CN1589324A - 编码烯醇丙酮酸磷酸-糖磷酸转移酶蛋白的基因 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的核酸分子,涉及其用于构建遗传改良的微生物的用途,还涉及借助于所述遗传改良的微生物制备精细化学品的方法,尤其是制备氨基酸的方法。
Description
发明背景
细胞中天然进行的代谢过程所产生的特定产物和副产物已用于工业的许多分支中,包括食品工业、动物饲料工业、化妆品工业及药学工业。这些分子合起来称为“精细化学品”,其包括有机酸(蛋白原的和非蛋白原的氨基酸)、核苷酸和核苷、脂类和脂肪酸、二醇、碳水化合物、芳香化合物、维生素和辅因子、以及酶。它们最好的产生是在每一特定的情况下通过大规模培养细菌,使产生并分泌大量的目标分子。一种对此目的尤其有用的生物体是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum),其为革兰氏阳性的非致病菌。通过菌株选择,已开发了许多突变菌株,它们产生多种目标化合物。但是,为提高特定分子产量的菌株选择是一种费时且困难的方法。
发明简述
本发明提供了新的可用于谷氨酸棒状杆菌或相关菌种的鉴定或分类的核酸分子。谷氨酸棒状杆菌为革兰氏阳性需氧细菌,其广泛用在工业上用于大规模产生多种精细化学品,也用于降解碳氢化合物(如在原油泄漏物中),以及用于氧化萜类化合物。本发明的核酸分子因此可用于鉴定能如通过发酵法用来产生精细化学品的微生物。虽然谷氨酸棒状杆菌自身为非致病的,但它与其它棒状杆菌如对人致病的重要病原菌白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)(白喉的病原菌)有亲缘关系。所以鉴定存在棒状杆菌的能力也具有显著的临床重要性,例如诊断应用。而且,所述核酸分子可作为对谷氨酸棒状杆菌或相关生物进行基因组作图的参考点。
这些新核酸分子编码的蛋白文中称为烯醇丙酮酸磷酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)蛋白。这些PTS蛋白可例如在谷氨酸棒状杆菌中转运高能含碳分子(如葡萄糖)或参与所述微生物中的胞内信号转导。由于可得到用于谷氨酸棒状杆菌中的克隆载体(如在Sinskey等人,美国专利号4,649,119中所公开的)和用于遗传操作谷氨酸棒状杆菌和相关短杆菌种(如lactofermentum)的技术(Yoshihama等人,细菌学杂志(J.Bacteriol.)162:(1985)591-597;Katsumata等人,细菌学杂志(J.Bacteriol.)159:(1984)306-311;和Santamaria等人,普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)130:(1984)2237-2246),本发明的核酸分子可用于该生物体的遗传操作,使其成为一种或多种精细化学品的较好或更有效的生产者。可修饰本发明的PTS分子,从而提高一种或多种精细化学品的产量、生产率和/或生产效率。例如,如果对参与葡萄糖摄入的PTS蛋白进行修饰,从而优化其活性,可增加葡萄糖摄入量或提高转运葡萄糖进入细胞的速率。细胞内葡萄糖和其它糖的降解提供了能量,所提供的能量可用于驱动能量逆差的生物化学反应,例如那些涉及精细化学品生物合成的生物化学反应。而且,所述的降解提供了特定精细化学品如氨基酸、维生素和辅因子生物合成所需的中间体和前体。通过修饰本发明的PTS分子增加胞内高能碳分子的量因此使增加产生一种或多种精细化学品所需的可用于进行代谢途径的能量和增加所述产生所需代谢物的胞内池成为可能。
而且,本发明的PTS分子可参与影响谷氨酸棒状杆菌中一种或多种精细化学品产量和/或生产率的一个或多个胞内信号转导途径。蛋白,例如从胞外介质输入一种或多种糖类所需的蛋白(如Hpr,为酶I或为酶II复合体的组分),在细胞内存在足量的糖时,这些蛋白通常被翻译后修饰,这样它们就不再能输入所述糖。虽然使转运系统关闭的糖量为足以维持正常细胞功能的量,但它限制了目标精细化学品的超量产生。因此建议修饰本发明的PTS蛋白,从而使它们不再对这类负调节起反应。这使得一种或多种糖类可达到较高的胞内浓度,并且延及从含有所述突变PTS蛋白的生物体可更有效地产生或以较高的产量产生一种或多种精细化学品。
本发明提供了这样的新核酸分子,其编码的蛋白文中称为烯醇丙酮酸磷酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)蛋白,所述蛋白例如参与将高能碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)输入谷氨酸棒状杆菌和/或参与谷氨酸棒状杆菌中的一个或多个胞内信号转导途径。编码PTS蛋白的核酸分子文中称为PTS核酸分子。在一个优选的实施方案中,PTS蛋白参与将高能碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)输入谷氨酸棒状杆菌,并且可参与谷氨酸棒状杆菌中的一个或多个胞内信号转导途径。此类蛋白的实例为被表1中所示基因编码的蛋白。
因此,本发明的一个方面涉及这样的分离的核酸分子(例如cDNAs),其包含编码PTS蛋白或其生物学活性部分的核苷酸序列和适合作为检测或扩增编码PTS的核酸(例如DNA或mRNA)的引物或杂交探针的核酸片段。在尤其优选的实施方案中,该分离的核酸分子包含任何集合A所列出的核苷酸序列或其编码区或其互补序列。在其它优选的实施方案中,该分离的核酸分子编码集合B中列出的任何氨基酸序列。本发明优选的PTS蛋白同样优选地具有至少一种本文所描述的PTS活性。
集合A定义为下面的表1中描述的序列表的核酸序列以及相关位置的序列修饰。
集合B定义为下面的表1中描述的序列表的多肽序列以及相关位置的序列修饰。
在另一个实施方案中,分离的核酸分子长度至少为15个核苷酸并且在严紧条件下与含有集合A的核苷酸序列的核酸分子杂交。分离的核酸分子优选与天然存在的核酸分子对应。分离的核酸更优选编码天然存在的谷氨酸棒状杆菌PTS蛋白或其生物活性部分。
本发明的另一个方面涉及包含本发明核酸分子的载体(例如重组表达载体),还涉及已导入所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中,通过使用在合适的培养基中培养的宿主细胞制备了PTS蛋白。然后可从培养基或宿主细胞中分离该PTS蛋白。
本发明的另一个方面涉及已导入PTS基因的或其中PTS基因被修饰的经遗传修饰的微生物。在一个实施方案中,通过导入至少一种作为转基因的编码突变PTS序列的本发明核酸分子而修饰了所述微生物的基因组。在另一个实施方案中,通过用经修饰的PTS基因进行同源重组而修饰(例如功能性破坏)了所述微生物基因组中的内源性PTS基因。在一个优选的实施方案中,微生物属于棒状杆菌属或短杆菌(Brevibacterium)属,尤其优选谷氨酸棒状杆菌。在一个优选的实施方案中,该微生物也被用于制备目标化合物,如氨基酸、尤其是赖氨酸。
另一个优选的实施方案是具有多于一种的集合A中所描述核酸分子的宿主细胞。可用技术人员已知的多种方法制备这些宿主细胞。例如,可通过携带几种本发明核酸分子的载体转染这些细胞。然而,也可使用每次导入一种本发明核酸分子的载体从而同时或相继使用多种载体。从而可构建携带许多、高达数百的本发明核酸序列的宿主细胞。这种积累通常能够对宿主细胞精细化学品的生产率产生超加性效果。
本发明的另一方面涉及分离的PTS蛋白或其部分,例如其生物活性部分。在一个优选的实施方案中,分离的PTS蛋白或其部分可参与将高能碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)输入谷氨酸棒状杆菌,并且可参与谷氨酸棒状杆菌中的一个或多个胞内信号转导途径。在另一个优选的实施方案中,分离的PTS蛋白或其部分与集合B的氨基酸序列足够同源,由此该蛋白或其部分仍然能够参与将高能碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)输入谷氨酸棒状杆菌和/或参与谷氨酸棒状杆菌中的一个或多个胞内信号转导途径。
此外,本发明涉及分离的PTS蛋白制品。在优选的实施方案中,该PTS蛋白含有集合B的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中,本发明涉及分离的全长蛋白,其和集合B的全长氨基酸序列(其由集合A中的可读框编码)充分同源。
可以将PTS多肽或其生物活性部分与非PTS多肽功能性地连接以产生融合蛋白。在优选的实施方案中,该融合蛋白具有不同于单独的PTS蛋白的活性,在其它优选的实施方案中,该融合蛋白导致来自谷氨酸棒状杆菌的目标精细化学品产量增加、生产率提高和/或生产效率提高。在尤其优选的实施方案中,所述融合蛋白向宿主细胞的整合调节细胞对目的化合物的生产率。
本发明的另一个方面涉及制备精细化学品的制备方法。该方法涉及含有载体的细胞的培养,这导致本发明PTS核酸分子的表达而产生精细化学品。在一个优选的实施方案中,该方法还包括得到含有此类载体的细胞的步骤,所述细胞用载体转染导致PTS核酸表达。在另一个优选的实施方案中,所述方法还包括从培养物中得到精细化学品的步骤。在一个优选的实施方案中,该细胞属于棒状杆菌属或短杆菌属。
本发明的另一个方面涉及调节来自微生物的分子生产率的方法。这些方法包括将细胞与调节PTS蛋白活性或PTS核酸表达的物质接触,使得和没有所述物质存在时相比细胞相关的活性受到调节。在一个优选的实施方案中,细胞有关一种或多种糖的摄入受到调节,使得该微生物的目标精细化学品的产量或生产率提高。调节PTS蛋白活性的物质刺激例如PTS蛋白的活性或PTS核酸的表达。刺激PTS蛋白活性或PTS核酸表达的物质的例子包括小分子、活性PTS蛋白和编码PTS蛋白并已导入细胞的核酸分子。抑制PTS活性或PTS表达的物质的例子包括小分子和反义PTS核酸分子。
本发明的另一个方面涉及调节细胞的目的化合物产量的方法,该方法包括向细胞中导入PTS野生型基因或PTS突变基因,所述基因仍位于分立的质粒上或者整合到宿主细胞的基因组中。向基因组的整合可随机发生或者通过同源重组发生,由此天然基因被整合的拷贝所代替,导致细胞的目标化合物的生产率被调节。在一个优选的实施方案中,所述产量增加了。在另一个优选的实施方案中,化学品是精细化学品,其在一个特别优选的实施方案中是氨基酸。在一个特别优选的实施方案中,该氨基酸是L-赖氨酸。
发明详述
本发明提供了参与将高能碳分子(例如蔗糖、果糖或葡萄糖)摄入谷氨酸棒状杆菌并且也在所述微生物中参与胞内信号转导途径的PTS核酸和PTS蛋白分子。本发明的分子可用于调节微生物的精细化学品生产率。该调节可基于提高产生例如ATP、GTP和其它分子所需的高能分子的胞内水平,其中所述ATP、GTP和其它分子用于细胞内驱动能量逆差的生物化学反应例如精细化学品的生物合成。所述精细化学品生产率的调节也可基于这样的事实:许多糖类的降解产物作为其它生物合成途径包括特定精细化学品生物合成途径的中间体或前体。而且已知PTS蛋白参与对精细化学品的一种或多种代谢途径具调节活性的特定胞内信号转导途径,因此可通过操纵所述PTS蛋白活化精细化学品的生物合成途径或抑制精细化学品的降解途径。本发明的诸方面进一步阐述如下。
I.精细化学品
术语“精细化学品”为本领域所认知,其包括已用于多种工业的由生物体产生的分子,其中所述工业例如但不限于药学工业、农业工业和化妆品工业。此类化合物包括有机酸如酒石酸、衣康酸和二氨基庚二酸、蛋白原的和非蛋白原的氨基酸、嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸(如在Rehm等人编辑的生物技术(Biotechnology)第6卷中Kuninaka,A.(1996)核苷酸和相关化合物(Nucleotides and related compounds),561-612页,VCH:Weinheim及其中所含参考文献中所述)、脂类、饱和和不饱和脂肪酸(如花生四烯酸)、二醇(如丙二醇和丁二醇)、碳水化合物(如透明质酸和海藻糖)、芳香化合物(如芳香胺、香草醛和靛蓝)、维生素和辅因子(如在Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry),A27卷,“维生素”(“Vitamins”),443-613页(1996)VCH:Weinheim及其中的参考文献;以及Ong,A.S.,Niki,E.和Packer,L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病”论文集(“Nutrition,Lipids,Health,and Disease”Proceedings ofthe UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associationsin Malaysia,and the Society for Free Radical Research-Asia),1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行,AOCS Press,(1995))、酶以及在Gutcho(1983)通过发酵的化学品(Chemicals by Fermentation),Noyes DataCorporation,ISBN:0818805086和其中的参考文献中所述的所有其它化学品。这些精细化学品中的某些化学品的代谢和用途进一步阐述如下。
A.氨基酸代谢和用途
氨基酸包含所有蛋白质的基本结构单元,并且为所有生物体的正常细胞功能所必需。术语“氨基酸”为本领域所认知。蛋白原的氨基酸有20种,为蛋白质的结构单元,在蛋白质中它们通过肽键连接,非蛋白原的氨基酸(已知成百种非蛋白原的氨基酸)在蛋白质中通常不存在(参见Ulmann工业化学百科全书(Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopediaof Industrial Chemistry)),A2卷,57-97页,VCH:Weinheim(1985))。氨基酸可为D-或L-构型,尽管在天然存在的蛋白质中发现的唯一类型通常为L-氨基酸。已充分说明了20种蛋白原氨基酸中每一种在原核和真核细胞中的生物合成和降解途径(参见例如,Stryer,L.生物化学(Biochemistry),第三版,578-590页(1988))。“必需”氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸),这样称呼是因为由于它们生物合成的复杂性,必须从食物中摄取它们,它们被简单的生物合成途径转化为其余11种“非必需”氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)。高等动物能够合成这些氨基酸中的一部分氨基酸,但必需氨基酸必须从食物中摄取,以进行正常的蛋白质合成。
除了它们在蛋白质生物合成中的功能外,这些氨基酸本身还是令人感兴趣的化学品,并且许多已发现在食品、动物饲料、化学品、化妆品、农业和药学工业中具有多种应用。赖氨酸不仅对人的营养而且对单胃动物如禽和猪都是一种重要的氨基酸。谷氨酸盐是最常用的调味添加剂(谷氨酸单钠盐,MSG),并且广泛用于食品工业,天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸也是如此。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于药学工业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于药学工业和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是广泛使用的动物饲料添加剂。(Rehm等人(编辑),生物技术(Biotechnology),第6卷,第14a章中的Leuchtenberger,W.(1996)Amino aids-technicalproduction and use,466-502页,VCH:Weinheim)。还发现这些氨基酸可用作前体,用于合成合成的氨基酸和蛋白质,如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨以及在其他Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry),A2卷,57-97页,VCH:Weinheim,1985中所述的物质。
