの測定に適用される試料としては、例えば、血清、血漿等の試料が挙げられるが、特に限定されない。
　アルブミンの測定においては、ブロモクレゾールパープルと４級アンモニウム塩との反応の前後において、波長３５０～６４０ｎｍの吸光度を測定することが好ましく、波長３８０～６２０ｎｍの吸光度を測定することがより好ましい。例えば、波長５８０～６２０ｎｍ（特には波長６００ｎｍ）の吸光度を測定してもよいし、波長３８０～４２０ｎｍ（特には波長４００ｎｍ）の吸光度を測定してもよい。
　アルブミンとブロモクレゾールパープルとの反応、およびその後の測定は、溶液において行ってもよいし、乾式分析要素を用いて行ってもよい。
＜溶液におけるアルブミンの測定方法＞
　本発明の方法によりアルブミンの測定を行うには、一液法により行っても、二液法により行ってもよい。
　一液法により行う場合には、例えば以下の通り行えばよい。即ち、試料と、ＢＣＰ、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩、および所望により使用される他の試薬を含有するｐＨ４．５～５．７、好ましくはｐＨ５．０～５．５の試液（測定用試液）とを混合して発色させ、適当な時間経過後に波長３５０～６４０ｎｍにおける吸光度を測定する。得られた吸光度を、予め濃度既知のアルブミン溶液を試料とし、上記と同じ測定用試薬を用いて同様の操作により得られたアルブミン濃度と吸光度との関係を表す検量線にあてはめることにより、試料中のアルブミン濃度を求めることができる。なお測定操作時の温度は、通常１５～３７℃、好ましくは３７℃である。
　また、二液法により行う場合には、例えば以下の通り行えばよい。即ち、先ず試料と、ＢＣＰを含まず、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩を含む第一試薬とを混合し、波長３５０～６４０ｎｍにおける吸光度（吸光度１）を測定する。
　次いで、この混合液と、ＢＣＰと４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩とを含む第二試薬とを混合して発色させ、適当な時間経過後、波長３５０～６４０ｎｍにおける吸光度（吸光度２）を測定する。
　次いで、吸光度２と吸光度１とから求めた吸光度差を、予め濃度既知のアルブミン濃度を試料とし、上記と同じ第１試薬、第２試薬を用いて同様の操作により得られた、アルブミン濃度と吸光度差との関係を表す検量線にあてはめることにより、試料中のアルブミン濃度を求めることができる。
　ＢＣＰを用いる本発明のアルブミン測定は、自動分析機等を用いて行うことができる。
＜乾式分析要素を用いたアルブミンの測定方法＞
　乾式分析要素は、好ましくは、支持体上に吸水層と展開層とを支持体側からこの順番で有し、ブロムクレゾールパープル(ＢＣＰ)と、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩（以下、４級アンモニウム塩と略記する）とを含有し、展開層のｐＨがグロブリンの等電点付近に設定されている。展開層のｐＨは、具体的には、約３．５から約７．０、好ましくは約３．５から約６．０、より好ましくは約３．７から６．０の範囲である。展開層のｐＨは、特に好ましくは５．０から６．０の範囲であり、例えば、５．５付近に設定することができる。
　ＢＣＰは、吸水層に含めてもよいし、展開層に含めてもよいし、あるいはこれらの層とは別に設けた層に含めてもよい。また、ＢＣＰは、上記した層のうちの一つの層に含めてもよいし、二以上の層に含めてもよい。好ましくは、ＢＣＰは、吸水層に含有される。また、吸水層がブロムクレゾールパープル(ＢＣＰ)を含む場合、吸水層のｐＨはＢＣＰのｐＫａ（ｐＫａ＝約６．０）以下であることが好ましい。ＢＣＰの使用量は１ｍ2当り約０．２ｇから約５．０ｇ、好ましくは約０．４ｇから約３．０ｇ、より好ましくは約０．６ｇから２．０ｇの範囲である。
　４級アンモニウム塩は、吸水層に含めてもよいし、展開層に含めてもよいし、あるいはこれらの層とは別に設けた層に含めてもよい。また、４級アンモニウム塩は、上記した層のうちの一つの層に含めてもよいし、二以上の層に含めてもよい。好ましくは、４級アンモニウム塩は、吸水層に含有される。４級アンモニウム塩の使用量は１ｍ2当り約０．００１ｇから約０．４ｇ、好ましくは約０．００１ｇから約０．３ｇ、より好ましくは約０．００２ｇから０．２ｇの範囲である。
　乾式分析要素は、一般的には、支持体と、その上に塗布される２以上の層を有する構成を有する。
