EP1446421A2 - Mutierte gene aus corynebacterium glutamicum - Google Patents

Mutierte gene aus corynebacterium glutamicum

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Publication number
EP1446421A2
EP1446421A2 EP02803765A EP02803765A EP1446421A2 EP 1446421 A2 EP1446421 A2 EP 1446421A2 EP 02803765 A EP02803765 A EP 02803765A EP 02803765 A EP02803765 A EP 02803765A EP 1446421 A2 EP1446421 A2 EP 1446421A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
mcp
nucleic acid
glutamicum
hypothetical
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02803765A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oskar Zelder
Markus Pompejus
Hartwig Schröder
Burkhard Kröger
Corinna Klopprogge
Gregor Haberhauer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1446421A2 publication Critical patent/EP1446421A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • Indirect modulation of fine chemical production can also be done by modifying the activity of a protein of the invention (ie, mutagenizing the corresponding gene) so that the overall ability of the cell to grow and divide, or to remain viable and productive, is increased.
  • the Production of fine chemicals from C. glutamicum is usually achieved by large-scale fermentation culture of these microorganisms, conditions that are often suboptimal for growth and cell division.
  • a protein of the invention e.g., a stress reaction protein, a cell wall protein, or a protein involved in the metabolism of compounds necessary for the occurrence of cell division and growth, such as nucleotides and amino acids
  • a protein of the invention e.g., a stress reaction protein, a cell wall protein, or a protein involved in the metabolism of compounds necessary for the occurrence of cell division and growth, such as nucleotides and amino acids
  • glufca icum cells in large-scale cultures, which in turn leads to increased yields and / or increased efficiency in the production of one or more desired fine chemicals should lead.
  • the metabolic pathways of a cell are necessarily interdependent and co-regulated.
  • This invention provides new nucleic acid molecules which encode proteins, which are referred to here as MCP proteins and, for example, modulate the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or as identification markers for C. glutamicum or related organisms can serve.
  • Nucleic acid molecules that encode an MCP protein are referred to here as MCP nucleic acid molecules.
  • the MCP protein can modulate the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or serve as identification markers for C. glutamicu-n or related organisms. Examples of such proteins are those encoded by the genes shown in Table 1.
  • isolated nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes an MCP protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which can be used as primers or hybridization probes for the detection or application of MCP- coding nucleic acid (for example. DNA or mRNA) are suitable.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region of one of these nucleotide sequences or a complement thereof.
  • co- the isolated nucleic acid molecule detects one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred MCP proteins according to the invention likewise preferably have at least one of the MCP activities described here.
  • nucleic acid sequences of the sequence listing together with the sequence changes at the respective position described in Table 1 are defined as Appendix A.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which an MCP gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing at least one nucleic acid molecule according to the invention which encodes the mutated MCP sequence as a transgene.
  • an endogenous MCP gene in the genome of the microorganism has been changed, for example functionally disrupted, by homologous recombination with an altered MCP gene.
  • the microorganism belongs to the genus Cory ebacterium or Brevibacterium, Corynebacterium glutamicum being particularly preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, such as an amino acid, lysine being particularly preferred.
  • a desired compound such as an amino acid, lysine being particularly preferred.
  • Another preferred embodiment is host cells that have more than one of the nucleic acid molecules described in Appendix A.
  • Such host cells can be produced in various ways known to the person skilled in the art. For example, they can be transfected by vectors which carry several of the nucleic acid molecules according to the invention. However, it is also possible to introduce one nucleic acid molecule according to the invention into the host cell with one vector and therefore to use several vectors either simultaneously or in a staggered manner. Host cells can thus be constructed which carry numerous up to several hundred of the nucleic acid sequences according to the invention. Such an accumulation can often achieve superadditive effects on the host cell with regard to fine chemical productivity.
  • the MCP polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-MCP polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the MCP protein alone.
  • this fusion protein can modulate the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals in C. glutamicum or serve as an identification marker for C. glutamicum or related organisms. Integrating this Fusion protein into a host cell, in particularly preferred embodiments, modulates the production of a desired compound from the cell.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical.
  • the method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which brings about the expression of an MCP nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • this method also comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of an MCP nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Corynebacterium or Brevibacterium.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism. These methods involve contacting the cell with a substance that modulates MCP protein activity or MCP nucleic acid expression so that a cell-associated activity is changed compared to the same activity in the absence of the substance.
  • the cell is modulated with respect to one or more C. glutamicum MCP protein activities, so that the yield, production and / or efficiency of the production of a desired fine chemical is improved by this microorganism.
  • the substance that modulates MCP protein activity can be a substance that stimulates MCP protein activity or MCP nucleic acid expression.
  • substances that stimulate MCP protein activity or MCP nucleic acid expression include small molecules, active MCP proteins and nucleic acids that encode MCP proteins and have been introduced into the cell.
  • substances that inhibit MCP activity or expression include small molecules and MCP antisense nucleic acid molecules.
  • the present invention provides MCP nucleic acid and protein molecules that can be used to identify Corynebacterium glutamicum or related organisms, to map the C. glutamicum genome (or the genome of a closely related organism), or to identify microorganisms - Those who are responsible for the production of fine chemicals, e.g. by fermentation processes can be used.
  • the proteins encoded by these nucleic acids can be used for direct or indirect modulation of the production or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, as an identification marker for C. glutamicum or related organisms, for the oxidation of terpenoids or for the degradation of hydrocarbons or as Targets can be used to develop therapeutic pharmaceutical compounds.
  • the aspects of the invention are further explained below.
  • arachidonic acid arachidonic acid
  • diols e.g. Propanediol and butanediol
  • carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • aromatic compounds e.g. aromatic amines, vanillin and indigo
  • vitamins and cofactors as described in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins” , Pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim and the quotations contained therein; and Ong, AS, Niki, E. and Packer, L.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for the normal cell functions in all organisms.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 types, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids can be in the optical D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetics industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim).
  • amino acids are also used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine, (S) -5-hydroxytryptophan and others in Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry , Vol. A2, pp. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 are suitable substances.
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are synthesized from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrosis-4-phosphate and phosphoenolpyruvate, in a 9-step biosynthetic pathway that only differs in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be produced from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is made from oxaloacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the protein biosynthesis requirement, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediate products are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert unwanted amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, the presence of a particular amino acid slowing down or completely stopping its own production (for an overview of feedback mechanisms in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer, L., Biochemistry , 3rd edition, chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)).
  • the output of a certain amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise another group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996).
  • vitamin is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself.
  • the group of vitamins can include cofactors and nutraceutical compounds.
  • cofactor includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • nutraceutical encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (e.g. polyunsaturated fatty acids).
  • Panthothenate (pantothenic acid, R- (+) -N- (2,4-dihydroxy-3,3,3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthetic steps for the conversion into pantoic acid, into ⁇ -alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5 '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • the biosynthesis of biotin from the precursor molecule pimeloyl-CoA in microorganisms has been extensively investigated and several of the genes involved have been identified. It has been found that many of the corresponding proteins are involved in the Fe cluster synthesis and belong to the class of the nifS proteins.
  • the lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it is a component of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydro- complex of genes.
  • the folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methylpterine.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇ 2
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B 12 is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also called “niacin”.
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • nucleotide includes the basic structural units of the nucleic acid molecules, which comprise a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA the sugar is ribose, for DNA the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside encompasses molecules which serve as precursors of nucleotides, but which, in contrast to the nucleotides, have no phosphoric acid unit.
  • nucleic acid molecules By inhibiting the biosynthesis of these molecules or their mobilization to form nucleic acid molecules, it is possible to inhibit RNA and DNA synthesis; if this activity is specifically inhibited in cancer cells, the ability of tumor cells to divide and replicate can be inhibited.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules but serve as energy stores (ie AMP) or as coenzymes (ie FAD and NAD).
  • the purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (eg thiamine, S-adenosyl methionine, folate or riboflavin), as an energy source for the cell (e.g. ATP or GTP) ) and for chemicals themselves, which are usually used as flavor enhancers (for example IMP or GMP) or for many medical applications (see for example Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Reh et al VCH: Weinheim, pp. 561-612)
  • Enzymes that are involved in the purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly serving as targets against the chemicals for crop protection, including fungicides , Herbicides and insecticides.
  • the purine nucleotides are synthesized from ribose 5-phosphate via a series of steps via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP), which leads to the production of guanosine 5' monophosphate (GMP) or adenosine 5 'monophosphate (AMP), from which the triphosphate forms used as nucleotides can be easily produced.
  • IMP inosine 5 'phosphate
  • GMP guanosine 5' monophosphate
  • AMP adenosine 5 'monophosphate
  • Pyrimidine biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted to cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked by an ⁇ , ⁇ -l, 1 bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen food and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva, CLA and Panek, AD (1996) Biotech Ann. Rev. 2: 293-314; and Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172: 97-102). Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • the MCP molecules according to the invention are directly or indirectly involved in the metabolic pathway of one or more fine chemicals in C. glutamicum.
  • the activity of the MCP molecules according to the invention to participate indirectly or directly in such metabolic pathways has an impact on the production of a desired fine chemical by this microorganism.
  • the activity of the MCP molecules according to the invention is modulated so that the C. glutamicum metabolic pathways, in which the MCP proteins according to the invention are involved, are modulated in terms of efficiency or output, which directly or indirectly affects the Production or efficiency of production of a desired fine chemical modulated by C. glutamicum.
  • MCP protein or “MCP polypeptide” includes proteins that modulate the yield, production and / or efficiency of production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, as a target protein for drug screening or design or can serve as identification markers for C. glutamicum or related organisms.
  • MCP proteins include those encoded by the MCP genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • MCP gene or “MCP nucleic acid sequence” include nucleic acid sequences which encode an MCP protein which consists of a coding region and corresponding untranslated 5 'and 3' sequence regions. Examples of MCP genes are those listed in Table 1.
  • production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (for example the desired fine chemicals) which is formed within a defined period of time and a defined fermentation volume (for example kg product per hour per 1 ).
  • concentration of the fermentation product for example the desired fine chemicals
  • fermentation volume for example kg product per hour per 1 .
  • yield or “product / carbon yield” is known in the art and encompasses the efficiency of converting the carbon source into the product (ie, the fine chemical). For example, this is usually expressed as kg of product per kg of carbon source.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated Process.
  • Metabolism is known in the art and encompasses all of the biochemical reactions that take place in an organism.
  • the metabolism of a particular compound (for example the metabolism of an amino acid, such as glycine) then encompasses all biosynthesis, modification and degradation pathways in the cell which concern this compound.
  • the MCP molecules according to the invention are capable of directly or indirectly modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as C. glutamicum.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • a microorganism such as C. glutamicum.
  • one or more MCP proteins of the invention can be manipulated so that their function is modulated. This modulation of the function can lead to modulation of the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals from C. glutamicum.
  • Gens directly modulate the ability of the cell to synthesize or degrade this compound, thereby modulating the yield and / or efficiency of fine chemical production.
  • a protein that regulates a fine chemical pathway by modulating the activity of a protein that regulates a fine chemical pathway, one can directly influence whether the production of the desired compound is up or down, both of which modulate the yield or efficiency of the production of the fine chemical from the cell.
  • Indirect modulation of fine chemical production can also be done by modifying the activity of a protein of the invention (ie, mutagenizing the corresponding gene) so that the overall ability of the cell to grow and divide, or to remain viable and productive, is increased.
  • the production of fine chemicals from C. glutamicum is usually achieved by large-scale fermentation culture of these microorganisms, conditions that are often suboptimal for growth and cell division.
