CN101812478B - 用于提高汉坦病毒融合蛋白g1s0.7表达的腺病毒高表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及腺病毒转移载体的改建，特别是对含肾综合征出血热(HFRS)致病原——汉坦病毒(HV)的嵌合基因G1S0.7的转移载体进行改建，用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的表达。利用基因重组技术，将含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，包括：将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子；或在其3’端插入WPRE转录调控元件；或替换启动子并插入WPRE调控元件。用本发明分别表达融合蛋白G1S0.7，比较各组重组腺病毒中外源蛋白的表达水平。结果显示本发明与原转移载体pShuttle相比，均能有效提高融合蛋白G1S0.7的表达，且以替换启动子组效果最明显。

Description

用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本发明涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致病原——汉坦病毒(HV)的嵌合基因G1S0.7的表达。

背景技术

肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状：

肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的一种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物。

为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大规模扩散最有效的防控措施。因此，针对HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的抗体出现较晚，滴度亦不高。本发明人多年对HV中免疫原性最强的核蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0.7、G2S0.7)的构建及其表达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影响因素等进行了较为深入的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机体的体液免疫(包括中和抗体)应答以及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。

然而在研究中我们也发现了一些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统，但是整体的免疫水平还不十分理想。因此，进一步选择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS基因工程疫苗的研究有着重要的意义。

表达载体的优化：

在HFRS基因工程疫苗研究领域里，如何提高外源基因的表达水平是亟待解决的难题之一。由于转录外源DNA序列的启动于和增强子是最基本的真核表达组件，因此，选择合适的启动子或增强子并改进其活性是提高外源基因表达首先要考虑的问题。许多来源于病毒的增强子元件，如SV40的早期基因增强子，Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列(LTR)区和人类巨细胞病毒(CMV)早期启动子，在来自各种哺乳动物的多种型别细胞中都有很强的活性。目前广泛应用的CMV启动子虽然是比较有效的表达系统启动子，但实际应用中有些基因通常不能得到满意的表达效果。例如Garg S，et al.Thehybrid cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin promoter along withwoodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances theprotective efficacy of DNA vaccines.2004；J Immunol.173：550～558比较了使用人CMV启动子和CAG启动子/增强子(人CMV启动子和鸡β-actin启动子的杂合体)的流感病毒血凝素(Haemagglutinin，HA)DNA疫苗的免疫效果，使用CMV启动子几乎不能诱发任何抗HA抗体，而使用CAG启动子/增强子可诱发较低水平的抗HA抗体。You LM，et al.A hybridpromoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression ofPCR-amplified ORFs in mammalian cells.2009；Sep 16.Mol Biol Rep.等的最新研究表明他们设计的一个含CAG启动子/增强子的真核载体pCAGX能在更广泛的宿主细胞中提高外源基因的蛋白表达水平。此外还有Yoshio Nitta，et al.A CMV-actin-globin hybrid promoter improves adeno-associated viral vectorgene expression in the arterial wall in vivo.The Journal of Gene Medicine.2005；7(10)：1348～1355和Halbert CL，et al.High-efficiency promoter-dependenttransduction by adeno-associated virus type 6 vectors in mouse lung.Hum GeneTher.2007 Apr；18(4)：344～354。多项报道显示CAG启动子比CMV启动子诱生抗体的水平要高。此外，国内外学者的研究表明，选择不同的启动子并配合不同的转录调节元件有助于选择出适用于特定基因的表达系统。如前文所述的Garg等的流感病毒血凝素DNA疫苗的免疫效果的研究，如在HA基因后加上土拨鼠肝炎病毒稳定mRNA转录后调节元件(mRNA-stabilizingpost-transcriptional regulatory element from the woodchuck hepatitis virus，WPRE)后，均可提高CMV启动子和CAG启动子诱生抗HA抗体的水平，且CAG启动子比CMV启动子诱生抗体的水平高一倍。在腺病毒表达系统中，也有Xu ZL，et al.Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulationelement enhances transgene expression from adenovirus vectors.BiochimBiophys Acta.2003；1621(3)：266～271和Boulos S，et al.Assessment of CMV，RSV and SYN1 promoters and the woodchuck post-transcriptional regulatoryelement in adenovirrus vectors for transgene expression in cortical neuronalcultures.Brain Res.2006；1102(1)：27～38。多项研究显示WPRE可以增强不同启动子的活性，增强基因的表达。