　支持体の上に塗布される層としては、（１）水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分として構成される吸水層；並びに（２）乾式分析要素の上側表面に点着供給された水性液体試料を、水性液体試料中に含有されている成分を実質的に偏在させることなしに横方向に広げ、単位面積当たりほぼ一定容量の割合で吸水性の親水性ポリマーを含む吸水層に供給する作用（メータリング作用）を有する、展開層：が挙げられる。また、支持体とその上に設ける層との間、並びに支持体の上に設けられる各層の間には、接着層などの中間層を設けることもできる。
　また、上記した吸水層及び展開層はそれぞれ別個の層として設けてもよいが、同一の層に上記した２以上の機能を同時に持たせることにより、一つの層として設けることもできる。即ち、吸水層と展開層は、同一の層として設けてもよい。以下、乾式分析要素に存在し得る構成要素について順番に説明する。
　支持体は、好ましくは、光透過性水不透過性支持体である。光透過性水不透過性支持体は従来の一体型多層分析要素に用いられる公知のものを用いることができる。その具体例としては、ポリエチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例えば、セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８０μｍから約３００μｍの範囲の透明な、例えば、波長約２００ｎｍから約９００ｎｍの範囲内の少なくとも一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる、平滑平面状の支持体を用いることができる。支持体の表面には公知の下塗層又は接着層を設けて吸水層との接着を強固にすることができる。
　吸水層は、水に接触して膨潤し水を吸収できる親水性ポリマーバインダーを主成分とする吸水性の層である。吸水層は分析操作時に展開層に点着された水性液体試料中の水がこの層の上側表面に到達した時に、展開層での水性液体試料の展開を良好にする作用を有している。
　吸水層に用いられるポリマーバインダーは水との接触時に膨潤して吸水する性質を有する非蛋白性の親水性ポリマーである。非蛋白性の親水性ポリマーの例として、ポリアクリルアミド、アガロース、特開昭５７－５０６６０、特開昭５８－７７６６４等に記載のアクリルアミド－Ｎ－ビニルピロリドンコポリマー等のアクリルアミド系コポリマー、特開昭６２－１３７５６４に記載のメタリルアルコールとアクリルアミド又はその誘導体、アクリル酸又はその誘導体、メタクリル酸又はその誘導体、又はＮ－ビニル－２－ピロリドンとの２元又は３元コポリマー等のメタクリルアルコール系コポリマー（メタリルアルコール系コポリマーは架橋硬化可能である。例えば、アクリルアミド－Ｎ－ビニル－２－ピロリドン－メタリルアルコール３元コポリマー）等がある。
　これらの非蛋白性親水性ポリマーのうちでは、アクリルアミド－Ｎ－ビニルピロリドンコポリマー等のアクリルアミド系コポリマー、または、アクリルアミド－Ｎ－ビニル－２－ピロリドン－メタリルアルコール３元コポリマー等のメタリルアルコール含有コポリマーが好ましい。吸水層に用いられるポリマーバイダーの被覆量は１ｍ2当り約５ｇから約１００ｇ、好ましくは約７ｇから約７０ｇの範囲である。ポリマーバインダーは必要により２種以上を混合して用いることができる。
　吸水層には、ＢＣＰの能力に悪影響を及ぼさない諸種の成分を含有させることができる。その例としてノニオン界面活性剤がある。ノニオン界面活性剤の具体例として、後述の試薬層又は展開層に含有させることができる界面活性剤と同様のものがある。ノニオン界面活性剤を吸水層に含有させることにより分析操作時に水性液体試料中の水が吸水層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また試薬展開層との液体接触が迅速にかつ実質的に一様になる。また、吸水層には後述する緩衝剤を含有させることができる。
　吸水層には架橋剤（硬化剤又は硬膜剤ともいわれる）を含有させることができる。架橋剤としては、有機ポリマー化学分野で周知の諸種の無機及び有機架橋剤を用いることができる。ポリビニルアルコール用の有機架橋剤の例としてジメチル尿素、メタリルアルコール含有ポリマー用の有機架橋剤の例としてホルムアルデヒドがある。架橋剤の吸水層中での含有量は、架橋硬化させる吸水層の被覆量と硬化の程度に応じて選択しうるが、一般的に被覆量で約５０ｍｇ／ｍ２～約５０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１００ｍｇ／ｍ２～約２０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。
