CN109694841A - 一种谷氨酸棒状杆菌重组菌、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其能解决传统的谷氨酸棒状杆菌的宿主菌外源蛋白表达量较低，限制了其作为外源蛋白表达宿主的应用程度的技术问题。一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。本发明改造的谷氨酸棒状杆菌重组菌其通过阻断NCgl1689基因的转录和翻译，实现外源蛋白的高表达。

Description

一种谷氨酸棒状杆菌重组菌、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸棒状杆菌重组菌、制备方法和应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性土壤微生物，是在上世纪五十年代从日本东京上野动物园的土壤中分离得到。在工业上该菌主要用于各种氨基酸、有机酸、高级醇等小分子的生产。随着基因工程、代谢工程、发酵工程等生物技术的不断进步，对谷氨酸棒杆菌的基因组序列、代谢通路和发酵条件的认识更加深刻。谷氨酸棒杆菌至今发现具有不产内毒素且胞外水解酶活性较低，能够分泌正确折叠的具有生物活性的蛋白质分子等优点。另外谷氨酸棒杆菌的培养技术非常成熟，能够进行大规模菌体发酵。因此谷氨酸棒杆菌可以作为一种优良的宿主用于各种异源蛋白的分泌表达生产。

但传统的谷氨酸棒状杆菌的宿主菌由于外源蛋白表达量较低，限制了其作为外源蛋白表达宿主的应用程度。因此，有必要对谷氨酸棒状杆菌的宿主菌进行改造使其更有利于外源蛋白的表达。

发明内容

本发明提供了一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其能能解决传统的谷氨酸棒状杆菌的宿主菌外源蛋白表达量较低，限制了其作为外源蛋白表达宿主的应用程度的技术问题。

一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。

进一步的，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌是由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032将NCgl1689基因全部缺失得到，NCgl1689于基因组中所在位置为1858763-1860730，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Gene ID: 1019721。

进一步的，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌是由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032将NCgl1689基因部分缺失得到，NCgl1689于基因组中所在位置为1858763-1860730。

更进一步的，NCgl1689基因中部分缺失的为AAA结构域，AAA结构域于基因组中所在位置为1859262-1859930。

更进一步的，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌于 2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC 16958 。

本发明还提供了上述谷氨酸棒状杆菌重组菌的制备方法，其特征在于：采用pK18mobsacB同源重组技术敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1689基因中的AAA结构域，使得获得的谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。

本发明还提供了上述谷氨酸棒状杆菌重组菌在制备纳米抗体VHH的应用。

本发明还提供了纳米抗体VHH的表达体系，其包括上述谷氨酸棒状杆菌重组菌，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌中转化有分泌组成型pXMJ19-VHH载体，所述分泌组成型pXMJ19-VHH载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了上述谷氨酸棒状杆菌重组菌在制备氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP中的应用。

本发明还提供了氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP的表达体系，其包括上述谷氨酸棒状杆菌重组菌，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌中转化有组成型pXMJ19-NT-proBNP载体，所述组成型pXMJ19-NT-proBNP载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明改造的谷氨酸棒状杆菌重组菌其通过阻断NCgl1689基因的转录和翻译，实现外源蛋白的高表达；经验证，采用本发明改造的谷氨酸棒状杆菌重组菌作为宿主菌进行外源蛋白表达时，其中，VHH的表达量提高46%，NT-proBNP的表达量提高了51%。

附图说明

图1为基因敲除菌株PCR验证电泳图；其中，泳道M为MarkerDL10000，泳道1为野生型菌株（谷氨酸棒状杆菌ATCC13032），PCR产物长度2182bp；泳道2为NCgl1689基因敲除菌株，PCR产物长度1516bp。

图2为EGFP蛋白表达的SDS-PAGE结果；其中，泳道1为野生型表达组成型pXMJ19空载体菌体破碎上清，泳道2为野生型菌株表达组成型pXMJ19-EGFP的菌体破碎上清，泳道3为重组菌株表达组成型pXMJ19-EGFP的菌体破碎上清；4；M: Marker 26610。

图3为NT-proBNP蛋白表达的WB结果，其中，泳道1为野生型表达组成型pXMJ19空载体菌体破碎上清，泳道2为野生型菌株表达组成型pXMJ19-NT-proBNP的菌体破碎上清，泳道3为重组菌株表达组成型pXMJ19-NT-proBNP的菌体破碎上清。

图4为VHH蛋白分泌表达的WB结果，其中，泳道1为野生型表达组成型pXMJ19空载体的发酵液上清，泳道2为野生型菌株表达分泌组成型pXMJ19-VHH的发酵液上清，泳道3为重组菌株表达分泌组成型pXMJ19-VHH的发酵液上清。

生物保藏说明

拉丁学名：Corynebacterium glutamicum；

中文译名：谷氨酸棒杆菌

保藏单位全称：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

保藏单位简称：CGMCC；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2018年12月17日

保藏编号：CGMCC16958

指定编号：ATCC 13032- ko-NCgl1689。

具体实施方式

下述实施例或应用例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例或应用例中所用的材料、试剂，基因合成等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例或应用例中所用大肠杆菌DH5α购买自TAKARA。

下述实施例或应用例中所用谷氨酸棒状杆菌C. glutamicumATCC13032。

下述实施例或应用例中所用载体骨架pXMJ19购自Addgene。

下述实施例或应用例中所用连接液solutionI购买自TaKaRa公司，货号 D6020A。

下述实施例或应用例中所用CloneExpress II one step cloning溶液购买自诺唯赞( ChinaNanJing)公司。

下述实施例或应用例中所用载体骨架pK18mobSacB购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。

下述实施例或应用例中大肠杆菌的培养使用LB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，去离子水 1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的培养使用LBB培养基，培养基配方为：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，脑心浸液 10g、去离子水1L。

下述实施例或应用例中谷氨酸棒状杆菌的转化子培养使用LBHIS培养基，培养基配方为：胰蛋白胨 5g、酵母提取物 2.5g、NaCl 5g、脑心浸液 18.5g、山梨醇 91g、去离子水1L。

下述实施例或应用例中SDS-PAGE所用到的试剂购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

SDS-PAGE实验所用到的试剂：

30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺Acr 29.2g、甲叉双丙烯酰胺 Bis 0.8g，加去离子水定容至100mL；

分离胶缓冲液：1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)、0.4% SDS、Tris 18.2g、0.4g SDS，用1MHCl调pH到8.8，加去离子水定容至100mL；