发明内容

本发明的目的是：将本申请人前期构建的含汉滩病毒76-118株的G1和S0.7的嵌合基因与腺病毒转移载体的重组质粒G1S0.7-pShuttle进行改建，以获得用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体。

本发明目的是以下述方式实现的：一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G1S0.7-pCAG，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示。

一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，在其3’端插入WPRE转录调控元件得到含WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G1S0.7-WPRE，其全基因序列为SEQ ID NO：2所示。

一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子并在其3’端插入WPRE转录调控元件，得到含CAG启动子/增强子和WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体G1S0.7-pCAG-WPRE，其全基因序列为SEQID NO：3所示。

本发明利用基因重组技术，将本申请人前期构建的含汉滩病毒76-118株的G1与S0.7的嵌合基因与腺病毒转移载体的重组质粒G1S0.7-pShuttle进行改建。本发明包括替换重组质粒G1S0.7-pShuttle的启动子(CAG)或(和)插入转录后调控元件(WPRE)，以提高融合蛋白G1S0.7的表达水平。将本发明及未改建质粒G1S0.7-pShuttle分别整合进腺病毒DNA，在HEK293细胞中包装腺病毒，比较各组重组腺病毒外源蛋白G1S0.7的表达水平。结果显示本发明与原转移载体pShuttle相比，均能有效提高融合蛋白G1S0.7的表达，且以替换启动子组效果最明显。

附图说明

图1.G1S0.7-pCAG Mfe I+Xba I双酶切鉴定结果。其中：L1：G1S0.7-pCAG；M：500bp DNA Ladder Marker。

图2.G1S0.7-WPRE Kpn I+Afl II双酶切鉴定结果。其中：L1：G1S0.7-WPRE；M：DL 2000 Marker。

图3.改建重组转移载体G1S0.7-pCAG-WPRE示意图。

图4.G1S0.7-pCAG、G1S0.7-WPRE、G1S0.7-pCAG-WPRE重组转移载体Xba I+Not I双酶切鉴定结果。其中：L1：G1S0.7-pCAG；L2：G1S0.7-WPRE；L3：G1S0.7-pCAG-WPRE；M：Wide Range DNA Marker。

图5.Ad-G1S0.7-pCAG、Ad-G1S0.7-WPRE、Ad-G1S0.7-pCAG-WPREI-Ceu I+PI-Sce I双酶切鉴定结果。其中：L1：Ad-G1S0.7-WPRE；L2：Ad-G1S0.7-pCAG；L3：Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE；M：Wide Range DNA Marker。

图6.融合蛋白G1S0.7在不同重组腺病毒中表达的免疫荧光检测结果。其中A：Ad-G1S0.7；B：Ad-G1S0.7-WPRE；C：Ad-G1S0.7-pCAG；D：Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE。E：正常293细胞对照。

图7.融合蛋白G1S0.7在不同重组腺病毒中表达的Western blot结果。其中A：293细胞对照；B：Adenovirus-Lac-Z对照C：Ad-G1S0.7；D：Ad-G1S0.7-WPRE；E：Ad-G1S0.7-pCAG；F：Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE。

具体实施方式

本发明所用的腺病毒表达系统购自CLONTECH公司的Adeno-X^TM系统(货号K1650-1)，其转移载体为pShuttle，含有CMV启动子。

本发明中所采用的汉坦病毒为汉滩病毒76-118株。其基因组由L、M和S三个基因片段组成。其中L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段编码囊膜糖蛋白(GP)G1和G2；S片段编码核衣壳蛋白(NP)。本发明中所涉及的融合基因由其M片段的G1部分及S片段的0.7部分分别PCR扩增获得，利用基因融合技术将其融合，并在其5’端设计Xba I，3’端设计Not I酶切位点，克隆入腺病毒转移载体pShuttle的相应酶切位点获得重组质粒，命名为G1S0.7-pShuttle。