在可产生它们的生物体如细菌中已充分描述了这些天然氨基酸的生物合成(细菌氨基酸生物合成及其调节的综述,见Umbarger,H.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。谷氨酸通过还原胺化α-酮戊二酸(柠檬酸循环中的中间体)而合成。谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸接下来由谷氨酸产生。丝氨酸的生物合成为三步,由3-磷酸甘油(糖酵解中间体)开始,在氧化、氨基转移和水解步骤后产生该氨基酸。半胱氨酸和甘氨酸两者均产生自丝氨酸;在丝氨酸转羟甲基酶催化的反应中前者通过高半胱氨酸与丝氨酸缩合,后者通过侧链β-碳原子转移至四氢叶酸。苯丙氨酸和酪氨酸在9步的生物合成途径中合成自糖分解和磷酸戊糖途径的前体赤藓糖4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸,它们的不同仅在预苯酸合成后的最后两步。色氨酸也从这两种起始分子产生,但其合成为11步的途径。酪氨酸也可在苯丙氨酸羟化酶催化的反应中由苯丙氨酸合成。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸均为丙酮酸盐(糖酵解的终产物)的生物合成产物。天冬氨酸形成自草酰乙酸(柠檬酸循环的中间体)。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸均通过转化天冬氨酸而形成。异亮氨酸从苏氨酸形成。组氨酸在一个复杂的9步途径中从一种活化糖——5-磷酸核糖-1-焦磷酸形成。
为细胞蛋白质合成所需的过量氨基酸不能被贮藏,并被降解以提供用于细胞主要代谢途径的中间体(综述参见Stryer,L.生物化学(Biochemistry)第三版,21章,“氨基酸降解和尿素循环”495-516页(1988))。虽然细胞可将不想要的氨基酸转化为有用的代谢中间体,从所需用于合成氨基酸的能量、前体分子和酶来说,氨基酸的产生是昂贵的。因此对于氨基酸的生物合成受到反馈抑制调节并不让人吃惊,其中特定氨基酸的存在起到减缓或完全终止其自身产生的作用(关于氨基酸生物合成途径中的反馈机制的综述参见Stryer,L.生物化学(Biochemistry)第三版,24章:”氨基酸和血红素的生物合成”575-600页(1988))。因此,任一特定氨基酸的输出受到细胞中存在的该氨基酸量的限制。
B.维生素、辅因子和营养成分的代谢和用途
维生素、辅因子和营养成分包含高等动物不能合成且必须摄取的另一类分子,虽然它们易于被其它生物体如细菌合成。这些分子自身为生物活性物质或为在多种代谢途径中作为电子载体或中间体的生物活性物质的前体。除了它们的营养价值外,这些化合物作为着色剂、抗氧化剂和催化剂或其它操作辅助剂也具有重要的工业价值(这些化合物的结构、活性和工业应用的概述参见例如,Ullman工业化学百科全书(Ullman’s Encyclopediaof Industrial Chemistry),“维生素”A27卷,443-613页,VCH:Weinheim,1996)。术语”维生素”为本领域认知,包括生物体行使正常功能所需的营养素,且该生物体自身不能合成它们。维生素组和包含辅因子和营养性化合物。术语“辅因子”包括进行正常酶促活性所需的非蛋白原化合物。此类化合物可为有机的或无机的,本发明的辅因子优选有机的。术语“营养成分”包括促进植物和动物尤其是人的健康食物添加剂。此类分子的实例为维生素、抗氧化剂和某些脂类(如多不饱和脂肪酸)。
已大量描述了这些分子在可产生它们的生物体如细菌中的生物合成(Ullman工业化学百科全书(Ullman’s Encyclopedia of IndustrialChemistry),“维生素”A27卷,443-613页,VCH:Weinheim,1996;Michal,G.(1999)生物化学途径:生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology),John Wiley& Sons;Ong,A.S.,Niki,E.和Packer,L.(1995)UNESCO/马来西亚科学和技术协会和亚州自由基研究协会联盟举办的“营养、脂类、健康和疾病”论文集(“Nutrition,Lipids,Health,and Disease”Proceedings of theUNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations inMalaysia,and the Society for Free Radical Research-Asia),1994年9月1-3日在马来西亚槟榔屿举行,AOCS Press:Champaign,IL X,374S)。
硫胺素(维生素B1)由嘧啶和噻唑部分通过化学偶联产生。核黄素(维生素B2)由鸟苷-5’-三磷酸(GTP)和核糖-5’-磷酸合成。核黄素接下来用于合成黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。合起来称为‘维生素B6’的化合物类(例如,吡哆素、吡哆胺、5’-磷酸吡哆醛和商业上使用的维生素B6盐酸盐)均为共同结构单元5-羟基-6-甲基吡啶的衍生物。泛酸盐(泛酸(R)-(+)-N-(2,4-二羟基-3,3-二甲基-1-氧代丁基)-β-丙氨酸)可通过化学合成或发酵产生。泛酸生物合成的最后步骤由ATP-驱动的β-丙氨酸和泛解酸的缩合组成。负责转化为泛解酸、β-丙氨酸和泛酸缩合生物合成步骤的酶是已知的。泛酸盐的代谢活性形式为辅酶A,其生物合成由5步酶促步骤进行。泛酸盐、5’-磷酸吡哆醛、半胱氨酸和ATP为辅酶A的前体。这些酶不仅催化泛酸盐的形成,而且催化(R)-泛解酸、(R)-pantolacton、(R)-泛醇(维生素B5原)、泛酰巯基乙胺(及其衍生物)和辅酶A的产生。
已详细研究了微生物中生物素从前体分子庚二酰辅酶A的生物合成,并鉴定了几种所涉及的基因。发现许多相应的蛋白质也参与Fe-簇合成,属于nifS蛋白质类。硫辛酸衍生自辛酸,并在能量代谢中作为辅酶,此时其成为丙酮酸脱氢酶复合体和α-酮戊二酸脱氢酶复合体的一部分。叶酸盐为一组这样的物质,其均为叶酸衍生物,来自于L-谷氨酸、对氨基苯甲酸和6-甲基蝶呤。已详细研究了某些微生物中始于生物转化代谢中间体鸟苷-5’-三磷酸(GTP)、L-谷氨酸和对氨基苯甲酸的叶酸及其衍生物的生物合成。
类可啉(如钴胺素且尤其是维生素B12)和卟啉属于一组四吡咯环体系的化学品。维生素B12的生物合成太复杂,目前尚未彻底解释清楚,但许多涉及的酶和物质已知。烟酸(烟酸盐)和烟酰胺为吡啶衍生物,也称为‘烟酸’。烟酸为重要的辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和它们的还原形式的前体。
这些化合物的大规模产生很大程度上依赖于无细胞的化学合成,虽然这些化学品中的一些如核黄素、维生素B6、泛酸盐和生物素也已通过微生物的大规模培养物产生。只有维生素B12是仅通过发酵产生的,因为其合成的复杂性。体外方法需要耗费材料和时间,通常以高的代价耗费。
C.嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸的代谢和用途
嘌呤和嘧啶代谢基因及它们相应的蛋白质为治疗肿瘤和病毒感染的重要靶标。术语“嘌呤”或“嘧啶”包括构成核酸、辅酶和核苷酸的含氮碱基。术语“核苷酸”包括核酸分子的基本结构单元,其由含氮碱基、戊糖(对RNA而言,该糖为核糖,对DNA而言,该糖为D-脱氧核糖)和磷酸组成。术语“核苷”包括作为核苷酸前体的分子,但其不含核苷酸所具有的磷酸单元。通过抑制这些分子的生物合成,或抑制它们形成核酸分子的代谢,可抑制RNA和DNA合成;通过以靶向癌细胞的方式抑制这种活性,可抑制肿瘤细胞分裂和复制的能力。
此外,有不形成核酸分子但作为能量贮存体(即AMP)或作为辅酶(即FAD和NAD)的核苷酸。
一些出版物已描述了这些化学品通过影响嘌呤和/或嘧啶代谢对这些医学适应症的用途(例如Christopherson,R.I.和Lyons,S.D.(1990)“作为化学治疗剂的嘧啶和嘌呤从头生物合成的强力抑制剂”医学研究述评(Med.Res.Reviews)10:505-548)。对参与嘌呤和嘧啶代谢的酶的研究集中在研发可用作如免疫抑制剂或抗增生剂的新药上(Smith,J.L.,(1995)“核苷酸合成中的酶”结构生物学最新观点(Curr.Opin.Struct.Biol.)5:752-757;(1995)Biochem Soc.Transact.23:877-902)。但是,嘌呤和嘧啶碱基、核苷和核苷酸具有其它应用:用作一些精细化学品(例如,硫胺素、S-腺苷-甲硫氨酸、叶酸盐或核黄素)生物合成的中间体,作为细胞的能量载体(例如,ATP或GTP),和本身作为化学品,通常作为增味剂(例如,IMP或GMP)或用于一些医药用途(参见例如,Kuninaka,A.(1996)生物技术中的核苷酸和相关化合物(Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology)第6卷,Rehm等人编辑.VCH:Weinheim,561-612页)。同样,参与嘌呤、嘧啶、核苷或核苷酸代谢的酶越来越多地用作靶,研发用于作物保护的抗这些酶的化学品包括杀真菌剂、除草剂和杀虫剂。
已阐释了这些化合物在细菌中的代谢(综述参见例如,核酸研究和分子生物学进展(Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology),第42卷,Academic Press中的Zalkin,H.和Dixon,J.E.(1992)“嘌呤核苷酸的从头生物合成”,259-287页;和生物化学途径:生物化学和分子生物学图集(Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology),Wiley:纽约一书中的Michal,G.(1999)“核苷酸和核苷”,第8章)。嘌呤代谢已是深入研究的主题,其对细胞的正常功能是必需的。高等动物中受损的嘌呤代谢可引起严重疾病,如痛风。嘌呤核苷酸从核糖-5-磷酸开始,经过一系列步骤,通过中间体化合物次黄苷-5’-磷酸(IMP),产生鸟苷-5’-单磷酸(GMP)或腺苷-5’-单磷酸(AMP),由此易于形成用作核苷酸的三磷酸形式。这些化合物也用作能量贮存体,这样它们的降解可提供细胞内用于许多不同生物化学过程的能量。嘧啶的生物合成由核糖-5-磷酸形成尿苷-5’-单磷酸(UMP)而进行。UMP接下来转化为胞苷-5’-三磷酸(CTP)。所有这些核苷酸的脱氧形式通过一步还原步骤从核苷酸的二磷酸核糖形式产生为核苷酸的二磷酸脱氧核糖形式。通过磷酸化后,这些分子可参与DNA合成。
D.海藻糖的代谢和用途
海藻糖由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1连接组成。它通常作为甜味剂用于食品工业,为干的或冷冻食品和饮料中的添加剂。但它也用于药学、化妆品和生物技术工业(参见例如,Nishimoto等人(1998)美国专利号5,759,610;Singer,M.A.和Lindquist,S.生物技术趋势(Trends Biotech.)16(1998):460-467;Paiva,C.L.A.和Panek,A.D.Biotech.Ann.Rev.2(1996):293-314;和Shiosaka,M.J.Japan 172:(1997)97-102)。海藻糖通过酶从许多微生物产生,并天然释放入环境介质中,从中可用本领域公知的方法收集海藻糖。
II.烯醇丙酮酸磷酸:糖磷酸转移酶系统
培养中细胞的快速生长和分裂能力在高程度上取决于细胞可摄入和利用高能分子如葡萄糖和其他糖类的程度。存在不同的转运蛋白,用于将不同的碳源转运入细胞,例如用于糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或棉子糖的转运蛋白,以及用于淀粉或纤维素降解产物的转运蛋白。其他转运系统用于输入醇类(如甲醇或乙醇)、烃类、脂肪酸和有机酸如醋酸或乳酸。在细菌中,可采用多种机制将糖类通过细胞膜转运入细胞。除了糖质子同向转运外,细菌的烯醇丙酮酸磷酸:糖磷酸转移酶系统(PTS)是摄入糖的最常用方法之一。该系统不仅催化糖和己糖醇的转运(伴随着磷酸化作用),也调节与糖利用相关的细胞代谢。这些PTS系统在细菌中是广泛存在的,但没有发现存在于古细菌或真核生物中。PTS系统功能上包含两种胞浆蛋白即酶I和HPr并包含变数的特定糖整合膜和外周膜转运复合体(在每种情况下标示为带特定糖上标的“酶II”。例如酶IIGlu为结合葡萄糖的酶II复合体)。已知单糖、二糖或寡糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖或棉子糖及等特异的酶II。酶I将磷酰基从烯醇丙酮酸磷酸(PEP)转移至磷酰基载体蛋白HPr。然后HPr将磷酰基转移至多种酶II转运复合体。虽然在所有细菌中酶I和HPr的氨基酸序列很相似,但PTS转运蛋白的序列可分成结构上不相关的家族。这些基因之间的数目和同源性在细菌间是不同的。大肠杆菌(E.coli)基因组编码38种不同的PTS蛋白,其中的33种为属于22种不同转运蛋白的亚单位。生殖支原体(M.genitalium)基因组包含1个酶I的基因和1个HPr的基因以及2个PTS转运蛋白基因。T.palladium和沙眼衣原体(C.trachomatis)的基因组包含酶I样蛋白和HPr样蛋白的基因但无PTS转运蛋白的基因。
所有PTS转运蛋白由三个功能单位IIA、IIB和IIC组成,它们作为复合体中的亚单位存在(如IIAGlcIICBGlc)或作为单链多肽的结构域存在(如IICBAGlcNAc)。IIA和IIB连续地将磷酰基从HPr转移至被转运的糖。IIC包含糖结合位点并跨内膜6或8次。糖转运与IIB结构域的瞬时磷酸化相偶联,酶I、HPr和IIA在组氨酸残基处磷酸化,而IIB亚单位在半胱氨酸或组氨酸残基处磷酸化,这取决于所参与的转运蛋白。被输入糖的磷酸化作用具有的好处是它阻断了所述糖通过细胞膜向胞外基质的回扩散,因为带电荷的磷酸根不易于通过膜的疏水核。
除了在糖类主动转运中的作用外,一些PTS蛋白还在胞内信号转导中起作用。这些亚单位变构调节或通过磷酸化作用调节其靶标。它们的调节活性随着它们磷酸化程度(即非磷酸化形式与磷酸化形式的比)的不同而变化,这接下来随着糖依赖性的去磷酸化作用和烯醇丙酮酸磷酸依赖性的再磷酸化作用之比的不同而变化。在大肠杆菌中通过PTS蛋白进行此类胞内调节的实例包括去磷酸化的IIAGlc抑制甘油激酶和该蛋白的磷酸化形式活化腺苷酸环化酶。在这些微生物中一些转运蛋白的HPr和IIB结构域通过转录的抗终止子的可逆磷酸化作用调节基因表达。在革兰氏阳性菌中,HPr的活性受HPr-特异的丝氨酸激酶和磷酸酶调节。例如在丝氨酸46位磷酸化的HPr为转录阻抑蛋白CcpA的共同阻抑蛋白。最后发现未磷酸化的酶I抑制细菌趋化机制的感应激酶CheA,这在糖结合以及细菌转运系统和那些引起细菌运动的系统间建立了直接的联系(Sonenshein,A.L.等人编辑,Bacillus subtilis und andere grampositive Bakterien.ASM:Washington,DC;Neidhard,F.C.等人编辑(1996),Escherichia coli und Salmonella.ASM Press Washington,DC;Lengeler等人(1999),原核生物生物学,第II部分,68-87页,Thieme-Verlag,Stuttgart).
III.本发明的组成要件和方法
本发明至少部分是基于本文中称作PTS核酸和PTS蛋白分子的新分子的检测,这些分子参与将高能碳分子(例如葡萄糖、果糖或蔗糖)摄入谷氨酸棒状杆菌,并且也参与这些微生物中的一个或多个胞内信号转导途径。在一个实施方案中,PTS分子将高能碳分子输入所述细胞,其中高能分子降解所产生的能量用于驱动能量上较不利的生物化学反应。它们的降解产物可用作许多其他代谢途径的中间体或前体。在另一实施方案中,PTS分子可参与一个或多个胞内信号转导途径,且PTS分子经修饰形式(如磷酸化PTS蛋白)的存在可参与信号转导级联,调节一个或多个细胞进程。在一个优选的实施方案中,本发明PTS分子的活性影响所述生物体目标精细化学品的生产率。在一个尤其优选的实施方案中,本发明的PTS分子具有经修饰的活性,由此谷氨酸棒状杆菌中一种或多种精细化学品的产量、生产率或生产效率同样被调节。
