EP1444334A2 - Gene, die für phosphoenolpyruvat-zucker-phosphotransferase proteine codieren - Google Patents

Gene, die für phosphoenolpyruvat-zucker-phosphotransferase proteine codieren

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EP1444334A2
EP1444334A2 EP02783045A EP02783045A EP1444334A2 EP 1444334 A2 EP1444334 A2 EP 1444334A2 EP 02783045 A EP02783045 A EP 02783045A EP 02783045 A EP02783045 A EP 02783045A EP 1444334 A2 EP1444334 A2 EP 1444334A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
pts
nucleic acid
protein
cell
molecules
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02783045A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar Zelder
Markus Pompejus
Hartwig Schröder
Burkhard Kröger
Corinna Klopprogge
Gregor Haberhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paik Kwang Industrial Co Ltd
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Priority to EP07103392A priority Critical patent/EP1801205A3/de
Publication of EP1444334A2 publication Critical patent/EP1444334A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1223—Phosphotransferases with a nitrogenous group as acceptor (2.7.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases

Definitions

  • Certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes in cells are used in many industries, including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
  • These molecules that. collectively referred to as "fine chemicals” include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors and enzymes.
  • Their production is best accomplished by growing large-scale bacteria that have been developed to produce and secrete large quantities of the desired molecule.
  • a particularly suitable organism for this purpose is Corynebacterium glutamicum, a gram-positive, non-pathogenic bacterium. Through strain selection, a number of mutant strains have been developed that produce a range of desirable compounds. However, selecting strains that are improved in the production of a particular molecule is a time consuming and difficult process.
  • This invention provides novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify Corynebacterium glutamicum or related types of bacteria.
  • C. glutamicum is a gram-positive, aerobic bacterium that is commonly used in industry for the large-scale production of a number of fine chemicals, as well as for the degradation of hydrocarbons (e.g. when crude oil overflows) and for the oxidation of terpenoids.
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms that can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • Corynebacterium species such as CoryneJacteriurn diphtheriae (the causative agent of diphtheria), which are important pathogens in humans.
  • CoryneJacteriurn diphtheriae the causative agent of diphtheria
  • the ability to identify the presence of Corynebacterium species can therefore also be of significant clinical importance, for example in diagnostic applications.
  • These nucleic acid molecules can also serve as reference points for mapping the C. glutamicum genome or genomes of related organisms.
  • PTS proteins can, for example, transport high-energy carbon-containing molecules, such as glucose, in C. glutamicum or participate in the intracellular signal transduction in these microorganisms.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of this organism in order to make it better and more efficient as a producer of one or more fine chemicals.
  • the PTS molecules according to the invention can be modified such that the yield, production and / or the efficiency of the production of one or more fine chemicals is improved. For example, if a PTS protein involved in glucose uptake is modified in such a way that its activity is optimized, the amount of glucose taken up or the rate at which the glucose is transported into the cell can be increased.
  • the breakdown of glucose and other sugars in the cell provides energy with which energetically unfavorable biochemical reactions can be driven, e.g. those involved in the biosynthesis of fine chemicals. This degradation also poses
  • the PTS molecules according to the invention can also be involved in one or more intracellular signal transduction pathways which influence the yields and / or the rate of production of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • Proteins which are necessary, for example, for the import of one or more sugars from the extracellular medium are often post-translationally modified in the presence of a sufficient amount of sugar in the cell so that they can no longer import this sugar.
  • the amount of sugar at which the transport system is switched off is sufficient to maintain normal cell functions, but it limits the overproduction of the desired fine chemical. It is therefore advisable to modify the PTS proteins according to the invention so that they no longer respond to such negative regulation. This allows higher intracellular concentrations of one or more sugars and, by extension, more efficient production or higher yields of one or more fine chemicals from organisms which contain these mutant PTS proteins.
  • This invention provides new nucleic acid molecules which encode the proteins referred to here as phosphoenolpyruvate: sugar-phosphotransferase system (PTS) proteins, which, for example, involve the import of high-energy carbon molecules (eg glucose, fructose or sucrose) into C. glutamicum and / or may be involved in one or more intracellular C. glutamicum signal transduction pathways.
  • PTS sugar-phosphotransferase system
  • Nucleic acid molecules that encode a PTS protein are referred to here as PTS nucleic acid molecules.
  • the PTS protein is involved in the import of high energy carbon molecules (e.g. glucose, fructose or sucrose) into C. glutamicum and may be involved in one or more intracellular C. glutamicum signaling pathways. Examples of such proteins are those encoded by the genes shown in Table 1.
  • nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes a PTS protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which act as primers or hybridization probes for detecting or amplifying PTS encoding Nucleic acid (e.g. DNA or mRNA) are suitable.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region or a complement thereof.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred PTS proteins according to the invention likewise preferably have at least one of the PTS activities described here.
  • the nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • the isolated nucleic acid more preferably encodes a naturally occurring C. glutamicum PTS protein or a biologically active portion thereof.
  • vectors for example recombinant expression vectors, which contain the nucleic acid molecules according to the invention, and host cells, into which these vectors have been introduced.
  • a host cell that is grown in a suitable medium is used to produce a PTS protein.
  • the PTS protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which a PTS gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which codes the mutated PTS sequence as a transgene.
  • an endogenous PTS gene in the genome of the microorganism is changed by homologous recombination with an altered PTS gene, e.g. functionally disrupted.
  • the microorganism belongs to the genus Corynebacterium or JBreviJbacterium, Corynebacterium glutamicum being particularly preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, such as an amino acid, particularly preferably lysine.
  • host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to the person skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to use one vector in each case to have a nucleic acid molecule according to the invention in to introduce the host cell and therefore to use several vectors either simultaneously or in time. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation often allows superadditive effects on the host cell with regard to the fine chemical productivity to be achieved.
  • an isolated PTS protein or a section for example a biologically active section thereof.
  • the isolated PTS protein or its section can be involved in the import of high-energy carbon molecules (for example glucose, fructose or sucrose) into C. glutamicum and also in one or more intracellular signal transduction pathways of C. glutamicum.
  • the isolated PTS protein or a section thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B, so that the protein or its section continues to import high-energy carbon molecules (for example glucose, fructose or sucrose). in C. glutamicum and / or participate in one or more intracellular signal transduction pathways of C. glutamicum.
  • the invention also relates to an isolated PTS protein preparation.
  • the PTS protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which essentially forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is encoded by an open reading frame in Appendix A) is homologous.
  • the PTS polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-PTS polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the PTS protein alone and in other preferred embodiments results in increased yields, increased production and / or efficiency in the production of a desired fine chemical from C. glutamicum.
  • the integration of this fusion protein into a host cell modulates the production of a desired compound from the cell in particularly preferred embodiments.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of a PTS nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • This procedure includes a preferred embodiment also the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of a PTS nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism. These methods involve contacting the cell with a substance that modulates PTS protein activity or PTS nucleic acid expression so that a cell-associated activity is changed compared to the same activity in the absence of the substance.
  • the cell is modulated for the absorption of one or more sugars so that the yields or the speed of production of a desired fine chemical by this microorganism is improved.
  • the substance that modulates PTS protein activity stimulates PTS protein activity or PTS nucleic acid expression.
  • substances that stimulate PTS protein activity or PTS nucleic acid expression include small molecules, active PTS proteins and nucleic acids that encode PTS proteins and have been introduced into the cell. Examples of substances that inhibit PTS activity or expression include small molecules and antisense PTS nucleic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the yields of a desired compound from a cell, comprising introducing into a cell a PTS wild-type or mutant gene that either remains on a separate plasmid or is integrated into the genome of the host cell.
  • the integration into the genome can be random or by homologous recombination, so that the native gene is replaced by the integrated copy, which causes the production of the desired compound from the cell to be modulated.
  • these yields are increased.
  • the chemical is a fine chemical, which in an especially preferred embodiment is an amino acid. In a particularly preferred embodiment, this amino acid is L-lysine.
  • the present invention provides PTS nucleic acid and protein molecules which are involved in the absorption of high-energy carbon molecules (e.g. sucrose, fructose or glucose) in C. glutamicum and which can also be involved in intracellular signal transduction pathways in this microorganism.
  • the molecules according to the invention can be used in the modulation of the production of fine chemicals by microorganisms. This modulation can be based on increased intracellular levels of high-energy molecules, which are required to generate, for example, ATP, GTP and other molecules, which are used to drive energetically unfavorable biochemical reactions in the cell, for example the biosynthesis of a fine chemical.
  • This modulation of fine chemical production can also be due to the fact that the degradation products of many sugars serve as intermediates or precursors for other biosynthetic pathways, including those of certain fine chemicals.
  • PTS proteins are known to be involved in certain intracellular signal transduction pathways which may have regulatory activity for one or more metabolic pathways of fine chemicals; manipulation of these PTS proteins can therefore activate a fine chemical biosynthetic pathway or repress a fine chemical degradation pathway. The aspects of the invention are further explained below.
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and have applications in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diamino-pimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, Pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim and the citations contained therein), lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and butanediol
  • Carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors as described in Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", p 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the citations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell functions.
  • amino acid is known in the art.
  • amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • Nonessential amino acids alanine, arginine, asparagine, aspartate, cysteine, glutamate, glutamine, glycine, proline, serine and tyrosine
  • Higher animals have the ability to synthesize some of these amino acids, but the essential amino acids must be ingested with food for normal protein synthesis to take place.
  • Lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs. Glutamate is most commonly used as a flavor additive
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate, in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate in a 9-step biosynthetic pathway that differs only in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is made from oxaloacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • Education takes place in a complex 9-step process of histidine from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the cell's protein biosynthesis requirement, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediate products are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd ed. Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, the presence of a certain amino acid slowing down or completely stopping its own production (for an overview of the feedback mechanism in amino acid biosynthesis pathways, see Stryer, L ., Biochemistry, 3rd ed., Chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)).
  • the output of a certain amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor encompasses non-proteinaceous compounds which are necessary for the occurrence of normal enzyme activity. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferred organic.
  • nutraceutical encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (eg polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B 2 ) is synthesized from guanosine 5'-triphosphate (GTP) and ribose 5'-phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds which are collectively referred to as "vitamin B6" (for example pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal-5 'phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride) are all derivatives of the common structural unit 5-hydroxy-6-methyl- pyridine.