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or proteins which are involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell growth and division, such as nucleotides and amino acids
  • a protein according to the invention for example a stress reaction protein, a cell wall protein or proteins which are involved in the metabolism of compounds which are necessary for the occurrence of cell growth and division, such as nucleotides and amino acids
  • glutamicum cells in large-scale cultures, which in turn leads to increased yields and / or increased efficiency in the production of one or several desired fine chemicals should lead.
  • the metabolic pathways of a cell are necessarily interdependent and co-regulated.
  • the isolated nucleic acid sequences according to the invention are located in the genome of a Corynebacterium glutamicum staimxes, which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 13032.
  • the nucleotide sequence of the isolated C. glutamicum MCP nucleic acid molecules and the predicted amino acid sequences of the C. glutamicum MCP proteins are shown in Appendix A and B, respectively. Computer analyzes were carried out which classified and / or identified many of these nucleotide sequences as sequences with homology to E. coli or Bacillus subtilis genes.
  • the present invention also relates to proteins whose amino acid sequence is essentially homologous to an amino acid sequence in Appendix B.
  • a protein whose amino acid sequence is essentially homologous to a selected amino acid sequence is at least about 50% homologous to the selected amino acid sequence, for example the entire selected amino acid sequence.
  • a protein whose amino acid sequence is essentially homologous to a selected amino acid sequence can also be at least about 50-60%, preferably at least about
  • An MCP protein according to the invention or a biologically active section or fragment thereof can modulate the yield, production and / or efficiency of the production of one or more fine chemicals in C. glutamicum, degrade hydrocarbons, oxidize terpenoids, serve as a target for drug development or as an identification marker serve for C. glutamicum or related organisms.
  • nucleic acid molecules which encode MCP molecules or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are used as hybridization probes or primers for the identification or amplification of MCP-coding nucleic acids (for example MCP-DNA ) are sufficient.
  • MCP-coding nucleic acids for example MCP-DNA
  • nucleic acid molecules can be used to identify C. glutamicum or related organisms, to map the genome of C. glutamicum or related organisms or to identify microorganisms that are used to produce fine chemicals, e.g. by fermentation processes are suitable.
  • nucleic acid molecule as used herein is intended to encompass DNA molecules (e.g. cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (e.g.
  • nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.
  • isolated nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example, sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid ).
  • the isolated MCP nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic Flank the DNA of the cell from which the nucleic acid originates (for example a C. glutamicum cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule such as a cDNA molecule, can also be substantially free of other cellular material or culture medium if it is produced by recombinant techniques, or of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • a C. glutamicum MCP cDNA can be isolated from a C. glutamicum bank by using a complete sequence from Appendix A or a section thereof as a hybridization probe and Standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , NY, 1989) can be used.
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been produced on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof, the one
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pETIld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl).
  • This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • milk serum promoter e.g., milk serum promoter; U.S. Patent No. 4,873,316 and European Patent Application Publication No. 264,166
  • Development-regulated promoters are also included, for example the mouse hox promoters (Kessel and Gruss (1990) Science 249: 374-379) and the ⁇ -fetoprotein promoter (Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3: 537 -546).
  • C. gluta-nicum can be carried out by protoplast transformation (Kastsumata, R. et al., (1984) J. Bacteriol. 159: 306-311), electroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol Letters, 53: 399-303) and, in cases where special vectors are used, also by conjugation (as described, for example, in Schwarzfer, A., et (1990) J. Bacteriol. 172: 1663-1666).
  • a suitable method for determining the amount of transcription of the mutant gene is to carry out a Northern blot (see, for example, Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York), whereby a primer which is designed in such a way that it binds to the gene of interest is provided with a detectable (usually radioactive or chemiluminescent) label so that - if the Total RNA of a culture of the organism extracted, separated on a gel, on a stable matrix is transferred and incubated with this probe - the binding and the quantity of binding of the probe indicate the presence and also the amount of mRNA for this gene.
  • Total cell RNA can be isolated from Corynebacterium glutamicum by various methods known in the art, such as in Bormann, ER et al., (1992) Mol. Microbiol. 6: 317-326.
  • Standard techniques such as Western blot, can be used to determine the presence or the relative amount of protein that is translated from this mRNA (see, for example, Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York).
  • total cell proteins are extracted, separated by gel electrophoresis, transferred to a matrix, such as nitrocellulose, and incubated with a probe, such as an antibody, which specifically binds to the desired protein.
  • This probe is usually provided with a chemiluminescent or colorimetric label that is easy to detect. The presence and amount of label observed indicates the presence and amount of the mutant protein sought in the cell.
  • Corynebacteria are grown in synthetic or natural growth media.
  • a number of different growth media for Corynebakterian are known and readily available (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32: 205-210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters 11: 11-16; Patent DE 4,120,867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., Ed. Springer-Verlag).
  • These media consist of one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and trace elements.
  • Preferred carbon sources are sugars, such as mono-, di- or polysaccharides.
  • Very good carbon sources are, for example, glucose, fructose, mannose, galactose, ribose, sorbose, ribulose, lactose, maltose, sucrose, raffinose, starch or cellulose.
  • Sugar can also be added to the media through complex compounds such as molasses or other by-products of sugar refining. It can also be advantageous to add mixtures of different carbon sources.
  • Other possible carbon sources are alcohols and organic acids such as methanol, ethanol, acetic acid or lactic acid.
  • Nitrogen sources are usually organic or inorganic nitrogen compounds or materials containing these compounds contain.
  • Inorganic salt compounds that may be included in the media include the chloride, phosphorus or sulfate salts of calcium, magnesium, sodium, cobalt, molybdenum, potassium, manganese, zinc, copper and iron.
  • Chelating agents can be added to the medium to keep the metal ions in solution.
  • Particularly suitable chelating agents include dihydroxyphenols, such as catechol or protocatechuate, or organic acids, such as citric acid.
  • the media usually also contain other growth factors, such as vitamins or growth promoters, which include, for example, biotin, riboflavin, thiamine, folic acid, nicotinic acid, panthothenate and pyridoxine.
  • the growing conditions are defined separately for each experiment.
  • the temperature should be between 15 ° C and 45 ° C and can be kept constant or changed during the experiment.
  • the pH of the medium should be in the range of 5 to 8.5, preferably around 7.0, and can be maintained by adding buffers to the media.
  • An exemplary buffer for this purpose is a potassium phosphate buffer.
  • Synthetic buffers such as MOPS, HEPES; ACES etc. can be used alternatively or simultaneously.
  • the cultivation pH value can also be kept constant during the cultivation by adding NaOH or NH 4 OH. If complex media components, such as yeast extract, are used, the need for additional buffers is reduced since many complex bindings have a high buffer capacity.
  • the pH value can also be regulated with gaseous ammonia.
  • the medium is inoculated to an ODgoo of 0.5-1.5 using cells that are placed on agar plates, such as CM plates (10 g / 1 glucose, 2.5 g / 1 NaCl, 2 g / 1 urea, 10 g / 1 polypeptone, 5 g / 1 yeast extract, 5 g / 1 meat extract, 22 g / 1 agar pH 6.8 with 2 M NaOH), which had been incubated at 30 ° C., were grown.
  • the inoculation of the media is carried out either by introducing a saline solution of C. glutamicum cells from CM plates or by adding a liquid preculture of this bacterium.
  • DNA band shift assays also referred to as gel retardation assays
  • reporter gene assays as in Kolmar, H. et al., (1995)
  • the desired product can be obtained from C. glutamicum cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the C. glutamicum cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is kept for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification procedures is subjected to chromatography with an appropriate resin, either with the desired molecule retained on the chromatography resin, but not many contaminants in the sample, or the contaminants remaining on the resin, the sample however not. If necessary, these chromatographic steps can be repeated using the same or different chromatographic resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application 5 for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by prior art techniques. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin layer chromatography, NIRS,

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Nukleinsäuremoleküle, deren Verwendung zur Konstruktion von gentechnisch verbesserten Mikroorganismen und Verfahren zur Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere Aminosäuren mit Hilfe dieser gentechnisch verbesserten Mikroorganismen.

Description

Gene die für neue Proteine codieren
Hintergrund der Erfindung
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich vorkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen werden in vielen Industriezweigen verwendet, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die ge- meinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet werden, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Co- faktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Bakterien im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck besonders geeigneter Organismus ist Cornebac e iu-T! glutamicum, ein gram-positives, nicht-patho- genes Bakterium. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutanten- stammen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt neuartige Nukleinsäure oleküle bereit, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Corynebactθrium glutamicum oder verwandten Bakterienarten verwenden lassen. C. glutamicu-n ist ein gram-positives, aerobes Bakterium, das in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien und auch zum Abbau von Kohlenwasserstoffen (bspw. beim Überlaufen von Rohöl) und zur Oxidation von Terpenoiden gemeinhin verwendet wird. Die Nukleinsäuremoleküle können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, verwenden lassen. C. glutamicu-n selbst ist zwar nicht-pa- thogen, jedoch ist es mit anderen Corynebacterium-Arten, wie Co- rynebacterium diphtheriae (dem Erreger der Diphtherie) verwandt, die bedeutende Pathogene beim Menschen sind. Die Fähigkeit, das Vorhandensein von Corynebacterium-Arten zu identifizieren, kann daher auch eine signifikante klinische Bedeutung haben, z.B. bei diagnostischen Anwendungen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zudem als Bezugspunkte zur Kartierung des C. gl u tamicum-Genoms oder von Genomen verwandter Organismen dienen. Diese neuen Nukleinsäuremoleküle codieren Proteine, die hier als Marker- und Feinchemikalienproduktions- (MCP-) Proteine bezeichnet werden. Diese MCP-Pro eine können bspw. direkt oder indirekt an der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glu- tamicum beteiligt sein. Die erfindungsgemäßen MCP-Proteine können auch am Abbau von Kohlenwasserstoffen oder an der Oxidation von Terpenoiden beteiligt sein. Diese Proteine lassen sich zur Identifikation von Coryneiac e iu-ri glutamicum oder von zu C. glutamicum verwandten Organismen verwenden; das Vorliegen eines für C. glutamicum und verwandte Arten spezifischen MCP-Proteins in einem Proteingemisch kann auf das vorliegen eines dieser Bakterien in der Probe hindeuten. Ferner können diese MCP-Protein Homologa in Pflanzen oder Tieren aufweisen, die an einem Erkrankungszustand oder einem Leiden beteiligt sind; so können diese Proteine als nützliche pharmazeutische Ziele für das Arzneimittel-Screening und die Entwicklung therapeutischer Verbindungen dienen.
Aufgrund der Verfügbarkeit von in Corynebacterium glutamicum verwendbaren Klonierungsvektoren, wie bspw. offenbart in Sinskey et al., US-Patent Nr. 4 649 119, und von Techniken zur genetischen Manipulation von C. glutamicum und den verwandten BrevibacteriumArten (z.B. lactofermentum) (Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162:591-597 (1985); Katsu ata et al . , J. Bacteriol. 159:306-311 (1984); und Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130:2237-2246 (1984) ) , lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um die Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien zu modulieren. Diese Modulation kann aufgrund einer direkten Auswirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder aufgrund einer indi- rekten Auswirkung einer solchen Manipulation erfolgen. Bspw. kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) die Fähigkeit der Zelle zur Synthese oder zum Abbau dieser Verbindung direkt modu- lieren, wodurch die Ausbeute und/oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie moduliert wird. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien- Stoffwechselweg reguliert, direkt beeinflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie von der Zelle moduliert.