术语“PTS蛋白”或“PTS多肽”包含参与从胞外基质将一种或多种高能碳化合物(如单糖、二糖或寡糖,诸如果糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、棉子糖、半乳糖、核糖、乳糖、麦芽糖和核酮糖)摄入细胞内部的蛋白。这些PTS蛋白也可参与一个或多个胞内信号转导途径,例如但不限于导致多种糖摄入细胞的胞内信号转导途径。PTS蛋白的例子包括表1和集合A中所列出的PTS基因编码的那些蛋白。涉及PTS系统的概述性参考文献见Strver,L.(1988),生物化学(Biochemistry),第37章:“膜转运”,W.H.Freeman:New York,959-961页;Darnell,J.等人(1990),分子细胞生物学(MolecularCell Biology),Scientific American Books;New York,552-553页和Michal,G.编辑(1999),生物化学途径:生物化学和分子生物学图集(BiochemicalPathways:An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology),第15章“专门的细菌代谢(Special Bacterial Metabolism)”。术语“PTS基因”和“PTS核酸序列”包括编码PTS蛋白的核酸序列,其含有一个编码区和相应的非翻译5′和3′序列区。PTS基因的例子在表1中列出。术语“生产率”为本领域已知并且包括发酵产物的浓度(例如在预定的时间段和预定的发酵体积产生的目标精细化学品(例如kg产物/h/l))的浓度。术语“生产效率”包括得到特定产物量所需时间(例如,细胞达到精细化学品的特定生产率所需时间)。术语“产量”或“产物/碳产量”为本领域已知并且包括将碳源转化成产物(即精细化学品)的效率。这例如通常表达为kg产物/kg碳源。增加化合物的产量或生产率为在预定期间内及特定的培养体积中增加了所得分子的量或该化合物适宜得到的分子的量。术语“生物合成”和“生物合成途径”为本领域已知并且包括细胞在例如多步过程或高度调节的过程中从中间物合成化合物,优选有机化合物。术语“降解”和“降解途径”为本领域已知并且包括细胞在例如多步过程或高度调节的过程中将化合物,优选有机化合物裂解成降解产物(用更通俗的术语:更小或更简单的分子)。术语“代谢”为本领域已知并且包括生物体中发生的全部生物化学反应。特定化合物的代谢(例如氨基酸如甘氨酸的代谢)因此包括细胞中该化合物的所有生物合成、修饰和降解途径。术语“转运”或“输入”为本领域已知并且包括促进一种或多种分子通过细胞膜的运动,否则其中所述细胞膜不能被所述分子穿过。
在另一个实施方案中,微生物如谷氨酸棒状杆菌中本发明的PTS分子能够调节目标分子例如精细化学品的生产率。借助于基因重组技术,可操作一种或多种本发明的PTS蛋白使得它们的功能被调节。可以例如修饰参与PTS-介导的葡萄糖输入的蛋白,使之具有最佳活性,这样用于输入葡萄糖的PTS系统可转运较大量的葡萄糖入细胞。葡萄糖分子不仅可用作驱动能量逆差的生物化学反应如精细化学品生物合成的能源,而且在精细化学品的许多生物合成途径中用作前体和中间体(例如丝氨酸是自3-磷酸甘油酸合成的)。在任何情况下,通过增加目标精细化学品产生可获得的能量或通过增加目标精细化学品产生可获得的化合物,可以增加任何所述目标精细化学品的总产量或生产率。
而且,已知许多PTS蛋白在通过维持碳源的可获得性而调节细胞代谢和糖摄入的胞内信号转导途径中起重要作用。例如已知增加果糖1,6-二磷酸(在糖酵解中产生的一种化合物)的胞内水平导致HPr丝氨酸残基的磷酸化作用,这阻止了该蛋白在PTS糖转运过程中作为磷酰基供体,从而阻止进一步的糖摄入。如果诱变HPr,使所述丝氨酸残基不能被磷酸化,这样可组成型活化HPr并因此增加糖的细胞内转运,接下来确保了较多的胞内能量贮存和一种或多种目标精细化学品生物合成的中间体/前体。
制备本发明核酸序列的一个适宜的起点是谷氨酸棒状杆菌菌株的基因组,可以从美国典型培养物保藏中心得到该菌株(名称是ATCC13032)。
用常规方法,通过表1所示的修饰可以从这些核酸序列制备本发明的核酸序列。
本发明的PTS蛋白或其生物学活性部分或片段可参与将高能含碳分子如葡萄糖转运入谷氨酸棒状杆菌或在所述微生物中参与胞内信号转导或可以具有表1列出的一种或多种活性。
下面的分段详细描述本发明的各方面:
A.分离的核酸分子
本发明的一个方面涉及编码PTS多肽或其生物活性部分的分离核酸分子及核酸分子片段,其中所述核酸分子片段足以用作杂交探针或引物,用来鉴定或扩增编码PTS的核酸(例如PTS DNA)。如此处所用,术语“核酸分子”是指包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)和用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该术语也包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译区:基因编码区5’端上游的至少约100个核苷酸序列和基因编码区3’端下游的至少约20个核苷酸序列。核酸分子可为单链或双链,但优选地为双链DNA。“分离的”核酸分子为从其它核酸分子分离的核酸分子,其存在于核酸的天然源中。优选地,“分离的”核酸不具有该核酸所来自的生物体基因组DNA中天然存在于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸5’和3’端的序列)。例如,在不同实施方案中,该分离的PTS核酸分子可包含少于约5kb,4kb,3kb,2kb,1kb,0.5kb或0.1kb的该核酸所来自的细胞(如谷氨酸棒状杆菌细胞)基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。而且,“分离的”核酸分子如cDNA分子当通过重组技术产生时可基本上不含有其它细胞物质或培养基,当通过化学合成产生时,可基本上不含有化学前体或其它化学品。
本发明的核酸分子,如具有的核苷酸序列为集合A的核酸分子或其部分可用标准的分子生物学技术和本文提供的序列信息制备。例如,使用集合A全部或部分序列作为杂交探针和标准的杂交技术(例如,如在Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual).第二版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989中所述),可自谷氨酸棒状杆菌文库分离谷氨酸棒状杆菌PTS cDNA。而且,包含集合A的全部序列或其部分的核酸分子可使用根据该序列设计的寡核苷酸引物,应用聚合酶链反应分离(例如,包含集合A的全部或部分序列的核酸分子可使用根据该同样序列设计的寡核苷酸引物,应用聚合酶链反应分离)。例如,可从正常的内皮细胞分离mRNA(例如,通过Chirgwin等人(1979)生物化学(Biochemistry)18:5294-5299的硫氰酸胍提取法)以及用反转录酶(例如,莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶,可从Gibco/BRL,Bethesda,MD获得;或AMV反转录酶,可从Seikagaku America,Inc.,St.Petersburg,FL获得)可制备cDNA。用于聚合酶链反应扩增的合成寡核苷酸引物可根据集合A所示的核苷酸序列之一设计。本发明的核酸可用cDNA或另外用基因组DNA作为模板、使用合适的寡核苷酸引物按照标准的PCR扩增技术来扩增。这样扩增的核酸可克隆入合适的载体并通过DNA序列分析鉴定。对应于PTS核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术制备,例如用DNA自动合成仪制备。
在一个优选的实施方案中,本发明的分离核酸分子包含集合A中所示的核苷酸序列之一。
在另一个优选的实施方案中,本发明的分离的核酸分子含有与任一集合A中所示核苷酸序列或其部分互补的核酸分子,所述核酸分子与集合A中所示任一核苷酸序列足够互补使其与集合A中所示任一序列杂交而得到稳定双链体。
在一个实施方案中,本发明的核酸分子编码这样的蛋白质或其部分,其包括的氨基酸序列充分同源于集合B的一个氨基酸序列,以至于该蛋白质或其部分仍然能够参与将高能含碳分子(如葡萄糖)转运入谷氨酸棒状杆菌并且也参与一个或多个胞内信号转导途径。此处所用术语“充分同源”是指蛋白质或其部分所具有的氨基酸序列具有最小数的与集合B氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基(例如,氨基酸残基具有与集合B中序列之一的氨基酸残基相似的侧链),以至于该蛋白质或其部分能够将高能含碳分子如葡萄糖转运入谷氨酸棒状杆菌,并且能够在所述微生物中参与胞内信号转导。此类代谢途径中的蛋白质成员如此处所述,可将高能含碳分子如葡萄糖转运入谷氨酸棒状杆菌,并且也在所述微生物中参与胞内信号转导。此类活性的实例也在此进行了描述。因此,“PTS蛋白的功能”涉及基于烯醇丙酮酸磷酸的全部功能和/或调节一种或多种糖转运途径。PTS蛋白活性的实例在表1中给出。
本发明PTS核酸分子编码的蛋白部分优选地是任何PTS蛋白的具生物学活性的部分。文中所用术语“PTS蛋白的生物学活性部分”包含PTS蛋白的一部分,例如结构域或基序,其能够将高能含碳分子如葡萄糖转运入谷氨酸棒状杆菌或在所述微生物中参与胞内信号转导或者具有表1中所示活性。为了确定PTS蛋白或者其生物学活性部分能否参与将高能含碳分子如葡萄糖转运入谷氨酸棒状杆菌或在所述微生物中参与胞内信号转导,可以进行酶活性分析。这些分析方法在实施例部分的实施例8中详细描述,技术人员熟知这些方法。
除了群体中存在的PTS序列的天然变体外,技术人员还理解可通过突变向集合A的核苷酸序列中导入变化,由此导致所编码的PTS蛋白的氨基酸序列改变,但PTS蛋白的功能不变。例如,可在集合A的核苷酸序列中进行在“非必需”氨基酸残基处导致氨基酸替换的核苷酸替换。可以修饰任一PTS蛋白(集合B)的野生型序列中的“非必需”氨基酸残基而不改变所述PTS蛋白的活性,但“必需”氨基酸残基为PTS蛋白活性所需。然而,其它氨基酸残基(例如,在具有PTS活性的结构域中不保守或仅为半保守的那些氨基酸残基)对活性可为非必需的,并因此可被改变,而此类氨基酸残基的改变不改变PTS活性。
编码同源于集合B的蛋白质序列的PTS蛋白的分离核酸分子可通过将一个或多个核苷酸替换、添加或删除导入集合A的核苷酸序列而产生,这样将一个或多个氨基酸的替换、添加或删除导入所编码的蛋白质。可通过标准技术将突变导入集合A的核苷酸序列之一,如定点诱变和PCR-介导的诱变。优选地,在一处或多处预测的非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”为将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基类已在本领域定义过。这些分类包括具有碱性侧链的氨基酸(例如,赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如,天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如,甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如,苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如,酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此,在PTS蛋白中预测的非必需氨基酸残基优选地用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换。在另一实施方案中,可如通过饱和诱变沿着全部或部分PTS编码序列随机导入突变,并对所得突变体筛选文中所述的PTS活性,以鉴定保留PTS活性的突变体。对任一集合A的序列诱变后,可重组表达编码蛋白,并用例如文中所述的试验(参见实施例部分的实施例8)确定所述蛋白质的活性。
B.重组表达载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及包含编码PTS蛋白(或其部分)的核酸或包含基因组合且其中至少一种基因编码PTS蛋白的载体,优选表达载体。如此处所用,术语“载体”是指这样的核酸分子,其可转运与其连接的另一核酸。一种类型的载体为“质粒”,是指其中可连接额外DNA片段的环状双链DNA环。另一种类型的载体为病毒载体,其中可将额外DNA片段连接入病毒基因组。某些载体可在它们所导入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如,非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组,并因此随着宿主基因组而复制。而且,某些载体可指导与它们操作性连接的基因的表达。此类载体此处称为“表达载体”。一般,用于重组DNA技术中的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中,“质粒”和“载体”可互换使用,因为质粒是最经常使用的载体形式。但是,本发明旨在包括其它形式的表达载体,如病毒载体(例如,复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒),它们起到类似的作用。
本发明的重组表达载体以适于在宿主细胞中表达核酸的形式包含本发明的核酸,这就是说重组表达载体包括一个或多个调节序列,其选择是基于用作表达的宿主细胞进行的,它们可操作地与待表达的核酸序列连接。在重组表达载体中,术语“功能地连接”是指目的核苷酸序列与调节序列以允许该核苷酸序列表达(例如,在体外转录/翻译系统中,或当载体导入宿主细胞时在宿主细胞中表达)的方式连接。术语“调节序列”是指包括启动子、增强子和其它表达调控元件(例如,多聚腺苷酸化信号)。此类调节序列如在Goeddel;基因表达技术:酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。调节序列包括在许多类型宿主细胞中控制核苷酸序列组成型表达的调节序列和仅在某些宿主细胞中控制核苷酸序列直接表达的调节序列。本领域普通技术人员了解到表达载体的设计可取决于如对欲转化宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达程度等因素。本发明的表达载体可导入宿主细胞,以产生由此处所述核酸所编码的蛋白质或肽,包括融合蛋白或融合肽(例如,PTS蛋白、PTS蛋白的突变形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达PTS蛋白。例如,PTS基因可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞和其它真菌细胞(参见Romanos,M.A.等人(1992)“在酵母中外源基因的表达:综述”(“Foreign gene Expression in yeast:areview”),酵母(Yeast)8:423-488;J.W.Bennet & L.L.Lasure编辑的更多的用于真菌的基因操作(More Gene Manipulations in Fungi),AcademicPress:San Diego一书中的van den Hondel,C.A.M.J.J.等人(1991)“丝状真菌中的异源基因表达”(“Heterologous gene Expression in filamentousfungi”),396-428页;以及Peberdy,J.F.等人编辑的真菌的应用分子遗传学(Applied Molecular Genetics of Fungi),Cambridge University Press:Cambridge一书中的van den Hondel,C.A.M.J.J.和Punt,P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”(“Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi),1-28页)、藻类和单细胞植物细胞(参见Schmidt,R.和Willmitzer,L.(1988)根瘤农杆菌介导的在鼠耳芥叶和子叶外植体中的高效转化,植物细胞报道(Plant Cell Rep.):583-586)、或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel,基因表达技术:酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,AcademicPress,San Diego,CA(1990)中进一步进行了讨论。另外,可体外转录并翻译重组表达载体,如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在原核生物中蛋白质的表达主要用含有组成型或诱导型启动子的载体进行,控制融合或非融合蛋白的表达。融合载体将一些氨基酸添加至其中编码的蛋白质上,通常添加至重组蛋白的氨基末端。此类融合载体一般具有三个任务:1)用于增强重组蛋白的表达;2)用于增加重组蛋白的溶解性;和3)在亲和层析中作为配体而利于重组蛋白的纯化。通常,于融合部分和重组蛋白的连接处导入蛋白酶剪切位点到融合表达载体中,这使得在该融合蛋白纯化后,可将重组蛋白从融合单元分离。这些酶和它们的对应识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
