KR20050042459A - 포스포에놀피루베이트-당-포스포트랜스퍼라제 단백질을코딩하는 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 핵산 분자, 생물공학적으로 개선된 미생물의 제작에 있어서의 그의 용도 및 상기 생물공학적으로 개선된 미생물에 의한 정밀화학물질, 특히 아미노산의 생산 방법에 관한 것이다.

Description

포스포에놀피루베이트-당-포스포트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 유전자 {Genes Coding for Phosphoenolpyruvate-Sugar-Phosphotransferase Proteins}

세포에서 자연발생적으로 일어나는 대사 과정의 특정 산물 및 부산물은 식품, 사료, 화장품 및 제약 산업을 비롯한 다양한 산업 분야에 사용된다. 총체적으로 "정밀화학물질"로 불리는 이들 분자로는 유기산, 단백질성 및 비단백질성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민, 보조인자 및 효소를 들 수 있다. 이들은 각각의 특정한 경우 목적하는 분자를 대량으로 생산하고 분비하도록 개발된 세균의 대규모 배양에 의해 가장 잘 수행된다. 이러한 목적에 특히 적합한 유기체는 그람 양성의 비병원성 세균인 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)이다. 균주 선별을 통해, 다양한 목적하는 화합물을 생산하는 다수의 돌연변이 균주가 개발되어 있다. 그러나, 특정 분자의 생산을 위해 개량된 균주의 선별은 시간 소모적이고 어려운 과정이다.

<발명의 간단한 설명>

본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 또는 관련 세균종의 확인 또는 분류에 사용될 수 있는 신규 핵산 분자를 제공한다. 씨. 글루타미쿰 (C. glutamicum)은 다수의 정밀화학물질의 대량 생산, 탄화수소의 분해 (예를 들어, 조성 오일 스필의 경우) 및 테르페노이드의 산화를 위한 산업에 널리 사용되는 그람 양성 호기성 세균이다. 따라서, 상기 핵산 분자는 예를 들어, 발효 공정에 의해 정밀화학물질을 생산하는 데 이용할 수 있는 미생물을 확인하는 데 사용할 수 있다. 씨. 글루타미쿰 그 자체는 비병원성이지만, 이는 인간에서의 주요 병원체인 코리네박테리움 디프테리애 Corynebacterium diphteriae) (디프테리아의 병원체)와 같은 다른 코리네박테리움 종과 관련된다. 따라서, 코리네박테리움 종의 존재를 확인하는 능력은 또한 예를 들어 진단적 적용에서와 같이 임상적으로 상당히 중요하다. 더욱이, 상기 핵산 분자는 씨. 글루타미쿰 게놈 또는 관련 유기체의 게놈을 맵핑하기 위한 기준점으로 사용할 수 있다.

이들 신규 핵산 분자는 이하에서 포스포에놀피루베이트: 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS) 단백질로 지칭되는 단백질을 코딩한다. 이들 PTS 단백질은 예를 들어 글루코스와 같은 고에너지 탄소 함유 분자를 씨. 글루타미쿰에 수송하거나 상기 미생물의 세포내 신호 전달에 참여할 수 있다. 예를 들어 신스키 (Sinskey) 등의 미국 특허 제 4 646 119호에 개시된 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰에 사용하기 위한 클로닝 벡터, 및 씨. 글루타미쿰 및 관련 브레비박테리움 (Brevibacterium) 종 (예를 들어 락토페르멘툼)의 유전적 조작 기술 (문헌 [Yoshihama et al., J. Bacteriol. 162 (1985) 591-597]; [Katsumata et al., J. Bacteriol. 159 (1984) 306-311]; 및 [Santamaria et al. J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 2237-2246])의 이용가능성 때문에, 본 발명의 핵산 분자는 상기 유기체가 하나 이상의 정밀화학물질의 보다 우수하고 보다 효율적인 생산자가 되도록 하기 위해 상기 유기체의 유전적 조작에 사용될 수 있다. 본 발명의 PTS 분자는 하나 이상의 정밀화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율이 개선되도록 변형될 수 있다. 예를 들어 글루코스 유입에 관련된 PTS 단백질이 그 활성이 최적화되도록 변형된다면, 글루코스의 유입량 또는 글루코스가 세포 내로 수송되는 속도가 증가할 수 있다. 세포의 글루코스 및 다른 당의 분해는 예를 들어 정밀화학물질의 생합성에 관련된 것과 같은, 에너지론적으로 일어나기 힘든 생화학 반응이 일어나도록 하는데 사용될 수 있는 에너지를 제공한다. 더욱이, 상기 분해는 아미노산, 비타민 및 보조인자와 같은 특정 정밀화학물질의 생합성에 요구되는 중간체 및 전구체를 제공한다. 따라서, 본 발명의 PTS 분자의 변형을 통해 세포내 고에너지 탄소 분자의 양을 증가시키면, 하나 이상의 정밀화학물질의 생산에 요구되는 대사 과정 및 상기 생산에 요구되는 대사산물의 세포내 풀 (pool)을 수행하는데 이용가능한 에너지 둘 다를 증가시킬 수 있다.