  • Panthothenate (pantothenic acid, R- (+) -N- (2, 4-dihydroxy-3, 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthetic steps for the conversion into pantoic acid, into ß-alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5 '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • guanosine 5'-triphosphate GTP
  • L-glutamic acid L-glutamic acid
  • p-aminobenzoic acid The biosynthesis of folic acid and its derivatives, starting from the metabolic intermediates guanosine 5'-triphosphate (GTP), L-glutamic acid and p-aminobenzoic acid, has been extensively investigated in certain microorganisms.
  • Corrinoids such as the cobalamines and especially vitamin B ⁇
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B ⁇ is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also called “niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • nucleic acid molecules which comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA the sugar is ribose, for DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides, but which, in contrast to the nucleotides, have no phosphoric acid unit.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules, but that serve as energy stores (i.e. AMP) or as coenzymes (i.e. FAD and NAD).
  • Enzymes involved in purine and pyrimidine metabolism have focused on the development of new drugs that can be used, for example, as immunosuppressants or antiproliferants (Smith, JL "Enzymes in Nucleotide Synthesis” Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Bioche. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (e.g. thiamine, S-adenosyl methionine, folate or riboflavin), as energy sources for the cell (e.g.
  • ATP or GTP are commonly used as flavor enhancers (e.g. IMP or GMP) or for many medical applications (see e.g. Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., ed VCH: Weinheim, pp. 561-612)
  • Enzymes which are involved in the purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly used as targets against chemicals for crop protection, including fungicides, herbicides and Insecticides are being developed.
  • the purine nucleotides are passed through a series of steps via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP) synthesized from ribose 5-phosphate, which leads to the production of guanosine 5 'monophosphate (GMP) or adenosine 5' monophosphate (AMP), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily prepared.
  • IMP inosine 5 'phosphate
  • GMP guanosine 5 'monophosphate
  • AMP adenosine 5' monophosphate
  • UMP uridine 5 'monophosphate
  • CTP cytidine 5 'triphosphate
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked via ⁇ , CC-l, l bonds. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, CLA and Panek,
  • Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is released naturally into the surrounding medium, from which it can be obtained by methods known in the art.
  • transporter proteins for transporting different carbon sources into the cell, e.g. transporter proteins for sugar, such as glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose or raffinose, as well as transporter proteins for starch or cellulose degradation products.
  • Other transport systems are used to import alcohols (e.g. methanol or ethanol), alkanes, fatty acids and organic acids such as acetic acid or lactic acid.
  • sugars can be transported into the cell via the cell membrane by a variety of mechanisms.
  • sugar phosphotransferase system one of the most common methods for sugar intake. This system not only catalyzes the translocation (with accompanying phosphorylation) of sugars and hexitols, but also regulates cellular metabolism depending on the availability of carbohydrates.
  • PTS sugar phosphotransferase system
  • the PTS system consists of two cytoplasmic proteins, enzyme I and HPr, and a variable number of sugar-specific integral and peripheral membrane transport complexes (which are each called “enzyme II” with a sugar-specific superscript, eg enzyme n ⁇ iu » f for the glucose-binding enzyme II complex).
  • Enzymes II which are specific for mono-, di- or oligosaccharides, such as glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose and others, are known.
  • Enzyme I transfers phosphoryl groups from phosphoenol pyruvate (PEP) to the phosphoryl carrier protein HPr. HPr then transfers the phosphoryl groups to various enzyme II transport complexes.
  • the amino acid sequences of enzyme I and HPr are quite similar in all bacteria, but the sequences for PTS transporters can be divided into structurally unrelated families. The number and homology between these genes varies from bacterium to bacterium.
  • the E. coli genome encodes 38 different PTS proteins, 33 of which are subunits belonging to 22 different transporters.
  • the genitalium M. genome each contains 1 gene for enzyme I and HPr, and only two genes for PTS transporters.
  • the T. palladium and C. trachomatis genomes contain genes for enzyme I and HPr-like proteins, but not for PTS transporters.
  • All PTS transporters consist of three functional units IIA, IIB and IIC, which occur either as protein subunits in a complex (eg IIA Glc IICB Glc ) or as domains of a single polypeptide chain (eg IICBA Glc NAc).
  • IIA and IIB successively transfer phosphoryl groups from HPr to the transported sugars.
  • IIC contains the sugar binding site and spans the inner membrane six or eight times. Sugar translocation is linked to the transient phosphorylation of the IIB domain.
  • the enzyme I, HPr and IIA are phosphorylated on the histidine residues, whereas the IIB subunits are phosphorylated either on the cysteine or the histidine residues, depending on the transporter involved.
  • the phosphorylation of the imported sugar has the advantage that the diffusion of the sugar through the cell membrane back into the extracellular medium is blocked, since the charged phosphate group cannot easily cross the hydrophobic core of the membrane.
  • PTS proteins In addition to their function in the active transport of sugars, some PTS proteins play a role in intracellular signal transduction. These subunits regulate their targets either allosterically or through phosphorylation. Their regulatory activity varies with the extent of their phosphorylation (i.e. the ratio of the non-phosphorylated to the phosphorylated form), which in turn depends on the ratio of the sugar-dependent
  • the activity of HPr is modulated by HPr-specific serine kinases and phosphatases. For example.
  • HPr which is phosphorylated on serine 46, acts as the corepressor of the transcription repressor CcpA.
  • unphosphorylated enzyme I inhibits the CheA sensor kinase of the bacterial chemotaxis machinery, creating a direct link between the sugar binding and the transport systems of the bacterium and those systems that cause bacterial movement (Sonenshein, AL et al., Ed. Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria.
  • ASM Washington, DC; Neidhard, FC et al., Ed. (1996) Escherichia coli and Salmonella. ASM Press Washington, DC; Lengeier et al., (1999) Biology of Pro karyotes, section II, pp. 68-87, Thie e-Verlag, Stuttgart).
  • the present invention is based, at least in part, on the discovery of new molecules, referred to here as PTS nucleic acid and protein molecules, which are involved in the uptake of high-energy carbon molecules (eg glucose, sucrose and fructose) in C. glutamicum and also in one or more intracellular signal transduction pathways in them
  • high-energy carbon molecules eg glucose, sucrose and fructose
  • the PTS molecules import high-energy carbon molecules into the cell, where the energy generated by their degradation is used to drive less energetic biochemical reactions. Your breakdown products can be used as intermediates or precursors for a number of other metabolic pathways.
  • the PTS molecules can participate in one or more intracellular signal transduction pathways, wherein the presence of a modified form of a PTS molecule (eg, a phosphorylated PTS protein) can participate in a signal transduction cascade that regulates one or more cell processes.
  • the activity of the PTS molecules according to the invention has an effect on the production of a desired fine chemical by this organism.
  • the PTS molecules according to the invention have a modulated activity, so that the yield, production or efficiency in the production of one or more fine chemicals from C. glutamicum are also modulated.
  • PTS protein or "PTS polypeptide” encompasses proteins that are involved in the absorption of one or more high energy
  • Carbon compounds e.g. mono-, di- or oligosaccharides such as fructose, mannose, sucrose, glucose, raffinose, galactose, ribose, lactose, maltose and ribulose
  • PTS proteins may also be involved in one or more intracellular signal transduction pathways, such as, but not limited to, those that cause various sugars to be incorporated into the cell.
  • Examples of PTS proteins include those encoded by the PTS genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • PTS gene or "PTS nucleic acid sequence” encompass nucleic acid sequences which encode a PTS protein which consists of a coding region and corresponding untranslated 5 'and 3' sequence regions. Examples of PTS genes are listed in Table 1.
  • production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (for example the desired fine chemical which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1)
  • efficiency of production encompasses the time it takes to achieve a certain amount of production (e.g. how long it takes the cell to set up a certain throughput rate of a fine chemical).
  • yield or "product / carbon yield” is in the Known in the art and includes the efficiency of converting the carbon source into the product (ie, the fine chemical) For example, it is usually expressed as kg of product per kg of carbon source. Increasing the yield or production of the compound increases the amount of molecules or suitable molecules of this compound obtained in a given amount of culture over a predetermined period of time.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated Process.
  • metabolism is known in the art and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism. The metabolism of a certain compound (eg the metabolism of an amino acid, such as glycine) then encompasses all the biosynthetic, modification and degradation pathways of this compound in the cell.
  • transport or “import” is known in the art and encompasses the facilitated movement of one or more molecules across a cell membrane through which the molecule cannot otherwise pass.
  • the PTS molecules according to the invention are capable of modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • a microorganism such as C. glutamicum.
  • one or more PTS proteins according to the invention can be manipulated in such a way that their function is modulated.
  • a protein involved in the PTS-mediated import of glucose can be modified to have optimal activity, and the PTS system for importing glucose can thus deliver large amounts of glucose into the cell.
  • Glucose molecules are not only used as an energy source for energetically unfavorable biochemical reactions, such as the biosynthesis of fine chemicals, but also as precursors and intermediates in a number of fine chemical biosynthetic pathways (e.g.
  • HPr can be constitutively activated, and thus sugar transport into the cell can be increased, which in turn means larger intracellular energy stores and intermediate / precursor molecules for the biosynthesis of one or more desired fine chemicals guaranteed.
  • the genome of a Corynebacterium glutamicum strain which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032, is suitable as a starting point for producing the nucleic acid sequences according to the invention.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be produced from these nucleic acid sequences by conventional methods using the changes described in Table 1.
  • the PTS protein according to the invention or a biologically active section or fragments thereof can be involved in the transport of high-energy carbon-containing molecules, such as glucose, in C. glutamicum or in an intracellular signal transduction in this microorganism, or one or more of the activities listed in Table 1 exhibit.
  • One aspect of the invention relates to isolated nucleic acid molecules which encode PTS polypeptides or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are for use as
  • Hybridization probes or primers are sufficient to identify or amplify PTS-encoding nucleic acids (eg PTS-DNA).
  • nucleic acid molecule is intended to encompass DNA molecules (eg cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (eg mRNA) as well as DNA or RNA analogs which are generated by means of nucleotide analogs. This term also includes the untranslated at the 3 'and 5' ends of the coding gene region Sequence: at least about 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least about 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' end of the coding gene region.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably a double-stranded DNA.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • An “isolated” nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example, sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid ).