浓缩胶缓冲液：1.0 M Tris-HCl (pH 6.8)、0.4% SDS、Tris 12.1g、0.4g SDS，用1MHCl调pH到6.8，加去离子水定容至100 mL；

10%AP：过硫酸铵1g,加去离子水溶解，定容至10 mL；

5*上样缓冲液：SDS 0.1g、DTT 0.78g、溴酚蓝0.05g、甘油 5mL、1M pH6.8 Tris-HCl2.5 mL，加去离子水定容至10 mL；

5*电泳缓冲液：Tris 15 g、甘氨酸92g、SDS 5g，加去离子水溶解，定容至1L；

12%分离胶配方:30%丙烯酰胺 2 mL、分离胶缓冲液 1.25 mL、H2O 2.25 mL、10%AP 25µL、TEMED 3 µL；

4%浓缩胶配方：H2O 1.15 mL、30%丙烯酰胺 0.335 mL、浓缩胶缓冲液 0.5 mL、10%AP15µL、TEMED 2.5µL。

实施例1 谷氨酸棒状杆菌重组菌的制备

1、一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，谷氨酸棒状杆菌重组菌于 2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC16958；谷氨酸棒状杆菌重组菌是由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032将NCgl1689基因中的AAA结构域缺失得到，NCgl1689于基因组中所在位置为1858763-1860730，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Gene ID: 1019721，AAA结构域于基因组中所在位置为1859262-1859930。

2、上述谷氨酸棒状杆菌重组菌的制备方法，采用pK18mobsacB同源重组技术敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1689基因中的AAA结构域，使得获得的谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。

制备方法包括以下步骤：

（1）根据谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组（基因NCgl1689）设计敲除AAA结构域的上、下游同源臂引物，以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组（基因NCgl1689）为模板进行PCR扩增，分别得到AAA结构域的上游同源臂片段和下游同源臂片段，上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

上游同源臂引物为NCgl1689-LF和NCgl1689-LR，

NCgl1689-LF为CGGAATTC AATCCTGCCTGACTACGG，

NCgl1689-LR为GCTTGATAGCCCAGCACCAGCAACAAG；

下游同源臂引物为NCgl1689-RF和NCgl1689-RR，

NCgl1689-RF为CTGGTGCTGGGCTATCAAGCGTGAACAG，

NCgl1689-RR为GCTCTAGACAGTGAGTGTAGGTAGGGTG；

PCR扩增的反应体系为10×Q5 Buffer 5μL、dNTPs（2.5mmol/L） 4μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Q5DNA聚合酶（2U/μL）0.5μL、模板1μL，加水至50μL；

PCR扩增条件为：98℃ 3min；98℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 1min15s；胶回收后得到上、下游同源臂。

（2）以上、下游同源臂片段为模板，以NCgl1689-LF和NCgl1689-RR为引物进行融合PCR，获得由上游同源臂片段和下游同源臂片段整合形成的同源修复片段。

融合PCR的反应体系为10×Q5 Buffer 5μL、dNTPs（2.5mmol/L） 4μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Q5DNA聚合酶（2U/μL）0.5μL、模板1μL，加水至50μL；

融合PCR条件为：98℃ 3min；98℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 1min，30个循环；72℃1min15s；

胶回收后得到同源修复片段。

（3）将同源修复片段与pK18mobsSacB载体连接，构建形成敲除载体pK18-1689-LR.

具体的，选用的酶切位点是EcoRI和XbaI；

同源修复片段酶切体系为：10x FastDigest Green Buffer 10μL， 酶 5μL，同源修复片段10μL，水补齐到100μL；

载体酶切体系为：10x FastDigest Green Buffer 10μL， 酶 5μL，载体10μL，水补齐到100μL，37℃ 水浴反应30min；

将酶切产物跑1%的核酸胶，采用胶回收的方式得到具有相同粘性末端的线性化载体和同源修复片段；

线性化载体和同源修复片段摩尔比1:1，solutionI 5 μL，无菌水补齐到10μL，16℃连接2个小时，获得pK18-1689-LR。

（4）扩增敲除载体pK18-1689-LR， 10μL 的连接产物加到100μL的E.coli DH5α感受态细胞中，冰上静置15min；

42 ℃水浴锅中热激90s；

热击90 s后冰上放置5min；

37℃，100rpm，LB培养基，恢复培养1h；

取60 μL涂布于含有30μg/mL卡那的LB固体平板上，37℃倒置培养16h；

PCR验证挑选阳性克隆子，验证结果如图1所示，提取质粒即为基因敲除载体。

（5）将验证正确的敲除载体pK18-1689-LR转化谷氨酸棒杆菌感受态中。

具体的，将感受态细胞从-80℃冰箱中取出，置于冰上融化，添加 6 μL 重组质粒后轻轻混匀，转移至预冷的 0.1cm 电击杯中，静置15 min；

电击，仪器： BIO-RAD MicroPulser，模式：Bacteria 1.8kv，6.2ms；

电击杯中立即加入恢复培养基LBHIS 200 μL（事先分装好1.5 EP 管中0.5 mL) 混匀后转入含有恢复培养基的1.5mL EP 管中；

于 46℃ 水浴 6min，到时间后取出，冰上静置5 min；

将含有转化后感受态的1.5mL EP 管置于摇床，30℃、100rpm 振荡培养 1h；

将菌液于 6000rpm 离心 3min，在超净台中浓缩菌体至 100-200μL，涂布于质粒对应的抗性恢复平板上，于 30℃培养箱倒置培养 48-72 h。

（6）对转化后的谷氨酸棒状杆菌进行筛选，获得谷氨酸棒状杆菌重组菌。

具体的，将步骤（5）转化后的谷氨酸棒状杆菌分别在10μg /mL卡那抗性平板和10μg /mL卡那抗性加0.2g/mL蔗糖平板上进行培养，仅在卡那抗性平板上生长的菌为蔗糖敏感型；

将蔗糖敏感型的谷氨酸棒状杆菌用LBB液体培养基培养24h；

划线在20g/mL蔗糖固体板上，然后以NCgl1689-LF 和NCgl1689-RR作引物， PCR验证获得正确的敲除菌株，验证结果如图1所示。

实施例2 绿色荧光蛋白检测分析

1、构建重组菌株表达组成型pXMJ19-EGFP

（1）构建RBS-egfp基因片段，RBS的核苷酸序列为AAAAGGAGGACAACTA，egfp的基因序列如SEQ ID NO：6所示。

所需引物为SD-EGFP-F和SD-EGFP-R；

SD-EGFP-F CCCAAGCTTAAAGGAGGACAACTAATGGTGAGCAAGGGCG（酶切位点Hind III）

SD-EGFP-R CCCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG （酶切位点BamH I）

PCR扩增反应体系为 10×Q5 Buffer 5μL、dNTPs（2.5mmol/L） 4μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Q5DNA聚合酶（2U/μL）0.5μL、模板1μL，加水至50μL。