그리고, 본 발명의 PTS 분자는 씨. 글루타미쿰으로부터의 하나 이상의 정밀화학물질의 생산 수율 및(또는) 속도에 영향을 주는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관여할 수 있다. 예를 들어 세포외 배지 (예를 들어, Hpr, 엔자임 I, 또는 엔자임 II 복합체의 구성원)로부터 하나 이상의 당을 유입하기 위해 요구되는 단백질은, 충분한 양의 세포 내 당의 존재 하에서 빈빈히 번역후 변형되어 상기 당을 더이상 도입할 수 없게 된다. 상기 수송계가 중단된 상태에서의 당의 양은 정상 세포 기능을 유지하는데 충분하지만, 이는 목적하는 정밀화학물질의 과다생산을 제한하게 된다. 따라서, 본 발명의 PTS 단백질을 변형하여 이들이 이러한 종류의 음성 조절에 더이상 반응하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 이는 신장에 의해 하나 이상의 당의 보다 높은 세포내 농도, 상기 돌연변이체 PTS 단백질을 함유하는 유기체로부터의 하나 이상의 정밀화학물질의 보다 효율적인 생산 또는 보다 높은 수율을 달성할 수 있도록 한다.

본 발명은 예를 들어 고에너지 탄소 분자 (예를 들어 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스)를 씨. 글루타미쿰 내로 유입하는데 참여하거나, 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있는 이하에서 포스포에놀피루베이트: 당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS) 단백질로 지칭되는 단백질을 코딩하는 신규 핵산 분자를 제공한다. PTS 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 이하에서 PTS 핵산 분자로 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, PTS 단백질은 고에너지 탄소 분자 (예를 들어 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스)를 씨. 글루타미쿰으로 도입하는데 관여하고, 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 세포내 신호 전달 과정에 참여할 수 있다. 이러한 단백질의 예는 표 1에 열거된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.

결과적으로, 본 발명의 한 측면은 PTS 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자 (예를 들어, cDNA), 및 PTS 코딩 핵산 (예를 들어 DNA 또는 mRNA)을 검출하거나 증폭하기 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 적합한 핵산 단편에 관한 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 첨부문서 A에 열거된 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 코딩 영역 또는 그의 상보체를 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 첨부문서 B에 열거된 임의의 아미노산 서열을 코딩한다. 유사하게 본 발명의 바람직한 PTS 단백질은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 PTS 활성을 갖는다.

첨부문서 A는 하기에서 표 1에 기재된 상응하는 위치의 서열 변이와 함께 서열 목록의 핵산 서열을 정의한다.

첨부문서 B는 하기에서 표 1에 기재된 상응하는 위치의 서열 변이와 함께 서열 목록의 폴리펩티드 서열을 정의한다.

다른 실시양태에서, 단리된 핵산 분자는 그 길이가 15개의 뉴클레오티드 이상이고, 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자와 엄격한 조건 하에 혼성화된다. 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 자연 발생 핵산 분자에 상응한다. 보다 바람직하게는, 단리된 핵산은 씨. 글루타미쿰의 PTS 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위를 코딩한다.