  • the isolated PTS nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the Flank the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. glufcamicum cell).
  • an "isolated" nucleic acid molecule such as a cDNA molecule, can be essentially free of another cellular material or culture medium if it is made by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be produced using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a C. glutamicum PTS cDNA can be isolated from a C. glutamicum bank by using a complete sequence from Appendix A or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J. , Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • cDNA can be obtained by means of reverse transcriptase (for example Moloney-MLV- Reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc. , St. Louis, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV- Reverse transcriptase, available from Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc. , St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to a PTS nucleotide sequence can be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid molecule which is complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A or a portion thereof, which is a nucleic acid molecule which is sufficiently complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A that it can hybridize to one of the sequences given in Appendix A, creating a stable duplex.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof, the one
  • the term "sufficiently homologous" refers to proteins or portions thereof whose amino acid sequences have a minimal number of identical or equivalent amino acid residues (e.g. an amino acid residue with a side chain similar to an amino acid residue in one of the sequences of Appendix B) to an amino acid sequence from Appendix B so that the protein or a portion thereof can transport high-energy carbon molecules such as glucose in C. glutamicum and can also be involved in the intracellular signal transduction in this microorganism.
  • Protein components of these metabolic pathways as described here, transport high-energy carbon-containing molecules such as glucose in C. glutamicum and are also able to of intracellular signal transduction in this microorganism. Examples of these activities are also described here.
  • the "function of a PTS protein” relates to the complete functioning and / or the regulation of one or more sugar transport routes based on phosphoenolpyruvate. Table 1 gives examples of the PTS protein activities.
  • Sections of proteins which are encoded by the PTS nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active sections of one of the PTS proteins.
  • the term "biologically active section of a PTS protein", as used here, is intended to include a section, for example a domain or a motif, of a PTS protein which contains high-energy carbon-containing molecules, such as glucose, in C. glutamicum can transport, or can be involved in the intracellular signal transduction in this microorganism, or has an activity given in Table 1.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out , These test methods, as described in detail in Example 8 of the example part, are familiar to the person skilled in the art.
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded PTS protein without affecting the functionality of the PTS protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be prepared in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue can be changed in a wild-type sequence from one of the PTS proteins (Appendix B) without changing the activity of the PTS protein, whereas an "essential" amino acid residue is required for the PTS protein activity .
  • other amino acid residues for example non-conserved or only semi-preserved amino acid residues in the domain with PTS activity
  • An isolated nucleic acid molecule that encodes a PTS protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be prepared by introducing one or more nucleotide substitutions, additions or deletions are generated in a nucleotide sequence from Appendix A, so that one or more amino acid substitutions, additions or deletions are introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A by standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • conservative amino acid substitutions are introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain.
  • Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (eg lysine, arginine, histidine), acidic side chains (eg aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains
  • non-polar side chains e.g. alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains e.g. threonine, valine, Isoleucine
  • aromatic side chains e.g. tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • a predicted non-essential amino acid residue in a PTS protein is thus preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the PTS coding sequence, for example by saturation uagenesis, and the resulting mutants can be examined for the PTS activity described here in order to identify mutants who maintain PTS activity.
  • the encoded protein can be expressed recombinantly, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example part).
  • vectors preferably expression vectors, containing a nucleic acid encoding a PTS protein (or a portion thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which stands for a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can replicate autonomously in a host cell into which they have been introduced (e.g. bacterial vectors, with bacterial origin of replication and episo alle mammal vectors).
  • vectors eg non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors are integrated into the genome of a host cell when it is introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are called "expression vectors".
  • expression vectors usually the expression vectors used in recombinant DNA techniques are in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (for example replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vector according to the invention comprises a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, which means that the recombinant expression vectors have one or more regulatory sequences selected on the basis of the host cells to be used for expression which are compatible with the nucleic acid sequence to be expressed is operatively linked.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / Translation system or in a host cell if the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to encompass promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the direct expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. The person skilled in the art is aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the host cell to be transformed, the extent of expression of the desired protein, etc.
  • the expression vectors according to the invention can be introduced into the host cells, so that proteins or peptides are thereby obtained , including fusion proteins or peptides that are encoded by the nucleic acids as described herein (e.g., PTS proteins, mutant forms of PTS proteins, fusion proteins, etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of PTS proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • PTS genes can be found in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells (with Baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al.
  • the recombinant expression vector can be transcribed and translated in vitro, for example using T7 promoter regulatory sequences and T7 polymerase.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which Glutathione-S-Transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A to the recombinant target protein is fused.
  • GST Glutathione-S-Transferase
  • the coding sequence of the PTS protein is cloned into a pGEX expression vector so that a vector is generated which encodes a fusion protein, comprising from the N-terminus to the C-terminus, GST - thrombin cleavage site - X protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant PTS protein that is not fused to GST can be obtained by cleaving the fusion protein with thrombin.
  • Suitable inducible non-fusion expression vectors from E. coli include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pETIld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETlld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a host bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector, so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as C. glutamicum (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). This change in the nucleic acid sequences according to the invention is carried out by standard DNA synthesis techniques.
  • the PTS protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943 ), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi, such as filamentous fungi, suitable include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, JF Peberdy et al., ed. , Pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the PTS proteins according to the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the PTS proteins according to the invention can be expressed in single-cell plant cells (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes such as crops).
  • plant expression vectors include those which are described in detail in: Bekker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM ⁇ (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus and Simian Virus 40.
  • suitable expression systems for prokaryotic and eukaryotic cells see chapters 16 and 17 from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used for the expression of the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-specific promoters (Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235-275), in particular promoters of T cell receptors
  • pancreatic-specific promoters e.g. neurofilament promoter; Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477
  • pancreatic-specific promoters e.g. milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166
  • mammary-specific promoters 10 e.g. milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166.
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:15 537-546).
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction.
  • RNA molecule that is antisense to the PTS mRNA is possible.
  • Regulatory sequences can be selected which are operably linked to a nucleic acid cloned in the antisense direction and which control the continuous expression of the antisense RNA molecule in a multiplicity of cell types, for example viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences are selected which control the constitutive, tissue-specific or cell type-specific expression 0 of antisense RNA.
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • a highly effective regulatory region the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • a further aspect of the invention relates to the host cells into which a recombinant expression vector according to the invention has been introduced.
  • the terms "host cell” and “recombinant host cell” are used interchangeably here. It goes without saying that these terms refer not only to a specific target cell, but also to the descendants or potential descendants of this cell. Because determined in successive generations due to mutation or environmental influences Modifications can occur, these offspring are not necessarily identical to the parental cell, but are still included in the scope of the term as used here.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • a PTS protein can be expressed in bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • bacterial cells such as C. glutamicum, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • CHO Chinese hamster ovary cells
  • COS cells Chinese hamster ovary cells
  • Other suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Corynebacterium glutamicum and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 3.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection” as used here are intended to encompass a large number of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (for example DNA) into a host cell, including calcium phosphate or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection or electroporation. Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene that encodes a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that confer resistance to drugs such as G418, hygromycin and methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding a PTS protein, or can be introduced on a separate vector.
  • a vector which contains at least a section of a PTS gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the PTS gene, for example to functionally disrupt it.
  • This PTS gene is preferably a Corynebacterium glutamicum PTS gene, however a homologue from a related bacterium or even from a mammalian, yeast or insect source can be used.
  • the vector is designed such that the endogenous PTS gene is functionally disrupted when homologous recombination occurs (ie no longer encodes a functional protein, also referred to as a "knockouf 'vector).
  • the vector may alternatively be designed such that the endogenous PTS gene is mutated or otherwise altered during homologous recombination, but still encodes the functional protein (for example the upstream regulatory region can be altered in such a way that the expression of the endogenous PTS protein is altered thereby)
  • PTS gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' end by additional nucleic acid of the PTS gene, which is a homologous recombination between the exogenous PTS gene carried by the vector and an endogenous PTS gene in a microorganism.
  • the additional flanking PTS nucleic acid is necessary for a Successful homologous recombination with the endogenous gene is sufficiently long.
  • the vector usually contains several kilobase flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) (see, for example, Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (e.g., by electroporation), and cells in which the introduced PTS gene is homologously recombined with the endogenous PTS gene are selected using methods known in the art.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • the inclusion of a PTS gene in a vector under the control of the lac operon enables e.g. expression of the PTS gene only in the presence of IPTG.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used for the production (ie expression) of a PTS protein.
  • the invention also provides methods for the production of PTS proteins using the host cells according to the invention.
  • the method comprises growing the invention host cell (into which a recombinant expression vector encoding a PTS protein has been introduced or into whose genome a gene encoding a wild-type or altered PTS protein has been introduced) in a suitable medium until the PTS Protein has been produced.
  • the method comprises isolating the PTS proteins from the medium or the host cell.
  • the nucleic acid molecules, proteins, protein homologs, fusion proteins, primers, vectors and host cells described here can be used in one or more of the following methods: identification of C. glutamicum and related organisms, mapping of genomes of organisms that are related to C. glutamicum are related, identification and localization of C. glutamicum sequences of interest, evolution studies, determination of PTS protein regions which are necessary for the function, modulation of the activity of a PTS protein; Modulating the activity of a PTS path; and modulating the cellular production of a desired compound, such as a fine chemical.
  • the PTS nucleic acid molecules according to the invention have a large number of uses. They can initially be used to identify an organism as Corynebacterium glutamicum or close relatives thereof.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. glutamicum genes.
  • the invention provides the nucleic acid sequences of a number of C. glutamicum genes.
  • Corynebacterium glutamicum itself is not pathogenic, but it is related to pathogenic species such as Corynebacterium diptheriae. The detection of such an organism is of significant clinical importance.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is useful not only when mapping the genome, but also for functional studies of C. glutamicuzn proteins.
  • the C. glutamicum genome can be cleaved, for example, and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally with the nucleic acid molecules according to the invention, pre- preferably probed with easily detectable markings; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of C.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related bacteria, such as Brevibacterium lactofermen turn.
  • the PTS nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the sugar intake system in which the molecules according to the invention are involved is used by many bacteria;
  • the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function.
  • This type of determination is valuable for protein technology studies and can provide an indication of which protein can tolerate mutagenesis without losing function.