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder lebensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Großmaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandproteins oder eines Proteins, das am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt ist, die für das Auftreten von Zellteilung und -Wachstum nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein besseres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen mög- lieh ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. glufca icum-Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer gewünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoff- wechselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert. Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwechselwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg beteiligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regula- tion eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Diese Erfindung stellt neue Nukleinsäuremoleküle bereit, die Pro- teine codieren, die hier als MCP-Proteine bezeichnet werden und bspw die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Iden- tifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen können. Nukleinsäuremoleküle, die ein MCP-Protein codie- ren, werden hier als MCP-Nukleinsäuremoleküle bezeichnet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das MCP-Protein die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicu-n oder verwandte Organismen dienen. Beispiele für solche Proteine sind diejenigen, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsäuremoleküle (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidsequenz , die ein MCP-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridisie- rungssonden zum Nachweis oder zur A plifikation von MCP-codieren- der Nukleinsäure (bspw. DNA oder mRNA) eignen. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäuremo- lekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen oder den codierenden Bereich einer dieser Nukleotidsequenzen oder ein Komplement davon. In anderen bevorzugten Ausführungsformen co- diert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen MCP-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen MCP-Aktivitäten.
Als Anhang A werden im folgenden die Nukleinsäuresequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Als Anhang B werden im folgenden die Polypeptidsequenzen des Sequenzprotokolls zusammen mit den in Tabelle 1 beschriebenen Sequenzveränderungen an der jeweiligen Position definiert.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäu- remolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül , das eine Nu- kleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nukleinsäuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül . Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker be- vorzugt ein natürlich vorkommendes C. gluta-nicu-n-MCP-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nu- kleinsäuremoleküle enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird diese Wirtszelle zur Herstellung eines MCP-Proteins verwendet, indem die Wirtszelle in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das MCP-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle iso- liert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch veränderten Mikroorganismus, bei dem ein MCP-Gen eingebracht oder verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen mindestens eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls verändert worden, das die mutierte MCP- Sequenz als Transgen codiert. Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes MCP-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten MCP-Gen verändert, z.B. funktioneil disruptiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Cory ebacterium oder Brevibacterium, wobei Corynebacterium glutamicum besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie einer Aminosäure verwendet, wobei Lysin besonders bevorzugt ist . Eine weitere bevorzugte Ausführungsform sind Wirtszellen, die mehr als eine der in Anhang A beschriebenen Nukleinsäuremoleküle besitzen. Solche Wirtszellen lassen sich auf verschiedene dem Fachmann bekannte Wege herstellen. Beispielsweise können sie durch Vektoren, die mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle tragen, transfiziert werden. Es ist aber auch möglich mit einem Vektor jeweils ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül in die Wirtszelle einzubringen und deshalb mehrere Vektoren entweder gleichzeitig oder zeitlich abgestuft einzusetzen. Es können somit Wirtszellen konstruiert werden, die zahlreiche, bis zu mehreren Hundert der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen tragen. Durch eine solche Akkumulation lassen sich häufig überadditive Effekte auf die Wirtszelle hinsichtlich der Feinchemikalien-Produktivität erzielen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes MCP- Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt, davon. Das isolierte MCP-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform die Produktion oder Ef- fizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte MCP-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt die Fähigkeit behält, bspw. die Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum zu modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen zu dienen.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes MCP-Proteinpräparat . Das MCP-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängen- protein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist.
Das MCP-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-MCP-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das MCP-Protein allein. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen kann dieses Fusionsprotein die Ausbeute, Produktion und/oder Ef- fizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen MCP-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer MCP- Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Fein- chemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Corynebac- terium oder Brevibacterium.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modula- tion der Produktion eines Moleküls von einem Mikroorganismus. Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, die die MCP-Proteinaktivität oder die MCP-Nukleinsäure- Expression moduliert, so daß eine zeilassoziierte Aktivität verglichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verän- dert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich einer oder mehrerer C. glutamicum-MCP-Proteinaktivi- täten moduliert, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert wird. Die Substanz, die die MCP- Proteinaktivität moduliert, kann eine Substanz sein, die die MCP- Proteinaktivität oder die MCP-Nukleinsäure-Expression stimuliert. Beispiele für Substanzen, die die MCP-Proteinaktivität oder MCP- Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive MCP-Proteine und Nukleinsäuren, die MCP-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele für Substanzen, die die MCP-Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und MCP-Antisense-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modula- tion der Ausbeuten, der Produktion und/oder der Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines MCP-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung von der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform eine Aminosäure ist. Diese Aminosäure ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform L-Lysin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt MCP-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle bereit, die zur Identifikation von Corynebacterium glutamicum oder verwandter Organismen, zur Kartierung des C. gluta- micum-Genoms (oder des Genoms eines nah verwandten Organismus) oder zur Identifikation von Mikroorganismen verwendet werden kön- nen, die zur Produktion von Feinchemikalien, z.B. durch Fermentationsverfahren, verwendet werden können. Die von diesen Nukleinsäuren codierten Proteine können zur direkten oder indirekten Modulation der Produktion oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum, als Identifikations- marker für C. glutamicum oder verwandte Organismen, zur Oxidation von Terpenoiden oder zum Abbau von Kohlenwasserstoffen oder als Ziele zur Entwicklung therapeutischer pharmazeutischer Verbindungen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Aspekte sind nachstehend weiter erläutert.
I . Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts- und Kosmetikindustrie. Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopi- melinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene A i- nosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and re- lated compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlehydrate (bspw. Hya- luronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische A ine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L.
(1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the
UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert.
A. Metabolismus und Verwendungen von Aminosäuren
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen in allen Organismen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der optischen D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch euka- ryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. , Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phe- nylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, weil sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese gewöhnlich mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosynthesewege in die übrigen 11 "nichtessentiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glut- amin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu syn- thetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts- und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, son- dem auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatriu - glutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie ver- wendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Gly- cin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharma- zeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet . Threo- nin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechno- logy Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S) -5-Hydroxytryptophan und anderen in Ulmann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Bio- ehem. 47:533-606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von α-Ketoglutarat , einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt . Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren, beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt der Glykolyse) und ergibt nach Oxida- tions-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlen- stoffatoms auf Tetrahydrofolat in einer durch Serin-Transhydroxy- methylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glykolyse- und Pentosephosphatweges , Eryt- hrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat , in einem 9-Schritt-Bio- syntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Präphenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem kom- plexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker. Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden statt dessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über Rückkopplungs-Mechanismen bei Aminosäure-Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.
B. Metabolismus und Verwendungen von Vitaminen, Cofaktoren und Nutrazeutika
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Verarbei- tungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Pro- duktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1.-3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavinmononu- kleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin B " bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5' -phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6-methylpyri- din. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+) -N- (2, 4-Dihydroxy-3, 3-di- methyl-l-oxobutyl) -ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-ge- triebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure . Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Ala- nin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5 '-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R) -Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster- Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehö- ren. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Ketoglutaratdehydro- genasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den Stoffwechselzwischenprodukten Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) , L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.
Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bχ2) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B12 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinami- dadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien, wie Riboflavin, Vitamin B6, Pantothenat und Biotin, auch durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind. Nur Vitamin Bι wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Ver- fahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
C. Puri-i-, Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Py- rimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteile der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleo- tid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose- Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisierung zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei Krebszellen gehemmt, läßt sich die Tei- lungs- und Replikationsfähigkeit von Tumorzellen hemmen. Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10:505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressiva oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J.L. (1995) "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol . 5:752-757; (1995) Biochem. Soc . Trans- act. 23:877-902). Die Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Ribofla- vin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, die gewöhnlich als Geschmacksverstärker (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen verwendet werden (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Reh et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612) . Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden, entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in: Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin-Metabolismus, das Objekt intensiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell . Ein gestörter Purin-Metabolismus in hö- heren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden aus Ribose-5-phosphat über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 '-phosphat (IMP) synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5' -mono- phosphat (GMP) oder Adenosin-5 ' -monophosphat (AMP) führt, aus de- nen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschie- dene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidin- biosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 ' -monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat . UMP wiederum wird in Cytidin-5 '-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleo- tide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Di- phosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyribose- form des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über eine α,α-l, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für ge- trocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al . , (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16:460-467; Paiva, C.L.A. und Panek, A.D. (1996) Biotech Ann. Rev. 2:293-314; und Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172:97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
II . Elemente und Verfahren der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als MCP-Nukleinsäure-Mole- küle bezeichnet werden. Diese MCP-Nukleinsäuremoleküle eignen sich nicht nur zur Identifikation von C. glutamicum oder verwandten Bakterienarten, sondern auch als Marker zur Kartierung des C. glutamicum-Genoms und zur Identifizierung von Bakterien, die sich zur Produktion von Feinchemikalien durch z.B. fermentative Ver- fahren eignen. Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auch auf den MCP-Proteinmolekülen, die von diesen MCP-Nu- kleinsäuremolekülen codiert werden. Diese MCP-Moleküle können die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, als Identi- fikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen, Kohlenwasserstoffe abbauen und als Ziele für die Entwicklung therapeutischer pharmazeutischer Verbindungen dienen. In einer Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen MCP-Moleküle direkt oder indirekt am Stoffwechselweg einer oder mehrerer Feinchemika- lien in C. glutamicum beteiligt. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Aktivität der erfindungsgemäßen MCP-Moleküle, an solchen Stoffwechselwegen indirekt oder direkt teilzunehmen, eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Aktivität der erfindungsgemäßen MCP-Moleküle moduliert, so daß die C. glutamicum-Stoffwechselwege, an de- nen die erfindungsgemäßen MCP-Proteine beteiligt sind, hinsichtlich der Effizienz oder des Ausstoßes moduliert werden, was direkt oder indirekt die Produktion oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch C. glutamicum moduliert.
Der Begriff "MCP-Protein" oder "MCP-Polypeptid" umfaßt Proteine, die die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Zielprotein für Arzneimittelscreening oder -design oder als Identifikations- marker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen können. Beispiele für MCP-Proteine umfassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten MCP-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "MCP-Gen" oder "MCP-Nukleinsäurese uenz" umfassen Nu- kleinsäuresequenzen, die ein MCP-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5 ' - und 3 ' -Sequenzbereichen besteht. Beispiele für MCP-Gene sind die in Tabelle 1 aufgelisteten. Die Begriffe "Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemi- kalie) , das innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet wird (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Ausstoßrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff "Ausbeute" oder "Produkt/Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlen- stoffquelle. Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle), bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Die erfindungsgemäßen MCP-Moleküle sind in einer anderen Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie C. glutamicum, direkt oder indirekt zu modulieren. Unter Verwendung von Gen-Rekombinationstechniken kann/können ein oder mehrere erfindungsgemäße MCP-Proteine so manipuliert werden, daß seine Funktion moduliert ist. Diese Modulation der Funktion kann zur Modulation der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien von C. glutamicum führen.
Beispielsweise kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemika- lie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden
Gens) die Fähigkeit der Zelle, diese Verbindung zu synthetisieren oder abzubauen, direkt modulieren und dadurch die Ausbeute und/ oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalien modulieren. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien-Stoffwechselweg reguliert, direkt beeinflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemikalie von der Zelle moduliert.