通常的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc;Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)基因(Gene)67:31-40)、pMAL(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ),它们分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A结合至重组靶蛋白。在一个实施方案中,将PTS蛋白的编码序列克隆入pGEX表达载体,以产生编码融合蛋白的载体,其从N-末端至C-末端包含GST-凝血酶切割位点-X蛋白。该融合蛋白使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂通过亲和层析纯化。通过将该融合蛋白用凝血酶切割可得到不与GST融合的重组PTS蛋白。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人(1988)基因(Gene)69:301-315)和pET11d(Studier等人,基因表达技术:酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,Academic Press,San Diego,California(1990)60-89)。pTrc载体中目标基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合的trp-lac融合启动子的转录。pET11d载体中目标基因的表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的从T7-gn10-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)中居住的、具有位于lacUV5启动子转录调控下的T7gn1基因的λ前噬菌体提供。
最大化重组蛋白表达的一个策略是将该蛋白质在具有对所述重组蛋白进行蛋白酶切割的能力缺损的宿主细菌中表达(Gottesman,S.,基因表达技术:酶学方法(Gene Expression Technology:Methods in Enzymology)185,Academic Press,San Diego,California(1990)119-128)。另一策略是改变欲插入表达载体的核酸的核酸序列,以使用于每一氨基酸的单个密码子为选择用于表达的细菌如谷氨酸棒状杆菌所优选使用的密码子(Wada等人(1992)核酸研究(Nucleic Acids Res.)20:2111-2118)。本发明核酸序列的此改变可应用标准的DNA合成技术实施。
在另一实施方案中,PTS蛋白表达载体为酵母表达载体。用于在酿酒酵母中表达的载体包括pYepSec1(Baldari,等人(1987)Embo J.6:229-234),pMFa(Kurjan和Herskowitz,(1982)细胞(Cell)30:933-943),pJRY88(Schultz等人(1987)基因(Gene)54:113-123),和pYES2(InvitrogenCorporation,San Diego,CA)。适用于其它真菌如丝状真菌的载体和用于构建载体的方法包括在:J.F.Peberdy等人编辑的真菌的应用分子遗传学(Applied Molecular Genetics of Fungi),Cambridge University Press:Cambridge一书中的van den Hondel,C.A.M.J.J.和Punt,P.J.(1991)“丝状真菌的基因转移体系和载体开发”(Gene transfer systems and vectordevelopment for filamentous fungi),1-28页中详述的那些。
另外,本发明的PTS蛋白可使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)病毒学(Virology)170:31-39)。
在另一实施方案中,本发明的PTS蛋白可在单细胞植物细胞(如藻类)或在来自高等植物(如种子植物,诸如作物)的植物细胞中表达。植物表达载体的实例包括在:Becker,D.,Kemper,E.,Schell,J.和Masterson,R.(1992)“具有靠近左边界的选择性标记的新植物双元载体(New plantbinary vectors with selectable markers located proximal to the left border),植物分子生物学(Plant Mol.Biol.)20:1195-1197;和Bevan,M.W.(1984)“用于植物转化的双元农杆菌载体”(Binary Agrobacterium vectors forplant transformation),核酸研究(Nucl.Acid.Res.)12:8711-8721中详述的那些。
在另一实施方案中,本发明的核酸用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed,B.(1987)自然(Nature)329:840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6:187-195)。当用于哺乳动物细胞时,表达载体的调控功能通常由病毒调控元件提供。例如,常用的启动子来自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。用于原核和真核细胞的其它合适表达系统参见Sambrook,J.,Fritsh,E.F.和Maniatis,T.分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual),第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中的第16和17章。
在另一实施方案中,重组哺乳动物表达载体可优选地在特定细胞类型中指导核酸的表达(例如,使用组织-特异性调控元件来表达核酸)。组织-特异性调控元件为本领域公知。合适的组织-特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝-特异性;Pinkert等人(1987)基因进展(Genes Dev.)1:268-277)、淋巴-特异性启动子(Calame and Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275),特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人(1983)细胞(Cell)33:729-740;Queen和Baltimore(1983)细胞(Cell)33:741-748)、神经元-特异性启动子(例如,神经丝启动子;Byrne和Ruddle(1989)PNAS86:5473-5477)、胰-特异性启动子(Edlund等人(1985)科学(Science)230:912-916)、以及乳腺-特异性启动子(例如,奶乳清启动子;美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。也同样包括调节发育的启动子,如鼠hox启动子(Kessel和Gruss(1990)科学(Science)249:374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)基因进展(Genes Dev.)3:537-546)。
本发明还提供了含本发明的DNA分子的重组表达载体,其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是,DNA分子功能性地连接到调控序列上,该连接方式使得可以表达产生与PTS mRNA反义的RNA分子(通过转录该DNA分子)。可以对功能性地连接反义方向克隆的核酸的调控序列进行选择以控制反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达,例如,可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以控制反义RNA实现组成型组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒,其中在高效调控区域的控制下产生反义核酸,其活性由载体所导入细胞的类型决定。反义基因的基因表达调控的讨论见Weintraub,H.等人,反义RNA作为遗传分析的分子工具,Reviews-Trendsin Genetics,卷1(1)1986。
本发明的另一方面涉及已导入本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。当然,该术语不仅指特定的受试细胞,也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境因素在传代过程中可发生某些改变,这样,后代实际上可能并非与亲代细胞相同,但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为任意的原核或真核细胞。例如,PTS蛋白可在细菌细胞如谷氨酸棒状杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为技术人员公知。与谷氨酸棒状杆菌有关的、可常规用作本发明核酸和蛋白质分子的宿主细胞的微生物如表3所示。
载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用,术语“转化”和“转染”意指本领域内公知的各种将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的技术,包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染、电穿孔。转化或转染宿主细胞的合适方法可在Sambrook等人(分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual).第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989)和其它的实验室手册中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染,已知根据所用的表达载体和所用的转染技术,仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞以鉴定和筛选整合体。优选的选择标记包括那些可赋予药物抗性的基因,所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码PTS蛋白质的基因位于同一载体上被导入宿主细胞或可以位于不同的载体上导入。经导入核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如,掺入了选择标志基因的细胞将存活,而其他细胞死亡)。
通过制备出含至少部分PTS基因的载体,所述部分PTS基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变PTS基因(如功能性破坏)来生成同源重组微生物。优选地该PTS基因为谷氨酸棒状杆菌PTS基因,但也可为来自相关细菌或甚至来自哺乳动物、酵母或昆虫的同系物。在一个优选的实施方案中,载体设计为在同源重组后可功能性破坏内源PTS基因(即,不再编码功能蛋白质;也称为“敲除”载体)。另外,载体可设计为在同源重组后内源PTS基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如,可改变上游调控区域由此改变内源PTS蛋白的表达)。在此同源重组载体中,改变的PTS基因部分在其5′和3′端侧翼为PTS基因的其它核酸,从而允许在载体携带的外源PTS基因和微生物中的内源PTS基因之间发生同源重组。此其它的两翼PTS核酸的长度应足以使与内源基因的重组成功进行。通常,载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(参见例如,Thomas,K.R.,和Capecchi,M.R.(1987)细胞(Cell)51:503中对同源重组载体的描述)。使用本领域公知的方法,将该载体导入微生物(例如,通过电穿孔)和细胞,筛选其中导入的PTS基因已与内源PTS基因同源重组的微生物和细胞。
在另一实施方案中,产生的重组微生物可含有可调控导入基因表达的所选系统。例如,将在载体中包含的PTS基因插入乳糖操纵子的控制下,使得PTS基因仅在存在IPTG时表达。此类调控系统为本领域熟知。
本发明的宿主细胞如培养的原核或真核宿主细胞可用于产生(即表达)PTS蛋白。因此,本发明还提供了使用本发明的宿主细胞来产生PTS蛋白的方法。在一个实施方案中,该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中已导入了编码PTS蛋白的重组表达载体,或其中基因组已导入了编码野生型或改变的PTS蛋白的基因),直至产生PTS蛋白。在另一实施方案中,该方法还包括从培养基或宿主细胞分离PTS蛋白。
C.本发明的用途和方法
文中所述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物、融合蛋白、引物、载体和宿主细胞可用于一种或多种下述方法中:鉴定谷氨酸棒状杆菌及相关生物体;绘制与谷氨酸棒状杆菌相关的生物体的基因组图谱;鉴定并定位目标谷氨酸棒状杆菌序列;进化研究;确定为PTS蛋白所需的功能区域;调节PTS蛋白活性;调节PTS途径的活性;以及调节目标化合物如精细化学品的细胞生产率。本发明的PTS核酸分子具有多种用途。首先,它们可用于鉴定生物体为谷氨酸棒状杆菌或其近亲。它们也可用于在混合的微生物群体中鉴定谷氨酸棒状杆菌或其相关菌的存在。本发明提供了许多谷氨酸棒状杆菌基因的核酸序列。通过将微生物单一群体或混合群体的培养物提取的基因组DNA在严格条件下与包含对谷氨酸棒状杆菌独特的谷氨酸棒状杆菌基因区域的探针杂交,可确定该生物体是否存在。虽然谷氨酸棒状杆菌自身为非致病的,但它与致病种如白喉棒状杆菌有亲缘关系。这种生物体的检测具有显著的临床重要性。
本发明的核酸和蛋白质分子也可用作基因组特异性区域的标记。它不仅可用于基因组图谱,也可用于谷氨酸棒状杆菌蛋白质的功能研究。例如,可切割谷氨酸棒状杆菌基因组,并将片段与DNA-结合蛋白孵育来确定与特定的谷氨酸棒状杆菌DNA-结合蛋白结合的基因组区域。另外,那些结合蛋白的片段可用本发明的核酸分子探测,优选地用具有易于检测的标记物的核酸分子探测;此核酸分子与基因组片段的结合可将片段定位于谷氨酸棒状杆菌的基因组图谱中,并且当用不同的酶进行多次时,利于快速确定蛋白质结合的核酸序列。而且,本发明的核酸分子可充分同源于亲缘种的序列,这样这些核酸分子可用作在亲缘菌如乳糖发酵短杆菌中构建基因组图谱的标记。
本发明的PTS核酸分子也用于进化研究和蛋白质结构研究。许多细菌利用本发明分子参与的糖代谢体系;通过将本发明核酸分子的序列与那些来自其它生物体的编码类似酶的序列比较,可评估所述生物体的进化关系。所以,此比较使得可评估哪些区域保守和哪些区域不保守,这有利于确定那些对酶功能所必需的蛋白质区域。这种确定对蛋白质工程研究有价值,并可指出该蛋白质可耐受何种诱变且不丢失其功能。
本发明PTS核酸分子的操作可导致产生与野生型PTS蛋白功能不同的PTS蛋白。这些蛋白质可在功效或活性上提高,在细胞内可以较通常多的量存在,或可在功效或活性上降低。
可修饰本发明的PTS分子,从而使一种或多种精细化学品的产量、生产率和/或生产效率提高。通过修饰参与葡萄糖摄入的PTS蛋白,使其具有最佳活性,可增加葡萄糖摄入的程度和提高葡萄糖转运入细胞的速率。细胞内葡萄糖和其他糖的降解提供了能量,所述能量可用于驱动能量逆差的生物化学反应,例如那些参与精细化学品生物合成的反应。所述降解提供了用于特定精细化学品如氨基酸、维生素和辅因子生物合成的中间体和前体。通过修饰本发明的PTS分子而增加胞内高能碳分子的量因此使增加产生一种或多种精细化学品所需的可用于进行代谢途径的能量和增加所述产生所需代谢物的胞内池成为可能。相反,通过降低这样的糖的摄入,可以下调所述的代谢途径并因此可增加目标生物合成途径的生产率,其中所述糖的降解产物包括的化合物仅用于在代谢途径中竞争产生目标精细化学品的代谢途径中的酶、辅因子或中间体。