  • PTS proteins with functional differences from the wild-type PTS proteins. These proteins may be improved in efficiency or activity, may be present in the cell in greater numbers than usual, or may be weakened in efficiency or activity.
  • the PTS molecules according to the invention can be modified in such a way that the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals is improved.
  • a PTS protein involved in glucose uptake in such a way that it has optimal activity, the extent of glucose uptake or the rate at which glucose is transported into the cell can be increased.
  • the breakdown of glucose and other sugars within the cell provides the energy that can be used to drive energetically unfavorable biochemical reactions, such as those involved in the biosynthesis of fine chemicals. This degradation also provides intermediate and precursor molecules for the biosynt certain fine chemicals such as amino acids, vitamins and cofactors.
  • the PTS molecules according to the invention can be involved in one or more intracellular signal transduction pathways which influence the yields and / or production rate of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • proteins that are necessary for the import of one or more sugars from the extracellular medium eg HPr, enzyme 1 or a building block of an enzyme-II complex
  • HPr high intracellular fructose-1,6-bisphosphate levels cause the phosphorylation of HPr on serine-46, whereupon this molecule can no longer participate in the transport of a sugar.
  • This intracellular sugar level, at which the transport system is switched off, may be sufficient to maintain the normal functioning of the cell, but is restrictive for the overproduction of the desired fine chemical. It is therefore desirable to modify the PTS proteins of the invention so that they are no longer susceptible to such negative regulation. This results in higher intracellular concentrations of one or more sugars, and by extension, more efficient production or greater yields of one or more fine chemicals from organisms which contain these mutant PTS proteins.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can be used to generate C. glutamicum or related Generate bacterial strains expressing mutant PTS nucleic acid and protein molecules so that the yield, production and / or efficiency of production of a desired compound is improved.
  • the desired compound can be a natural product of C. glutamicum, which comprises the end products of the biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic routes, and molecules which do not occur naturally in the metabolism of C. glutamicum, but which are derived from a C. glutamicum according to the invention. Trunk are produced.
  • Example 1 Preparation of the entire genomic DNA from Corynebacterium glutamicum ATCC13032
  • a culture of Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) was grown overnight at 30 ° C with vigorous shaking in BHI medium (Difco). The cells were harvested by centrifugation, the supernatant was discarded, and the cells were resuspended in 5 ml of buffer I (5% of the original olumen of the culture - all stated volumes are calculated for 100 ml of culture volume).
  • the composition of buffer I 140.34 g / 1 sucrose, 2.46 g / 1 MgS0 4 • 7 H 2 0, 10 ml / 1 KHP0 4 solution (100 g / l, adjusted to pH 6 with KOH, 7), 50 ml / 1 M12 concentrate (10 g / 1 (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g / 1 NaCl, 2 g / 1 MgS0 • 7 H 2 0, 0.2 g / 1 CaCl 2 , 0 , 5 g / 1 yeast extract (Difco), 10 ml / 1 trace element mixture (200 mg / 1 FeS0 4 • H0, 10 mg / 1 ZnS0 • 7 H 2 0, 3 mg / 1 MnCl 2 • 4 H 2 0, 30 mg / 1 H 3 B0 3, 20 mg / 1 CoCl 2 • 6 H 2 0, 1 mg / 1 NiCl 2 ⁇ 6H 2 0, 3 mg / 1 Na 2 Mo0 4 • 2 H 2 0, 500
  • the cell wall was degraded at 37 ° C. and the protoplasts obtained were harvested by centrifugation All was washed once with 5 ml of buffer I and once with 5 ml of TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). The pellet was resuspended in 4 ml TE buffer and 0.5 ml SDS solution (10%) and 0.5 ml NaCl solution (5 M) were added. After adding Proteinase K at a final concentration of 200 ⁇ g / ml, the suspension was incubated at 37 ° C. for about 18 hours.
  • the DNA was purified by extraction with phenol, phenol-chloroform-isoayl alcohol and chloroform-isoamyl alcohol using standard procedures. Then the DNA was precipitated by adding 1/50 volume of 3 M sodium acetate and 2 volumes of ethanol, followed by incubation for 30 min at -20 ° C and 30 min centrifugation at 12000 rpm in a high-speed centrifuge with an SS34 rotor (Sorvall) , The DNA was dissolved in 1 ml of TE buffer containing 20 ⁇ g / ml RNase A and dialyzed against 1000 ml of TE buffer at 4 ° C. for at least 3 hours. During this time the buffer was exchanged 3 times.
  • Plasmids pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 75: 3737-3741) found particular use; pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmids of the pBS series (pBSSK +, pBSSK- and others; Stratagene, LaJolla, USA) or cosmids, such as SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) or Lorist6 (Gibson, TJ Rosenthal, A., and Waterson, RH (1987) Gene 53: 283-286.
  • Genomic banks as described in Example 2, were used for DNA sequencing according to standard methods, in particular the chain termination method with ABI377 sequencing machines (see, for example, Fleischman, RD et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269; 496-512)
  • the sequencing primers with the following nucleotide Sequences were used: 5 '-GGAAACAGTATGACCATG-3' or 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.
  • In vivo mutagenesis of Corynebacterium glutamicum can be carried out by passing a plasmid (or other vector) DNA through E. coli or other microorganisms (eg Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae), which maintain the integrity of their cannot maintain genetic information.
  • E. coli or other microorganisms eg Bacillus spp. Or yeasts such as Saccharomyces cerevisiae
  • Usual mutator strains have mutations in the genes for the DNA repair system (e.g., utHLS, mutD, mutT, etc., for comparison see Rupp, WD (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, pp. 2277-2294, ASM : Washington). These strains are known to the person skilled in the art. The use of these strains is, for example, in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 illustrates.
  • Example 5 DNA transfer between Escherichia coli and Corynej bacterium glutamicum
  • Corynebacterium and Brevijbacfceritzrn species contain endogenous plasmids (such as pHMl519 or pBLl) that replicate autonomously (for an overview see, for example, Martin, JF et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146).
  • Shuttle vectors for Escherichia coli and Corynejacterium glutamicum can easily be constructed using standard vectors for E. coli (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press or Ausubel , FM et al.
  • origins of replication are preferably obtained from endogenous plasmids isolated from Corynebacterium and BreviJbactertium species.
  • transformation markers for these species are genes for kanamycin resistance (such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon) or for Chlora phenicol (Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology , VCH, Weinheim)
  • kanamycin resistance such as those derived from the Tn5 or Tn-903 transposon
  • Chlora phenicol Winnacker, EL (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology , VCH, Weinheim
  • glutamicum and which can be used for various purposes, including gene overexpression (See, e.g., Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. (1992 ) Genes 102: 93-98).
  • gene overexpression See, e.g., Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, JF et al., (1987) Biotechnology, 5: 137-146 and Eikmanns, BJ et al. (1992 ) Genes 102: 93-98).
  • Using standard methods it is possible to clone a gene of interest into one of the shuttle vectors described above and to introduce such hybrid vectors into Corynebacterium glutamicum strains.
  • the transformation of C. glutamicum can be
  • Transfer shuttle vectors for C. glutamicum to E. coli by preparing Plas id DNA from C. glutamicum (using standard methods known in the art) and transforming it into E. coli. This transformation step can be carried out using standard methods, but an Mcr-deficient E. coli strain is advantageously used, such as NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19).
  • Example 6 Determination of the expression of the utant protein
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant gene is to carry out a Northern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols) in Molecular Biology, Wiley: New York), wherein a primer that is designed to bind to the gene of interest is provided with a detectable (usually radioactive or chemiluminescent) label so that - if the total RNA is one Culture of the organism extracted, separated on a gel, transferred to a stable matrix and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the probe indicates the presence and also the amount of mRNA for this gene.
  • a detectable label usually radioactive or chemiluminescent
  • Total cell ENA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, as described in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Standard techniques such as Western blot, can be used to determine the presence or the relative amount of protein that is translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York).
  • total cell proteins are extra- , separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the mutant protein sought in the cell.
  • Example 7 Growth of genetically modified Corynebacterium glutamicum media and growing conditions
  • Corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for Corynebakterian are known and readily available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag).
  • These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media via complex compounds such as molasses or other by-products from sugar refining. It can also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are alcohols and organic acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds. Exemplary nitrogen sources include ammonia gas or ammonium salts, such as NHC1 or (NH 4 ) 2 S0, NH 4 OH, nitrates,
  • Urea amino acids or complex nitrogen sources such as corn steep liquor, soy flour, soy protein, yeast extracts, meat extracts and others.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus, or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols such as catechol or protocatechuate or organic acids such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as Vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • Growth factors and salts often come from complex media components such as yeast extract, molasses, corn steep liquor and the like.
  • the exact composition of the media connections depends heavily on the respective experiment and is decided individually for each case. Information about media optimization is available from the textbook "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach” (Ed. PM Rhodes, PF Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3).
  • Growth media can also be obtained from commercial suppliers, such as Standard 1 (Merck) or BHI (Brain heart infusion, DIFCO) and the like.
  • All media components are sterilized, either by heat (20 min at 1.5 bar and 121 ° C) or by sterile filtration.
  • the components can be sterilized either together or, if necessary, separately. All media components can be present at the beginning of the cultivation or can be added continuously or in batches.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH value can also be kept constant during the cultivation by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components such as yeast extract are used, the need for additional buffers is reduced, since many complex compounds have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the incubation period is usually in the range of several hours to several days. This time is selected so that the maximum amount of product accumulates in the broth.
  • the disclosed growth experiments can be carried out in a variety of containers, such as microtiter plates, glass tubes, glass flasks or glass or metal fermenters of different sizes.
  • the microorganisms should be grown in microtiter plates, glass tubes or shake flasks either with or without baffles. It is preferable to use 100 ml shake flasks containing 10% (by volume) of the required growth medium. are filling.
  • the flasks should be shaken on a rotary shaker (amplitude 25 mm) at a speed in the range of 100-300 rpm. Evaporation losses can be reduced by maintaining a humid atmosphere; alternatively, a mathematical correction should be carried out for the evaporation losses.
  • the medium is seeded to an OD 600 of 0.5-1.5 using cells grown on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which were incubated at 30 ° C.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also known as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for use in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The activity of membrane transport proteins can be determined according to the techniques described in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; and 270-322.