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder lebensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Großmaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandpro- teins oder von Proteinen, die am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt sind, die für das Auftreten von Zellwachstum und -tei- lung nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein besseres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen möglich ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. glutamicum-Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer ge- wünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoffwechselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert . Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwechselwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg beteiligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regulation eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Die isolierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen befinden sich im Genom eines Corynebacterium glutamicum-Staimxes , der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist. Die Nukleotidsequenz der isolierten C. glu- tamicum-MCP-Nukleinsäuremoleküle und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der C. glutamicum-MCP-Proteine sind im Anhang A bzw. B gezeigt. Es wurden Computeranalysen durchgeführt, die viele dieser Nukleotidsequenzen als Sequenzen mit Homologie zu E. coli- oder Bacillus subtilis-Genen klassifizierten und/oder identifi- zierten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine, deren Aminosäuresequenz zu einer Aminosäuresequenz in Anhang B im wesentlichen homolog ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein, dessen Amino- säuresequenz im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, zumindest zu etwa 50% homolog zu der ausgewählten Aminosäuresequenz, bspw. zur gesamten ausgewählten Aminosäuresequenz. Ein Protein, dessen Aminosäuresequenz zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz im wesentlichen homolog ist, kann auch mindestens zu etwa 50-60%, vorzugsweise mindestens zu etwa
60-70%, stärker bevorzugt mindestens zu etwa 70-80%, 80-90% oder 90-95% und am stärksten bevorzugt mindestens zu etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder noch homologer zur ausgewählten Aminosäuresequenz sein.
Ein erfindungsgemäßes MCP-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragment davon kann die Ausbeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpe- noide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen.
In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben: A. Isolierte Nukleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, die MCP-Moleküle oder biologisch aktive Abschnitte davon codie- ren, sowie Nukleinsäurefragmente, die zur Verwendung als Hybridi- sierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder A plifizie- rung von MCP-codierenden Nukleinsäuren (z.B. MCP-DNA) hinreichen. Diese Nukleinsäuremoleküle können zur Identifikation von C. glutamicum oder verwandten Organismen, zur Kartierung des Genoms von C. glutamicum oder verwandten Organismen oder zur Identifikation von Mikroorganismen, die zur Produktion von Feinchemikalien, z.B. durch Fermentationsverfahren, geeignet sind, verwendet werden. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, soll DNA- Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 '-Ende des codierenden Genbereichs gelegene untransla- tierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 ' -Endes des codierenden Bereichs des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzel- strängig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppel- strängige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nuklein- säure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden). In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte MCP-Nukleinsäuremole- kül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine C. glutamicum-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül , kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard-Techniken und der hier bereitgestellten SequenzInformation isoliert werden. Bspw. kann eine C. glutamicum-MCP-cDNA aus einer C. glu- tamicum-Bank isoliert werden, indem eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sam- brook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremole- kül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299), und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-Reverse-Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Trans- kriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) und mittels zufallsgemäßen Polynukleotidprimern oder Oligonu- kleotidprimern auf der Basis einer der im Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotid- Sequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß PCR-Standard-Amplifikations- techniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Se- quenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer MCP-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard- Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen. Die Sequenzen von Anhang A entsprechen den erfindungsgemäßen MCP-cDNAs aus Corynebacterium glutamicum. Diese cDNAs umfassen Sequenzen, die MCP-Proteine (d.h. den "codierenden Bereich", der in jeder Sequenz in Anhang A angegeben ist), sowie die 5'- und 3 '-untranslatierten Sequenzen, die ebenfalls in Anhang A angegeben sind. Das Nukleinsäuremolekül kann alternativ nur den codierenden Bereich einer der Sequenzen in Anhang A umfassen. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann überdies nur einen Abschnitt des codierenden Bereichs von einer der Sequenzen in Anhang A umfassen, bspw. ein Fragment, das als Sonde oder Primer oder Fragment verwendet werden kann, welches einen biologisch ak- tiven Abschnitt eines MCP-Proteins codiert. Die aus der Klonie- rung der MCP-Gene aus C. glutamicum ermittelten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von MCP-Homologa in anderen Zelltypen und Organismen und MCP-Homologa von anderen Corynebak- terien oder verwandten Arten ausgelegt sind. Die Sonde bzw. der Primer umfaßt gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes Oligonukleo- tid. Das Oligonukleotid umfaßt gewöhnlich einen Nukleotidsequenz- bereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 auf- einanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges von einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges von einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz aus Anhang A können in PCR-Reaktionen zur Klo- nierung von MCP-Homologa verwendet werden. Sonden auf der Basis der MCP-Nukleotidsequenzen können zum Nachweisen von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe Proteine codieren, verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungs- gruppe, bspw. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Diese Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Kits zur Identifizierung von Zellen verwendet werden, die ein MCP-Protein mißexprimieren, bspw. durch Messen einer Menge einer MCP-codierenden Nukleinsäure in einer Zellenprobe, bspw. durch Nachweisen der MCP-mRNA-Spiegel oder durch Bestimmen, ob ein genomisches MCP-Gen mutiert oder dele- tiert ist.
Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nuklein- säuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine
Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt davon die Fähigkeit behält, die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum zu modulieren, Kohlenwasserstoffe abzubauen, Terpe- noide zu oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung zu dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen zu dienen. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl identischer oder äquivalenter (bspw. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) Aminosäurereste zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen kann. Beispiele dieser Aktivitäten sind ebenfalls hier beschrieben. Somit trägt die "Funktion eines MCP-Proteins" zur Gesamt-Regulation des Stoffwechselweges einer oder mehrerer Feinchemikalien oder zum Abbau eines Kohlenwasserstoffs oder zur Oxidation eines Terpenoids bei.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen MCP-Nu- kleinsäure olekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der MCP-Proteine. Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines MCP-Proteins", wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne/ein Motiv eines MCP-Proteins, umfassen, die/das die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum moduliert, Kohlenwasserstoffe abbaut, Terpenoide oxidiert, als Ziel für Arzneimittelentwicklung oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dient. Zur Bestimmung, ob ein MCP-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen oder Terpenoide oxidieren kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte eines MCP-Proteins codieren, lassen sich durch Isolieren eines Abschnitts von einer der Sequenzen in Anhang B, Exprimieren des codierten Abschnitt des MCP-Proteins oder -Peptides (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des codierten Abschnittes des MCP-Proteins oder -Peptides herstellen.
Die Erfindung umfaßt zudem Nukleinsäuremoleküle, die sich von ei- ner der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen (und Abschnitten davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit das gleiche MCP-Protein codieren wie dasjenige, das von den in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen codiert wird. In einer anderen Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz , die ein Protein mit einer in Anhang B gezeigten Aminosäuresequenz codiert. In einer weiteren Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäu- remolekül ein C. glu tamicum-Vollängenprotein, das zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B (codiert von einem in Anhang A gezeigten offenen Leseraster) im wesentlichen homolog ist.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der MCP-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls bewußt darüber, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten MCP-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des MCP-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nichtessentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich in der Wildtypse- quenz von einem der MCP-Proteine (Anhang B) verändern läßt, ohne daß die Aktivität des MCP-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die MCP-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht-konser- vierte oder lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Do- mäne mit MCP-Aktivität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die MCP-Aktivität verändert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft folglich Nukleinsäure- moleküle, die MCP-Proteine codieren, die veränderte Aminosäurereste enthalten, die für die MCP-Aktivität nicht-essentiell sind. Diese MCP-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz in Anhang B, behalten aber dennoch mindestens eine der hier beschriebenen MCP-Aktivitäten. Das isolierte Nu- kleinsäuremolekül umfaßt bei einer Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens etwa 50% Homologie zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweist und die Ausbeute, Produktion und/ oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren, Kohlenwasserstoffe abbauen, Terpenoide oxidieren, als Ziel für Arzneimittelentwicklung dienen oder als Identifikationsmarker für C. glutamicum oder verwandte Organismen dienen kann.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein MCP-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere A inosäuresubsti- tutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken, wie stellengerichtete Mu- tagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht. Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Aspa- raginsäure, Glutaminsäure) , ungeladenen polaren Seitenketten
(z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan) , betaverzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einem MCP-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der MCP- codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungs u- tagenese, und die resultierenden Mutanten können auf eine hier beschriebene MCP-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine MCP-Aktivität beibehalten. Nach der Mu- tagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
B. jRe.ko-7Lbinaz.te Express ionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein MCP-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier ver- wendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektortyp ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren mit bakteriellem Replikations- ursprung und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Zudem können be- stimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken verwendet wer- den können, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch andere Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren), die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, d.h. daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, umfassen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden sind. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbun- den" , daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische (n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem in-vitro-Tran- skriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulato- rische Sequenz" soll Promotoren, Repressorbindungsstellen, Akti- vatorbindungsstellen, Enhancerbereiche und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Terminatoren, andere Elemente der m-RNA-Se- kundärstruktur oder Polyadenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Regulatorische Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fach- mann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Ausmaß der Proteinexpression usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich der Fusionsproteine oder -peptide, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. MCP-Proteine, mutierte Formen von MCP- Proteinen, Fusionsproteine, usw.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von MCP-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryo- tischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können MCP-Gene in bakte- riellen Zellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovi- rus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al . (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al . (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al . , Hrsg, S. 1-28, Cambridge
University Press: Cambridge), Algenzellen und Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, bei. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekom- binantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinan- ten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions-Expressionsvektoren wird oft eine proteolyti- sche Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entsprechenden ErkennungsSequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Ziel- protein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des MCP-Proteins in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus: GST - Thrombin- Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante MCP-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht-Fusions--?. -coli-Expres- sionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al . , (1988) Gene 69:301-315) und pET lld (Studier et al . Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET lld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten vira- len RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserieren- den Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression ausgewählten Bakterium, wie C. glutamicum, verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann durch Standard- DNA-Synthesetechniken erfolgen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der MCP-Protein-Expres- sionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Bal- dari et al . , (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Hersko- witz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eig- nen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecu- lar Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen MCP-Proteine in Insekten- zellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al . , (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen MCP-Proteine in Zellen einzelliger Pflanzen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feld- fruchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Bek- ker, D. , Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvek- tor exprimiert. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt. Gemein- hin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryotische und eukaryotische Zellen siehe in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugs- weise in einem bestimmten Zeiltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al . (1987) Genes Dev. 1:268-277), lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immuno1. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und Immunglobuli- nen (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore
(1983) Cell 33:741-748), neuronenspezifische Promotoren (bspw. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al.,
(1985) Science 230:912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren
(bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungs- regulierte Promotoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox- Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science 249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546) .
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Anti- sense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. D.h. daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur MCP-mRNA antisense ist, möglich wird. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Richtung klo- nierte Nukleinsäure gebunden sind und die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisen- se-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle ei- nes hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Antisense-Genen siehe Weintraub, H. et al . , Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht un- bedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Bspw. kann ein MCP-Protein in Bakterienzellen, wie C. glutamicum, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzel- len des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Corynebacterium glutamicum verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryotische oder eukaryotische Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion" , "Konjugation" und "Transduktion" , wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirts- zelle umfassen, einschließlich natürlicher Kompetenz, chemisch vermittelter Übertragung, Calciumphosphat- oder Calciumchlorid- Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofek- tion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in Sam- brook et al . (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbüchern.