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 예를 들어, 재조합 벡터, 및 상기 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 한 실시양태에서, PTS 단백질은 적합한 배지에서 배양되는 숙주 세포를 이용하여 제조한다. 그 후, PTS 단백질을 배지 또는 숙주 세포로부터 단리할 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 PTS 유전자가 도입되거나 PTS 유전자가 변이된 유전공학적 변이 미생물에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 미생물의 게놈은 돌연변이 PTS 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자를 트랜스 유전자 (transgene)로서 도입하여 변이시킨다. 다른 실시양태에서, 상기 미생물의 게놈 내의 내생성 PTS 유전자는 변이된 PTS 유전자와의 상동성 재조합에 의해 변이, 예를 들어, 기능적으로 파괴된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속하며, 코리네박테리움 글루타미쿰이 특히 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 상기 미생물은 또한 아미노산, 특히 바람직하게는 리신과 같은 목적하는 화합물의 제조에 사용된다.

또다른 바람직한 실시양태는 첨부문서 A에 기재된 하나 이상의 핵산 분자를 갖는 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 이는 예를 들어 몇몇 본 발명의 핵산 분자를 운반하는 벡터에 의해 형질감염될 수 있다. 그러나, 각 경우에 본 발명의 한 핵산 분자를 숙주 세포 내로 도입하는 벡터를 이용하고, 따라서 복수의 벡터를 동시에 또는 연속으로 사용하는 것도 또한 가능하다. 즉, 수많은, 수백개 이하의 본 발명의 핵산 서열을 운반하는 숙주 세포를 만드는 것이 가능하다. 이러한 축적은 빈번히 정밀화학물질 생산성에 관한 숙주 세포에 대한 상당한 부가 효과를 가져온다.

본 발명의 다른 측면은 단리된 PTS 단백질 또는 그의 부위, 예를 들어, 생물 활성 부위에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 단리된 PTS 단백질 또는 그의 부위는 고에너지 탄소 분자 (예를 들어 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스)를 씨. 글루타미쿰 내로 유입하는 것, 그리고 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관여한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 단리된 PTS 단백질 또는 그의 부위는, 상기 단백질 또는 그의 부위가 고에너지 탄소 분자 (예를 들어 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스)를 씨. 글루타미쿰 내로 유입하는 것 및(또는) 씨. 글루타미쿰의 하나 이상의 신호 전달 경로에 참여할 수 있도록 첨부문서 B의 아미노산 서열과 충분한 상동성이 있다.

더욱이, 본 발명은 단리된 PTS 단백질 제제에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, PTS 단백질은 첨부문서 B의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 첨부문서 B의 전체 아미노산 서열과 실질적으로 상동성이 있는 단리된 전장 단백질 (첨부문서 A의 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩됨)에 관한 것이다.

PTS 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 부위를 PTS 폴리펩티드가 아닌 폴리펩티드와 작동 가능하게 결합하여 융합 단백질을 생산할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 PTS 단백질 단독의 활성과는 다른 활성을 가지며, 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 씨. 글루타미쿰으로부터의 목적하는 정밀화학물질의 수율을 증가시키고, 생산량 및(또는) 생산 효율을 증가시킨다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 융합 단백질을 숙주 세포에 도입시켜 숙주 세포에 의한 목적하는 화합물의 생산을 조절한다.

본 발명의 또다른 측면은 정밀화학물질의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명의 PTS 핵산 분자를 발현하는 벡터를 포함하는 세포를, 정밀화학물질이 생산되도록 배양하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 또한 PTS 핵산을 발현하는 벡터로 상기 세포를 형질감염시켜 상기 벡터를 함유하는 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 또한 배양물로부터 정밀화학물질을 수득하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속에 속한다.

본 발명의 또다른 측면은 미생물로부터 분자가 생산되는 것을 조절하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 PTS 단백질 활성 또는 PTS 핵산 발현을 조절하는 물질과 세포를 접촉시켜 세포 관련 활성이 상기 물질의 부재 하의 동일한 활성에 비해 바뀌도록 하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 상기 미생물에 의한 목적하는 정밀화학물질의 수율 또는 생산 속도가 개선되도록 하나 이상의 당의 유입에 관해 조절된다. PTS 단백질 활성을 조절하는 물질은 예를 들어 PTS 단백질 활성 또는 PTS 핵산 발현을 자극한다. PTS 단백질 활성 또는 PTS 핵산 발현을 자극하는 물질의 예로는 소분자, 활성 PTS 단백질, 및 PTS 단백질을 코딩하고 세포에 도입된 핵산을 들 수 있다. PTS 활성 또는 PTS 발현을 억제하는 물질의 예로는 소분자 및 안티센스 PTS 핵산 분자를 들 수 있다.