PCR扩增条件为：98℃ 3min；98℃ 15s；58℃ 15s ，72℃ 30s，30个循环；72℃2min。

(2) RBS-egfp基因片段与组成型pXMJ19载体分别通过Hind III酶 、BamH I酶酶切后进行连接。

组成型pXMJ19载体酶切体系为：10X FastDegist Green Buffer 10 µL，Hind III酶 5µL，

BamH I酶 5µL，组成型pXMJ19载体 10 µL，水补齐到100µL。

RBS-egfp基因片段酶切体系为：10X FastDegist Green Buffer 10 µL，Hind III酶 5µL，BamH I酶 5µL， RBS-egfp基因片段10 µL，水补齐到100µL。

37℃水浴30min， 进行核酸电泳：1%核酸胶，110V， 30min，用Axygen的胶回收试剂盒进行线性化片段的回收。

连接体系：SolutionI 5 µL，片段与载体摩尔比3:1，水补齐10µL，16℃连接2h。

（3）转化得到重组载体pXMJ19-EGFP。

将10μL 的连接产物加到100μL的E.coli DH5α感受态细胞中，冰上静置15min，42℃水浴锅中热激90s，冰上静置5min，转入500μL 的LB培养基中，37℃ 100rpm恢复培养1h，取50μL菌液涂布于含有氯霉素的LB固体平板上，37℃培养16h后挑选阳性克隆子，提取质粒即为重组载体pXMJ19-EGFP。

2、构建重组菌和对照菌。

将构建好的重组载体pXMJ19-EGFP转入大肠杆菌DH5α中，从扩大培养的大肠杆菌中提取重组载体，通过电转化的方法转入谷氨酸棒杆菌中，即获得重组菌株表达组成型pXMJ19-EGFP。其中对照菌1为野生型表达组成型pXMJ19空载体，对照菌2为野生型菌株表达组成型pXMJ19-EGFP。

3、培养，30℃，200rpm，LBB培养基，36h(胞内表达此时表达量最高)。

4、GFP蛋白提取、分析

取等量的菌体用PBS洗三次，分别用等量的PBS重悬菌体，并加入等量的细玻璃珠，用高通量匀质器破菌提蛋白；将匀质液离心，取溶有蛋白的上清跑蛋白胶，蛋白胶上层为4%的浓缩胶，下层为12%的分离胶，结果如图2所示，其中，野生型菌株表达组成型pXMJ19-EGFP的荧光值/OD600为98538，重组菌株表达组成型pXMJ19-EGFP的荧光值/OD600为112826，表达量提高14%。

组成型pXMJ19质粒构建方法

组成型pXMJ19质粒是将pXMJ19质粒中的lacq基因去掉，采用方法为用EcoRV和HindIII双酶切pXMJ19质粒，将lacq基因和tac启动子区域切掉，设计两端含EcoRV和HindIII酶切位点的PCR引物将tac启动子区域100bp片段扩出来，将载体骨架与tac启动子连接获得组成型pXMJ19质粒。

(1)设计两端含EcoRV和HindIII酶切位点的tac启动子片段，扩增tac片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，扩增引物为Tac-f和Tac-r。

Tac-f CTGATATCTTGCGCCGACATCAT （酶切位点EcoRV）

Tac-r CCCAAGCTTATTCTGTTTCCTGT （酶切位点HindIII）

PCR反应体系为 10×Q5 Buffer 5μL、dNTPs（2.5mmol/L） 4μL、上下游引物（10μmol/L）各1μL、Q5DNA聚合酶（2U/μL）0.5μL、模板1μL，加水至50μL。

PCR扩增条件为：98℃ 3min；98℃ 15s；58℃ 15s ，72℃ 10s，30个循环；72℃2min。

（2）tac启动子片段与pXMJ19质粒同源重组，敲除lacq基因。

将tac启动子片段和pXMJ19质粒分别用EcoRV和HindIII酶切，两者酶切体系相同，酶切体系为：10X FastDegist Green Buffer 10 µL，酶各 5µL，pXMJ19载体 10 µL，水补齐到100µL；

37℃水浴30min；

进行核酸电泳：1%核酸胶，110V， 30min， 用Axygen的胶回收试剂盒进行线性化载体片段的回收。

连接体系：SolutionI 5 µL，片段与载体摩尔比3:1，水补齐10µL。16℃连接2h。

（3）将10μL 的连接产物加到100μL的E.coli DH5α感受态细胞中，冰上静置15min，42 ℃水浴锅中热激90s，冰上静置5min，转入500μL 的LB培养基中，37℃ 100rpm恢复培养1h。

（4）取50μL菌液涂布于含有氯霉素的LB固体平板上，37℃培养16h后挑选阳性克隆子，提取质粒即为组成型pXMJ19质粒。

实施例3氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP表达体系的构建和检测分析

氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP，基因序列如SEQ ID NO：8所示，231bp,76aa，8.4kDa。

脑钠肽前体 （pro-brain natriuretic peptide， proBNP）由 134个氨基酸残基组成， 经蛋白酶裂解为有生物活性的脑钠肽BNP和没有生物活性的氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP，而NT-porBNP相比较于 BNP具有更稳定的优点，因此NT-proBNP蛋白作为心血管检查试剂盒中的标准品和校正品。

氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP的表达体系，其包括上述谷氨酸棒状杆菌重组菌，谷氨酸棒状杆菌重组菌中转化有组成型pXMJ19-NT-proBNP载体，组成型pXMJ19-NT-proBNP载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

1、组成型pXMJ19-NT-proBNP载体的构建。

（1）构建两端含SmaI酶切末端的HIS-sumo-NT-proBNP片段。

HIS-sumo-NT-proBNPP片段包括顺序连接的HIS标签序列、NT-proBNP基因和sumo基因，并在整个基因前后加上和组成型pXMJ19载体中SmaI两端序列同源的序列，HIS-sumo-NT-proBNP片段由金维智公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；其中，HIS为组氨酸标签，便于后期进行蛋白筛选，sumo为促溶标签蛋白，和目的蛋白融合表达可以促进目的蛋白的可溶表达，基因序列如SEQ ID NO：9所示。