Es ist bekannt, daß für die stabile Transfektion von Säugetierzellen je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Zur Identifizierung und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotre- xat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Mar- ker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein MCP-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können bspw. durch Medikamentenselektion identifiziert wer- den (z.B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben) . Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines MCP- Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das MCP-Gen zu verändern, bspw. funk- tionell zu disrumpieren. Dieses MCP-Gen ist vorzugsweise ein Corynebacterium glu amicum-MCP-Gen, jedoch kann ein Homologon von einem verwandten Bakterium oder sogar aus einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene MCP-Gen bei homologer Rekombination funktioneil disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert; auch als "Knockout"-Vektor bezeichnet) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene MCP-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktioneile Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen MCP-Proteins verändert wird.). Der veränderte Abschnitt des MCP-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des MCP-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen MCP-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen MCP-Gen in einem Mikroorganismus ermöglicht. Die zusätzliche flankierende MCP-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor weniger als eine Kilobase flankierende DNA (sowohl am 5'- als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) eingebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte MCP-Gen mit dem endogenen MCP- Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorga- nismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines MCP-Gens in einen Vektor, wodurch es unter die Kontrolle des Lac-Operons gebracht wird, ermöglicht z.B. die Expression des MCP-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regula- torischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines MCP-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von MCP-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungs- gemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein MCP-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes MCP-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das MCP-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der MCP-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinho- ologa, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren nachstehenden Verfahren verwendet werden: Identifikation von C. glutamicum und verwandten Organismen, Kar- tierung von Genomen von Organismen, die mit C. glutamicum verwandt sind, Identifikation und Lokalisation von C. glutamic--m-Se- quenzen von Interesse, Evolutionsstudien, Bestimmung von MCP-Pro- teinbereichen, die für die Funktion notwendig sind, Modulation der Aktivität eines MCP-Proteins; Modulation der Aktivität eines oder mehrerer Stoffwechselwege und Modulation der zellulären Produktion einer gewünschten Verbindung, wie einer Feinchemikalie. Die erfindungsgemäßen MCP-Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Verwendungen. Sie können zunächst zur Identifikation eines Organismus als Corynebacterium glutamicum oder naher Verwand- ter davon verwendet werden. Sie können zudem zur Identifikation des Vorliegens von C. glutamicum oder eines Verwandten davon in einer Mischpopulation von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Reihe von C. glutamicum-Genen bereit. Durch Sondieren der extrahierten genomi- sehen DNA einer Kultur einer einheitlichen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die einen Bereich eines C. glu amicum-Gens überspannt, das für diesen Organismus einzigartig ist, kann man bestimmen, ob dieser Organismus zugegen ist. Corynebacterium glutamicum selbst ist zwar nicht pathogen, jedoch ist es mit pathogenen Arten, wie Corynebacterium diptheriae, verwandt. Der Nachweis eines solchen Organismus ist von signifikanter klinischer Bedeutung.
Zum Nachweis des Vorliegens von C. glutamicum in einer Probe kön- nen im Fachgebiet bekannte Techniken eingesetzt werden. Insbesondere können die Zellen in der Probe zunächst in einer geeigneten Flüssigkeit oder auf einem geeigneten festen Kulturmedium gezüchtet werden, um die Anzahl der Zellen in der Kultur zu vergrößern. Diese Zellen werden lysiert, und die gesamte enthaltene DNA wird extrahiert und gegebenenfalls gereinigt, um Zelltrümmer und Proteinmaterial zu entfernen, die die anschließende Analyse stören könnten. Polymerasekettenreaktion oder eine ähnliche, im Fachge- biet bekannte Technik wird durchgeführt (s. einen allgemeinen Überblick über Methodologien, die gewöhnlich zur Nukleinsäurese- quenz-Amplifikation verwendet werden in Mullis et al., U.S. -Patent Nr. 4683195, Mullis et al., U.S. -Patent Nr. 4965188 und In- nis, M.A., und Gelfand, D.H. (1989) PCR-Protocols, A guide to Methods and Applications, Academic Press, S. 3-12, und (1988) Bio- technology 6:1197, und Internationale Patentanmeldung Nr. WO89/01050), wobei Primer, die für ein erfindungsgemäßes MCP-Nu- kleinsäuremolekül spezifisch sind, mit der Nukleinsäureprobe in- kubiert werden, so daß diese bestimmte MCP-Nukleinsäuresequenz , falls in der Probe vorhanden, amplifiziert wird. Die bestimmte, zu amplifizierende Nukleinsäuresequenz wird auf der Basis ihres ausschließlichen Vorkommens im Genom von C. glutamicum und nur einiger nah verwandter Bakterien ausgewählt. Das Vorliegen des gewünschten Amplifikationsproduktes zeigt das Vorliegen von C. glutamicum oder eines mit C. glutamicum nah verwandten Organismus an.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können ferner als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken ist es möglich, die physikalische Lokalisierung der erfindungsgemäßen MCP- Nukleinsäuremoleküle auf dem C. glutamicum-Genom nachzuweisen, was wiederum zur leichteren Lokalisierung anderer Nukleinsäure o- leküle und Gene auf der Karte verwendet werden kann. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle ebenfalls die Konstruktion einer genomischen Karte in solchen Bakterien ( z.B. Brevibacterium lactofermentum) ermög- liehen können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle eignen sich nicht nur zum Kartieren des Genoms, sondern auch für funktioneile Studien von C. glutamicum-Proteinen. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes C. gluta icum-DNA-bin- dendes Protein bindet, kann das C. glutamicum-Genom bspw. gespalten und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von C. glutamicum, und wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz , an die das Protein bindet . Die erfindungsgemäßen MCP-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstruktur-Untersuchungen. Die StoffWechselprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Se- quenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein tolerieren kann ohne die Funktion zu verlieren.
Die erfindungsgemäßen MCP-Proteine lassen sich als Marker zur Klassifizierung eines unbekannten Bakteriums als C. glutamicum oder zur Identifikation von C. glutamicum oder nahe verwandten Bakterien in einer Probe verwenden. Unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken können bspw. Zellen in einer Probe gegebenenfalls amplifiziert werden (z.B. durch Züchten in einem geeigneten Medium) , um die Probengröße zu erhöhen, und können dann lysiert werden, so daß die darin enthaltenen Proteine freigesetzt werden. Diese Probe kann gegebenenfalls gereinigt werden, um Zelltrümmer und Nukleinsäuremoleküle zu entfernen, die die anschließende Analyse stören könnten. Antikörper, die für ein ausgewähltes erfindungsgemäßes MCP-Protein spezifisch sind, können mit der Proteinprobe in einem typischen Western-Test-Format inku- biert werden (s. z.B. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei der Antikörper an sein Zielprotein bindet, wenn dieses Protein in der Probe vorliegt. Ein MCP-Protein wird für diesen Testtyp ausgewählt, wenn es für C. glutamicum oder C. glutamicum und sehr nahe verwandte Bakte- rien einzigartig oder fast einzigartig ist. Die Proteine in der Probe werden dann durch Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine geeignete Matrix, wie Nitrocellulose übertragen. Ein geeigneter Zweitantikörper mit einer nachweisbaren Markierung (z.B. chemilu ineszierend oder colorimetrisch) wird mit der Matrix in- kubiert, gefolgt von stringentem Waschen. Das Vorliegen oder Fehlen der Markierung zeigt das Vorliegen oder Fehlen des Zielproteins in der Probe an. Ist das Protein zugegen, zeigt dies das Vorliegen von C. glutamicum an. Ein ähnliches Verfahren ermöglicht die klassifizierung eines unbekannten Bakteriums als C. glutamicum; wenn eine Reihe für C. glutamicum spezifischer Proteine nicht in den Proteinproben nachgewiesen wird, die von dem unbekannten Bakterium präpariert wurden, ist dieses Bakterium wahrscheinlich nicht C. glutamicum.
Die genetische Manipulation der erfindungsgemäßen MCP-Nukleinsäu- remoleküle kann die Produktion von MCP-Proteinen mit funktioneilen Unterschieden zu den Wildtyp-MCP-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein.
Diese Änderungen der Aktivität können direkt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien in C. glutamicum modulieren. Beispielsweise kann man durch Modifikation der Aktivität eines Proteins, das an der Biosynthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt ist, (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) die Fähigkeit der Zelle, diese Verbindung zu synthetisieren oder abzubauen, direkt modulieren und dadurch die Ausbeute und/oder Effizienz der Pro- duktion der Feinchemikalie modulieren. Ebenso kann man durch Modulation der Aktivität eines Proteins, das einen Feinchemikalien- Stoffwechselweg reguliert, direkt beeinflussen, ob die Produktion der gewünschten Verbindung hoch- oder herunterreguliert wird, was beides die Ausbeute oder Effizienz der Produktion der Feinchemi- kalie von der Zelle moduliert.
Die indirekte Modulation der Feinchemikalienproduktion kann auch durch Modifikation der Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins (d.h. durch Mutagenese des entsprechenden Gens) erfolgen, so daß die Fähigkeit der Zelle, zu wachsen und sich zu teilen oder lebensfähig und produktiv zu bleiben, insgesamt erhöht ist. Die Produktion von Feinchemikalien aus C. glutamicum wird gewöhnlich durch Fermentationskultur im Großmaßstab dieser Mikroorganismen erzielt, Bedingungen, die für das Wachstum und die Zellteilung häufig suboptimal sind. Durch Verändern eines erfindungsgemäßen Proteins (z.B. eines Streßreaktionsproteins, eines Zellwandproteins oder von Proteinen, die am Stoffwechsel von Verbindungen beteiligt sind, die für das Auftreten von Zellwachstum und -tei- lung nötig sind, wie Nukleotide und Aminosäuren) , so daß ein bes- seres Überleben, Wachsen und Vermehren in diesen Bedingungen möglich ist, kann es möglich sein, die Anzahl und die Produktivität dieser veränderten C. gluta-nicum-Zellen in Kultur im Großmaßstab zu steigern, was wiederum zu gesteigerten Ausbeuten und/oder zu gesteigerter Effizienz der Produktion einer oder mehrerer ge- wünschter Feinchemikalien führen sollte. Ferner sind die Stoff- wechselwege einer Zelle notwendigerweise voneinander abhängig und co-reguliert . Durch Ändern der Aktivität irgendeines Stoffwech- selwegs in C. glutamicum (d.h. durch Ändern der Aktivität eines der erfindungsgemäßen Proteine, das an einem solchen Weg beteiligt ist) ist es möglich, gleichzeitig die Aktivität oder Regulation eines anderen Stoffwechselwegs in diesem Mikroorganismus zu ändern, der direkt an der Synthese oder am Abbau einer Feinchemikalie beteiligt sein kann.