　好ましくは、吸水層に含まれるＢＣＰは、展開層に移動しないように処理されている。このような処理の一例としては、上記のような架橋剤を用いて吸水層を架橋硬化させることが挙げられる。
　吸水層は必要に応じて２層以上設けることができる。２層以上の吸水層を設ける場合には、試薬展開層に近い層に高分子量のｐＨ緩衝剤又は高分子量の酸を含有させることができる。用いることができる高分子量の酸の例として、公知のカルボキシル基含有ポリマー、スルホン酸基含有ポリマーがある。吸水層を２層設ける場合、支持体に近い吸水層には上記の非蛋白性親水性ポリマーだけでなく、広い範囲の親水性ポリマーを用いることができる。そのような親水性ポリマーの例としては、脱イオンゼラチンがある。吸水層の乾燥時の厚さは、一般的には約１μｍから約１００μｍ、好ましくは約３μｍから約５０μｍ程度である。
　展開層としては、例えば、特開昭５５－１６４３５６、特開昭５７－６６３５９等に記載の織物展開層（例えば、ブロード、ポプリン等の平織物）、特開昭６０－２２２７６９等に記載の編物展開層（例えば、トリコット編、ダブルトリコット編、ミラニーズ編等）、特開昭５７－１４８２５０に記載の有機ポリマー繊維パルプ含有抄造紙からなる展開層、特公昭５３－２１６７７、米国特許第３，９９２，１５８等に記載のメンブランフイルタ（ブラッシュポリマー層）、ポリマーミクロビーズ、ガラスミクロビーズ、珪藻土が親水性ポリマーバインダーに保持されてなる連続微空隙含有多孔性層等の非繊維等方的多孔性展開層、特開昭５５－９０８５９に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しないポリマー接着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有多孔性層（三次元格子状粒状構造物層）からなる非繊維等方的多孔性展開層等を用いることができる。
　好ましくは、展開層としては、グロブリンに対する親和性が高いポリマーを用いることが好ましい。グロブリンに対する親和性が高いポリマーとしては、アクリル系（ポリアクリルアミドなど）、セルロース系（カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースなど）などが挙げられる。
　好ましくは、グロブリンに対する親和性が高いポリマーとしては、親水性ビニル系ポリマー又はコポリマーを使用することができ、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン等を使用することができる。親水性ポリマーの被覆量は約０．１ｇ／ｍ２から約３０ｇ／ｍ２、好ましくは約０．５ｇ／ｍ２から約２０ｇ／ｍ２の範囲である。
　また、吸水層及び展開層には、ＢＣＰおよび４級アンモニウム塩とともに分析操作時に水性液体試料（例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、髄液、尿に代表される生物体液）が点着され展開された領域のｐＨ値を約３．５から約７．０、好ましくは約３．５から約６．０、より好ましくは約３．７から約６．０の範囲に維持できる有機酸又は有機酸を含む酸性ｐＨ緩衝剤（以下、緩衝剤ということがある）を含有させることができる。
　有機酸としてはヒドロキシカルボン酸及びジカルボン酸からなる群から選択された少なくとも１種の有機酸が用いられる。ヒドロキシカルボン酸の例としては、特開昭５７－５０６６０、特開昭６１－２４３３６４、特開昭６２－２７６６４等に記載のリンゴ酸、乳酸、コハク酸、マロン酸、枸櫞酸、酒石酸がある。ジカルボン酸の例としては、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、ピメリン酸、３，３－ジメチルグルタル酸がある。これらのうちでリンゴ酸が好ましい。上記の有機酸のほかに日本化学会編「化学便覧基礎編」（東京，丸善，１９６６年発行）１３１２－１３２０頁、米国特許３４３８７３７号明細書等に記載のその他のｐＨ緩衝剤組成物も用いることができる。
　緩衝剤の吸水層又は展開層における含有量は１ｍ２当り約３０ミリ当量から約５００ミリ当量、好ましくは約５０ミリ当量から約３００ミリ当量の範囲である。リンゴ酸の場合の含有量は１ｍ２当り約０．５ｇ～約３５ｇ、好ましくは約０．５ｇ～約２０ｇの範囲である。緩衝剤は試薬と一緒に親水性ポリマー中に分散させ、吸水層、試薬層及び／又は展開層に分散保持させることが好ましい。