（2）将合成的基因片段与经SmaI酶切线性化的组成型pXMJ19载体进行同源重组。

载体酶切体系为：10X FastDegist Green Buffer 10 µL，SmaI酶 5µL，组成型pXMJ19载体 10 µL，水补齐到100µL；

37℃水浴2h；

进行核酸电泳：1%核酸胶，110V， 30min, 用Axygen的胶回收试剂盒进行线性化载体片段的回收。

同源重组体系：（试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit诺唯赞 南京）5× CE II Buffer 2µL ，Exnase II 1µL，片段：载体摩尔比3:1，水补齐10µL；37℃水浴30min，进行连接。

（3）转化，将10μL 的连接产物加到100μL的E.coli DH5α感受态细胞中，冰上静置15min，42 ℃水浴锅中热激90s，冰上静置5min,转入500μL 的LB培养基中，37℃ 100rpm恢复培养1h。

（4）筛选，取50μL菌液涂布于含有氯霉素的LB固体平板上，37℃培养16h后即可挑选阳性克隆子，提取质粒即为组成型pXMJ19-NT-proBNP载体。

2、将构建好的组成型pXMJ19-NT-proBNP载体转入重组谷氨酸棒杆菌中，即获得重组菌株表达组成型pXMJ19-NT-proBNP。其中对照菌1为野生型表达组成型pXMJ19空载体，对照菌2为野生型菌株表达组成型pXMJ19-NT-proBNP。

3、培养，30℃，200rpm，LBB培养基，48h (胞内表达此时表达量最高)。

4、蛋白提取、检测，采用Western blot方法对重组菌株表达组成型pXMJ19-NT-proBNP和对照菌1、对照菌2表达的蛋白进行检测，其WB结果如图3所示，ImageJ软件对WB结果进行灰度分析，野生型菌株表达NT-proBNP的IntDen为0.138，重组菌株表达NT-proBNP的IntDen为0.209，表达量提高了51%。

实施例4纳米抗体VHH表达体系的构建和检测分析

纳米抗体VHH，骆驼科动物体内存在一种只含重链不含轻链的天然重链抗体（hcAb）,克隆骆驼体内重链抗体的可变区后得到的仅由重链可变区组成的单域抗体，称为纳米抗体VHH.

在肿瘤、感染性疾病、淀粉样变疾病、肠炎、血栓以及动脉粥样硬化病变的诊断与治疗方面具有良好的应用效果。

纳米抗体VHH，分子大小为15kDa，基因序列如SEQ ID NO：10所示。

1、分泌组成型pXMJ19-VHH载体的构建。

（1）金维智公司合成基因片段，该基因片段包括启动子、信号肽和VHH序列，基因片段的两端加酶切位点EcoRV和EcoRI，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；

（2）将合成的基因片段与经SmaI酶切线性化的组成型pXMJ19载体进行同源重组。

载体酶切体系为：10X FastDegist Green Buffer 10 µL，SmaI酶 5µL，组成型pXMJ19载体 10 µL，水补齐到100µL；

37℃水浴2h；

进行核酸电泳：1%核酸胶，110V， 30min, 用Axygen的胶回收试剂盒进行线性化载体片段的回收；

同源重组体系：（试剂盒ClonExpress II One Step Cloning Kit诺唯赞 南京）5 ×CE II Buffer 2µL ，Exnase II 1µL，片段：载体摩尔比3:1，水补齐10µL；37℃水浴30min，进行连接。

获得含分泌组成型pXMJ19-VHH载体的连接产物，分泌组成型pXMJ19-VHH载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

（3）转化

将10μL 的连接产物加到100μL的E.coli DH5α感受态细胞中，冰上静置15min，42 ℃水浴锅中热激90s，冰上静置5min,转入500μL 的LB培养基中，37℃ 100rpm恢复培养1h。

（4）筛选

取50μL菌液涂布于含有30mg/ml氯霉素的LB固体平板上，37℃培养16h后即可挑选阳性克隆子，提取质粒即为分泌组成型pXMJ19-VHH载体。

2、构建重组菌和对照菌。

将构建好的分泌组成型pXMJ19-VHH载体转入谷氨酸棒杆菌中，即获得重组菌株表达分泌组成型pXMJ19-VHH载体。其中对照菌1为野生型表达组成型pXMJ19空载体，对照菌2为野生型菌株表达分泌组成型pXMJ19-VHH载体。

3、培养，30℃，200rpm，LBB培养基，60h (分泌表达此时表达量最高)。

4、蛋白提取、检测，采用Western blot方法对重组菌株表达分泌组成型pXMJ19-VHH载体和对照菌2表达分泌组成型pXMJ19-VHH载体的分泌蛋白进行检测，其WB结果如图4所示，ImageJ软件对WB结果进行灰度分析，野生型菌株表达VHH的IntDen为1.095，重组菌株表达VHH的IntDen为1.6，表达量提高了46%。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种谷氨酸棒状杆菌重组菌、制备方法和应用