Diese vorstehend genannten Mutagenesestrategien für MCP-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer Feinchemikalie aus C. glutamicum be- wirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Mutagenesestrategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Strategien und einschließlich der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um C. glutamicum- oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte MCP-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann jedes von C. glutamicum hergestellte Produkt sein, ein- schließlich der Endprodukte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vorkommender metabolischer Wege sowie Moleküle, die im Metabolismus von C. glutamicum nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen C. glu amicum-Stamm produziert werden.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffent- lichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Beispiel 1: Präparation der gesamten genomischen DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Eine Kultur von Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032) wurde über Nacht bei 30°C unter starkem Schütteln in BHI-Medium (Difco) gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 5ml Puffer I (5% des Ursprungsvolumens der Kultur - sämtliche angegebenen Volumina sind für 100 ml Kulturvolumen berechnet) resuspendiert. Zusammensetzung von Puffer I: 140,34 g/1 Saccharose, 2,46 g/1 MgS04 • 7 H20, 10 ml/1 KH2P04-Lösung (100g/l, mit KOH auf pH-Wert 6,7 eingestellt), 50 ml/1 M12-Konzentrat (10 g/1 (NH4)2S04, 1 g/1 NaCl, 2 g/1 MgS04 • 7 H20, 0,2 g/1 CaCl2, 0,5 g/1 Hefe-Extrakt (Difco) , 10 ml/1 Spurenelemente-Mischung (200 mg/1 FeS04 • H20, 10 mg/1 ZnS04 • 7 H20, 3 mg/1 MhCl2 • 4 H20, 30 mg/1 H3B03 , 20 mg/1 CoCl2 • 6 H20, 1 mg/1 NiCl2 • 6 H20, 3 mg/1 Na2Mo04 ■ 2 H20, 500 mg/1 Komplexbildner (EDTA oder Citronensäure) , 100 ml/1 Vitamingemisch (0,2 ml/1 Biotin, 0,2 mg/1 Folsäure, 20 mg/1 p-Aminobenzoesäure, 20 mg/1 Riboflavin, 40 mg/1 Ca-Panthothenat, 140 mg/1 Nikotinsäure, 40 mg/1 Pyridoxolhydrochlorid, 200 mg/1 Myo-Inositol) . Ly- sozym wurde in einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml zur Suspension gegeben. Nach etwa 4 Std. Inkubation bei 37°C wurde die Zell- wand abgebaut, und die erhaltenen Protoplasten wurden durch Zen- trifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit 5 ml Puffer I und einmal mit 5 ml TE-Puffer (10 inM Tris-HCl, 1 M EDTA, pH-Wert 8) gewaschen. Das Pellet wurde in 4 ml TE-Puffer resuspendiert, und 0,5 ml SDS-Lösung (10%) und 0,5 ml NaCl-Lösung (5 M) wurden zugegeben. Nach Zugabe von Proteinase K in einer Endkonzentration von 200 μg/ml wurde die Suspension etwa 18 Std. bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol, Pheno1-Chloro- form-Isoamylalkohol und Chloroform-Isoamylalkohol mittels Standard-Verfahren gereinigt . Dann wurde die DNA durch Zugabe von 1/50 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol, anschließender Inkubation für 30 min bei -20°C und 30 min Zentrifugation bei 12000 U/min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit einem SS34-Rotor (Sorvall) gefällt. Die DNA wurde in 1 ml TE-Puffer gelöst, der 20 μg/ml RNase A enthielt, und für mindestens 3 Std. bei 4°C gegen 1000 ml TE-Puffer dialysiert. Während dieser Zeit wurde der Puffer 3mal ausgetauscht. Zu Aliquots von 0,4 ml der dialysierten DNA-Lösung wurden 0,4 ml 2 M LiCl und 0,8 ml Ethanol zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei -20°C wurde die DNA durch Zentrifugation gesammelt (13000 U/min, Biofuge Fresco, Heraeus, Hanau, Deutschland). Das DNA-Pellet wurde in TE-Puffer gelöst. Durch dieses Verfahren hergestellte DNA konnte für alle Zwecke verwendet werden, einschließlich Southern-Blotting oder zur Konstruktion genomischer Banken.
Beispiel 2: Konstruktion genomischer Corynebacterium glutamicum (ATCC13032) -Banken in Escherichia coli
Ausgehend von DNA, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, wurden gemäß bekannter und gut eingeführter Verfahren (siehe bspw. Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al . (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons) Cosmid- und Plas id-Banken hergestellt.
Es ließ sich jedes Plasmid oder Cosmid einsetzen. Besondere Verwendung fanden die Plasmide pBR322 (Sutcliffe, J.G. (1979) Proc . Natl Acad. Sei. USA, 75:3737-3741); pACYC177 (Change & Cohen (1978) J. Bacteriol. 134:1141-1156); Plasmide der pBS-Reihe (pBSSK+, pBSSK- und andere; Stratagene, LaJolla, USA) oder Cosmide, wie SuperCosl (Stratagene, LaJolla, USA) oder Lorist6 (Gibson, T.J. Rosenthal, A. , und Waterson, R.H. (1987) Gene 53: 283-286.
Beispiel 3 : DNA-Sequenzierung und Computer-Funktionsanalyse
Genomische Banken, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurden zur DNA- Sequenzierung gemäß Standard-Verfahren, insbesondere dem Kettenabbruchverfahren mit ABI377-Sequenziermaschinen (s. z.B. Flei- schman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd. , Science 269:496-512) verwendet . Die Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotid- Sequenzen wurden verwendet: 5 ' -GGAAACAGTATGACCATG-3 ' oder 5 ' -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ' .
Beispiel 4 : In-vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Corynebacterium glutamicum kann durchgeführt werden, indem eine Plasmid- (oder andere Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae) geschleust wird, die die Integrität ihrer genetischen Information nicht aufrechterhalten kön- nen. Übliche Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z.B., mutHLS, mutD, mutT, usw., zum Vergleich siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Esche- richia coli and Salmonella, S. 2277-2294, ASM: Washington) . Diese Stämme sind dem Fachmann bekannt. Die Verwendung dieser Stämme ist bspw. in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34 veranschaulicht.
Beispiel 5 : DNA-Transfer zwischen Escherichia coli und Corynebacterium glutamicum
Mehrere Corynebacterium- und Brevibacterium-Arten enthalten endogene Plasmide (wie bspw. pHM1519 oder pBLl) die autonom replizieren (für einen Überblick siehe bspw. Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology 5:137-146). Shuttle-Vektoren für Escherichia coli und Corynebac eri m glutamicum lassen sich leicht mittels Standard-Vektoren für E. coli konstruieren (Sambrook, J. et al . , (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons), denen ein Replikationsursprung für und ein geeigneter Marker aus Corynebacterium glutamicum beigegeben wird. Solche Replikationsursprünge werden vorzugsweise von endogenen Plasmiden entnommen, die aus Corynebacterium- und Brevibactertium-Arten isoliert worden sind. Besondere Verwendung als Transformationsmarker für diese Arten sind Gene für Kanamycin-Resistenz (wie solche, die vom Tn5- oder Tn-903-Transposon stammen) oder für Chloramphenicol (Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones - Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim) . Es gibt zahlreiche Beispiele in der Literatur für die Herstellung einer großen Vielzahl von Shuttle-Vektoren, die in E. coli und C. glutamicum replizieren und für verschiedene Zwecke verwendet werden können, einschließlich Gen- Überexpression (siehe bspw. Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597, Martin, J.F. et al . , (1987) Biotechnology, 5:137-146 und Eikmanns, B.J. et al . (1992) Gene 102:93-98) .
Mittels Standard-Verfahren ist es möglich, ein Gen von Interesse in einen der vorstehend beschriebenen Shuttle-Vektoren zu klonie- ren und solche Hybrid-Vektoren in Corynebacterium glutamicum- Stämme einzubringen. Die Transformation von C. gluta-nicum läßt sich durch Protoplastentransformation (Kastsumata, R. et al . , (1984) J. Bacteriol. 159:306-311), Elektroporation (Liebl, E. et al., (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303) und in Fällen, bei denen spezielle Vektoren verwendet werden, auch durch Konjugation erzielen (wie z.B. beschrieben in Schäfer, A. , et (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666). Es ist ebenfalls möglich, die Shuttle-Vektoren für C. glutamicum auf E. coli zu übertragen, indem Plasmid-DNA aus C. glutamicum (mittels im Fachgebiet bekannter Standard-Verfahren) präpariert und in E. coli transformiert wird. Dieser Transformationsschritt kann mit Standard-Verfahren erfolgen, jedoch wird vorteilhafterweise ein Mcr-defizienter E. coli-Stamm verwendet, wie NM522 (Gough & Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19) .
Beispiel 6 : Bestimmung der Expression des mutanten Proteins
Die Beobachtungen der Aktivität eines mutierten Proteins in einer transformierten Wirtszelle beruhen auf der Tatsache, daß das mu- tante Protein auf ähnliche Weise und in ähnlicher Menge exprimiert wird wie das Wildtyp-Protein. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des mutanten Gens (ein Anzei- chen für die mRNA-Menge, die für die Translation des Genprodukts verfügbar ist) ist die Durchführung eines Northern-Blots (s. bspw. Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York) , wobei ein Primer, der so ausgestaltet ist, daß er an das Gen von Interesse bindet, mit einer nachweis- baren (gewöhnlich radioaktiven oder chemilumineszierenden) Markierung versehen wird, so daß - wenn die Gesamt-RNA einer Kultur des Organismus extrahiert, auf einem Gel aufgetrennt, auf eine stabile Matrix übertragen und mit dieser Sonde inkubiert wird - die Bindung und die Quantität der Bindung der Sonde das Vorliegen und auch die Menge der mRNA für dieses Gen anzeigt. Diese Information ist ein Hinweis auf das Ausmaß der Transkription des mutanten Gens. Gesamt-Zell-RNA läßt sich durch verschiedene Verfahren aus Corynebacterium glutamicum isolieren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie in Bormann, E.R. et al., (1992) Mol. Mi- crobiol . 6:317-326 beschrieben.
Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Menge an Protein, das von dieser mRNA translatiert wird, können Standard- Techniken, wie Western-Blot, eingesetzt werden (s. bspw. Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York) . Bei diesem Verfahren werden Gesa t-Zellproteine extra- hiert, durch Gelelektrophorese aufgetrennt, auf eine Matrix, wie Nitrocellulose, übertragen und mit einer Sonde, wie einem Antikörper, die an das gewünschte Protein spezifisch bindet, inkubiert, . Diese Sonde ist gewöhnlich mit einer chemilumineszieren- den oder colorimetrischen Markierung versehen, die sich leicht nachweisen läßt. Das Vorliegen und die beobachtete Menge an Markierung zeigt das Vorliegen und die Menge des gesuchten Mutantenproteins in der Zelle an.
Beispiel 7: Wachstum von genetisch verändertem Corynebacterium glutamicum - Medien und Anzuchtbedingungen
Genetisch veränderte Corynebakterien werden in synthetischen oder natürlichen Wachstumsmedien gezüchtet. Eine Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien für Corynebakterian sind bekannt und leicht erhältlich (Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol . Biotechnol. 32:205-210; von der Osten et al . (1998) Biotechnology Letters 11:11-16; Patent DE 4 120 867; Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Bd. II, Balows, A. , et al., Hrsg. Springer-Verlag). Diese Medien bestehen aus einer oder mehreren Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganischen Salzen, Vitaminen und Spurenelementen. Bevorzugte Kohlenstoff- quellen sind Zucker, wie Mono-, Di- oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind bspw. Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribulose, Lactose, Maltose, Saccha- rose, Raffinose, Stärke oder Cellulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder andere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vorteilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Alkohole und organi- sehe Säuren, wie Methanol, Ethanol, Essigsäure oder Milchsäure. Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindungen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie NH4C1 oder (NH4)2S0 , NH4OH, Nitrate, Harnstoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere.
Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor- oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen. Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure. Die Medien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bspw. Biotin, Ribofla- vin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyridoxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Medienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Medienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch "Applied Micro- biol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wach- stumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbietern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und dergleichen.
Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121°C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zusammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder wahlfrei kontinuierlich oder chargenweise hinzugegeben werden.