本发明中所替换的CAG启动子/增强子是人类巨细胞病毒(humancytomegalovirus，CMV)早期启动子与鸡β-actin启动子的杂合体。其序列是综合参考其他人文献，并根据本项目要求在其5’端设计Mfe I，3’端设计Sfi I，Nhe I酶切位点，其中Sfi I用于后续研究克隆位点，片段大小1747bp，交由Takara公司至pMD19-T Simple载体中合成。改建后的重组转移载体命名为G1S0.7-pCAG。G1S0.7-pCAG的全基因序列为SEQ ID NO：1所示。

本发明中所插入WPRE转录调控元件全名为土拨鼠肝炎病毒稳定mRNA转录后调节元件(mRNA-stabilizing post-transcriptional regulatoryelement from the woodchuck hepatitis virus，WPRE)，其序列参考GENBANK序列编号AX823860的WPRE序列，根据本发明要求在其5’端和3’端分别设计Kpn I和Afl II酶切位点，并在KpnI位点后，设计终止密码。片段大小623bp，交由Takara公司至pMD19-T Simple载体中合成。重组转移载体命名为G1S0.7-WPRE。G1S0.7-WPRE的全基因序列为SEQ ID NO：2所示。

本发明中所涉及的第三种重组转移载体在上述G1S0.7-pCAG基础上改建获得。利用WPRE序列上的Kpn I和Afl II酶切位点克隆入pCAG相应的位点。改建后的重组转移载体命名为G1S0.7-pCAG-WPRE。G1S0.7-pCAG-WPRE的全基因序列为SEQ ID NO：3所示。

本发明中所有重组转移载体构建方法具体如下：

1)G1S0.7-pCAG构建方法：根据腺病毒转移载体pShuttle的酶切位点，设计各改建片段的插入酶切位点，CAG序列5’端设计Mfe I，3’端设计Sfi I，Nhe I，其中Sfi I用于后续研究克隆位点。用Mfe I和Xba I双酶切G1S0.7-pShuttle质粒，Mfe I和Nhe I双酶切pMD19-T Simple-CAG质粒(NheI和Xba I同尾酶)，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的2×YT固体培养基，37℃孵箱培养12～14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图1.为G1S0.7-pCAG阳性克隆Mfe I+Xba I双酶切鉴定结果。

2)G1S0.7-WPRE构建方法：根据腺病毒转移载体pShuttle的酶切位点，为WPRE序列的5’端和3’端分别设计Kpn I和Afl II酶切位点。用Kpn I和Afl II分别双酶切pMD19-T Simple-WPRE和G1S0.7-pShuttle质粒，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的2×YT固体培养基，37℃孵箱培养12～14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。附图2.为G1S0.7-WPRE阳性克隆Kpn I+AflII双酶切鉴定结果。

3)G1S0.7-pCAG-WPRE构建方法：Kpn I和Afl II双酶切重组转移载体G1S0.7-pCAG，并同样双酶切pMD19-T Simple-WPRE，胶回收载体和目的片段，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含卡那抗性的2×YT固体培养基，37℃孵箱培养12～14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。图3.为改建重组转移载体G1S0.7-pCAG-WPRE示意图。

4)含目的片段G1S0.7转移载体的鉴定：本发明所构建目的片段为汉滩病毒76-118株M片段G1部分和S片段0.7部分的嵌合基因G1S0.7，其大小约为2.5kb。在完成所有重组转移载体的改建后，用Xba I和Not I双酶切鉴定含目的片段G1S0.7的转移载体。附图4.为G1S0.7-pCAG、G1S0.7-WPRE、G1S0.7-pCAG-WPRE重组转移载体酶切鉴定结果。

5)重组腺病毒DNA构建、鉴定及腺病毒包装：将上述构建成功的转移载体和腺病毒质粒分别用PI-Sce I和I-Ceu I双酶切，胶回收目的片段和载体，T4连接酶14℃连接过夜，连接产物转化(JM109感受态)后涂布含氨苄抗性的2×YT固体培养基，37℃孵箱培养12～14小时，挑选单菌落摇菌提质粒后酶切鉴定，获得阳性克隆。将重组腺病毒DNA用Pac I酶单切以线性化质粒，转染HEK293细胞，待出现明显CPE(Cytopathic Effect，细胞病变)后收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌的PBS。反复冻融该沉淀3次后离心收集上清，即为重组腺病毒。附图5.为Ad-G1S0.7-pCAG、Ad-G1S0.7-WPRE、Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE双酶切鉴定结果。

6)不同重组腺病毒融合蛋白表达水平的比较：测定重组腺病毒滴度(具体方法参见CLONTECH Adeno-X^TM Rapid Titer Kit，Cat.No.631028)。以100pfu/cell的MOI感染293细胞，同时感染本申请人前期包装的Ad-G1S0.7腺病毒作为对照，48小时后免疫荧光检测目的蛋白的表达。可观察到细胞膜上的特异性荧光，其中改建转移载体重组腺病毒的荧光显著，尤以Ad-G1S0.7-pCAG组最为明显，Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE次之。Western blot检测目的蛋白的表达，以相同的MOI感染293细胞，48小时后收样并测定蛋白含量，确保每孔上样量相同。可观察到目的蛋白的特异性表达，其中改建转移载体重组腺病毒的目的蛋白特异条带比较显著，尤以Ad-G1S0.7-pCAG组表达最为明显，Ad-G1S0.7-pCAG-WPRE次之。利用ELISA检测蛋白表达水平，包被本申请人制备针对融合蛋白的特异性单抗1A8，检测抗体为出血热抗原免疫兔血清，得到结果与上述结果相符。附图6.为不同重组腺病毒融合蛋白G1S0.7表达水平的免疫荧光检测结果；附图7.为融合蛋白G1S0.7在不同重组腺病毒中表达的Western blot结果。

序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体

<160>3

<210>1

<211>7726

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

taactataac ggtcctaagg tagcgaaagc tcagatctgg atctcccgat cccctatggt    60

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gtcaagcatg aaggcagaag agattacacc tggtagatat agaacagcag tctgtgggct     4380

ctaccctgca cagattaagg cacggcagat gatcagtcca gttatgagtg taattggttt    4440

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gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga    4800

caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag    4860

cagatctgca gatctgaatt catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca    4920

ttatgggtat tatgggtctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc    4980

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ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    5100

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    5160

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    5220

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    5280

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    5340

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ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    5520

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    5580

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ttctgtaatg aaggagaaaa ctcaccgagg cagttccata ggatggcaag atcctggtat    6600

cggtctgcga ttccgactcg tccaacatca atacaaccta ttaatttccc ctcgtcaaaa    6660

ataaggttat caagtgagaa atcaccatga gtgacgactg aatccggtga gaatggcaaa    6720

agcttatgca tttctttcca gacttgttca acaggccagc cattacgctc gtcatcaaaa    6780

tcactcgcat caaccaaacc gttattcatt cgtgattgcg cctgagcgag acgaaatacg    6840

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<210>2

<211>7342

<212>DNA

<213>Artificial

<400>2

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tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta     300

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ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa     480

ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca     540

atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta     600

cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt     660

acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg     720

acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca     780

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tggataatca ccaatcgttg aatacaataa caaaacatac ccaagtaagt tggagaggaa    1200

aggctgatca gtcacagtct agtcaaaatt catttgagac agtgtccact gaagttgact    1260

tgaaaggaac atgtgttcta aaacacaaaa tggtggaaga atcataccgt agtaggaaat    1320

cagtaacctg ttacgacctg tcttgcaata gcacttactg caagccaaca ctatacatga    1380

ttgtaccaat tcatgcatgc aatatgatga aaagctgttt gattgcattg ggaccataca    1440

gagtacaggt ggtttatgag agaacttact gtatgacagg agtcctgatt gaagggaaat    1500

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gtgttcatat tgtatgtttc tttgttgcag ttaaagggaa tacttataaa atttttgaac    1620

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gatccatgga agcatttaca ggaatcttca gatcaccaca tggggaagat catgatctgg    1800

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ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta    4320

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gctgagttga aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag     7080

caaaagttca aaatcaccaa ctggtccacc tacaacaaag ctctcatcaa ccgtggctcc     7140

ctcactttct ggctggatga tggggcgatt caggcctggt atgagtcagc aacaccttct     7200

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ccgcaccccc tctagcgggc gcgggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc    1680

ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccatctcca gcctcggggc    1740

tgccgcaggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc    1800

gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac    1860

agctcctggg caacgtgctg gttgttgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggcct    1920

cgacggccgc tagcgtttaa acgggccctc tagaatgggg atatggaagt ggctagtgat    1980

ggccagttta gtatggcctg ttttgacact gagaaatgtc tatgacatga aaattgagtg    2040

cccccataca gtaagttttg gggaaaacag tgtgataggt tatgtagaat taccccccgt    2100

gccattggcc gacacagcac agatggtgcc tgagagttct tgtagcatgg ataatcacca    2160

atcgttgaat acaataacaa aacataccca agtaagttgg agaggaaagg ctgatcagtc    2220

acagtctagt caaaattcat ttgagacagt gtccactgaa gttgacttga aaggaacatg    2280

tgttctaaaa cacaaaatgg tggaagaatc ataccgtagt aggaaatcag taacctgtta    2340

cgacctgtct tgcaatagca cttactgcaa gccaacacta tacatgattg taccaattca    2400

tgcatgcaat atgatgaaaa gctgtttgat tgcattggga ccatacagag tacaggtggt    2460

ttatgagaga acttactgta tgacaggagt cctgattgaa gggaaatgct ttgtcccaga    2520

tcaaagtgtg gtcagtatta tcaagcatgg gatctttgat attgcaagtg ttcatattgt    2580

atgtttcttt gttgcagtta aagggaatac ttataaaatt tttgaacagg ttaagaaatc    2640

ctttgaatca acatgcaatg atacagagaa taaagtgcaa ggatattata tttgtattgt    2700

agggggaaac tctgcaccaa tatatgttcc aacacttgat gatttcagat ccatggaagc    2760

atttacagga atcttcagat caccacatgg ggaagatcat gatctggctg gagaagaaat    2820

tgcatcttat tctatagtcg gacctgccaa tgcaaaagtt cctcatagtg ctagctcaga    2880

tacattgagc ttgattgcct attcaggtat accatcttat tcttccctta gcatcctaac    2940

aagttcaaca gaagctaagc atgtattcag ccctgggttg ttcccaaaac ttaatcacac    3000

aaattgtgat aaaagtgcca taccactcat atggactggg atgattgatt tacctggata    3060

ctacgaagct gtccaccctt gtacagtttt ttgcgtatta tcaggtcctg gggcatcatg    3120

tgaagccttt tctgaaggcg ggattttcaa cataacctct cccatgtgct tagtgtcaaa    3180

acaaaatcga ttccggttaa cagaacagca agtgaatttt gtgtgtcagc gagtggacat    3240

ggacattgtt gtgtactgca acgggcagag gaaagtaata ttaacaaaaa ctctagttat    3300

tggacagtgt atatatacta taacaagctt attctcatta ctacctggag tagcacattc    3360

tattgctgtt gaattgtgtg tacctgggtt ccatggttgg gccacagctg ctctgcttgt    3420

tacattctgt ttcggatggg ttcttatacc agcaattaca tttatcatac taacagtcct    3480

aaagttcatt gctaatattt ttcacacaag taatcaagag aataggctaa aatcagtact    3540

tagaaagata aaggaagagt ttgaaaaaac aaaaggctca atggtatgtg atgtctgcaa    3600

gtatgagtgt gaaacctata aagaattaaa ggcacacggg gtatcatgcc cccaatctca    3660

atgtccttac tgttttactc attgtgaacc cacagaagca gcattccaag ctcattacaa    3720

ggtatgccaa gttactcaca gattcaggga tgatctaaag gtcgacatgg caactatgga    3780

ggaattacag agggaaatca atgcccatga gggtcaatta gtgatagcca ggcagaaggt    3840

gagggatgca gaaaaacagt atgaaaagga tccagatgag ttgaacaaga gaacattaac    3900

tgaccgagag ggcgttgcag tatctatcca ggcaaaaatt gatgagttaa aaaggcaact    3960

ggcagatagg attgcaactg ggaaaaacct tgggaaggaa caagatccaa caggggtgga    4020

gcctggagac catctgaaag agaggtcaat gctcagttat ggtaatgtgc tggatttaaa    4080

ccatttggat attgatgaac ctacaggaca gacagcagac tggctgagca tcatcgtcta    4140

tcttacatcc tttgtcgtcc cgatacttct gaaagctctg tatatgttga caacaagggg    4200

gaggcaaact accaaggata ataaagggac ccggattcga tttaaggatg atagctcgtt    4260

cgaggatgtt aacggtatcc ggaaaccaaa acatctttac gtgtccttgc caaatgcaca    4320

gtcaagcatg aaggcagaag agattacacc tggtagatat agaacagcag tctgtgggct    4380

ctaccctgca cagattaagg cacggcagat gatcagtcca gttatgagtg taattggttt    4440

tctagcatta gcaaaggact ggagtgatcg tatcgaacaa tggttaattg aaccttgcaa    4500

gcttcttcca gatacagcag cagttcatca tcatcatcat catgcggccg ccactgtgct    4560

ggatgatccg agctcggtac ctaaaccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagtatca    4620

acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt    4680

tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc    4740

tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc    4800

cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg    4860

gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc    4920

cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg    4980

cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg    5040

tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc    5100

agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct    5160

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctgctt aagtttaaac    5220

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc    5280

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa    5340

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac    5400

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg    5460

gcttctgagg cggaaagaac cagcagatct gcagatctga attcatctat gtcgggtgcg    5520

gagaaagagg taatgaaatg gcattatggg tattatgggt ctgcattaat gaatcggcca    5580

acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc    5640

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg    5700

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa    5760

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga    5820

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag    5880

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct    5940

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg    6000

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc    6060

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt    6120

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta    6180

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac    6240

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc    6300

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat    6360

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc    6420

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt    6480

cacctagatc cttttgatcc tccggcgttc agcctgtgcc acagccgaca ggatggtgac    6540

caccatttgc cccatatcac cgtcggtact gatcccgtcg tcaataaacc gaaccgctac    6600

accctgagca tcaaactctt ttatcagttg gatcatgtcg gcggtgtcgc ggccaagacg    6660

gtcgagcttc ttcaccagaa tgacatcacc ttcctccacc ttcatcctca gcaaatccag    6720

cccttcccga tctgttgaac tgccggatgc cttgtcggta aagatgcggt tagcttttac    6780

ccctgcatct ttgagcgctg aggtctgcct cgtgaagaag gtgttgctga ctcataccag    6840

gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc cacggttgat gagagctttg    6900

ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg    6960

tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc    7020

cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta caaccaatta accaattctg    7080

attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca ggattatcaa    7140

taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg aggcagttcc    7200

ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca tcaatacaac    7260

ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca tgagtgacga    7320

ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt ccagacttgt tcaacaggcc    7380

agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc attcgtgatt    7440

gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa acaggaatcg    7500

aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct gaatcaggat    7560

attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt aaccatgcat     7620

catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc gtcagccagt     7680

ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca tgtttcagaa     7740

acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct gattgcccga     7800

cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa tttaatcgcg     7860

gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta ttactgttta     7920

tgtaagcaga cagttttatt gttcatgatg atatattttt atcttgtgca atgtaacatc     7980

agagattttg agacacaacg tggctttgtt gaataaatcg aacttttgct gagttgaagg     8040

atcagatcac gcatcttccc gacaacgcag accgttccgt ggcaaagcaa aagttcaaaa     8100

tcaccaactg gtccacctac aacaaagctc tcatcaaccg tggctccctc actttctggc     8160

tggatgatgg ggcgattcag gcctggtatg agtcagcaac accttcttca cgaggcagac     8220

ctcagcgcta gattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt     8280

tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc     8340

acctgacgt                                                             8349

Claims (3)

1.一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G1S0.7-pCAG，其全基因序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，在其3’端插入WPRE转录调控元件，得到含WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G1S0.7-WPRE，其全基因序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种用于提高汉坦病毒融合蛋白G1S0.7表达的腺病毒高表达载体，对含嵌合基因G1S0.7的腺病毒转移载体G1S0.7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子并在其3’端插入WPRE转录调控元件，得到含CAG启动子/增强子和WPRE调控元件的高表达汉坦病毒融合蛋白G1S0.7的腺病毒重组转移载体，命名为G1S0.7-pCAG-WPRE，其全基因序列为SEQ ID NO：3所示。

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