<130> 2019

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1968

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 1

gtgaactctc gcggattgcc acacaccacc aaccactaca agaaagaacc ccctaccgtg 60

ccttttcacg atttcactga ccctgatagc gatcctaggc aaaatgcacc agctaacccc 120

accgctcaac cgccatctgc ccccacctca cactcatcac agcagggtct ccctccgggc 180

gccattatga tcccttttcc agggcaaccg cagcagcaaa gcgcacccaa tgacgagacc 240

cgtttcatcg accttaacga acgtcataaa gatgatgaac cagccctgtt tcgcgatgat 300

gttattgatc aaactctcgc tattttgatc agtaaaaata agcccaatgc gctactcgtt 360

gggcctgccg gtacaggtaa atcccgtatc gcagaagata ttgcgcgccg ccttgccaat 420

gatgacgtat ctattcccga tcagcttgtc ggccaccgta ttcttgatgt ctccattgca 480

gagcttgttg ctggtgctgg cgttgttggt cagctcgaag aacgcattct ggatctcatc 540

aagtatgcga ccgacccgag taacaaagtc attatcttta ttgacgagat tcaccaaatt 600

gctggtgatc agtccagtca cagtggatcg caagccaaag ttgctcagat tctcaaaccc 660

tatcttgccc gtggtgacct tcgtgttatt ggtgccacca ccacccagga agctcgtgac 720

ttcgatcatg atccagccct caaacgccgt tttagcagag taaatgtcga tgaatttgat 780

cgagatcaaa cgctcactat tcttcatgct gcacgtgatg gttacctcaa acatttcaac 840

aacgctgtca cggtatctga cgacgtactg ggctatgtct acacctactc gcagcaattc 900

aacccaggca atacagcaca acctgatgca gcactgacgc tgtttgataa ggcgttggct 960

tccctaacta tggagaaaca gcgtctgatc aacaaccatg tcattgcgcc gtcgctcaag 1020

ttccctgtgt cagaaaggca catccataac accgctcgca aacttgcctt tggctctcaa 1080

gtgccagcct ccatcaatac tgatgatgct cgtgacaaac tcgaaacgtt gtttggtcaa 1140

gatcatatta ttgagccagt actcaccgct atcaagcgtg aacagcttgg tattttccct 1200

cgcaccaaac cattgagctg ggtgtttgct ggttcatctg gtgtgggtaa aacagaaatg 1260

gcgcgtattc tctctcgcgc cattaatggc ggcgatccca tcattatcaa tggtcccgaa 1320

tacattagtc ctgagtccat tactggcctt atcggatcat ccgatggcta tatcggctct 1380

aattctaagc gtgctaaacc actcgacccg ctgatttcta atccgcgtca ggtgattgtg 1440

ctcgatgaat ttgagaagtc tcaccctcat ttccagcaat tgttcatggc agctcttgat 1500

acaggcacta tggcgatggc taatggcacg acattgaatt tctctcaggc cattatcatt 1560

gccaccacca atgcagcccg cgacaaaatc ggtcgtgaca gctttggatt cgattcagat 1620

aattcaggtg tcctcggttc tgctcaagca gcaactgatc cgcgtgcaca ggaacgcctc 1680

aagtcactga tgtccaagga tttccctgtt gaactgctca accgtttcca gaatatcttt 1740

gccttcaacc gcattgatgc aggcacctac cgtgagattc tggacaatct ctaccagcgt 1800

cgccgtgacg ccgtgctgct tagccacccg cattacgcag cacagatccc tgcagatatt 1860

gattcagaca ctcttgatca gctggtggaa accaccttta tctcagattt tggtgcacgt 1920

cctgctgcac gcaccatcga agaccacatc gcatccttgc tgatgtga 1968

<210> 2

<211> 6198

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 2

tagagcctga ctagcggtgt ttaaggcact attatgttgc ttttaaacag catcgaataa 60

gcactttaag cgtcattttt ttccatagcg aaatacgtat ttttgagttc tttagtcatg 120

cgccattaac tagaagatct atttcactac accacaggct tccggaagtt gcacattgga 180

aaaaccctta gataaatatt gaaatatgaa tttaataata gattccgaac gaaatcggtg 240

ttagcgtctg tgctgaaaca atctaatcgc gtttcaggac acctacatga tcaggagctc 300

tttttgttaa acagagtcag tcgtattgca ggcgcttctg caatcacact atgcatcggc 360

ttaaccacaa tactaagccc tacttccact gcacaaagcc tcgagcaggt ccaactgcaa 420

gaaagcggtg gtggttccgt ccaagcaggc ggctccctgc gtctgtcctg caccgcatcc 480

ggcttcacct tcgacgattc cgacatgggc tggtaccacc aggctccagg caacgagtgc 540

gagctggtct ccaccatcgg caacgacggc tccacctact acgcagactc cgtgaagggc 600

cgcttcacca tctcccgcga caacgcaaag aacaccgtgt acctccagat gaacaacctg 660

aagccagagg acaccgcaat gtactactgc gcagcagatc tgcacccaac cttccgcaag 720

tgggattccc gcacctccga ctgctactcc ggcccactgg agtacggcta caactactgg 780

ggccagggta cccaggtgac cgtctcttca caccaccacc accaccactg agaattcagc 840

ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca 900

gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc 960

ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg 1020

cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc 1080

tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga 1140

gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa 1200

actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta 1260

caaactcttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 1320

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 1380

tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 1440

gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 1500

ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 1560

gagcactttt gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 1620

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 1680

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 1740

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 1800

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 1860

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 1920

gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 1980

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 2040

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 2100

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 2160

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 2220

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 2280

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 2340

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 2400

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttggggt gggcgaagaa 2460

ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catccagcca ttcggggtcg ttcactggtt 2520