本发明的PTS分子可参与一种或多种这样的胞内信号转导途径,所述胞内信号转导途径影响谷氨酸棒状杆菌中一种或多种精细化学品的产量和/或生产率。例如从胞外介质输入一种或多种糖类所需的蛋白(如Hpr,为酶I或为酶II复合体的组分),在细胞内存在足量的所述糖时,这些蛋白通常被翻译后修饰,这样它们就不再能输入所述糖。在大肠杆菌中进行的一个实例为:大肠杆菌中高的胞内果糖-1,6-二磷酸水平导致HPr在丝氨酸46位处磷酸化,其结果是所述分子不再能参与糖的转运。为了维持正常的细胞功能,同时限制目标精细化学品的超量产生,使转运系统关闭的该胞内糖水平可以是足够的。因此希望修饰本发明的PTS蛋白,从而使它们不对这种负调节敏感。其结果是含有所述突变PTS蛋白的生物体产生较高胞内浓度的一种或多种糖,并且延及至一种或多种精细化学品更高的生产率或更高的产量。
上述用于增加谷氨酸棒状杆菌目标化合物产量的PTS蛋白的诱变策略不用于限制;对这些诱变策略的变化对技术人员是显而易见的。本文公开的这些策略和机制使得可以使用本发明的核酸和蛋白质分子以产生表达突变的PTS核酸和蛋白质分子的谷氨酸棒状杆菌或相关的细菌菌株,从而提高目标化合物的产量、生产率和/或产生效率。该目标化合物可为谷氨酸棒状杆菌的任一天然产物,其包括生物合成途径的终产物和天然代谢途径的中间体,该目标化合物也可为在谷氨酸棒状杆菌代谢中非天然存在的分子,但该分子为本发明的谷氨酸棒状杆菌菌株产生。
不应将下面的实施例理解为对限制对本发明的进一步阐述。在该申请中引用的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请的全部内容此处引用作为参考。
实施例
实施例1:谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的总基因组DNA的制备
谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的培养物在30℃于BHI培养基(Difco)中剧烈振摇过夜。离心收获细胞,弃上清并将细胞重悬于5ml缓冲液-I(培养物原初体积的5%-所有陈述的体积按100ml培养物体积计算)。缓冲液-I的组成:140.34g/l蔗糖,2.46g/l MgSO4·7H2O,10ml/l KH2PO4溶液(100g/l,用KOH调节至pH6.7),50ml/l M12浓缩物(10g/l(NH4)2SO4,1g/lNaCl,2g/l MgSO4·7H2O,0.2g/l CaCl2,0.5g/l酵母提取物(Difco),10ml/l痕量元素混合物(200mg/l FeSO4·H2O,10mg/l ZnSO4·7H2O,3mg/lMnCl2·4H2O,30mg/l H3BO3,20mg/l CoCl2·6H2O,1mg/l NiCl2·6H2O,3mg/l Na2MoO4·2H2O,500mg/l络合剂(EDTA或柠檬酸),100ml/l维生素-混合物(0.2mg/l生物素,0.2mg/l叶酸,20mg/l对氨基苯甲酸,20mg/l核黄素,40mg/l Ca-泛酸盐,140mg/l烟酸,40mg/l维生素B6盐酸盐,200mg/l肌醇)。向悬液中加入溶菌酶至终浓度2.5mg/ml。在37℃孵育约4小时后,细胞壁降解,离心收获所得的原生质体。沉淀用5ml缓冲液-I洗一次并用5ml TE-缓冲液(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8)洗一次。将沉淀重悬于4ml TE-缓冲液,并加入0.5ml SDS溶液(10%)和0.5ml NaCl溶液(5M)。加入蛋白酶K至终浓度200μg/ml后,将悬液在37℃孵育约18小时。使用标准方法用酚、酚-氯仿-异戊醇和氯仿-异戊醇提取而纯化DNA。然后,加入1/50体积的3M醋酸钠和2体积的乙醇,于-20℃孵育30分钟,并在高速离心机上使用SS34转子(Sorvall)于12,000转/分离心30分钟,沉淀DNA。将该DNA溶于含20μg/ml RNaseA的1ml TE-缓冲液中,并用1000ml TE-缓冲液于4℃透析至少3小时。在此期间,更换缓冲液3次。向分装的0.4ml透析过的DNA溶液中加入0.4ml 2M LiCl和0.8ml乙醇。于-20℃孵育30分钟后,离心(13,000转/分,Biofuge Fresco,Heraeus,Hanau,德国)收集DNA。将该DNA沉淀溶于TE-缓冲液。用此方法制备的DNA可用于所有目的,包括Southern印迹或构建基因组文库。
实施例2:在大肠杆菌中构建谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的基因组文库
从如实施例1所述制备的DNA开始,按照公知的且已建立的方法(参见例如,Sambrook,J.等人(1989)“分子克隆:实验室手册”(”MolecularCloning:A Laboratory Manual”),Cold Spring Harbor Laboratory Press,或Ausubel,F.M.等人(1994)“分子生物学最新方法”(”Current Protocolsin Molecular Biology”),John Wiley & Sons.)构建粘粒和质粒文库。
可使用任一质粒或粘粒。特别使用的是质粒pBR322(Sutcliffe,J.G.(1979)美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),75:3737-3741);pACYC177(Change & Cohen(1978)细菌学杂志(J.Bacteriol)134:1141-1156)、pBS系列的质粒(pBSSK+,pBSSK-及其它;Stratagene,LaJolla,USA)、或粘粒如SuperCos1(Stratagene,LaJolla,USA)或Lorist6(Gibson,T.J.,Rosenthal A.和Waterson,R.H.(1987)基因(Gene)53:283-286)。
实施例3:DNA序列测定和功能的计算分析
如实施例2所述的基因组文库按照标准方法用于DNA序列测定,尤其是使用ABI377序列测定仪通过链终止法测定(参见例如,Fleischman,R.D.等人(1995)“流感嗜血菌(Haemophilus Influenzae)Rd的全基因组随机序列测定和组装”,科学(Science),269:496-512)。使用具有以下核苷酸序列的测序引物:5’-GGAAACAGTATGACCATG-3’或5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’。
实施例4:体内诱变
谷氨酸棒状杆菌的体内诱变可通过将质粒(或其它载体)DNA在不能维持其遗传信息完整性的大肠杆菌或其它微生物(例如Bacillus spp.或酵母如酿酒酵母)中传代而实施。常见的突变基因菌株在用于DNA修复系统的基因中有突变(例如mutHLS,mutD,mutT等;参考文献见大肠杆菌和沙门菌(Escherichia coli and Salmonella),ASM:Washington一书中的Rupp,W.D.(1996)DNA修复机制,2277-2294页)。此类菌株为技术人员熟知。此类菌株的用途在例如Greener,A.和Callahan,M.(1994)Strategies7:32-34中进行了阐述。
实施例5:在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌之间的DNA转移
几种棒状杆菌和短杆菌种类含有自主复制的内源质粒(例如pHM1519或pBL1)(综述参见例如,Martin,J.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology),5:137-146)。使用标准的大肠杆菌载体易于构建大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体(Sambrook,J.等人(1989),“分子克隆:实验室手册”(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”),Cold Spring HarborLaboratory Press,或Ausubel,F.M.等人(1994)“最新分子生物学方法”(“Current Protocols in Molecular Biology”),John Wiley & Sons),其中加入复制原点和来自谷氨酸棒状杆菌的适当标记。此类复制原点优选地取自从棒状杆菌和短杆菌分离的内源质粒。这些种类中作为转化标记尤其有用的是卡那霉素抗性基因(如衍生自Tn5或Tn903转座子的基因)或氯霉素抗性基因(Winnacker,E.L.(1987)”From Genes to Clones-Introductionto Gene Technology,VCH,Weinheim)。在文献中有许多在大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌中均复制的多种穿梭载体的例子,且其可用于多个目的,包括基因过表达(参考文献参见例如,Yoshihama,M.等人(1985)细菌学杂志(J.Bacteriol.)162:591-597,Martin J.F.等人(1987)生物技术(Biotechnology),5:137-146和Eikmanns,B.J.等人(1992)基因(Gene),102:93-98)。
使用标准技术,可将目的基因克隆入上述的穿梭载体之一并可将此杂合载体导入谷氨酸棒状杆菌菌株。谷氨酸棒状杆菌的转化可通过原生质体转化(Kastsumata,R.等人(1984)细菌学杂志(J.Bacteriol.)159,306-311)、电穿孔(Liebl,E.等人(1989)FEMS Microbiol.Letters,53:399-303)以及当使用特别的载体时,也通过接合(如在Schfer,A等人(1990)细菌学杂志(J.Bacteriol.)172:1663-1666中所述)来完成。也可转移谷氨酸棒状杆菌的穿梭载体至大肠杆菌,其为通过制备来自谷氨酸棒状杆菌的质粒DNA(使用本领域公知的标准方法)并将其转化至大肠杆菌。该转化步骤可使用标准方法进行,但有利的是使用Mcr-缺陷的大肠杆菌菌株,如NM522(Gough & Murray(1983)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:1-19)。
实施例6:突变蛋白质的表达的确定
在转化的宿主细胞中对突变蛋白质活性的观察依赖于突变蛋白质以与野生型蛋白质相似的方式和相似的量表达的事实。确定突变基因转录水平(指示可用于翻译为基因产物的mRNA量)的有用方法是进行Northern印迹(参考文献见例如,Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology),Wiley:New York),其中设计为与目的基因结合的引物用可检测标志(通常为放射性的或化学发光的)标记,这样当提取生物体培养物的总RNA、在凝胶上运行、转移至稳定的基质并与该探针孵育时,探针的结合和结合量指示了该基因的存在和其mRNA量。该信息是突变基因转录程度的证据。通过几种方法可从谷氨酸棒状杆菌中分离总细胞RNA,这些方法均为本领域熟知,如在Bormann,E.R.等人(1992)分子微生物学(Mol.Microbiol.)6:317-326中所描述。
为了确定从该mRNA翻译的蛋白质的存在或相对量,可使用标准技术如Western印迹(参见例如,Ausubel等人(1988)分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology),Wiley:New York)。在该方法中,提取细胞总蛋白质、通过凝胶电泳分离、转移至基质如硝化纤维并与探针孵育,其中所述探针如与目标蛋白质特异性结合的抗体。该探针通常用易于检测到的化学发光或显色标记物标记。所观察到的标记物的存在和量指示了在细胞中目标突变蛋白质的存在和量。
实施例7:遗传修饰的谷氨酸棒状杆菌的生长—培养基和培养条件
遗传修饰的棒状杆菌培养在合成或天然的生长培养基中。用于棒状杆菌的许多种不同生长培养基为人们熟知并易于获得(Lieb等人(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.,32:205-210;von der Osten等人(1998)Biotechnology Letters,11:11-16;Patent DE4,120,867;在原核生物(TheProcaryotes),Volume II,Balows,A.等人编辑.Springer-Verlag一书中的Liebl(1992)“棒状杆菌属”(“The Genus Corynebacteria”))。这些培养基由一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和痕量元素组成。优选的碳源是糖类,如单糖、二糖或或多糖。优良碳源的实例是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉和纤维素。也可通过复合化合物如糖蜜或其它来自糖加工的副产品提供糖至培养基。提供不同碳源的混合物也可是有利的。其它可能的碳源为醇类和有机酸,如甲醇、乙醇、醋酸或乳酸。氮源通常为有机或无机氮化合物,或为包含这些化合物的物质。示例性氮源包括氨气或胺盐如NH4Cl或(NH4)2SO4、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸和复合氮源如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉羹等。
可包括在培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、亚磷酸盐或硫酸盐。可向培养基中加入螯合物以维持溶液中的金属离子。尤其有用的螯合物包括二羟基酚,如儿茶酚或原儿茶酚盐,和有机酸如柠檬酸。培养基一般也包括其它生长因子如维生素或生长促进剂,其实例包括生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和维生素B6。生长因子和盐通常来自复合的培养基组成,如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。培养基化合物的精确组成强烈取决于直接实验并在每一具体情况下单独确定。有关培养基优化的信息在课本“Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach”(P.M.Rhodes,P.F.Stanbury编辑,IRL Press(1997)53-73页,ISBN 0 19 963577 3)中可找到。也可从供应商处得到生长培养基,如Standard1(Merck)或BHI(brain heart infusion,DIFCO)和其它。
通过加热(1.5巴,121℃加热20分钟)或过滤除菌对所有的培养基组成成份进行灭菌。组成成份可一起灭菌,或需要的话分开灭菌。所有的培养基组成成份可在培养开始时存在,或它们可任选地连续加入或分批加入。
对每一实验分别定义培养条件。温度应在15℃和45℃的范围之间。在实验中温度可保持恒定或可改变。培养基的pH应在5至8.5的范围之间,优选地在7.0附近,可通过向培养基中添加缓冲液而维持。用于此目的的示例性缓冲液为磷酸钾缓冲液。可备选地或同时使用合成缓冲液如MOPS、HEPES、ACES和其它。在生长过程中通过加入NaOH或NH4OH也可维持恒定的培养pH。如果使用复合的培养基组成如酵母提取物,可减轻对额外的缓冲液的需要,因为许多复合化合物具有高缓冲能力。如果使用发酵罐培养微生物,用气态氨也可控制pH。
培养时间通常在几小时到几天之间。选择培养时间以允许肉汤中累积最大量的产物。可在多种容器如不同规格的微滴定板、玻璃管、玻璃烧瓶或玻璃或金属发酵罐中实施公开的生长实验。对于筛选大量的克隆,应在微滴定板、玻璃管或在有或没有挡板的摇瓶中培养微生物。优选地使用100ml摇瓶,其中装有10%(体积)的所需生长培养基。该烧瓶应在旋转振荡器(振幅25mm)上以100-300转/分摇动。可通过维持潮湿环境减少蒸发损失;备选地,对蒸发损失应进行数学上的校正。
如果试验遗传修饰的克隆,也应试验未修饰的对照克隆或含基本质粒的无任何插入的对照克。使用已于30℃孵育的在琼脂板上生长的细胞接种培养基至OD600 0.5-1.5,其中所述琼脂板如CM板(10g/l葡萄糖,2.5g/lNaCl,2g/l尿素,10g/l聚胨,5g/l酵母抽取物,5g/l肉羹,22g/l琼脂,用2M NaOH调节至pH6.8)。培养基的接种通过导入来自CM板的谷氨酸棒状杆菌细胞的盐水悬液或添加该细菌的原液体培养物而完成。
实施例8:突变蛋白质功能的体外分析