  • the effect of the genetic modification in C. glutamicum on the production of a desired compound can be determined by culturing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components are examined for the increased production of the desired product (ie an amino acid).
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89- 90 and pp.
  • the analytical methods include measurements of the amount of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites from biosynthetic pathways and measurements of gases that are generated during fermentation. Standard methods for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein.
  • nutrients in the medium e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions
  • Example 10 Purification of the desired product from C. glutamicum culture
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the C. glutamicum cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is kept for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification procedures is subjected to chromatography with an appropriate resin, either with the desired molecule retained on the chromatography resin but not with many contaminants in the sample, or with the contaminants remaining on the resin but not the sample. If necessary, these chromatography steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and the most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by standard techniques in the art. These include high-performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin-layer chromatography, NIRS, enzyme test or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp.
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • NIRS enzyme test or microbiological tests.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuremoleküle, deren Verwendung zur Konstruktion von gentechnisch verbesserten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Aminosäuren mit Hilfe dieser gentechnisch verbesserten Mikroorganismen.

Description

Gene die für Phosphoenolpyruvat-Zucker-phosphotransferase Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich- orkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die. gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteino- gene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Corynebacterium glutamicum, ein gram-positives, nicht-pathogenes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäuremoleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Corynebacterium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicum ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien, und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden gemeinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoieküle können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicum selbst ist zwar nicht- pathogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie CoryneJacteriurn diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zudem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. glutamicum- Genoms oder von Genomen verwandter Organismen dienen.
Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als Phosphoenolpyruvat : Zucker-Phosphotransferasesystem- (PTS) -Proteine bezeichnet werden. Diese PTS-Proteine können bspw. energiereiche kohlenstoffhaltige Moleküle, wie Glucose, in C. glutamicum transportieren oder in diesen Mikroorganismen an der intrazellulären Signaltransduktion teilnehmen. Aufgrund der Verfügbarkeit von Klonierungsvektoren zur Verwendung in Corynebacterium glutamicum, wie bspw. offenbart in Sinskey et al., US-Patent Nr. 4 649 119, und Techniken zur genetischen Manipulation von C. glutamicum und den verwandten BreviJbacterϊum-Arten (z.B. Lactofermentum) Yoshi- hama et al . , J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597; Katsu ata et al., J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311; und Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2237-2246), lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um es als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser und effizienter zu machen. Die er- findungsgemäßen PTS-Moleküle lassen sich so modifizieren, daß die Ausbeute, Produktion und/oder die Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien verbessert wird. Modifiziert man bspw. ein an der Glucose-Auf hme beteiligtes PTS-Protein derart, daß seine Aktivität optimiert ist, kann die Menge der aufgenommenen Glucose oder die Geschwindigkeit, mit der die Glucose in die Zelle befördert wird, erhöht werden. Der Abbau von Glucose und anderen Zuckern in der Zelle liefert Energie, mit der sich energetisch ungünstige biochemische Reaktionen antreiben lassen, wie z.B. solche, die an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt sind. Dieser Abbau stellt zudem
Zwischen- und Vorstufen-Moleküle bereit, die für die Biosynthese bestimmter Feinchemikalien nötig sind, wie Aminosäuren, Vitamine und Cofaktoren. Durch Erhöhen der Menge an intrazellulären energiereichen Kohlenstoff-Molekülen über die Modifikation der erfindungsgemäßen PTS-Moleküle läßt sich daher sowohl die
Energie, die zur Durchführung der für die Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien nötigen Stoffwechselwege verfügbar ist, als auch der intrazelluläre Pool an Metaboliten, die für diese Produktion nötig sind, vergrößern.
Die erfindungsgemäßen PTS-Moleküle können ferner an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sein, die die Ausbeuten und/oder die Geschwindigkeit der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von C. glutamicum beein- flussen. Proteine, die bspw. für den Import von einem oder mehreren Zuckern aus dem extrazellulären Medium nötig sind (bspw. Hpr, Enzym I, oder ein Bestandteil des Enzym-II-Komplexes) , werden bei Vorhandensein einer hinreichenden Menge Zucker in der Zelle häufig posttranslational modifiziert, so daß sie diesen Zucker nicht mehr importieren können. Die Zuckermenge, bei der das TransportSystem abgeschaltet wird, reicht zwar zur Aufrecht- erhaltung der normalen Zellfunktionen aus, jedoch schränkt sie die Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie ein. Es empfiehlt sich daher, die erfindungsgemäßen PTS-Proteine zu modifizieren, so daß sie auf eine solche negative Regulation nicht mehr ansprechen. Dadurch lassen sich höhere intrazelluläre Konzentrationen eines oder mehrerer Zucker und durch Extension eine effizientere Produktion oder höhere Ausbeuten von einer oder mehreren Feinchemikalien aus Organismen erzielen, die diese mutanten PTS-Proteine enthalten.
Diese Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die die hier als Phosphoenolpyruvat : Zucker-Phosphotransferasesystem- (PTS) -Proteine bezeichneten Proteine codieren, welche bspw. am Import energiereicher Kohlenstoff-Moleküle (z.B. Glucose, Fructose oder Saccharose) in C. glutamicum und/oder an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum beteiligt sein können. Nukleinsäuremoleküle, die ein PTS-Protein codieren, werden hier als PTS-Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das PTS-Protein am Import von energiereichen Kohlenstoff-Molekülen (z.B. Glucose, Fructose oder Saccharose) in C. glutamicum beteiligt und kann an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum beteiligt sein. Beispiele für solche Proteine sind diejenigen, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsäuremoleküle (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidseguenz, die ein PTS-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridi- sierungssonden zum Nachweisen oder zur Amplifikation von PTS- codierender Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotid- sequenzen oder den codierenden Bereich oder ein Komplement davon. In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen PTS-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen PTS-Aktivitaten. Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nuklein- säuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker bevorzugt ein natürlich vorkommendes C. glutamicum-PTS-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird zur Herstellung eines PTS-Proteins eine Wirtszelle verwendet, die in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das PTS-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Mikroorganismus, bei dem ein PTS-Gen eingebracht oder verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungsge ä- ßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte PTS- Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes PTS-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten PTS-Gen verändert, z.B. funktionell disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder JBreviJbacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure, besonders bevorzugt Lysin, verwendet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäur^sequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sic_λäufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes PTS- Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt davon. Das isolierte PTS-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform am Import von energiereichen Kohlenstoff-Molekülen (bspw. Glucose, Fructose oder Saccharose) in C. glutamicum und zudem an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum beteiligt sein. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte PTS- Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt weiterhin am Import von energiereichen Kohlenstoff-Mole- külen (bspw. Glucose, Fructose oder Saccharose) in C. glutamicum und/oder an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen von C. glutamicum teilnehmen kann.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes PTS-Proteinpräparat . Das PTS-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängen- protein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist.
Das PTS-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-PTS-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das PTS-Protein allein und ergibt bei anderen bevorzugten Aus- führungsformen erhöhte Ausbeuten, eine erhöhte Produktion und/ oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie aus C. glutamicum. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen PTS-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer PTS- Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls aus einem Mikroorganismus. Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz , die die PTS-Proteinaktivität oder die PTS-Nukleinsäure- Expression moduliert, so daß eine zeilassoziierte Aktivität ver- glichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verändert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich der Aufnahme eines oder mehrerer Zucker moduliert, so daß die Ausbeuten oder die Geschwindigkeit der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert wird. Die Substanz, die die PTS-Proteinaktivität moduliert, stimuliert bspw. die PTS-Proteinaktivität oder die PTS-Nukleinsäure-Expression. Beispiele von Substanzen, die die PTS-Proteinaktivität oder die PTS-Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive PTS-Proteine und Nukleinsäuren, die PTS-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele von Substanzen, die die PTS- Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und Antisense-PTS-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines PTS-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung aus der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung stellt PTS-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle bereit, die an der Aufnahme energiereicher Kohlenstoff- Moleküle (bspw. Saccharose, Fructose oder Glucose) in C. glutamicum sind sowie auch an intrazellulären Signaltransduktionswegen in diesem Mikroorganismus beteiligt sein können. Die erfindungs- ge äßen Moleküle lassen sich bei der Modulation der Produktion von Feinchemikalien von Mikroorganismen verwenden. Diese Modulation kann auf erhöhten intrazellulären Spiegeln energiereicher Moleküle beruhen, die zur Erzeugung von bspw. ATP, GTP und anderen Molekülen, benötigt werden, die zum Antreiben energetisch ungünstiger biochemischer Reaktionen in der Zelle, bspw. der Biosynthese einer Feinchemikalie, verwendet werden. Diese Modulation der Feinchemikalien-Produktion kann auch auf der Tatsache beruhen, daß die Abbauprodukte vieler Zucker als Zwischenprodukte oder Vorstufen für andere Biosynthesewege dienen, einschließlich denen bestimmter Feinchemikalien. Ferner sind PTS-Proteine bekanntlich an bestimmten intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt, die für einen oder mehrere Stoffwechselwege von Feinchemikalien regulatorische Aktivität aufweisen können; durch Manipulation dieser PTS-Proteine kann man daher einen Feinchemikalien-Biosyntheseweg aktivieren oder einen Feinchemikalien- Abbauweg reprimieren. Die erfindungsgemäßen Aspekte werden nachstehend weiter erläutert .
I. Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, und Kosmetik-Industrie . Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diamino- pimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidon- säure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Co- faktoren (wie beschrieben in Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Litera- tursteilen, beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert .
A. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über
Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht- proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ulimann' s Encyclo- pedia of Industrial Che istry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)) . Die Aminosäuren können in der D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry,
3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosyntheseswege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschaftsund pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv
(Mononatriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetik- industrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim) . Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Che istry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weihheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533 - 606) . Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure- Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse) , und ergibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homo- cystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seiten- ketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse- und Pentose- phosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalanin- hydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin her- stellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoff- wechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure-Bio- synthesewegen, siehe Stryer, L. , Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Vi tamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwen düngen
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfs- stoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ull- ann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Ver- bindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittel- zusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehr- fach ungesättigte Fettsäuren) .