Die Anzuchtbedingungen werden für jedes Experiment gesondert definiert. Die Temperatur sollte zwischen 15°C und 45°C liegen und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verändert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7,0 liegen, und kann durch Zugabe von Puffern zu den Medien aufrechterhalten werden. Ein beispielhafter Puffer für diesen Zweck ist ein Kaliumphosphatpuffer. Synthetische Puffer, wie MOPS, HEPES; ACES usw., können alternativ oder gleichzeitig verwendet werden. Der Anzucht-pH-Wert läßt sich während der An- zucht auch durch Zugabe von NaOH oder NH4OH konstant halten. Werden komplexe Medienkomponenten, wie Hefe-Extrakt, verwendet, sinkt der Bedarf an zusätzlichen Puffern, da viele komplexe Ver- bindungen eine hohe Pufferkapazität aufweisen. Beim Einsatz eines Fermenters für die Anzucht von Mikroorganismen kann der pH-Wert auch mit gasförmigem Ammoniak reguliert werden.
Die Inkubationsdauer liegt gewöhnlich in einem Bereich von mehreren Stunden bis zu mehreren Tagen. Diese Zeit wird so ausgewählt, daß sich die maximale Menge Produkt in der Brühe ansammelt. Die offenbarten Wachstumsexperimente können in einer Vielzahl von Behältern, wie Mikrotiterplatten, Glasröhrchen, Glaskolben oder Glas- oder Metallfermentern unterschiedlicher Größen durchgeführt werden. Zum Screening einer großen Anzahl von Klonen sollten die Mikroorganismen in Mikrotiterplatten, Glasröhrchen oder Schüttelkolben entweder mit oder ohne Schikanen, gezüchtet werden. Vorzugsweise werden 100-ml-Schüttelkolben verwendet, die mit 10% (bezogen auf das Volumen) des erforderlichen Wachstumsmediums gefüllt sind. Die Kolben sollten auf einem Kreiselschüttler (Amplitude 25 mm) mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 100-300 U/ min geschüttelt werden. VerdampfungsVerluste können durch Aufrechterhalten einer feuchten Atmosphäre verringert werden; alter- nativ sollte für die Verdampfungsverluste eine mathematische Korrektur durchgeführt werden.
Werden genetisch modifizierte Klone untersucht, sollte auch ein unmodifizierter Kontrollklon oder ein Kontrollklon getestet wer- den, der das Basisplasmid ohne Insertion enthält. Das Medium wird auf eine ODgoo von 0,5 - 1,5 angeimpft, wobei Zellen verwendet werden, die auf Agarplatten, wie CM-Platten (10 g/1 Glucose, 2,5 g/1 NaCl, 2 g/1 Harnstoff, 10 g/1 Polypepton, 5 g/1 Hefeextrakt, 5 g/1 Fleischextrakt, 22 g/1 Agar pH-Wert 6,8 mit 2 M NaOH), die bei 30°C inkubiert worden sind, gezüchtet wurden. Das Animpfen der Medien erfolgt entweder durch Einbringen einer Kochsalzlösung von C. glutamicum-Zellen von CM-Platten oder durch Zugabe einer flüssigen Vorkultur dieses Bakteriums.
Beispiel 8: In-vitro-Analyse der Funktion mutanter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Di- xon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmanε, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl., Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J. , Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergen-Assays (wie in Kolmar, H. et al., (1995)
EMBO J. 14:3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen beschrieben) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotisehen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün-Fluoreszenz- Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß Techniken, wie sie in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes , Molecular Structure and Func- tion, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322 beschrieben sind, erfolgen.
Beispiel 9 : Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in C. glutamicum auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) ge- züchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten bezüglich der erhöhten Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird/werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektroskopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzyma- tische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A. , et al . , (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3 ; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publica- tions) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt-Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gemeinsamer Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Mi- crobial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben.
Beispiel 10: Reinigung des gewünschten Produktes aus C. glutami- cum-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus C. glutamicum-Zellen oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den C. glutamicum-Zellen sezerniert, werden die Zel- len durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatograph!eharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung 5 für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
10 Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, und das vorhergehende Reinigungsverfahren soll nicht einschränkend sein. Diese Reinigungstechniken sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) .
15
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS,
20 Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al . (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al . (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27,
25 VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566,
575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd.
30 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routinever- 35 fahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Die Angaben in Tabelle 1 sind folgendermassen zu verstehen:
40
In Spalte 1"DNA-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "5" in der Spalte "DNA-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO: 5.
45 In Spalte 2"AS-ID" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die SEQ ID NO des anhängenden Sequenzprotokolls. Eine "6" in der Spalte "AS-ID" bedeutet demzufolge ein Verweis auf SEQ ID NO : 6.
In Spalte 3"Identifikation" wird eine eindeutige interne Bezeichnung für jede Sequenz aufgeführt.
In Spalte 4 "AS-POS" bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der Polypeptidsequenz "AS-ID" in der gleichen Zeile. Eine "26" in der Spalte "AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Polypeptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.
In Spalte 5 "AS-Wildtyp" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Wildtyp-Stamm.
In Spalte 6 "AS-Mutante" bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure - dargestellt im Ein-Buchstaben-Code- an der in Spalte 4 angegebenen Position beim entsprechenden Mutanten-Stamm.
In Spalte 7"Funktion" wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polypeptidsequenz aufgeführt.
Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Aspartat
E Glutamat
F Phenylalanin
G Glycin
H His
I Isoleucin
K Lysin
L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin Tabelle 1
Gene die für neue Proteine codieren
DNA AS Identifikation: AS AS AS Funktion:
ID: ID: Pos: Wildtyp Mutai
1 2 RXA00033 158 L F TRANSPORTER
382 G E TRANSPORTER
3 4 RXA00054 613 A V DNA/RNA HELICASE (DEAD/DEAH BOX FAMILY)
5 6 RXA00056 262 G D Hypothetical Exported Protein
7 8 RXA00065 101 S F hypot etical protein
9 10 RXA00068 35 S N hypothetical protein
11 12 RXA00077 374 A T HUNTINGTIN INTERACTING PROTEIN HYPE
13 14 RXA00080 70 G D INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
253 P S INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
15 16 RXA00110 172 S F Hypothetical Membrane Spanning Protein
17 18 RXA00118 53 V I Hypothetical Cytosolic Protein
19 20 RXA00121 164 G D hypothetical protein
21 22 RXA00150 85 G D Hypothetical Membrane Spanning Protein
23 24 RXA00151 110 V 1 hypothetical protein
25 26 RXA00155 231 P S hypothetical protein
28 RXA00185 508 D N Hypothetical Cytosolic Protein
30 RXA00197 322 A V MEMBRANE METALLOPROTEASE
32 RXA00199 12 P S hypothetical protein
370 L F hypothetical protein
34 RXA00211 44 V I GLUTAMYL-TRNA(GLN) AMIDOTRANSFERASE SUBUNIT B (EC 6.3.5.-)
36 RXA00220 122 G D ACETYLTRANSFERASE (EC 2.3.1.-)
38 RXA00240 8 R K hypothetical protein
40 RXA00354 67 G E Hydrolase (HAD superfamily)
42 RXA00397 236 A V XAA-PRO AMINOPEPTIDASE (EC 3.4.11.9)
44 RXA00409 217 G D TRANSPORTER
46 RXA00416 223 A V Hypothetical Membrane Spanning Protein
48 RXA00424 4 R K hypothetical protein
50 RXA00451 78 S N CYTOSINE DEAMINASE (EC 3.5.4.1)
52 RXA00476 274 G E hypothetical protein
287 G R hypothetical protein
54 RXA00486 80 R H TRANSCRIPTIONAL REGULATORY PROTEIN, LYSR FAMILY
56 RXA00493 363 A T 60 KD CHAPERONIN GROEL
58 RXA00496 340 P L hypothetical protein
60 RXA00503 186 A T putative sugar kinase
62 RXA00507 224 A V LIPASE (EC 3.1.1.3)
64 RXA00510 17 G s hypothetical protein
66 RXA00550 554 S F PENICILLIN-BINDING PROTEIN 1A
68 RXA00552 295 A T THIOSULFATE SULFURTRANSFERASE (EC 2.8.1.1 )
69 70 RXA00576 157 E K hypothetical protein
71 72 RXA00611 291 I T TRANSPORTER
73 74 RXA00614 86 P S PHOSPHOESTERASE
75 76 RXA00637 148 E K TRANSCRIPTIONAL REGULATOR, MERR FAMILY
77 78 RXA00654 399 S F INNER MEMBRANE PROTEIN
79 80 RXA00678 127 A T hypothetical protein
81 82 RXA00691 214 A T Hypothetical Cytosolic Protein
83 84 RXA00719 306 D N GTP-BINDING PROTEIN
468 A T GTP-BINDING PROTEIN
85 86 RXA00731 550 A T TRANSPORTER
776 L F TRANSPORTER
87 88 RXA00740 93 A T hypothetical protein
89 90 RXA00812 106 A V INHIBITION OF MORPHOLOGICAL DIFFERENTIATION
91 92 RXA00831 166 A T Hypothetical Cytosolic Protein
93 94 RXA00835 54 A V Hypothetical Membrane Spanning Protein
95 96 RXA0091 635 D N hypothetical protein
97 98 RXA00943 55 P S hypothetical protein
123 L F hypothetical protein
99 100 RXA00963 211 P S 2-HYDROXYHEPTA-2,4-DIENE-1 ,7-DIOATE ISOMERASE (EC 5.3.3.-) / 5-CARBOXYMETHYL-2- OXO-HEX-3-ENE-1 ,7-DIOATE DECARBOXYLASE (EC 4.1.1.-)
101 102 RXA01011 201 A T Hypothetical Cytosolic Protein
103 104 RXA01017 37 V I Hypothetical Cytosolic Protein
105 106 RXA01037 28 G D hypothetical protein
107 108 RXA01046 408 A V ATP-DEPENDENT CLP PROTEASE ATP-BINDING SUBUNIT CLPA
109 110 RXA01109 113 A V hypothetical protein
111 112 RXA01122 104 R c hypothetical protein
113 114 RXA01127 60 D N 3-ISOPROPYLMALATE DEHYDROGENASE (EC 1.1.1.85)
115 116 RXA01128 221 T 1 TAURINE-BINDING PERIPLASMIC PROTEIN PRECURSOR
117 118 RXA01129 2 V 1 cyclic nucleotide binding protein/2 CBS domains
119 120 RXA01173 146 A T Hypothetical Secreted Protein