cccctttctg atttctggca tagaagaacc cccgtgaact gtgtggttcc gggggttgct 2580

gatttttgcg agacttctcg cgcaattccc tagcttaggt gaaaacacca tgaaacacta 2640

gggaaacacc catgaaacac ccattagggc agtagggcgg cttcttcgtc tagggcttgc 2700

atttgggcgg tgatctggtc tttagcgtgt gaaagtgtgt cgtaggtggc gtgctcaatg 2760

cactcgaacg tcacgtcatt taccgggtca cggtgggcaa agagaactag tgggttagac 2820

attgttttcc tcgttgtcgg tggtggtgag cttttctagc cgctcggtaa acgcggcgat 2880

catgaactct tggaggtttt caccgttctg catgcctgcg cgcttcatgt cctcacgtag 2940

tgccaaagga acgcgtgcgg tgaccacgac gggcttagcc tttgcctgcg cttctagtgc 3000

ttcgatggtg gcttgtgcct gcgcttgctg cgcctgtagt gcctgttgag cttcttgtag 3060

ttgctgttct agctgtgcct tggttgccat gctttaagac tctagtagct ttcctgcgat 3120

atgtcatgcg catgcgtagc aaacattgtc ctgcaactca ttcattatgt gcagtgctcc 3180

tgttactagt cgtacatact catatttacc tagtctgcat gcagtgcatg cacatgcagt 3240

catgtcgtgc taatgtgtaa aacatgtaca tgcagattgc tgggggtgca gggggcggag 3300

ccaccctgtc catgcggggt gtggggcttg ccccgccggt acagacagtg agcaccgggg 3360

cacctagtcg cggatacccc ccctaggtat cggacacgta accctcccat gtcgatgcaa 3420

atctttaaca ttgagtacgg gtaagctggc acgcatagcc aagctaggcg gccaccaaac 3480

accactaaaa attaatagtc cctagacaag acaaaccccc gtgcgagcta ccaactcata 3540

tgcacggggg ccacataacc cgaaggggtt tcaattgaca accatagcac tagctaagac 3600

aacgggcaca acacccgcac aaactcgcac tgcgcaaccc cgcacaacat cgggtctagg 3660

taacactgag taacactgaa atagaagtga acacctctaa ggaaccgcag gtcaatgagg 3720

gttctaaggt cactcgcgct agggcgtggc gtaggcaaaa cgtcatgtac aagatcacca 3780

atagtaaggc tctggcgggg tgccataggt ggcgcaggga cgaagctgtt gcggtgtcct 3840

ggtcgtctaa cggtgcttcg cagtttgagg gtctgcaaaa ctctcactct cgctgggggt 3900

cacctctggc tgaattggaa gtcatgggcg aacgccgcat tgagctggct attgctacta 3960

agaatcactt ggcggcgggt ggcgcgctca tgatgtttgt gggcactgtt cgacacaacc 4020

gctcacagtc atttgcgcag gttgaagcgg gtattaagac tgcgtactct tcgatggtga 4080

aaacatctca gtggaagaaa gaacgtgcac ggtacggggt ggagcacacc tatagtgact 4140

atgaggtcac agactcttgg gcgaacggtt ggcacttgca ccgcaacatg ctgttgttct 4200

tggatcgtcc actgtctgac gatgaactca aggcgtttga ggattccatg ttttcccgct 4260

ggtctgctgg tgtggttaag gccggtatgg acgcgccact gcgtgagcac ggggtcaaac 4320

ttgatcaggt gtctacctgg ggtggagacg ctgcgaaaat ggcaacctac ctcgctaagg 4380

gcatgtctca ggaactgact ggctccgcta ctaaaaccgc gtctaagggg tcgtacacgc 4440

cgtttcagat gttggatatg ttggccgatc aaagcgacgc cggcgaggat atggacgctg 4500

ttttggtggc tcggtggcgt gagtatgagg ttggttctaa aaacctgcgt tcgtcctggt 4560

cacgtggggc taagcgtgct ttgggcattg attacataga cgctgatgta cgtcgtgaaa 4620

tggaagaaga actgtacaag ctcgccggtc tggaagcacc ggaacgggtc gaatcaaccc 4680

gcgttgctgt tgctttggtg aagcccgatg attggaaact gattcagtct gatttcgcgg 4740

ttaggcagta cgttctcgat tgcgtggata aggctaagga cgtggccgct gcgcaacgtg 4800

tcgctaatga ggtgctggca agtctgggtg tggattccac cccgtgcatg atcgttatgg 4860

atgatgtgga cttggacgcg gttctgccta ctcatgggga cgctactaag cgtgatctga 4920

atgcggcggt gttcgcgggt aatgagcaga ctattcttcg cacccactaa aagcggcata 4980

aaccccgttc gatattttgt gcgatgaatt tatggtcaat gtcgcggggg caaactatga 5040

tgggtcttgt tgttggcgtc ccggaaaacg attccgaagc ccaacctttc atagaaggcg 5100

gcggtggaat cgaaatctcg tgatggcagg ttgggcgtcg cttggtcggt catttcgaag 5160

ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt 5220

gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga agccatcaca gacggcatga tgaacctgaa 5280

tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg 5340

gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg 5400

gattggctga gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt 5460

caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt 5520

attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt 5580

gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacggaac tccggatgag 5640

cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct 5700

ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag 5760

caactgactg aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg 5820

tatatccagt gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgtcgaag 5880

ctcggcggat ttgtcctact caagctgatc cgacaaaatc cacacattat cccaggtgtc 5940

cggatcggtc aaatacgctg ccagctcata gaccgtatcc aaagcatccg gggctgatcc 6000

ccggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 6060

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgtg gtttgcccca gcaggcgaaa 6120

atcctgtttg atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta 6180

tcccactacc gagatatc 6198

<210> 3

<211> 6089

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 3

aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc catgggtcat catcaccacc 60

accacggtag cgacagtgag gttaaccagg aagccaaacc ggaagtgaaa ccggaggtga 120

agccggaaac ccacatcaat ctgaaggtga gcgacggcag cagcgaaatc ttttttaaaa 180

ttaagaaaac taccccgctg cgtcgcctga tggaagcctt tgccaagcgc cagggcaagg 240

aaatggacag cctgcgcttt ctgtacgatg gcattcgcat ccaggcagat caggccccgg 300

aggacctgga tatggaggac aacgacatca tcgaagccca tcgcgaacag attggtggtc 360

atccgctggg tagcccgggt agcgcaagcg atctggaaac cagcggcctg caggaacagc 420

gcaatcatct gcagggcaaa ctgagcgaac tgcaggtgga acagaccagc ctggaaccgc 480

tgcaggaaag cccgcgtccg acaggcgtgt ggaagagtcg cgaagtggcc accgaaggta 540

tccgcggcca tcgcaaaatg gtgctgtata ccctgcgtgc cccgcgctaa cgggtaccga 600

gctcgaattc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 660

aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 720

gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 780

gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 840

gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 900

aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 960

acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct 1020

ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 1080

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 1140

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 1200

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 1260

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 1320

gttttccaat gatgagcact tttgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1380