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH:' Weinheim, 1996, Michal,. G. (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert . Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmono- nukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B6" bezeich- net werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5 ' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methyl- pyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+) -N- (2 , 4-Dihydroxy- 3 , 3-dimethyl-l-oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP- getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure . Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5 '-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine ge- hören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Gluta insäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechselzwischenprodukten Guanosin- 5 ' -triphosphat (GTP) , L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bι ) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin Bι ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt . Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größten- teils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin Bß, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin Bχ wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-StoffWechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleo- tid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose- Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzerogenen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikations-Fähigkeit von Tumorzellen hemmen.
Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10: 505-548). Untersuchungen an
Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; Bioche . Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als GeschmacksVerstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612). Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in : Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin- Metabolis us, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell . Ein gestörter Purin-Metabo- lismus in höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 ' -phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5 ' -monophosphat (GMP) oder Adenosin-5 ' -monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau
Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 '-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat . UMP wiederum wird in Cytidin-5 ' -triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxy- formen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduk- tionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über α,CC-l,l- Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet . Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467; Paiva, C.L.A. und Panek,
A.D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314; und Shiosaka, M.J. Japan 172 (1997) 97-102) . Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Ver- fahren gewonnen werden kann.
II. Das Phosphoenolpyruvat :Zucker-Phosphotransferase-System
Die Fähigkeit von Zellen, zu wachsen und sich rasch in Kultur zu teilen ist zu einem hohen Grad vom Ausmaß abhängig, mit dem die Zellen energiereiche Moleküle aufnehmen und nutzen können, wie Glucose und andere Zucker. Es gibt unterschiedliche Transporterproteine zum Transport unterschiedlicher Kohlenstoffquellen in die Zelle, bspw. Transportproteine für Zucker, wie Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose oder Raffinose, sowie auch Transportproteine für Stärke- oder Zelluloseabbauprodukte. Andere Transportsysteme dienen dem Import von Alkoholen (z.B. Methanol oder Ethanol) , Alkanen, Fettsäuren und organischen Säuren, wie Essigsäure oder Milchsäure. In Bakterien können Zucker durch eine Vielzahl von Mechanismen über die Zellmembran in die Zelle befördert werden. Neben dem Zucker-Protonen-Syport ist das bakterielle Phospho- enolpyruvat : Zucker-Phosphotransferase-System (PTS) eines der gebräuchlichsten Verfahren für die Zuckerauf ahme. Dieses System katalysiert nicht nur die Translokation (mit einhergehender Phos- phorylierung) von Zuckern und Hexitolen, sondern reguliert auch den zellulären Metabolismus in Abhängigkeit der Verfügbarkeit von Kohlenhydraten. Diese PTS-Systeme sind in Bakterien ubiquitär, kommen aber nicht in Archebakterien oder Eukaryonten vor. Das PTS-System besteht funktioneil aus zwei cytoplasmatischen Proteinen, Enzym I und HPr, und einer variablen Anzahl zucker- spezifischer integraler und peripherer Membran-Transportkomplexe (die jeweils als "Enzym II" mit einer zuckerspezifischen Hochstellung bezeichnet werden, z.B. Enzym nβiu» fur den glucose- bindenen Enzym-II-Komplex) . Enzyme II, die für Mono- Di- oder Oligosaccharide, wie Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ri- böse, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose und andere spezifisch sind, sind bekannt. Das Enzym I überträgt Phosphorylgruppen von Phosphoenolpyruvat (PEP) auf das Phos- phoryl-Trägerprotein HPr. HPr überträgt dann die Phosphorylgruppen auf verschiedene Enzym-II-Transportkomplexe . Die Amino- säuresequenzen von Enzym I und HPr sind zwar in allen Bakterien recht ähnlich, jedoch lassen sich die Sequenzen für PTS-Trans- porter in strukturell unverwandte Familien unterteilen. Die Anzahl und die Homologie zwischen diesen Genen variiert von Bakterium zu Bakterium. Das E. coli-Genom codiert 38 unter- schiedliche PTS-Proteine, von denen 33 Untereinheiten sind, die zu 22 verschiedenen Transportern gehören. Das M. genitalium-Genom enthält jeweils 1 Gen für Enzym I und HPr, und nur zwei Gene für PTS-Transporter. Die Genome von T. palladium und C. trachomatis enthalten Gene für Enzym-I- und HPr-ähnliche Proteine, nicht aber für PTS-Transporter.
Sämtliche PTS-Transporter bestehen aus drei funktioneilen Einheiten IIA, IIB und IIC, die entweder als Proteinuntereinheiten in einem Komplex (z.B. IIAGlcIICBGlc) oder als Domänen einer einzigen Polypeptidkette (z.B. IICBAGlcNAc) vorkommen. IIA und IIB übertragen nacheinander Phosphorylgruppen von HPr auf die transportierten Zucker. IIC enthält die Zuckerbindungsstelle und überspannt die Innenmembran sechs oder acht Mal. Die Zuckertrans- lokation ist mit der transienten Phosphorylierung der IIB-Domäne gekoppelt. Das Enzym I, HPr und IIA werden an den Histidinresten phosphoryliert, wohingegen die IIB-Untereinheiten je nach dem beteiligten Transporter entweder an den Cystein- oder den Histidinresten phosphoryliert sind. Die Phosphorylierung des importierten Zuckers hat den Vorteil, daß die Diffusion des Zuckers durch die Zellmembran zurück in das extrazelluläre Medium blockiert wird, da die geladene Phosphatgruppe den hydrophoben Kern der Membran nicht leicht durchqueren kann.
Einige PTS-Proteine spielen neben ihrer Funktion beim aktiven Transport von Zuckern eine Rolle bei der intrazellulären Signal- transduktion. Diese Untereinheiten regulieren ihre Ziele entweder allosterisch oder durch Phosphorylierung. Ihre regulatorische Aktivität variiert mit dem Ausmaß ihrer Phosphorylierung (d.h. dem Verhältnis der nicht-phosphorylierten zur phosphorylierten Form) , das wiederum mit dem Verhältnis der zuckerabhängigen
Dephosphorylierung und der Phosphoenolpyruvat-abhängigen Rephos- phorylierung variiert. Beispiele einer solchen intrazellulären Regulation durch PTS-Proteine in E. coli umfassen die Hemmung von Glycerinkinase durch dephosphoryliertes IIAGlc, und die Akti- vierung der Adenylatcyclase durch die phosphorylierte Version dieses Proteins . Die HPr- und IIB-Domänen einiger Transporter in diesen Mikroorganismen regulieren die Genexpression durch reversible Phosphorylierung der Transkriptionsantiterminatoren. In gram-positiven Bakterien wird die Aktivität von HPr durch HPr- spezifische Serinkinasen und Phosphatasen moduliert. Bspw. wirkt HPr, das an Serin 46 phosphoryliert ist, als Corepressor des Transkriptions-Repressors CcpA. Schließlich hat man entdeckt, daß unphosphoryliertes Enzym I die Sensorkinase CheA der bakteriellen Chemotaxis-Maschinerie hemmt, was eine direkte Verbindung zwischen der Zuckerbindung und den Transportsystemen des Bakteri- u s und solchen Systemen schafft, die die Bakterienbewegung bewirken (Sonenshein, A.L. et al . , Hrsg. Bacillus subtilis und andere grampositive Bakterien. ASM: Washington, DC; Neidhard, F.C. et al., Hrsg. (1996) Escherichia coli und Salmonella. ASM Press Washington, DC; Lengeier et al., (1999) Biology of Pro- karyotes, Abschnitt II, S. 68-87, Thie e-Verlag, Stuttgart) .
III. Erfindungscremäße Elemente und Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als PTS-Nukleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden und an der Aufnahme energiereicher Kohlenstoffmoleküle (z.B. Glucose, Saccharose und Fructose) in C. glutamicum beteiligt sind und auch an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen in diesen
Mikroorganismen beteiligt sein können. Bei einer Ausführungsform importieren die PTS-Moleküle energiereiche Kohlenstoffmoleküle in die Zelle, wo die durch ihren Abbau erzeugte Energie zum Antreiben energetisch weniger begünstigter biochemischer Reaktionen eingesetzt wird. Ihre Abbauprodukte können als Zwischenprodukte oder Vorstufen für eine Reihe anderer Stoffwechselwege eingesetzt werden. Bei einer anderen Ausführungsform können die PTS-Moleküle an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen teilnehmen, wobei die Gegenwart einer modifizierten Form eines PTS-Moleküls (z.B. ein phosphoryliertes PTS-Protein) an einer Signaltransduktionskaskade teilnehmen kann, die einen oder mehrere Zellvorgänge reguliert. Die Aktivität der erfindungsgemäßen PTS-Moleküle hat bei einer bevorzugten Ausführungsform eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus . Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform haben die erfindungsgemäßen PTS-Moleküle eine modulierte Aktivität, so daß die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C. glutamicum ebenfalls moduliert sind.
Der Begriff "PTS-Protein" oder "PTS-Polypeptid" umfaßt Proteine, die an der Aufnahme von einer oder mehreren energiereichen
Kohlensto fVerbindungen (z.B. Mono-, Di- oder Oligosacchariden, wie Fructose, Mannose, Saccharose, Glucose, Raffinose, Galactose, Ribose, Lactose, Maltose und Ribulose) aus dem extrazellulären Medium ins Innere der Zelle beteiligt sind. Diese PTS-Proteine können ebenfalls am einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sein, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die die Aufnahme verschiedener Zucker in die Zelle bewirken. Beispiele für PTS-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten PTS-Genen codiert werden. Für allgemeine Literaturstellen bezüglich des PTS-Syste s siehe Stryer, L., (1988) Biochemistry. Kapitel 37: "Membrane Transport", W.H. Freeman: New York, S. 959-961; Darneil, J. et al. (1990) Molecular Cell Biology, Scientific American Books; New York, S. 552-553 und Michal, G. Hrsg. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular
Biology, Kapitel 15 "Special Bacterial Metabolism" . Die Ausdrücke "PTS-Gen" oder "PTS-Nukleinsäuresequenz" umfassen Nukleinsäure- sequenzen, die ein PTS-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3 ' -Sequenzbereichen besteht. Beispiele für PTS-Gene sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie, die innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet werden (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Durchsatzrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff "Ausbeute" oder "Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) , bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege dieser Ver- bindung in der Zelle. Der Begriff "Transport" oder "Import" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die erleichterte Bewegung eines oder mehrerer Moleküle über eine Zellmembran, durch die das Molekül ansonsten nicht gelangen kann.