121 122 RXA01174 174 L F Hypothetical Membrane Glycoprotein
123 124 RXA01184 363 R K ABC TRANSPORTER INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
430 G D ABC TRANSPORTER INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
125 126 RXA01196 81 G D Hypothetical Cytosolic Protein
127 128 RXA01263 74 S F O-ANTIGEN ACETYLASE
129 130 RXA01268 150 D N CAPM PROTEIN
131 132 RXA01271 307 S F CAPD PROTEIN
131 132 RXA01271 525 L F CAPD PROTEIN
133 134 RXA01273 106 A V Hypothetical Membrane Associated Protein
135 136 RXA01315 20 A T TRANSCRIPTIONAL REGULATOR, TETR FAMILY
101 G D TRANSCRIPTIONAL REGULATOR, TETR FAMILY
137 138 RXA01318 67 A V putative membrane protein
139 140 RXA01326 103 A V hypothetical protein
141 142 RXA01331 13 T 1 Hypothetical Membrane Spanning Protein
403 P S Hypothetical Membrane Spanning Protein
544 T 1 Hypothetical Membrane Spanning Protein
143 144 RXA01400 549 G R Hypothetical Cytosolic Protein
145 146 RXA01425 85 E K 60 KDA INNER MEMBRANE PROTEIN YIDC
147 148 RXA01434 957 S F VIRULENCE FACTOR MVIN
1012 P S VIRULENCE FACTOR MVIN
149 150 RXA01439 116 L F ACETYLTRANSFERASE (EC 2.3.1.-)
151 152 RXA01441 104 C R hypothetical protein
153 154 RXA01448 159 G D INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
155 156 RXA01518 148 A T Hypothetical Membrane Spanning Protein
157 158 RXA01536 121 A V hypothetical protein
308 A V hypothetical protein
375 A T hypothetical protein
159 160 RXA01544 78 V 1 hypothetical protein
161 162 RXA01548 153 G D hypothetical protein
163 164 RXA01549 31 S G Hypothetical Membrane Spanning Protein
53 A T Hypothetical Membrane Spanning Protein
159 A T Hypothetical Membrane Spanning Protein
165 166 RXA01554 124 G D GLUCAN ENDO-1 ,3-BETA-GLUCOSIDASE A1 PRECURSOR (EC 3.2.1.39)
486 G R GLUCAN ENDO-1 ,3-BETA-GLUCOSIDASE A1 PRECURSOR (EC 3.2.1.39)
167 168 RXA01574 123 P S GLYCOSYL TRANSFERASE
169 170 RXA01585 112 V M hypothetical protein Rv2474c
171 172 RXA01590 1432 E K hypothetical protein
173 174 RXA01628 67 D N Hypothetical Membrane Glycoprotein
224 G D Hypothetical Membrane Glycoprotein
175 176 RXA01642 165 G E EXTRACELLULAR SUBTILISIN-LIKE PROTEASE PRECURSOR (EC 3.4.21.-)
294 A T EXTRACELLULAR SUBTILISIN-LIKE PROTEASE PRECURSOR (EC 3.4.21.-)
177 178 RXA01647 112 D N Hypothetical Membrane Associated Protein
167 G S Hypothetical Membrane Associated Protein
179 180 RXA01672 56 G D Hypothetical Membrane Spanning Protein
68 L F Hypothetical Membrane Spanning Protein
181 182 RXA01677 209 G R THIO DISULFIDE INTERCHANGE PROTEIN DSBA
183 184 RXA01693 102 A T Hypothetical Cytosolic Protein
185 186 RXA01741 17 D N hypothetical protein
187 188 RXA01 49 189 A V INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
212 P S INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
420 A T INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
189 190 RXA01754 596 D N hypothetical protein
191 192 RXA01761 441 R C hypothetical protein
1376 G S hypothetical protein
193 194 RXA01770 243 D N DNA HELICASE II (EC 3.6.1.-)
195 196 RXA01771 222 P S Membrane protease subunits, stomatin/prohibitin homologs
197 198 RXA01776 169 L F Hypothetical Membrane Spanning Protein
199 200 RXA01778 81 S F hypothetical protein
201 202 RXA01 79 229 T A Hypothetical Exported Protein
203 204 RXA01789 104 L F hypothetical protein
205 206 RXA01791 60 A V hypothetical protein
207 208 RXA01809 128 R Q Hypothetical Membrane Associated Protein
209 210 RXA01825 75 G D Hypothetical Membrane Spanning Protein
211 212 RXA01842 246 P S QUINONE OXIDOREDUCTASE (EC 1.6.5.5)
213 214 RXA01899 233 S N Hypothetical Cytosolic Protein
215 216 RXA01905 103 V I Hypothetical Exported Protein
219 220 RXA01910 220 G S hypothetical protein
221 222 RXA01945 629 E K Hypothetical Exported Protein
1382 G D Hypothetical Exported Protein
223 224 RXA01966 46 A V OLIGORIBONUCLEASE (EC 3.1.-.-)
225 226 RXA01982 341 A T hypothetical protein
227 228 RXA02021 305 S F 2,3,4,5-TETRAHYDROPYRIDINE-2-CARBOXYLATE N-SUCCINYLTRANSFERASE (HOMOLOG)
229 230 RXA02032 208 G S INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
231 232 RXA02053 66 H Y DRGA PROTEIN
233 234 RXA02058 188 S F hypothetical protein
235 236 RXA02059 24 G R Hypothetical Membrane Spanning Protein
237 238 RXA02070 150 A T MRP PROTEIN HOMOLOG
239 240 RXA02084 105 A V hypothetical protein
241 242 RXA02091 170 E K hypothetical protein
243 244 RXA02097 28 A V TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
427 G R TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
245 246 RXA02104 39 T I GLYCERATE KINASE (EC 2.7.1.31)
247 248 RXA02123 678 L F MAGNESIUM-CHELATASE SUBUNIT CHLI
249 250 RXA02138 88 A V HESB PROTEIN
251 252 RXA02151 165 A T Hypothetical Membrane Spanning Protein
253 254 RXA02163 23 P S hypothetical protein
255 256 RXA02185 104 G S RPF PROTEIN PRECURSOR
257 258 RXA02186 39 S F Hypothetical Cytosolic Protein
259 260 RXA02203 36 D N hypothetical protein
261 262 RXA02206 73 G D OXIDOREDUCTASE (EC 1.1.1.-)
114 A T OXIDOREDUCTASE (EC 1.1.1.-)
314 R C OXIDOREDUCTASE (EC 1.1.1.-)
263 264 RXA02217 65 E K quinate dehydrogenase (pyrroloquinoline-quinone) (EC 1.1.99.25) 92 T I quinate dehydrogenase (pyrroloquinoline-quinone) (EC 1.1.99.25)
265 266 RXA02219 292 V M Hypothetical Cytosolic Protein
267 268 RXA02221 176 L F hypothetical protein
269 270 RXA02267 65 A T DNA (CYTOSINE-5)-METHYLTRANSFERASE (EC 2.1.1.37)
271 272 RXA02271 126 G D Hypothetical Exported Protein
273 274 RXA02280 502 A V HEAT SHOCK PROTEIN HTPG
275 276 RXA02294 57 E K hypothetical protein
277 278 RXA02295 130 G D TRANSPORTER
279 280 RXA02296 61 S N Hypothetical Exported Protein
281 282 RXA02298 447 L F Hypothetical Cytosolic Protein
283 284 RXA02302 279 G E CHLORAMPHENICOL-SENSITIVE PROTEIN RARD
285 286 RXA02303 268 G D hypothetical protein
289 290 RXA02339 38 P S Hypothetical Cytosolic Protein
291 292 RXA02360 243 V I TYPE I RESTRICTION-MODIFICATION SYSTEM DNA METHYLASE
293 294 RXA02362 525 M I TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
295 296 RXA02367 3 I V PIRIN
297 298 RXA02387 10 A T Hypothetical Cytosolic Protein
299 300 RXA02390 195 G D THREONINE EFFLUX PROTEIN
301 302 RXA02395 533 A V TRANSPORTER
303 304 RXA02425 34 G E Heavy-Metal Cation Transporter
305 306 RXA02433 9 S N hypothetical protein
307 308 RXA02486 141 T I Hypothetical Cytosolic Protein
309 310 RXA02488 27 A T HEME TRANSPORT ASSOCIATED PROTEIN
311 312 RXA02495 81 G s ABC TRANSPORTER INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
313 314 RXA02570 184 R c ABC TRANSPORTER INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN
315 316 RXA02591 377 P s PHOSPHOENOLPYRUVATE CARBOXYKINASE [GTP] (EC 4.1.1.32)
317 318 RXA02604 570 G D Hypothetical Membrane Spanning Protein
319 320 RXA02678 3 M 1 Hypothetical Cytosolic Protein
321 322 RXA02683 81 G S hypothetical protein
323 324 RXA02721 181 G S Hypothetical Cytosolic Protein
325 326 RXA02725 208 A V hypothetical protein
327 328 RXA02735 27 P S 6-PHOSPHOGLUCONOLACTONASE (EC 3.1.1.31)
329 330 RXA02736 312 S F PUTATIVE OXPPCYCLE PROTEIN OPCA
331 332 RXA02744 231 M I PUTATIVE INTEGRAL MEMBRANE TRANSPORT PROTEIN
333 334 RXA02757 73 P S hypothetical protein
335 336 RXA02777 306 G D Hypothetical Cytosolic Protein
337 338 RXA02784 4 A V hypothetical protein
339 340 RXA02786 292 E K hypothetical protein
341 342 RXA02798 457 L S SULFITE REDUCTASE (NADPH) FLAVOPROTEIN ALPHA-COMPONENT (EC 1.8.1.2)
343 344 RXA02817 227 G D AEFA PROTEIN
345 346 RXA02825 362 S F HEME TRANSPORT ASSOCIATED PROTEIN
347 348 RXA02951 26 L F Hypothetical Cytosolic Protein
349 350 RXA03010 106 G S hypothetical protein
351 352 RXA03029 6 K E TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
7 P A TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
8 C 1 TRANSCRIPTIONAL REGULATOR
353 354 RXA03053 99 M 1 hypothetical protein
355 356 RXA03098 164 S N DNA alkylation repair enzyme
357 358 RXA03113 374 P L INTEGRAL MEMBRANE PROTEIN WITH TRKA DOMAINS
359 360 RXA03184 109 s F TRANSPORTER
361 362 RXA03316 6 D N
363 364 RXA03343 171 S F
365 366 RXA03377 55 A V
367 368 RXA03463 53 V 1
369 370 RXA03506 80 P L Hypothetical Cytosolic Protein
371 372 RXA03523 167 A T
375 376 RXA03577 72 A T
377 378 RXA03584 12 S F
379 380 RXA03591 902 S F
381 382 RXA03613 106 S Y
383 384 RXA03682 18 P s
385 386 RXA03700 139 E K
269 A T
387 388 RXA03803 44 P s
391 392 RXA03886 23 A V
393 394 RXA03940 86 T 1
395 396 RXA03947 81 A T
84 S N
397 398 RXA03955 126 T 1
399 400 RXA03975 55 V 1
401 402 RXA04007 145 s N
403 404 RXA04075 66 G s
173 A V
405 406 RXA04085 55 P S
407 408 RXA04092 18 A V
409 410 RXA04095 30 R K
413 414 RXA04169 21 T 1
415 416 RXA04172 46 P S
417 418 RXA04181 40 G D
419 420 RXA04319 40 R C
421 422 RXA04337 19 P S
423 424 RXA04352 2 G s
425 426 RXA04354 50 T 1
427 428 RXA04370 102 P L
429 430 RXA04546 85 A V Hypothetical Cytosolic Protein
362 P L Hypothetical Cytosolic Protein
431 432 RXA04549 214 G R
435 436 RXA04642 112 P L
437 438 RXA06004 148 D N
439 440 RXA06040 58 S P 59 1 M
93 V E

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül codierend für ein Polypeptid mit der jeweils in Tabellel/Spalte2 in Bezug genommenen
Aminosäuresequenz wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Ta- bellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition eine andere proteinogene Aminosäure codiert als die jeweilige in Ta- bellel/Spalte5 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül in der in Tabellel/Spalte4 angegebenenen Aminosäureposition die in Tabellel/Spalte6 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure codiert.
3. Ein Vektor, der wenigstens eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 enthält.
4. Eine Wirtszelle, die mit wenigstens einem Vektor nach An- spruch 3 transfiziert ist.
5. Eine Wirtszelle nach Anspruch 4, wobei die Expression des besagten Nukleinsäuremoleküls zur Modulation der Produktion einer Feinchemikalie aus besagter Zelle führt.
6. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie welches die Kultivierung einer Zelle beinhaltet, die mit wenigstens einen Vektor nach Anspruch 3 transfiziert worden ist, so dass die Feinchemikalie produziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Feinchemikalie eine Aminosäure ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure Lysin ist.
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