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1440

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1500

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1560

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1620

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1680

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt 1740

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 1800

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 1860

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 1920

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 1980

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 2040

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2100

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2160

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttgg 2220

ggtgggcgaa gaactccagc atgagatccc cgcgctggag gatcatccag ccattcgggg 2280

tcgttcactg gttccccttt ctgatttctg gcatagaaga acccccgtga actgtgtggt 2340

tccgggggtt gctgattttt gcgagacttc tcgcgcaatt ccctagctta ggtgaaaaca 2400

ccatgaaaca ctagggaaac acccatgaaa cacccattag ggcagtaggg cggcttcttc 2460

gtctagggct tgcatttggg cggtgatctg gtctttagcg tgtgaaagtg tgtcgtaggt 2520

ggcgtgctca atgcactcga acgtcacgtc atttaccggg tcacggtggg caaagagaac 2580

tagtgggtta gacattgttt tcctcgttgt cggtggtggt gagcttttct agccgctcgg 2640

taaacgcggc gatcatgaac tcttggaggt tttcaccgtt ctgcatgcct gcgcgcttca 2700

tgtcctcacg tagtgccaaa ggaacgcgtg cggtgaccac gacgggctta gcctttgcct 2760

gcgcttctag tgcttcgatg gtggcttgtg cctgcgcttg ctgcgcctgt agtgcctgtt 2820

gagcttcttg tagttgctgt tctagctgtg ccttggttgc catgctttaa gactctagta 2880

gctttcctgc gatatgtcat gcgcatgcgt agcaaacatt gtcctgcaac tcattcatta 2940

tgtgcagtgc tcctgttact agtcgtacat actcatattt acctagtctg catgcagtgc 3000

atgcacatgc agtcatgtcg tgctaatgtg taaaacatgt acatgcagat tgctgggggt 3060

gcagggggcg gagccaccct gtccatgcgg ggtgtggggc ttgccccgcc ggtacagaca 3120

gtgagcaccg gggcacctag tcgcggatac cccccctagg tatcggacac gtaaccctcc 3180

catgtcgatg caaatcttta acattgagta cgggtaagct ggcacgcata gccaagctag 3240

gcggccacca aacaccacta aaaattaata gtccctagac aagacaaacc cccgtgcgag 3300

ctaccaactc atatgcacgg gggccacata acccgaaggg gtttcaattg acaaccatag 3360

cactagctaa gacaacgggc acaacacccg cacaaactcg cactgcgcaa ccccgcacaa 3420

catcgggtct aggtaacact gagtaacact gaaatagaag tgaacacctc taaggaaccg 3480

caggtcaatg agggttctaa ggtcactcgc gctagggcgt ggcgtaggca aaacgtcatg 3540

tacaagatca ccaatagtaa ggctctggcg gggtgccata ggtggcgcag ggacgaagct 3600

gttgcggtgt cctggtcgtc taacggtgct tcgcagtttg agggtctgca aaactctcac 3660

tctcgctggg ggtcacctct ggctgaattg gaagtcatgg gcgaacgccg cattgagctg 3720

gctattgcta ctaagaatca cttggcggcg ggtggcgcgc tcatgatgtt tgtgggcact 3780

gttcgacaca accgctcaca gtcatttgcg caggttgaag cgggtattaa gactgcgtac 3840

tcttcgatgg tgaaaacatc tcagtggaag aaagaacgtg cacggtacgg ggtggagcac 3900

acctatagtg actatgaggt cacagactct tgggcgaacg gttggcactt gcaccgcaac 3960

atgctgttgt tcttggatcg tccactgtct gacgatgaac tcaaggcgtt tgaggattcc 4020

atgttttccc gctggtctgc tggtgtggtt aaggccggta tggacgcgcc actgcgtgag 4080

cacggggtca aacttgatca ggtgtctacc tggggtggag acgctgcgaa aatggcaacc 4140

tacctcgcta agggcatgtc tcaggaactg actggctccg ctactaaaac cgcgtctaag 4200

gggtcgtaca cgccgtttca gatgttggat atgttggccg atcaaagcga cgccggcgag 4260

gatatggacg ctgttttggt ggctcggtgg cgtgagtatg aggttggttc taaaaacctg 4320

cgttcgtcct ggtcacgtgg ggctaagcgt gctttgggca ttgattacat agacgctgat 4380

gtacgtcgtg aaatggaaga agaactgtac aagctcgccg gtctggaagc accggaacgg 4440

gtcgaatcaa cccgcgttgc tgttgctttg gtgaagcccg atgattggaa actgattcag 4500

tctgatttcg cggttaggca gtacgttctc gattgcgtgg ataaggctaa ggacgtggcc 4560

gctgcgcaac gtgtcgctaa tgaggtgctg gcaagtctgg gtgtggattc caccccgtgc 4620

atgatcgtta tggatgatgt ggacttggac gcggttctgc ctactcatgg ggacgctact 4680

aagcgtgatc tgaatgcggc ggtgttcgcg ggtaatgagc agactattct tcgcacccac 4740

taaaagcggc ataaaccccg ttcgatattt tgtgcgatga atttatggtc aatgtcgcgg 4800

gggcaaacta tgatgggtct tgttgttggc gtcccggaaa acgattccga agcccaacct 4860

ttcatagaag gcggcggtgg aatcgaaatc tcgtgatggc aggttgggcg tcgcttggtc 4920

ggtcatttcg aagggcacca ataactgcct taaaaaaatt acgccccgcc ctgccactca 4980

tcgcagtact gttgtaattc attaagcatt ctgccgacat ggaagccatc acagacggca 5040

tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc 5100

atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg 5160

aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa aacatattct caataaaccc tttagggaaa 5220

taggccaggt tttcaccgta acacgccaca tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg 5280

aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg 5340

gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc accagctcac cgtctttcat tgccatacgg 5400

aactccggat gagcattcat caggcgggca agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg 5460

tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta 5520

taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat 5580

atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa 5640

aatctcgtcg aagctcggcg gatttgtcct actcaagctg atccgacaaa atccacacat 5700

tatcccaggt gtccggatcg gtcaaatacg ctgccagctc atagaccgta tccaaagcat 5760

ccggggctga tccccggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 5820

tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gtggtttgcc 5880

ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt 5940

cggtatcgtc gtatcccact accgagattt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata 6000

ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 6060

gataacaatt tcacacagga aacagaatt 6089

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 4

aatcctgcct gactacggca gctggtcaat ggttcgaaga gatatgtctc atttcgcaaa 60

tgaaatggtt gacttcgacc cctatatcca cagccgacta ctcggcgtac acggaaaata 120

gcagctgatc catctagggt cagtgaactc tcgcggattg ccacacacca ccaaccacta 180

caagaaagaa ccccctaccg tgccttttca cgatttcact gaccctgata gcgatcctag 240

gcaaaatgca ccagctaacc ccaccgctca accgccatct gcccccacct cacactcatc 300

acagcagggt ctccctccgg gcgccattat gatccctttt ccagggcaac cgcagcagca 360

aagcgcaccc aatgacgaga cccgtttcat cgaccttaac gaacgtcata aagatgatga 420

accagccctg tttcgcgatg atgttattga tcaaactctc gctattttga tcagtaaaaa 480

taagcccaat gcgctactcg ttgggcctgc cggtacaggt aaatcccgta tcgcagaaga 540

tattgcgcgc cgccttgcca atgatgacgt atctattccc gatcagcttg tcggccaccg 600

tattcttgat gtctccattg cagagcttgt tgctggtgct gg 642

<210> 5

<211> 874

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 5

gctatcaagc gtgaacagct tggtattttc cctcgcacca aaccattgag ctgggtgttt 60

gctggttcat ctggtgtggg taaaacagaa atggcgcgta ttctctctcg cgccattaat 120

ggcggcgatc ccatcattat caatggtccc gaatacatta gtcctgagtc cattactggc 180

cttatcggat catccgatgg ctatatcggc tctaattcta agcgtgctaa accactcgac 240

ccgctgattt ctaatccgcg tcaggtgatt gtgctcgatg aatttgagaa gtctcaccct 300

catttccagc aattgttcat ggcagctctt gatacaggca ctatggcgat ggctaatggc 360

acgacattga atttctctca ggccattatc attgccacca ccaatgcagc ccgcgacaaa 420

atcggtcgtg acagctttgg attcgattca gataattcag gtgtcctcgg ttctgctcaa 480

gcagcaactg atccgcgtgc acaggaacgc ctcaagtcac tgatgtccaa ggatttccct 540

gttgaactgc tcaaccgttt ccagaatatc tttgccttca accgcattga tgcaggcacc 600

taccgtgaga ttctggacaa tctctaccag cgtcgccgtg acgccgtgct gcttagccac 660

ccgcattacg cagcacagat ccctgcagat attgattcag acactcttga tcagctggtg 720

gaaaccacct ttatctcaga ttttggtgca cgtcctgctg cacgcaccat cgaagaccac 780

atcgcatcct tgctgatgtg accaaccttt taggagtaca tcatgattga taccactgct 840

aacagcacct caggcaccct acctacactc actg 874

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 7

<211> 120

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 7

ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 60

atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 120

<210> 8

<211> 231

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 8

catccgctgg gtagcccggg tagcgcaagc gatctggaaa ccagcggcct gcaggaacag 60

cgcaatcatc tgcagggcaa actgagcgaa ctgcaggtgg aacagaccag cctggaaccg 120

ctgcaggaaa gcccgcgtcc gacaggcgtg tggaagagtc gcgaagtggc caccgaaggt 180

atccgcggcc atcgcaaaat ggtgctgtat accctgcgtg ccccgcgcta a 231

<210> 9

<211> 318

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 9

atgggtcatc atcaccacca ccacggtagc gacagtgagg ttaaccagga agccaaaccg 60

gaagtgaaac cggaggtgaa gccggaaacc cacatcaatc tgaaggtgag cgacggcagc 120

agcgaaatct tttttaaaat taagaaaact accccgctgc gtcgcctgat ggaagccttt 180

gccaagcgcc agggcaagga aatggacagc ctgcgctttc tgtacgatgg cattcgcatc 240

caggcagatc aggccccgga ggacctggat atggaggaca acgacatcat cgaagcccat 300

cgcgaacaga ttggtggt 318

<210> 10

<211> 426

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 10

caggtccaac tgcaagaaag cggtggtggt tccgtccaag caggcggctc cctgcgtctg 60

tcctgcaccg catccggctt caccttcgac gattccgaca tgggctggta ccaccaggct 120

ccaggcaacg agtgcgagct ggtctccacc atcggcaacg acggctccac ctactacgca 180

gactccgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaacg caaagaacac cgtgtacctc 240

cagatgaaca acctgaagcc agaggacacc gcaatgtact actgcgcagc agatctgcac 300

ccaaccttcc gcaagtggga ttcccgcacc tccgactgct actccggccc actggagtac 360

ggctacaact actggggcca gggtacccag gtgaccgtct cttcacacca ccaccaccac 420

cactga 426

<210> 11

<211> 303

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 11

tagagcctga ctagcggtgt ttaaggcact attatgttgc ttttaaacag catcgaataa 60

gcactttaag cgtcattttt ttccatagcg aaatacgtat ttttgagttc tttagtcatg 120

cgccattaac tagaagatct atttcactac accacaggct tccggaagtt gcacattgga 180

aaaaccctta gataaatatt gaaatatgaa tttaataata gattccgaac gaaatcggtg 240

ttagcgtctg tgctgaaaca atctaatcgc gtttcaggac acctacatga tcaggagctc 300

ttt 303

<210> 12

<211> 102

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 12

ttgttaaaca gagtcagtcg tattgcaggc gcttctgcaa tcacactatg catcggctta 60

accacaatac taagccctac ttccactgca caaagcctcg ag 102

<210> 13

<211> 589

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 人工序列（artificial sequence）

<400> 13

ggtcgactct agaggatccc atgggtcatc atcaccacca ccacggtagc gacagtgagg 60

ttaaccagga agccaaaccg gaagtgaaac cggaggtgaa gccggaaacc cacatcaatc 120

tgaaggtgag cgacggcagc agcgaaatct tttttaaaat taagaaaact accccgctgc 180

gtcgcctgat ggaagccttt gccaagcgcc agggcaagga aatggacagc ctgcgctttc 240

tgtacgatgg cattcgcatc caggcagatc aggccccgga ggacctggat atggaggaca 300

acgacatcat cgaagcccat cgcgaacaga ttggtggtca tccgctgggt agcccgggta 360

gcgcaagcga tctggaaacc agcggcctgc aggaacagcg caatcatctg cagggcaaac 420

tgagcgaact gcaggtggaa cagaccagcc tggaaccgct gcaggaaagc ccgcgtccga 480

caggcgtgtg gaagagtcgc gaagtggcca ccgaaggtat ccgcggccat cgcaaaatgg 540

tgctgtatac cctgcgtgcc ccgcgctaac gggtaccgag ctcgaattc 589

Claims (10)

1.一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。

2.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌重组菌是由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032将NCgl1689基因全部缺失得到，NCgl1689于基因组中所在位置为1858763-1860730，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌重组菌是由谷氨酸棒状杆菌ATCC13032将NCgl1689基因部分缺失得到，NCgl1689于基因组中所在位置为1858763-1860730。

4.根据权利要求1所述的一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：NCgl1689基因中部分缺失的为AAA结构域，AAA结构域于基因组中所在位置为1859262-1859930。

5.根据权利要求4所述的一种谷氨酸棒状杆菌重组菌，其特征在于：所述谷氨酸棒状杆菌重组菌于 2018年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC 16958。

6.如权利要求1~5中任一所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌的制备方法，其特征在于：采用pK18mobsacB同源重组技术敲除谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的NCgl1689基因中的AAA结构域，使得获得的谷氨酸棒状杆菌重组菌的NCgl1689基因不能正确地转录或翻译。

7.如权利要求5所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌在制备纳米抗体VHH的应用。

8.一种纳米抗体VHH的表达体系，其包括如权利要求5所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌中转化有分泌组成型pXMJ19-VHH载体，所述分泌组成型pXMJ19-VHH载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

9.如权利要求5所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌在制备氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP中的应用。

10.一种氨基末端-脑钠肽前体NT-proBNP的表达体系，其包括如权利要求5所述的谷氨酸棒状杆菌重组菌，所述谷氨酸棒状杆菌重组菌中转化有组成型pXMJ19-NT-proBNP载体，所述组成型pXMJ19-NT-proBNP载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。