Die erfindungsgemäßen PTS-Moleküle sind in einer anderen Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. glutamicum, zu modulieren. Mit Hilfe von Genrekombinationstechniken lassen sich ein oder mehrere erfindungsgemäße PTS-Proteine derart manipulieren, daß ihre Funktion moduliert ist. Bspw. kann ein Protein, das am PTS-vermittelten Import von Glucose beteiligt ist, so verändert werden, daß es optimale Aktivität aufweist, und das PTS-System für den Import von Glucose kann somit größere Mengen Glucose in die Zelle befördern. Glucosemoleküle werden nicht nur als Energiequelle für energetisch ungünstige biochemische Reaktionen, wie die Biosynthese von Feinchemikalien verwendet, sondern auch als Vorstufen und Zwischenprodukte bei einer Reihe von Feinchemikalien-Biosynthesewegen (bspw. wird Serin aus 3-Phosphoglycerat synthetisiert) . In jedem Fall läßt sich die Gesamtausbeute oder die Produktionsrate einer dieser gewünschten Feinchemikalien erhöhen, und zwar durch Erhöhen der Energie, die verfügbar ist, damit diese Produktion stattfindet, oder durch Vergrößern der Verfügbarkeit der Verbindungen, die nötig sind, damit diese Produktion stattfindet. Es ist zudem bekannt, daß viele PTS-Proteine eine Schlüsselrolle bei intrazellulären Signaltransduktionswegen spielen, die den Zellmetabolismus und die Zuckeraufnahme regulieren, indem sie die Verfügbarkeit von Kohlenstoffquellen aufrechterhalten. Man weiß bspw. , daß ein erhöhter intrazellulärer Spiegel von Fructose- 1, 6-bisphosphat (einer bei der Glycolyse erzeugten Verbindung) die Phosphorylierung eines Serinrestes von HPr bewirkt, was verhindert, daß dieses Protein in einem PTS-Zucker-Transportprozeß als Phosphoryldonor dient, wodurch die weitere Zuckeraufnahme blockiert wird. Mutagenisiert man HPr derart, daß dieser Serin- rest nicht phosphoryliert werden kann, kann man HPr konstitutiv aktivieren, und somit den Zuckertransport in die Zelle verstärken, was wiederum größere intrazelluläre Energiespeicher und Zwischenprodukt/Vorstufen-Moleküle für die Biosynthese von einer oder mehreren gewünschten Feinchemikalien gewährleistet.
Als Ausgangspunkt zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nuklein- säuresequenzen eignet sich das Genom eines Corynebacterium gluta- micurn-Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist.
Von diesen Nukleinsäuresequenzen lassen sich durch die in Tabelle 1 bezeichneten Veränderungen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit üblichen Verfahren herstellen.
Das erfindungsgemäße PTS-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragmente davon können am Transport von energiereichen kohlenstoffhaltigen Molekülen, wie Glucose, in C. glutamicum oder an einer intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein, oder können eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Aktivitäten aufweisen.
In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die PTS-Polypeptide oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als
Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Ampli- fizierung von PTS-codierenden Nukleinsäuren (z.B. PTS-DNA) hinreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül" soll DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) so- wie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 ' -Ende des codierenden Genbereichs gelegene untranslatierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 '-Endes des codierenden Genbereichs . Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppeisträngig sein, ist aber vorzugsweise eine doppeisträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird aus anderen Nukleinsäure olekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der geno- mischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte PTS-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. glufcamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül kann überdies im wesentlichen frei von einem anderen zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nuklein- säuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation hergestellt werden. Bspw. kann eine C. glutamicum-PTS-cDNA aus einer C. glutamicum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige Se- quenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungs- sonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nuklein- säuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen iso- lieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfah- ren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299) und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV- Reverse-Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase , erhältlich von Seikagaku America, Inc . , St . Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettereak- tion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen . Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß PCR-Standard-Amplifikati- onstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nuklein- säure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden . Oligonukleotide , die einer PTS-Nukleotidsequenz entsprechen, können durch Standard- Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA- Synthesegerät , hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungs- gemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres Nukleinsäuremolekül oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein Nukleinsäuremolekül handelt, das zu einer der in Anhang A ge- zeigten Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nuklein- säuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon weiterhin am Transport von energiereichen Kohlenstoffmolekülen (wie Glucose) in C. glutamicum und auch an einem oder meh- reren intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt sein kann. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter Aminosäurereste (bspw. ein Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon energiereiche Kohlenstoffmoleküle, wie Glucose, in C. glutamicum transportieren kann und zudem an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus betei- ligt sein kann. Proteinbestandteile dieser Stoffwechselwege transportieren, wie hier beschrieben, energiereiche kohlenstoffhaltige Moleküle wie Glucose in C. glutamicum und können auch an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein. Beispiele dieser Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit betrifft die "Funktion eines PTS-Proteins" das vollständige Funktionieren und/oder die Regulation von einem oder mehreren Zuckertransport-Wegen auf Phosphoenolpyruvat-Basis . In Tabelle 1 sind Beispiele der PTS-Proteinaktivitäten angegeben.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen PTS-Nu- kleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der PTS-Proteine. Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines PTS-Proteins", wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne oder ein Motiv, eines PTS-Proteins umfassen, die/das energiereiche kohlenstoffhaltige Moleküle, wie Glucose, in C. glutamicum transportieren kann, oder an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein kann, oder eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein PTS-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon am Transport von energiereichen kohlenstoffhaltigen Molekülen, wie Glucose, in C. glutamicum oder an der intrazellulären Signaltransduktion in diesem Mikroorganismus beteiligt sein kann, kann ein Test der enzy- matischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der PTS-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls dessen bewußt, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten PTS-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des PTS-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essen- tieller" Aminosäurerest läßt sich in einer Wildtypsequenz von einem der PTS-Proteine (Anhang B) verändern, ohne daß die Aktivität des PTS-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die PTS-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konservierte oder ledig- lieh semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit PTS-Akti- vität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die PTS-Aktivität verändert wird.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein PTS-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidseguenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken eingebracht werden, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-ver ittelte Mutagenese. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin) , sauren Seitenketten (z.B. Aspa- raginsäure, Glutaminsäure) , ungeladenen polaren Seitenketten
(z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einem PTS-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht . In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der PTS- codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungs u- tagenese, und die resultierenden Mutanten können auf die hier beschriebene PTS-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine PTS-Aktivität beibehalten. Nach der Mutage- nese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein PTS-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier ver- wendet betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppeisträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzlichen DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein vira- 1er Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Replikationsursprung und episo ale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht- episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet werden, die Form von Plas- miden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. re- plikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Der erfindungsgemäße rekombinante Expressionsvektor umfaßt eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, die mit der zu exprimieren- den Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden ist, umfaßt. In einem rekombinanten Exprtessionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem In-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulato- rische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem Ausmaß der Expression des gewünschten Proteins usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteinen oder -pepti- den, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. PTS-Proteine, mutante Formen von PTS-Proteinen, Fusionsproteine, usw. ) . Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von PTS-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryo- tischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können PTS-Gene in bakteriellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovi- rus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge) , Algen- und vielzelligen Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobact rium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit T7-Promotorregulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekom- binantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreini- gung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolyti- sche Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entspre- chenden ErkennungsSequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Ziel- protein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des PTS-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus, GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante PTS-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions-Expressionsvek- toren aus E. coli umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301 - 315) und pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor . Die Zielgenexpression aus dem pETlld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten vira- len RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausge- wählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res . 20: 2111 - 2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen erfolgt durch Standard-DNA-Synthesetechniken.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der PTS-Proteinexpres- sionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Bal- dari et al . , (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan und Hersko- witz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113 - 123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen PTS-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren ex- primiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170: 31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen PTS-Proteine in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Bek- ker, D. , Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res . 12: 8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert .. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDMδ (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Für weitere geeignete Ex- pressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe die Kapitel 16 und 17 aus Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nuklein- säure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1: 268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Im- munol. 43: 235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren
(Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733) und Immunglobu- 5 linen (Banerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33: 741-748), neuronspezifische Promotoren
(bspw. Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86: 5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., (1985) Science 230: 912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren 10 (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungs- regulierte Promoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249: 374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 15 537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. Dies bedeu-
20 tet, daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-.Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur PTS-mRNA antisense ist, möglich ist. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Rich- 5 tung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression 0 von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids , Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den 5 der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen, siehe Weintraub, H. et al . , Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
0 Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine be- 5 stimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein PTS-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzel- len des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführt .
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und " ransfektion", wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calcium- phosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-ver- mittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern.
Für die stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach verwendetem Expressionsvektor und verwendeter Transfekti- onstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifizierung und Selektion dieser Inte- granten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derje- nige, der ein PTS-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, überleben, wohingegen die anderen Zellen sterben) . Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines PTS- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das PTS-Gen zu verändern, bspw. funk- tionell zu disrumpieren. Dieses PTS-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glutamicum-PTS-Gen, jedoch kann ein Homologon von einem verwandten Bakterium oder sogar von einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene PTS-Gen bei homologer Rekombination funktionell disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert, ebenfalls bezeichnet als "Knockouf'-Vektor) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene PTS-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktioneile Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen PTS-Proteins verändert wird.). Der veränderte Abschnitt des PTS-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5 ' - und 3 ' -Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des PTS-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen PTS-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen PTS-Gen in einem Mikroorganismus, ermöglicht. Die zusätzliche flankierende PTS-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte PTS-Gen mit dem endogenen PTS-Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorga- nismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines PTS-Gens in einem Vektor unter der Kontrolle des Lac-Operons ermöglicht z.B. die Expression des PTS-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines PTS-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von PTS-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungs- gemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein PTS-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes PTS-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das PTS-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der PTS-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
C . Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- mologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kar- tierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. glutamicum-Se- quenzen von Interesse, EvolutionsStudien, Bestimmung von PTS-Pro- teinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines PTS-Proteins; Modulation der Aktivität eines PTS-Wegs; und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen PTS-Nukleinsäure oleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwandten davon verwendet werden. Sie können zudem zur Identifikation von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäure- sequenzen einer Reihe von C. glutamicum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer ein- heitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines C. glutamicum-Gens umfaßt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae, verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für funktio- nelle Studien von C. glutamicuzn-Proteinen nützlich. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. glutamicum- DNA-bindendes Protein bindet, kann das C. glutamicum-Genom bspw. gespalten werden, und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vor- zugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unter- schiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz , an die das Protein bindet . Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Bakterien, wie Brevibacterium lactofermen turn, dienen können.