　試薬層又は展開層に、ＢＣＰ、４級アンモニウム塩および緩衝剤を分散保持する親水性ポリマーを含有させる方法としては、ＢＣＰ、４級アンモニウム塩およびポリマーを含む水溶液、水－有機溶媒混合溶媒溶液又は有機溶媒溶液（有機溶媒の例：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等の脂肪族アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のジアルキルケトン；ジメチルエーテル等のジアルキルエーテル；テトラヒドロフラン、ジオキサン等の脂肪族環状エーテル；アセトニトリル；ヘキサン；β－メトキシエタノール；エチレングリコール等）を公知の方法により実質的に一様に展開層の上から塗布又は噴霧し乾燥する方法、並びに、ＢＣＰ、４級アンモニウム塩、緩衝剤、親水性ポリマーを含む溶液に展開層用の素材を浸漬し乾燥又は半乾燥状態で吸水層（親水性ポリマーバインダー層）の上に積層し一体化する方法等がある。ＢＣＰ、４級アンモニウム塩、緩衝剤、親水性ポリマー溶液を展開層の上から塗布又は噴霧する場合は、三者を溶解する溶剤は吸水層の親水性ポリマー層を溶解させないもので三者を溶解又は分散しうるものから適宜に選択して用いることが好ましい。
　ＢＣＰ、４級アンモニウム塩、緩衝剤、親水性ポリマーとともに界面活性剤を含有させて、ＢＣＰ、４級アンモニウム塩およびポリマーを展開層中に一様に含有保持させ、水性液体試料点着時のＢＣＰの放出速度をコントロールすることができる。また、水性液体試料の展開を一様にすることができる。界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤、両性界面活性剤のいずれも使用できるが、ノニオン界面活性剤が好ましい。ノニオン界面活性剤の具体例として、ｐ－オクチルフエノキシポリエトキシエタノール、ｐ－ノニルフエノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ｐ－ノニルフエノキシポリグリシドール、オクチルグルコシド等がある。これらのうちでポリオキシエチレンオレイルエーテルが好ましい。ノニオン界面活性剤の展開層における含有量は１ｍ２当り約２０ｍｇ～約１０ｇ、好ましくは約３０ｍｇ～約５．０ｇの範囲である。
　乾式分析要素は、当業者に公知の方法により調製することができる。乾式分析要素は一辺約１５ｍｍから約３０ｍｍの正方形又はほぼ同サイズの同形等の小片に裁断し、特公昭５７－２８３３１、実開昭５６－１４２４５４、特開昭５７－６３４５２、実開昭５８－３２３５０、特表昭５８－５０１１４４等に記載のスライド枠に収めて化学分析スライドとして用いることが、製造、包装、輸送、保存、測定操作等諸種の観点から好ましい。使用目的によっては、長いテープ状でカセット又はマガジンに収めて用いること、又は小片を開口のあるカードに貼付又は収めて用いることなどもできる。
　乾式分析要素を用いて前述の諸特許明細書等に記載の操作を行なうことにより、液体試料中のアルブミンの定量分析を実施できる。例えば、約５μＬから約３０μＬ、好ましくは約８μＬから約１５μＬの範囲の全血、血漿、血清、リンパ液、尿等の水性液体試料を展開層に点着し、約２０℃から約４０℃の範囲の実質的に一定の温度で、好ましくは３７℃近傍の実質的に一定の温度で約１分から約１０分、好ましくは約２分から約７分の範囲でインキュベーションし、光透過性支持体側から、乾式分析要素内の色変化、発色などの検出可能な変化を反射測光し、比色測定法の原理により液体試料中の測定対象成分の含有量を求めることができる。乾式分析要素を用いてアルブミンを分析する場合には、アルブミン－ＢＣＰ結合の吸収極大波長又はその近傍の波長の光を用いて試薬展開層の光学濃度を反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により液体試料中のアルブミン含有量を求めることができる。点着する水性液体試料の量、インキュベーション時間と温度は一定にすることにより測定対象成分の定量分析を高精度で実施できる。測定操作は特開昭６０－１２５５４３、特開昭６０－２２０８６２、特開昭６１－２９４３６７、特開昭５８－１６１８６７等に記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。
　次に、本発明について実施例を挙げて説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
＜実施例１＞