本领域已建立了对酶活性和动力学的确定。确定特定的改变酶的活性的实验应加以修改,使适应野生型酶特异活性的确定,这在本领域普通技术人员的能力范围内。可在下列参考文献中找到对酶从总体上的概观,以及有关结构、动力学、原理、方法、应用和对许多酶活性进行确定的例子的具体说明,例如Dixon,M.和Webb,E.C.,(1979)酶(Enzymes).Longmans:伦敦;Fersht,(1985)酶结构和机制(Enzyme Structure andMechanism).Freeman:纽约;Walsh,(1979)酶促反应机制(EnzymaticReaction Mechanisms).Freeman:San Francisco;Price,N.C.,Stevens,L.(1982)酶学基础(Fundamentals of Enzymology).Oxford Univ.Press:Oxford;Boyer,P.D.编辑(1983)酶(The Enzymes),第三版,Academic Press纽约;Bisswanger,H.,(1994)酶动力学(Enzymkinetik),第二版.VCH:Weinheim(ISBN 3527300325);Bergmeyer,H.U.,Bergmeyer,J.,Graβl,M.编辑(1983-1986)酶促分析方法(Methods of Enzymatic Analysis),第三版,I-XII卷,Verlag Chemie:Weinheim;以及Ullmann工业化学百科全书(Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1987)A9卷,“酶”.VCH:Weinheim,352-363页。
可通过几种已建立的方法测定结合DNA的蛋白质的活性,如DNA带移动试验(也称为凝胶阻滞试验)。此类蛋白质对其它分子表达的影响可使用报告基因试验测定(如在Kolmar,H.等人(1995)EMBO J.14:3895-3904及其中所引用的参考文献中所述)。报告基因测试系统为人们所熟知,并被建立以应用于原核和真核细胞,使用的酶如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白和几种其它的酶。
可根据如在生物膜,分子结构和功能(Biomembranes,MolecularStructure and Function),Springer:Heidelberg一书中的Gennis,R.B.(1989)”Pores,Channels and Transporters”,85-137;199-234和270-322页中所述的技术进行膜转运蛋白活性的测定。
实施例9:分析突变蛋白质对目标产物产生的影响
谷氨酸棒状杆菌中的遗传修饰对目标化合物(如氨基酸)产生的影响可通过将经修饰的微生物在合适的条件(如上文中所描述的那些条件)下生长并分析用于增加目标产物(即氨基酸)产生的培养基和/或细胞组成来确定。此类分析技术为技术人员熟知,包括光谱学、薄层色谱法、多种染色法、酶促和微生物学方法、以及分析色谱法如高效液相色谱法(参见例如,Ullman工业化学百科全书(Ullman,Encyclopedia of IndustrialChemistry),A2卷,89-90和443-613页,VCH:Weinheim(1985);Fallon,A.等人(1987)生物化学和分子生物学实验室技术(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)中的“HPLC在生物化学中的应用”(“Applications of HPLC in Biochemistry”),17卷;Rehm等人(1993)生物技术(Biotechnology),3卷,III章“产物回收和纯化”(“Productrecovery and purification”),469-714页,VCH:Weinheim;Belter,P.A.等人(1988)生物分离:生物技术中的下游加工(Bioseparations:downstreamprocessing for biotechnology),John Wiley and Sons;Kennedy,J.F.和Cabral,J.M.S.(1992)生物物质的回收方法(Recovery processes forbiological materials)John Wiley and Sons;在Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)一书中的Shaeiwitz,J.A.和Henry,J.D.(1988)生物化学分离(Biochemical separations),B3卷,11章,1-27页,VCH:Weinheim;以及Dechow,F.J.(1989)生物技术中的分离和纯化技术(Separation and purification techniques inbiotechnology),Noyes Publications.)。
除了测定发酵终产物外,还可分析用于产生目标化合物的代谢途径的其它组成如中间体和副产物来确定化合物的总体产生力、化合物的产率和/或生产效率。分析方法包括测定培养基中的营养素水平(例如,糖类、碳水化合物、氮源、磷酸盐和其它离子)、测定生物量组成和生长、分析生物合成途径中共同代谢物的产生及测定发酵过程中产生的气体。这些测定的标准方法在应用微生物生理学,实用方法(Applied Microbial Physiology,APractical Approach),P.M.Rhodes和P.F.Stanbury编辑,IRL Press,103-129;131-163和165-192页(ISBN:0199635773)及其引用的参考文献中列出。
实施例10:从谷氨酸棒状杆菌培养物中纯化目标产物
可通过多种本领域熟知的方法实施从谷氨酸棒状杆菌细胞或上述培养物上清回收目标产物。如果目标产物不从细胞中分泌,可低速离心从培养物中收获细胞、用标准技术如机械力或超声裂解细胞。离心去除细胞碎片,保留含有可溶蛋白质的上清级分用于进一步纯化目标化合物。如果化合物从谷氨酸棒状杆菌细胞分泌,则低速离心从培养物中去除细胞,并保留上清级分用于进一步纯化。
将来自两种中任一纯化方法的上清级分用合适的树脂进行层析,其中目标分子保留在层析树脂上而样本中的许多杂质不保留在层析树脂上,或者杂质保留在层析树脂上而样本不保留。此层析步骤必需时可重复,其中使用相同或不同的层析树脂。技术人员在选择合适的层析树脂以及将它们最有效地用于特定的待纯化分子方面是很精通的。可通过过滤或超滤浓缩纯化产物,并贮存在使产物稳定性最高的温度下。
有大量的纯化方法为本领域公知,上述纯化方法不用于限制。此类纯化技术例如在Bailey,J.E.和Ollis,D.F.生物化学工程基础(BiochemicalEngineering Fundamentals),McGraw-Hill:纽约(1986)中描述。
分离化合物的特性和纯度可通过本领域的标准技术确定。这些技术包括高效液相色谱(HPLC)、光谱法、染色法、薄层色谱法、NIRS、酶促试验或微生物学方法。此类分析方法在Patek等人(1994)Appl.Environ.Microbiol.60:133-140;Malakhova等人(1996)生物技术(Biotekhnologiya)11:27-32;和Schmidt等人(1998)生物加工工程(Bioprocess Engineer)19:67-70.Ulmann工业化学百科全书(Ulmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry)(1996)A27卷,VCH:Weinheim,89-90页,521-540页,540-547页,559-566页,575-581页和581-587页;Michal,G.(1999)生物化学途径:生物化学和分子生物学图集(Biochemical Pathways:An Atlas of Biochemistry and MolecularBiology),John Wiley and Sons;生物化学和分子生物学中的实验室技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology),17卷中的Fallon,A.等人(1987)HPLC在生物化学中的应用(Applications ofHPLC in Biochemistry)。
等同物
技术人员知道或通过简单的常规方法可确定许多于文中所描述本发明具体实施方案的等同物。此类等同物旨在包括在下面的专利权利要求书中。
表1中的信息理解如下:
在第1列中,“DNA ID”,每种情况下相关数字指所公开序列表的SEQ ID NO。所以,“DNA ID”列中的“5”指SEQ ID NO:5。
在第2列中,“AA ID”,每种情况下相关数字指所公开序列的SEQ IDNO。“AA ID”列中的“6”指SEQ ID NO:6。
在第3列中,列出了“标识”——每个序列的明确内部名称。
在第4列中,“AA pos”,每种情况下相关数字指相同行中多肽序列“AA ID”的氨基酸位置。所以,“AA pos”列中“26”是相应所示的多肽序列的氨基酸位置26。位置计算从N末端的+1开始。
在第5列中,“AA野生型”,每种情况下相关数字指相应野生型菌株在第4列中所示位置的氨基酸(用单字母代码)。
在第6列中,“AA突变株”,每种情况下相关数字指相应突变菌株在第4列中所示位置的氨基酸(用单字母代码)。
在第7列中,列出了“功能”——相应多肽序列的生理学功能。
蛋白原氨基酸的单字母代码:
A丙氨酸
C半胱氨酸
D天冬氨酸
E谷氨酸
F苯丙氨酸
G甘氨酸
H组氨酸
I异亮氨酸
K赖氨酸
L亮氨酸
M甲硫氨酸
N天冬酰胺
P脯氨酸
Q谷氨酰胺
R精氨酸
S丝氨酸
T苏氨酸
V缬氨酸
W色氨酸
Y酪氨酸
表1
编码烯醇丙酮酸磷酸-糖磷酸转移酶蛋白的基因
DNA ID: AA ID: 标识 AA位置: AA野生型 AA突变体 功能:
1 2 RXA01244 108 E K 烯醇丙酮酸磷酸-蛋白 磷酸转移酶
137 R C 烯醇丙酮酸磷酸-蛋白 磷酸转移酶
166 A T 烯醇丙酮酸磷酸-蛋白 磷酸转移酶
5 6 RXA01300 25 A T 磷酸载体蛋白HPR
7 8 RXA04358 227 E K 推定的磷酸转移酶酶II的组分SGCA(EC2.7.1.69)
9 10 RXA06018 122 K E PTS系统,果糖特异的IIBC组分(EC2.7.1.69)
序列表
<110>巴斯福股份公司
<120>编码烯醇丙酮酸磷酸-糖磷酸转移酶蛋白的基因
<130>O.Z.0050/52969
<160>8
<210>1
<211>1834
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(1804)
<223>RXA01244
<400>1
gatatgtgtt tgtttgtcaa tatccaaatg tttgaatagt tgcacaactg ttggttttgt 60
ggtgatcttg aggaaattaa ctcaatgatt gtgaggatgg gtg gct act gtg gct 115
Val Ala Thr Val Ala
1 5
gat gtg aat caa gac act gta ctg aag ggc acc ggc gtt gtc ggt gga 163
Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr Gly Val Val Gly Gly
10 15 20
gtc cgt tat gca agc gcg gtg tgg att acc cca cgc ccc gaa cta ccc 211
Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro Arg Pro Glu Leu Pro
25 30 35
caa gca ggc gaa gtc gtc gcc gaa gaa aac cgt gaa gca gag cag gag 259
Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg Glu Ala Glu Gln Glu
40 45 50
cgt ttc gac gcc gct gca gcc aca gtc tct tct cgt ttg ctt gag cgc 307
Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser Arg Leu Leu Glu Arg
55 60 65
tcc gaa gct gct gaa gga cca gca gct gag gtg ctt aaa gct act gct 355
Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val Leu Lys Ala Thr Ala
70 75 80 85
ggc atg gtc aat gac cgt ggc tgg cgt aag gct gtc atc aag ggt gtc 403
Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala Val Ile Lys Gly Val
90 95 100
aag ggt ggt cac cct gcg gaa tac gcc gtg gtt gca gca aca acc aag 451
Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val Ala Ala Thr Thr Lys
105 110 115
ttc atc tcc atg ttc gaa gcc gca ggc ggc ctg atc gcg gag cgc acc 499
Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu Ile Ala Glu Arg Thr
120 125 130
aca gac ttg cgc gac atc cgc gac cgc gtc atc gca gaa ctt cgt ggc 547
Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile Ala Glu Leu Arg Gly
135 140 145
gat gaa gag cca ggt ctg cca gct gtt tcc gga cag gtc att ctc ttt 595
Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly Gln Val Ile Leu Phe
150 155 160 165
gca gat gac ctc tcc cca gca gac acc gcg gca cta gac aca gat ctc 643
Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala Leu Asp Thr Asp Leu
170 175 180
ttt gtg gga ctt gtc act gag ctg ggt ggc cca acg agc cac acc gcg 691
Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro Thr Ser His Thr Ala
185 190 195
atc atc gca cgc cag ctc aac gtg cct tgc atc gtc gca tcc ggc gcc 739
Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile Val Ala Ser Gly Ala
200 205 210
ggc atc aag gac atc aag tcc ggc gaa aag gtg ctt atc gac ggc agc 787
Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val Leu Ile Asp Gly Ser
215 220 225
ctc ggc acc att gac cgc aac gcg gac gaa gct gaa gca acc aag ctc 835
Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala Glu Ala Thr Lys Leu
230 235 240 245
gtc tcc gag tcc ctc gag cgc gct gct cgc atc gcc gag tgg aag ggt 883
Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile Ala Glu Trp Lys Gly
250 255 260
cct gca caa acc aag gac ggc tac cgc gtt cag ctg ttg gcc aac gtc 931
Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln Leu Leu Ala Asn Val
265 270 275
caa gac ggc aac tct gca cag cag gct gca cag acc gaa gca gaa ggc 979
Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln Thr Glu Ala Glu Gly
280 285 290
atc ggc ctg ttc cgc acc gaa ctg tgc ttc ctt tcc gcc acc gaa gag 1027
Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu Ser Ala Thr Glu Glu
295 300 305
cca agc gtt gat gag cag gct gcg gtc tac tca aag gtg ctt gaa gca 1075
Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser Lys Val Leu Glu Ala
310 315 320 325
ttc cca gag tcc aag gtc gtt gtc cgc tcc ctc gac gca ggt tct gac 1123
Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu Asp Ala Gly Ser Asp
330 335 340
aag cca gtt cca ttc gca tcg atg gct gat gag atg aac cca gca ctg 1171
Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu Met Asn Pro Ala Leu
345 350 355
ggt gtt cgt ggc ctg cgt atc gca cgt gga cag gtt gat ctg ctg act 1219
Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln Val Asp Leu Leu Thr
360 365 370
cgc cag ctc gac gca att gcg aag gcc agc gaa gaa ctc ggc cgt ggc 1267
Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu Glu Leu Gly Arg Gly
375 380 385
gac gac gcc cca acc tgg gtt atg gct cca atg gtg gct acc gct tat 1315
Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met Val Ala Thr Ala Tyr
390 395 400 405
gaa gca aag tgg ttt gct gac atg tgc cgt gag cgt ggc cta atc gcc 1363
Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg Gly Leu Ile Ala
410 415 420
ggc gcc atg atc gaa gtt cca gca gca tcc ctg atg gca gac aag atc 1411
Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met Ala Asp Lys Ile
425 430 435
atg cct cac ctg gac ttt gtt tcc atc ggt acc aac gac ctg acc cag 1459
Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln
440 445 450
tac acc atg gca gcg gac cgc atg tct cct gag ctt gcc tac ctg acc 1507
Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu Ala Tyr Leu Thr
455 460 465
gat cct tgg cag cca gca gtc ctg cgc ctg atc aag cac acc tgt gac 1555
Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys His Thr Cys Asp
470 475 480 485
gaa ggt gct cgc ttt aac acc ccg gtc ggt gtt tgt ggt gaa gca gca 1603
Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys Gly Glu Ala Ala
490 495 500
gca gac cca ctg ttg gca act gtc ctc acc ggt ctt ggc gtg aac tcc 1651
Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Asn Ser
505 510 515
ctg tcc gca gca tcc act gct ctc gca gca gtc ggt gca aag ctg tca 1699
Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Lys Leu Ser
520 525 530
gag gtc acc ctg gaa acc tgt aag aag gca gca gaa gca gca ctt gac 1747
Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asp
535 540 545
gct gaa ggt gca act gaa gca cgc gat gct gta cgc gca gtg atc gac 1795
Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg Ala Val Ile Asp
550 555 560 565
gca gca gtc taaaccactg ttgagctaaa aagcctcaaa 1834
Ala Ala Val
<210>2
<211>568
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>2
Val Ala Thr Val Ala Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr
1 5 10 15
Gly Val Val Gly Gly Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro
20 25 30
Arg Pro Glu Leu Pro Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg
35 40 45
Glu Ala Glu Gln Glu Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser
50 55 60
Arg Leu Leu Glu Arg Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val
65 70 75 80
Leu Lys Ala Thr Ala Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala
85 90 95
Val Ile Lys Gly Val Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val
100 105 110
Ala Ala Thr Thr Lys Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu
115 120 125
Ile Ala Glu Arg Thr Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile
130 135 140
Ala Glu Leu Arg Gly Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly
145 150 155 160
Gln Val Ile Leu Phe Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala
165 170 175
Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro
180 185 190
Thr Ser His Thr Ala Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile
195 200 205
Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val
210 215 220
Leu Ile Asp Gly Ser Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala
225 230 235 240
Glu Ala Thr Lys Leu Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile
245 250 255
Ala Glu Trp Lys Gly Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln
260 265 270
Leu Leu Ala Asn Val Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln
275 280 285
Thr Glu Ala Glu Gly Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu
290 295 300
Ser Ala Thr Glu Glu Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser
305 310 315 320
Lys Val Leu Glu Ala Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu
325 330 335
Asp Ala Gly Ser Asp Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu
340 345 350
Met Asn Pro Ala Leu Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln
355 360 365
Val Asp Leu Leu Thr Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu
370 375 380
Glu Leu Gly Arg Gly Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met
385 390 395 400
Val Ala Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu
405 410 415
Arg Gly Leu Ile Ala Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu
420 425 430
Met Ala Asp Lys Ile Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr
435 440 445
Asn Asp Leu Thr Gln Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu
450 455 460
Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile
465 470 475 480
Lys His Thr Cys Asp Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val
485 490 495
Cys Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly
500 505 510
Leu Gly Val Asn Ser Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val
515 520 525
Gly Ala Lys Leu Ser Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala
530 535 540
Glu Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val
545 550 555 560
Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala Val
565
<210>3
<211>397
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(367)
<223>RXA01300
<400>3
gatcgacatt aaatcccctc ccttgggggg tttaactaac aaatcgctgc gccctaatcc 60
gttcggatta acggcgtagc aacacgaaag gacactttcc atg gct tcc aag act l15
Met Ala Ser Lys Thr
1 5
gta acc gtc ggt tcc tcc gtt ggc ctg cac gca cgt cca gca tcc atc 163
Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala Arg Pro Ala Ser Ile
10 15 20
atc gct gaa gcg gct gct gag tac gac gac gaa atc ttg ctg acc ctg 211
Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu Ile Leu Leu Thr Leu
25 30 35
gtt ggc tcc gat gat gac gaa gag acc gac gcg tcc tct tcc ctc atg 259
Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ser Leu Met
40 45 50
atc atg gcg ctg ggc gca gag cac ggc aac gaa gtt acc gtc acc tcc 307
Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu Val Thr Val Thr Ser
55 60 65
gac aac gct gaa gct gtt gag aag atc gct gcg ctt atc gca cag gac 355
Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala Leu Ile Ala Gln Asp
70 75 80 85
ctt gac gct gag taaacaacgc tctgcttgtt aaaagctcgt 397
Leu Asp Ala Glu
<210>4
<211>89
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>4
Met Ala Ser Lys Thr Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala
1 5 10 15
Arg Pro Ala Ser Ile Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu
20 25 30
Ile Leu Leu Thr Leu Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala
35 40 45
Ser Ser Ser Leu Met Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu
50 55 60
Val Thr Val Thr Ser Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ile Ala Gln Asp Leu Asp Ala Glu
85
<210>5
<211>940
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(910)
<223>RXA04358
<400>5
ggaacttcga ggtgtcttcg tggggcgtac ggagatctag caagtgtggc tttatgtttg 60
accctatccg aatcaacatg cagtgaatta acatctactt atg ttt gta ctc aaa 115
Met Phe Val Leu Lys
1 5
gat ctg cta aag gca gaa cgc ata gaa ctc gac cgc acg gtc acc gat 163
Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp Arg Thr Val Thr Asp
10 15 20
tgg cgt gaa ggc atc cgc gcc gca ggt gta ctc cta gaa aag aca aac 211
Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu Leu Glu Lys Thr Asn
25 30 35
agc att gat tcc gcc tac acc gat gcc atg atc gcc agc gtg gaa gaa 259
Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile Ala Ser Val Glu Glu
40 45 50
aaa ggc ccc tac att gtg gtc gct cca ggt ttc gct ttc gcg cac gcc 307
Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe Ala Phe Ala His Ala
55 60 65
cgc ccc agc aga gca gtc cgc gag acc gct atg tcg tgg gtg cgc ctg 355
Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu
70 75 80 85
gcc tcc cct gtt tcc ttc ggt cac agt aag aat gat ccc gtc aat ctc 403
Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn Asp Pro Val Asn Leu
90 95 100
atc gtt gct ctc gct gcc aaa gat gcc acc gca cat acc caa gcg atg 451
Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala His Thr Gln Ala Met
105 110 115
gcg gca ttg gct aaa gct tta gga aaa tac cga aag gat ctc gac gag 499
Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg Lys Asp Leu Asp Glu
120 125 130
gca caa agt ccc gag gag atc caa gca atc tta gag aag gca gca gcg 547
Ala Gln Ser Pro Glu Glu Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala
135 140 145
ccg gcg aag cag aag gct cct gct gtg gct cct gct gta aca ccc act 595
Pro Ala Lys Gln Lys Ala Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr
150 155 160 165
gac gct cct gca gcc tca gtc caa tcc aaa acc cac gac aag atc ctc 643
Asp Ala Pro Ala Ala Ser Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu
170 175 180
acc gtc tgt ggc aac ggc ttg ggt acc tcc ctc ttc ctc aaa aac acc 691
Thr Val Cys Gly Asn Gly Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr
185 190 195
ctt gag caa gtt ttc gac acc tgg ggt tgg ggt cca tac atg acg gtg 739
Leu Glu Gln Val Phe Asp Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val
200 205 210
gag gca acc gac act atc tcc gcc aag ggc aaa gcc aag gaa gct gat 787
Glu Ala Thr Asp Thr Ile Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp
215 220 225
ctc atc atg acc tct ggt gaa atc gcc cgc acg ttg ggt gat gtt gga 835
Leu Ile Met Thr Ser Gly Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly
230 235 240 245
atc ccg gtt cac gtg atc aat gac ttc acg agc acc gat gaa atc gat 883
Ile Pro Val His Val Ile Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp
250 255 260
gct gcg ctt cgt gaa cgc tac gac atc taactacttt aaaaggacga 930
Ala Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Asp Ile
265 270
aaatattatg 940
<210>6
<211>270
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>6
Met Phe Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp
1 5 10 15
Arg Thr Val Thr Asp Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu
20 25 30
Leu Glu Lys Thr Asn Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile
35 40 45
Ala Ser Val Glu Glu Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe
50 55 60
Ala Phe Ala His Ala Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met
65 70 75 80
Ser Trp Val Arg Leu Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn
85 90 95
Asp Pro Val Asn Leu Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala
100 105 110
His Thr Gln Ala Met Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg
115 120 125
Lys Asp Leu Asp Glu Ala Gln Ser Pro Glu Glu Ile Gln Ala Ile Leu
130 135 140
Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala Pro Ala Val Ala Pro
145 150 155 160
Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser Val Gln Ser Lys Thr
165 170 175
His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly Leu Gly Thr Ser Leu
180 185 190
Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp Thr Trp Gly Trp Gly
195 200 205
Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile Ser Ala Lys Gly Lys
210 215 220
Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly Glu Ile Ala Arg Thr
225 230 235 240
Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile Asn Asp Phe Thr Ser
245 250 255
Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Asp Ile
260 265 270
<210>7
<2l1>520
<212>DNA
<213>谷氨酸棒状杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(101)..(490)
<223>RXA06018
<400>7
agcctacctc tttggtaccg caggcctgtc taccggcgac caagcttcca tggaaatcat 60
ggccgcgatc atggcagctg gcatggtccc accaatcgcg ttg tcc att gct acc 115
Leu Ser Ile Ala Thr
1 5
ctg ctg cgc aag aag ctg ttc acc cca gca gag caa gaa aac ggc aag 163
Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu Asn Gly Lys
10 15 20
tct tcc tgg ctg ctt ggc ctg gca ttc gtc tcc gaa ggt gcc atc cca 211
Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly Ala Ile Pro
25 30 35
ttc gcc gca gct gac cca ttc cgt gtg atc cca gca atg atg gct ggc 259
Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met Met Ala Gly
40 45 50
ggt gca acc act ggt gca atc tcc atg gca ctg ggc gtc ggc tct cgg 307
Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val Gly Ser Arg
55 60 65
gct cca cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg gca atc gaa cca tgg tgg 355
Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu Pro Trp Trp
70 75 80 85
ggc tgg ctc atc gca ctt gca gca ggc acc atc gtg tcc acc atc gtt 403
Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser Thr Ile Val
90 95 100
gtc atc gca ctg aag cag ttc tgg cca aac aag gcc gtc gct gca gaa 451
Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val Ala Ala Glu
105 110 115
gtc gcg aag caa aaa gca caa caa gca gct gta aac gca taatcggacc 500
Val Ala Lys Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala
120 125 130
ttgacccgat gtctggtcgg 520
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>谷氨酸棒状杆菌
<400>8
Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu
1 5 10 15
Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser
20 25 30
Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro
35 40 45
Ala Met Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu
50 55 60
Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala
65 70 75 80
Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile
85 90 95
Val Ser Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys
100 105 110
Ala Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Val
115 120 125
Asn Ala
130
Claims (8)
1.分离的核酸分子,其编码的多肽所具有的氨基酸序列在每种情况下均涉及表1/第2列,其中在表1/第4列所示氨基酸位置处的核酸分子所编码的蛋白原氨基酸与表1/第5列相同行所示的特定氨基酸不同。
2.如权利要求1所述的分离的核酸分子,其中在表1/第4列中所示氨基酸位置处的核酸分子编码表1/第6列相同行所示的氨基酸。
3.载体,其包含至少一个如权利要求1所述的核酸序列。
4.宿主细胞,其用至少一种如权利要求3所述的载体转染。
5.如权利要求4所述的宿主细胞,其中所述核酸分子的表达调节所述细胞精细化学品的生产率。
6.制备精细化学品的方法,其包括培养已用至少一种如权利要求3所述的载体转染的细胞,从而产生精细化学品。
7.如权利要求6所述的方法,其中精细化学品是氨基酸。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述氨基酸是赖氨酸。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |