CN111040998A - 一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用，使用CRISPR‑Cas9技术将狂犬病毒糖蛋白基因定点敲入鼠源神经瘤母细胞(N2a cells)的Rosa26Safe‑harbor位点，经嘌呤霉素压力筛选和有限稀释法获得稳定表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株，再逐步扩大培养，以实现狂犬病毒糖蛋白稳定高效表达，获得的蛋白纯度高、稳定性好。为疫苗研制和狂犬病致病机理研究提供平台，有利于狂犬病毒的疾病诊断和深层次的分子机制研究。

Description

一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用。
背景技术
成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白株统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR/CRISPR-associated nucleasesystem，CRISPR/Cas)属于第三代基因编辑技术，同类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)与锌指核酶(zinc-finger nucleases) 相比，具有设计简单，可重复性好，效率高的特点，在进行基因的靶向修饰上具有优势。
狂犬病是一种因狂犬病病毒(Rabies Virus,RABV)感染引起的烈性传染病，传播途径主要是感染了狂犬病的动物的咬伤或者抓伤。狂犬病病毒可感染人类与温血动物，感染者一旦发病，死亡率几乎为100％，对公共安全危害极大。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，是一种有包膜的单股负链RNA病毒，基因组全长11928bp或11932bp，含有5个大的开放阅读框可编码5种结构蛋白，其中G基因及其编码的糖蛋白(GP)的研究最为深入。狂犬病毒糖蛋白(GP)位于病毒包膜表面，以同源3聚体的形式存在，构成病毒表面的突起，在诱导宿主细胞发生免疫应答，介导病毒与宿主细胞表面受体的识别结合，引起病毒的致病性等。现有技术中有学者利用酵母、昆虫细胞等真核表达株表达狂犬病毒糖蛋白，但未能获得产量高，纯度好的表达产物。
针对存在的问题，本发明致力于构建一种能够过表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，将狂犬病毒糖蛋白基因Rabv-G基因稳定敲入小鼠Rosa26 Safe-Harbor位点，得到稳定表达狂犬病毒糖蛋白N2a细胞株。
本发明的首要目的在于提供一株狂犬病毒糖蛋白过表达细胞株。
本发明的另一目的在于提供细胞株分泌的狂犬病毒糖蛋白。
本发明的另一目的在于提供细胞株在分泌狂犬病毒糖蛋白中的应用。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一株鼠源神经瘤母细胞株N2a-RABV G+，于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019114。
上述所述细胞株N2a-RABV G+分泌的狂犬病毒糖蛋白。
进一步的，所述狂犬病毒糖蛋白在制备抗病毒制剂中的应用。
进一步的，所述抗病毒制剂为抗狂犬病病毒制剂。
上述所述细胞株N2a-RABV G+在分泌表达狂犬病毒糖蛋白中的应用。
一种制备上述稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的方法，将狂犬病毒糖蛋白基因与载体 pROSA26 Doner-KS连接成重组质粒pRosaDoner-GDG，将pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g 混合，共转染，筛选阳性克隆，鉴定即得狂犬病毒糖蛋白细胞株。
进一步的，pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g混合体积比为1:1。
一种利用上述鼠源神经瘤母细胞株分泌表达狂犬病毒糖蛋白的方法，通过基因工程技术构建表达狂犬病病毒糖蛋白的质粒pRosaDoner-GDG和识别并靶向切割ROSA26位点的质粒 pROSA26-Cas9g，共转染，筛选阳性克隆，扩大培养后得可稳定表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株。
进一步的，所述载体中，ROSA26基因的同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
上述鼠源神经瘤母细胞株在制备单克隆抗体中的应用。
前期实验偶然发现，随机整合的形式的方式将狂犬病毒整合入CHO细胞表达，筛选时发现蛋白表达水平随着压力水平的上升而下降。本发明中选取了细胞表达系统，但随着基因靶向修饰以及基因安全位点的应用，避免了因为随机整合的方式将外源基因转入细胞产生的不稳定性和潜在危害性，削减了外源基因插入以及表达的难度。
本发明的有益效果是：
本发明通过使用CRISPR-Cas9技术将狂犬病毒糖蛋白基因定点敲入鼠源神经瘤母细胞 (N2a cells)的Rosa26 Safe-harbor位点，经嘌呤霉素压力筛选和有限稀释法获得稳定表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株，再逐步扩大培养，以实现狂犬病毒糖蛋白稳定高效表达，获得的蛋白纯度高、稳定性好。为疫苗研制和狂犬病致病机理研究提供平台，利于狂犬病毒的疾病诊断和深层次的分子机制研究。
附图说明
图1A为质粒转染细胞后24h；图1B为细胞压力筛选10d。
图2为单克隆细胞群落。
图3A为左同源臂特异引物扩增电泳结果；B为右同源臂特异引物扩增电泳结果；C为 RAVB-GD G特异引物扩增。其中图中M为DNAmarker，泳道1～3为阳性细胞DNA，泳道4为阴性对照。
图4为Western Blot结果，其中A横行为狂犬病病毒G蛋白Western Blot结果，B横行为内参GAPDH Western Blot结果，其中泳道M为PageRulerTM Prestained ProteinLadder，泳道1 为N2a细胞对照，泳道2～4为狂犬病G蛋白细胞株，泳道5为N2a细胞培养狂犬病毒。
具体实施方式
一株鼠源神经瘤母细胞株N2a-RABV G+，于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019114。
上述所述细胞株N2a-RABV G+分泌的狂犬病毒糖蛋白。
优选的，所述狂犬病毒糖蛋白在制备抗病毒制剂中的应用。
优选的，所述抗病毒制剂为抗狂犬病病毒制剂。
上述所述细胞株N2a-RABV G+在分泌表达狂犬病毒糖蛋白中的应用。
一种制备上述稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的方法，将狂犬病毒糖蛋白基因与载体 pROSA26 Doner-KS连接成重组质粒pRosaDoner-GDG，将pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g 混合，共转染，筛选阳性克隆，鉴定即得狂犬病毒糖蛋白细胞株。
优选的，pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g混合体积比为1:1。
一种利用上述鼠源神经瘤母细胞株分泌表达狂犬病毒糖蛋白的方法，通过基因工程技术构建表达狂犬病病毒糖蛋白的质粒pRosaDoner-GDG和识别并靶向切割ROSA26位点的质粒 pROSA26-Cas9g，共转染，筛选阳性克隆，扩大培养后得可稳定表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株。
优选的，所述载体中，ROSA26基因的同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
上述鼠源神经瘤母细胞株在制备单克隆抗体中的应用。
材料
大肠杆菌E coli DH5α，N2a细胞，小鼠Rosa26 Safe Harbor基因的敲入载体由本实验保存；胎牛血清，1640培养基，脂质体Lipofectami-neTM 2000，Pierce TM BCA ProteinAssay Kit，GAPDH Loading Control Monoclonal Antibody(GA1R)，质粒提取、回收、DNA、RNA抽提等试剂盒均购自Thermo；高保真Kod FX酶购自东洋纺(TOYOBO)；限制性内切酶NheI和BamHI及T4DNA 连接酶购自BioLabs；嘌呤霉素(Puromycin)购自上海生工；狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体购自CHEMICON公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG购自CST。
狂犬病病毒广东分离株RABV-GD为本实验保存(GenBank NO.KY451767.1)，狂犬病毒糖蛋白全基因组序列。
实施例1
引物
以狂犬病毒糖蛋白基因序列为模板(CCTCC NO：C2019114)，利用primer premier5软件编码糖蛋白的特异性引物(见下)。分别在上游引物、下游引物的5’端加Nhe I酶切位点、BamH I酶切位点与相应保护性碱基(见下划线标注)，引物由北京华大基因合成。
上游引物5’-CTAGCTAGCATGGTTCCTCAAGTCCTTGTGTTTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物5’-CGCGGATCCTTACAGCTTGGTCTCACCTCCGCCT-3’(SEQ ID NO.2)。
基因扩增
以RABV-GD细胞培养物为样品制备模板，RT-PCR扩增目的基因。RT-PCR扩增反应程序为： 95℃2min；98℃15s，60℃30s，68℃1min，30个循环；68℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，DNA纯化试剂盒进行切胶回收目的片段。
重组载体构建与鉴定
目的基因与载体pROSA26 Doner-KS分别经NheI、BamHI双酶切后回收，然后与经过NheI、 BamHI双酶切后回收的狂犬病毒糖蛋白基因(RABA-G)扩增产物在T4连接酶连接，转化DH5α感受态细胞后涂布在含氨苄的LB平板，过夜培养挑单菌落培养并提取质粒，经酶切和测序鉴定。
结果：经酶切和测序鉴定，构建正确的重组质粒命名为pRosaDoner-GDG。
N2a细胞Puro最低致死浓度的测定
N2a细胞(鼠源神经瘤母细胞(Mouse neuroblastoma N2a cells))接种于96孔板，培养至85％-90％细胞密度后，用不同浓度Puro的1640培养基(0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/mL)培养，每日更换培养基，连续观察14日，全部细胞死亡的最低浓度即为最适Puro筛选浓度。
结果：N2a细胞Puro最低致死浓度的测定，也就是最适合的Puro筛选浓度为2ug/ml。
狂犬病毒糖蛋白细胞株的建立与筛选
N2a细胞培养于含有10％胎牛血清的1640培养液中。转染前一日，将细胞以2×105个细胞接种至6孔板的培养液中，过夜培养使得细胞密为90％-95％，进行转染。
pROSA26-Cas9g RNA是一种携带Cas9及gRNA基因的质粒，该质粒在同源重组中负责识别并切割ROSA26靶向位点。
利用LipofectamineTM2000将质粒pRosaDoner-GDG和pROSA26-Cas9gRNA以体积比为1:1 混合后共转染到N2a细胞，同时设立对照组。转染48h后，更换为药物培养基进行筛选，7～ 10天后挑出单个细胞集落，按有限稀释法转入96孔板进行单克隆培养，再依次经24孔、6 孔板，细胞瓶逐步扩大培养。取6孔板时的部分细胞进行PCR鉴定，将PCR鉴定无误的细胞株继续扩大培养，冻存备用。
结果：共转染N2a细胞24h后(见图1的A)，以及压力筛选10d后(见图1的B)后发现，转染后24h，死亡细胞约为20％，而余下80％细胞均有荧光表达，压力筛选10天后，大部分细胞死亡，仍有部分细胞有荧光表达。经10d压力筛选后的荧光细胞经消化后，按有限稀释法转入96孔板后，培养10d后单个细胞形成单克隆细胞群落情况如图2，证明了经有限稀释法稀释的单个荧光细胞得到增殖。所述细胞株为鼠源神经瘤母细胞株N2a-RABV G+于2019 年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：C2019114，保藏地址为中国武汉武汉大学。
目的基因整合鉴定
使用制备的阳性克隆细胞为样品，制备DNA为模板，将定点整合后的左右同源臂序列，以及RAVB-GDG基因序列特异性引物分别进行PCR鉴定。
结果：挑选形成单克隆群落的阳性细胞孔，提取细胞的DNA组，使用定点整合后的左右同源臂序列，以及RAVB-GD G基因序列特异性引物分别进行PCR鉴定，所得结果如图3的A、 B和C。图3A中显示右(3’端)同源臂长度为1.2kb，图3B中显示左(5’端)同源臂长度为1.1kb，图3C中显示RAVB-GDG长度为1.6kb，产物大小符合实验预期，且测序结果验证正确率为100％。
左(5’端)同源左臂的核苷酸序列为：TCGTCGTCTGATTGGCTCTC(SEQ ID NO:3)；
左(5’端)同源右臂的核苷酸序列为：CGTGAGTCAAACCGCTATCC(SEQ ID NO:4)；
右(3’端)同源左臂的核苷酸序列为：GCTATGTGGATACGCTGCTTTA(SEQ ID NO:5)；
右(3’端)同源右臂的核苷酸序列为：CTGACGGGAGAGGTGATAGAC(SEQ ID NO:6)。
狂犬病毒糖蛋白细胞株的Western Blot鉴定
A.蛋白质样品的制备
将N2a细胞株弃去培养液，用预冷PBS漂洗3次；弃去细胞培养瓶中的所有液体，移液器吸干所有液体后；加入Pierce细胞裂解液(Thermo 87787)500μL；放置在冰上间断颠倒，至细胞完全脱落；每隔5～6分钟振荡器轻柔振荡一次，共4次；之后10,000×g，4℃离心5分钟，取上清；分装，标记，-80℃冻存备用。
B.蛋白质样品的定量
使用BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce TM BCA Protein Assay Kit,ThermoScientific,23225) 对细胞蛋白质样品进行定量。
实验步骤：
配制15％的SDS-PAGE分离胶，迅速在两玻璃板的间隙中灌注，留出灌注积层胶所需空间，并在分离胶溶液上覆盖一层0.1％SDS，待分离胶完全聚合后倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤数次以除去未聚合的丙烯酰胺。用滤纸将残留液体吸净，同时将配制好的5％的积层胶灌注并立即插入干净的TefLon梳子，积层胶聚合后小心拔出梳子，用电泳缓冲液小心冲洗电泳孔道。将制备的适量体积的质粒和等体积2×上样缓冲液混合后，在100℃加热5min以使混杂在质粒中的细菌蛋白质变性。将30μg样品和低分子量标准蛋白Marker加入进样孔，使用1 ×上样缓冲液补齐后电泳(8V/cm)，待染料前沿进入分离胶时将电压提高到15V/cm，直至染料到达分离胶底部，关闭电源。切除积层胶后将凝胶从中间切开，标记后分别用考马思亮蓝和银盐染色。
(1)将本发明已经制备好的狂犬病毒糖蛋白细胞株蛋白样品经SDS-PAGE电泳，方法同上。
(2)电转移切出含待转移的凝胶，包括宽分子量预染蛋白Marker，剪6张同样大小的滤纸和1张硝酸纤维素膜，将它们浸泡于转移缓冲液中，在塑料支架上依次叠放湿润的海绵、 3层滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层滤纸和海绵，使其相互对齐，且各层之间无气泡存在，将支架加紧插入电泳槽中，硝酸纤维素膜一侧接阳极，凝胶一侧接阴极，32V电压4℃转移 14～16h。
(3)封闭电转移结束后，加封闭液浸泡硝酸纤维素膜，室温封闭2小时或4℃过夜，同时对凝胶染色，检查蛋白转移是否完全。封闭后用洗涤缓冲液漂洗硝酸纤维素膜3次，每次5min。
(4)结合一抗将硝酸纤维素膜沿蛋白Marker 43KDa处剪切，将大于43KDa膜与小于43KDa的硝酸纤维素膜分别置于不含吐温的洗涤液中，振摇洗涤3次，每次5min。将大于43Da的硝酸纤维素膜与1:200倍稀释的狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体于室温平缓摇动反应2～4h，回收抗体；同步将小于43KDa硝酸纤维素膜与1:3000稀释的鼠GAPDH抗体于室温平缓摇动反应2～4h，回收抗体；再分别将纤维素膜浸泡于大量洗涤缓冲液中，平缓摇动洗涤3次，每次10min。
(5)结合二抗以HRP标记的羊抗鼠IgG为第二抗体与相应的纤维素膜条反应。用洗涤缓冲液1:3000稀释酶标二抗，将膜浸泡在二抗反应液中，室温平缓摇动反应2～4小时或4℃过夜，回收二抗，洗膜，方法同(4)。
(6)显色TMB显色液至适当，拍照。
(7)对Western Blot结果进行半定量比较。
结果：取制备好的细胞株蛋白质样品30μg上样，进行SDS-PAGE及Western Blot分析,结果如图4的A与B所示。根据图4的蛋白表达情况，本发明发现3、4号蛋白表达量相对于对照多，因此筛选出3、4号细胞株为狂犬病毒糖蛋白稳定表达的细胞株，3、4号蛋白为目的蛋白。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院动物卫生研究所
<120> 一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctagctagca tggttcctca agtccttgtg tttg 34
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgcggatcct tacagcttgg tctcacctcc gcct 34
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgtcgtctg attggctctc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgtgagtcaa accgctatcc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctatgtgga tacgctgctt ta 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgacgggag aggtgataga c 21

Claims (10)

1.一株鼠源神经瘤母细胞株N2a-RABV G+，于2019年5月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2019114。
2.权利要求1所述细胞株N2a-RABV G+分泌的狂犬病毒糖蛋白。
3.权利要求2所述狂犬病毒糖蛋白在制备抗病毒制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗病毒制剂为抗狂犬病病毒制剂。
5.权利要求1所述细胞株N2a-RABV G+在分泌表达狂犬病毒糖蛋白中的应用。
6.一种制备权利要求1鼠源神经瘤母细胞株的方法，其特征在于，将狂犬病毒糖蛋白基因与载体pROSA26Doner-KS连接成重组质粒pRosaDoner-GDG，将pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g混合，共转染，筛选阳性克隆，鉴定即得狂犬病毒糖蛋白细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，pRosaDoner-GDG与pROSA26-Cas9g混合体积比为1:1。
8.一种利用权利要求1鼠源神经瘤母细胞株分泌表达狂犬病毒糖蛋白的方法，其特征在于，构建表达狂犬病病毒糖蛋白的质粒pRosaDoner-GDG和识别并靶向切割ROSA26位点的质粒pROSA26-Cas9g，共转染，筛选阳性克隆，扩大培养后得可稳定表达狂犬病毒糖蛋白的细胞株。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体中，ROSA26基因的同源左臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，同源右臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
10.权利要求1鼠源神经瘤母细胞株在制备单克隆抗体中的应用。
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