Die erfindungsgemäßen PTS-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstrukturuntersuchungen. Das Zuk- keraufnahmesystem, an dem die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, wird von vielen Bakterien ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, welches Protein Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen PTS-Nukleinsäuremoleküle kann die Produktion von PTS-Proteinen mit funktioneilen Unter- schieden zu den Wildtyp-PTS-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein, oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein.
Die erfindungsgemäßen PTS-Moleküle können derart modifiziert sein, daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von einer oder mehreren Feinchemikalien verbessert ist. Durch derartige Modifikation eines an der Glucoseaufnahme betei- ligten PTS-Proteins, daß es optimale Aktivität aufweist, kann das Ausmaß der Glucoseaufnahme oder die Geschwindigkeit, mit der die Glucose in die Zelle befördert wird, vergrößert werden. Der Abbau von Glucose und anderen Zuckern innerhalb der Zelle stellt die Energie bereit, die zum Antrieb energetisch ungünstiger biochemi- scher Reaktionen, wie solchen, die an der Biosynthese von Feinchemikalien beteiligt sind, verwendet werden kann. Dieser Abbau stellt ebenfalls Zwischen- und Vorstufenmoleküle für die Biosynt- hese bestimmter Feinchemikalien, wie Aminosäuren, Vitamine und Cofactoren, bereit. Durch Erhöhung der Menge an intrazellulären energiereichen Kohlenstoffmolekülen durch Modifikation der erfindungsgemäßen PTS-Moleküle kann man daher die Energie, die zur Durchführung von Stoffwechselwegen, die zur Produktion von ein oder mehreren Feinchemikalien notwendig sind, verfügbar ist, und auch die intrazellulären Pools von Metaboliten, die für eine solche Produktion notwendig sind, vergrößern, umgekehrt kann man durch Senken des Imports eines Zuckers, dessen Abbauprodukte eine Verbindung umfassen, die nur in Stoffwechselwegen verwendet werden, die mit Stoffwechselwegen zur Produktion einer gewünschten Feinchemikalie um Enzyme, Cofaktoren oder Zwischenprodukte konkurrieren, diesen Stoffwechselweg herunterregulieren und somit vielleicht die Produktion durch den gewünschten Biosyntheseweg vergrößern.
Die erfindungsgemäßen PTS-Moleküle können an einem oder mehreren intrazellulären Signaltransduktionswegen, die die Ausbeuten und/ oder Produktionsrate von einer oder mehreren Feinchemikalien aus C. glutamicum beeinflussen, beteiligt sein. Bspw. werden Proteine, die für den Import von einem oder mehreren Zuckern aus dem extrazellulären Medium notwendig sind, (z.B. HPr, Enzym 1 oder ein Baustein eines Enzym-II-Komplexes) bei Anwesenheit einer hinreichenden Menge des Zuckers in der Zelle häufig posttranslatio- nal modifiziert, so daß sie nicht länger zum Import dieses Zuk- kers befähigt sind. Ein Beispiel hierfür erfolgt in E. coli, wo hohe intrazelluläre Fructose-1, 6-bisphosphatspiegel die Phosphorylierung von HPr an Serin-46 bewirken, woraufhin dieses Molekül nicht länger am Transport eines Zuckers teilnehmen kann. Dieser intrazelluläre Zuckerspiegel, bei dem das Transportsystem abgeschaltet wird, kann zwar hinreichend sein, um die normale Funktion der Zelle aufrechtzuerhalten, ist jedoch für die Überproduktion der gewünschten Feinchemikalie einschränkend. Es ist daher wünschenswert, die erfindungsgemäßen PTS-Proteine zu modifizie- ren, so daß sie nicht länger für eine solche negative Regulation empfänglich sind. Dadurch werden größere intrazelluläre Konzentrationen von einem oder mehreren Zuckern, und durch Exten- sion, eine effizientere Produktion oder größere Ausbeuten von einer oder mehreren Feinchemikalien aus Organismen, die diese mutanten PTS-Proteine enthalten, erzielt.
Diese vorstehend genannte Liste von Mutagenesestrategien für PTS- Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer gewünschten Verbindung bewirken sollen, soll nicht einschränkend sein; Variationen dieser Mutagenesestrategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Durch diese Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte PTS-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann ein natürliches Produkt von C. glutamicum sein, welches die Endprodukte der Biosynthesewege und Zwischenprodukte natürlich vorkommender etabo- lischer Wege sowie Moleküle umfaßt, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. glutamicum-Stamm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffent- lichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungs olumens der Kultur - sämtliche angegebenen Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Die Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KHP04-Lösung (100g/l, mit KOH eingestellt auf pH-Wert 6,7), 50 ml/1 M12-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2S04, 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgS0 • 7 H20, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 • H0, 10 mg/1 ZnS0 • 7 H20, 3 mg/1 MnCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03, 20 mg/1 CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl2 ■ 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo04 • 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat, 140 mg/1 Nikσtin- säure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myoinositol) . Ly- sozym wurde in einer Endkonzentration von 2 , 5 mg/ml zur Suspension gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zellwand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 μg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Pheno1-Chloro- form-Isoa ylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels Standard-Verfahren gereinigt. Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation bei 12000 U/min in einer HochgeschwindigkeitsZentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer gelöst, der 20 μg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht. Zu Aliquots von 0,4 ml der dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland) . Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2 : Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) -Banken in Escherichia coli
Ausgehend von DNA, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) Cos id- und Plasmid-Banken hergestellt.
Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl Acad. Sei. USA, 75: 3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134: 1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder Cos- mide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6 (Gib- son, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3 : DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA-Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science 269; 496-512) verwendet. Die Se uenzierprimer mit den folgenden Nukleotid- Sequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4 : In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geleitet wird, die die Inte- grität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten können. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-ReparaturSystem auf (z.B., utHLS, mutD, mutT, usw., zum Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7; 32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5: DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynejbac- terium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Brevijbacfceritzrn-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHMl519 oder pBLl) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5: 137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynejacterium glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al., (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium-- und BreviJbactertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chlora phenicol (Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Litera- tur zur Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum repliziert werden, und die für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162: 591-597, Martin, J.F. et al . , (1987) Biotechnology, 5: 137-146 und Eikmanns, B.J. et al. (1992) Gene 102: 93-98) . Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum- Stäm e einzubringen. Die Transformation von C. glutamicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al.,
(1984) J. Bacteriol. 159, 306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53: 399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die
Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plas id-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekannter Standard-Verfahren) präpariert wird und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Ver- fahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizien- ter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166: 1-19) .
Beispiel 6 : Bestimmung der Expression des utanten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mu- tante Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutanten Gens (ein Anzeichen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s. bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweisbaren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge von mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information ist ein Nachweis für das Ausmaß der Transkription des mutanten Gens . Gesamt-Zell-ENA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachge- biet bekannt sind, wie beschrieben in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge von Protein, das aus dieser mRNA translatiert wird, können Standard- Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesamt-Zellproteine extra- hiert, durch Gelelektrophorese getrennt, auf eine Matrix, wie Ni- trocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, inkubiert, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet. Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszierenden oder kolorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt . Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der Zelle an.
Beispiel 7 : Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedli- eher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol . 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoff- quellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte aus der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzu- geben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organische Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NHC1 oder (NH4)2S0 , NH4OH, Nitrate,
Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakte, Fleischextrakte und andere .
Anorganische SalzVerbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-, oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geei- gnete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat oder organische Säuren, wie Citronensäure . Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Ribofla- vin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten sind sterilisiert, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw. , können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der An- zucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Verbindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt. Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttel- kolben entweder mit oder ohne Schikanen gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums ge- füllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. VerdampfungsVerluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alter- nativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Korrektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollten auch ein un odifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet wer- den, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine OD600 von 0,5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten gezüchtet wurden, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypepton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH) , die bei 30°C inkubiert worden sind. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8 : In-vitro-Analyse der Funktion mutanter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Di- xon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl. Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J. , Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergenassays (wie beschrieben in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz- Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß den Techniken, wie beschrieben in Gennis, R.B. (1989) "Po- res, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322, erfolgen.
Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von imitiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie solchen, die vorstehend beschrie- ben sind) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten auf die erhöhte Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al . , (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Produkti- vität des Organismus, die Ausbeute und/oder die Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren um- fassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gewöhnlicher Metabolite aus Biosynthesewe- gen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrie- ben.
Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus C. glutami- cum-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation ge- erntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultrabeschallung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder wobei die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nöti- genfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chro- matographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und der wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes, zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, die nicht auf das vorhergehende Reinigungsverfahren eingeschränkt sind. Diese sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Bioche ical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Standard-Techniken des Fachgebiets bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11: 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routineverfahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls . Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 6.
In Spalte 3 "Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeichnung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1. In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7"Funktion" wird die physiologische Funktion der ent- sprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt .
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin
Tabelle 1
Gene die für Phosphoenolpyruvat-Zucker-phosphotransferase Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion:
ID: ID: Pos: Wildtyp Mutai
1 2 RXA01244 108 E K PHOSPHOENOLPYRUVATE— PROTEIN PHOSPHOTRANSFERASE
137 R C PHOSPHOENOLPYRUVATE— PROTEIN PHOSPHOTRANSFERASE
166 A T PHOSPHOENOLPYRUVATE— PROTEIN PHOSPHOTRANSFERASE
5 6 RXA01300 25 A T PHOSPHOCARRIER PROTEIN HPR
7 8 RXA04358 227 E K PUTATIVE PHOSPHOTRANSFERASE ENZYME II, A COMPONENT SGCA (EC 2.7.1.69)
9 10 RXA06018 122 K E PTS SYSTEM, FRUCTOSE-SPECIFIC IIBC COMPONENT (EC 2.7.1.69)

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid i mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen
Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Ta- bellel/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabellel/Spalteδ in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert.
3. Ein Vektor, der wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 enthält .
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach An- spruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist.
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