　特許第３２６６０７９号明細書の実施例１を参考に、ＢＣＰを３５ｍｍｏｌ／Ｌ、コハク酸１６６ｍｍｏｌ／Ｌ、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ）６０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＤＴＮＢ（ジチオビス（２－ニトロ安息香酸））１０ｍｍｏｌ／Ｌを含む混合液を作製した。その液に、テトラブチルアンモニウムブロミド（ＴＢＡ／Ｂｒとも表記する）を２０ｍｍｏｌ／Ｌ加え、検査液Ａを作製した。
　検査液Ａに生理食塩水を加えたものをバックグラウンドと定義し、ＡＬＢ１０ｇ／Ｌの水溶液を加えた液との吸光度の差を求めた。
　吸光度の測定結果を図１に示す。吸光度の単位は、ａ．ｕ．（任意単位）である（図２及び図３も同様である）。反応前が、バックグラウンドであり、反応後が、ＡＬＢ１０ｇ／Ｌを加えたものである。テトラブチルアンモニウムブロミドにより反応前の吸光度の減少が見られ、反応前後のＯＤ値の差は９．９２となり検出感度が高かった（波長６００ｎｍ）。
＜比較例１＞
　実施例１において、テトラブチルアンモニウムブロミドを加えることなく、検査液Ａを作製し、バックグラウンドとＡＬＢ１０ｇ／Ｌの水溶液を加えた液との吸光度の差を求めた。
　吸光度の測定結果を図２に示す。反応前が、バックグラウンドであり、反応後が、ＡＬＢ１０ｇ／Ｌを加えたものである。テトラブチルアンモニウムブロミドを添加していないため、反応前の吸光度の減少幅が小さく、反応前後のＯＤ値の差は６．１９であった（波長６００ｎｍ）。
＜比較例２＞
　実施例１において、テトラブチルアンモニウムブロミドの代わりに、長鎖アルキル基４級アンモニウムクロリド（セチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ＣＭＢＡ）を加えて、検査液Ｂを作製し、バックグラウンドとＡＬＢ１０ｇ／Ｌの水溶液を加えた液との吸光度の差を求めた。
　吸光度の測定結果を図３に示す。反応前の吸光度の減少が見られたが、反応後の吸光度の上昇がみられず、反応前後のＯＤ値の差は１以下であった（波長６００ｎｍ）

Claims (13)

  1. ブロモクレゾールパープルと、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩とを含む、アルブミン測定試薬。
  2. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量が６００以下である、請求項１に記載のアルブミン測定試薬。
  3. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖が、同一である、請求項１又は２に記載のアルブミン測定試薬。
  4. 炭素数８以下のアルキル鎖が、炭素数６以下のアルキル鎖である、請求項１又は２に記載のアルブミン測定試薬。
  5. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩が、テトラブチルアンモニウム塩である、請求項１又は２に記載のアルブミン測定試薬。
  6. 塩がハロゲン化物である、請求項１又は２に記載のアルブミン測定試薬。
  7. アルビミンとブロモクレゾールパープルとを、４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の存在下において反応させることを含む、アルブミンの測定方法。
  8. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩の分子量が６００以下である、請求項７に記載のアルブミンの測定方法。
  9. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖が、同一である、請求項７又は８に記載のアルブミンの測定方法。
  10. 炭素数８以下のアルキル鎖が、炭素数６以下のアルキル鎖である、請求項７又は８に記載のアルブミンの測定方法。
  11. ４本の炭素数８以下のアルキル鎖を有する４級アンモニウム塩が、テトラブチルアンモニウム塩である、請求項７又は８に記載のアルブミンの測定方法。
  12. 塩がハロゲン化物である、請求項７又は８に記載のアルブミンの測定方法。
  13. ブロモクレゾールパープルと４級アンモニウム塩との反応の前後において、波長３５０～６４０nmの吸光度を測定する、請求項７又は８に記載のアルブミンの測定方法。
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