본 발명의 또다른 측면은 별개의 플라스미드 상에 유지되어 있거나 숙주 세포의 게놈에 삽입되어 있는 PTS 야생형 유전자 또는 PTS 돌연변이 유전자를 세포 내에 삽입하는 것을 포함하는, 세포로부터의 목적하는 화합물의 수율을 조절하는 방법에 관한 것이다. 게놈 내로의 삽입은 무작위적으로 또는 천연 유전자가 삽입된 카피로 대체되도록 하는 상동성 재조합에 의해 일어날 수 있으며, 이에 의해 세포로부터의 목적하는 화합물의 생산이 조절된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 수율은 증가한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 화학물질은 정밀화학물질이며, 특히 바람직한 실시양태에서, 아미노산이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 아미노산은 L-리신이다.

본 발명은 씨. 글루타미쿰 내로의 고에너지 탄소 분자 (예, 글루코스, 프룩토스 또는 수크로스)의 유입에 관여하며 또한 상기 미생물의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있는 PTS 핵산 및 PTS 단백질 분자를 제공한다. 본 발명의 분자는 미생물로부터의 정밀화학물질의 생산을 조절하는 데 사용될 수 있다. 이러한 조절은, 예를 들어 정밀화학물질의 생합성과 같이 세포내에서 에너지론적으로 일어나기 힘든 생화학 반응이 일어나도록 하는데 사용되는 ATP, GTP 및 다른 분자를 생산하는데 필요한 고에너지 분자의 세포내 수준의 증가에 기초할 것이다. 정밀화학물질의 생산의 이러한 조절은 또한, 많은 당의 분해된 산물이 특정 정밀화학물질의 중간체 또는 전구체를 비롯한 다른 생합성 경로를 위한 중간체 또는 전구체로서 활용될 수 있다는 사실에 기초할 것이다. 그리고, PTS 단백질은 정밀화학물질의 하나 이상의 대사 경로에 대한 조절 활성을 가질 수 있는 특정 세포내 신호 전달 경로에 관여하는 것으로 알려져 있어서, 상기 PTS 단백질을 조작함으로써 정밀화학물질의 생합성 경로를 활성화시키거나 정밀화학물질의 분해 경로를 억제할 수 있다. 본 발명의 측면은 아래에 더 자세히 기재되어 있다.

Ⅰ. 정밀화학물질

용어 "정밀화학물질"은 당업계에 공지되어 있고, 제약 산업, 농업 및 화장품 산업과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 다양한 분야의 산업에 이용되는 유기체에 의해 생산되는 분자를 포함한다. 이들 화합물로는 타르타르산, 이타콘산 및 디아미노피멜산과 같은 유기산, 단백질성 및 비단백질성 아미노산, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드, 및 뉴클레오티드 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, p. 561-612, in Biotechnology vol. 6, Rehm et al., Editors VCH: Weinheim] 및 그의 참고문헌에 기재되어 있음), 지질, 포화 및 불포화 지방산 (예를 들어, 아라키돈산), 디올 (예를 들어, 프로판디올 및 부탄디올), 탄수화물 (예를 들어, 히알루론산 및 트레할로스), 방향족 화합물 (예를 들어, 방향족 아민, 바닐린 및 인디고), 비타민 및 보조인자 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp. 443-613 (1996) VCH: Weinheim] 및 그의 참고문헌; 및 [Ong, A. S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asia, held Sept. 1-3, 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, (1995)]에 기재되어 있음), 효소 및 문헌 [Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086] 및 그의 참고문헌에 기재된 다른 모든 화학물질이 있다. 특정 정밀화학물질의 대사 및 용도는 이하에 더 기재될 것이다.

A. 아미노산 대사 및 용도

아미노산은 모든 단백질의 기본 구조 단위를 구성하고, 따라서 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 용어 "아미노산"은 당업계에 공지되어 있다. 20종이 있는 단백질성 아미노산은 이들이 펩티드 결합에 의해 함께 결합되어 있는 단백질에 대한 구조 단위로 작용하는 반면, 비단백질성 아미노산 (수백 종이 공지되어 있음)은 통상적으로는 단백질에서 발견되지 않는다 (문헌 [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)] 참조). L-아미노산이 통상적으로 천연 발생 단백질에서 발견되는 유일한 종류이지만, 아미노산은 D 또는 L 광학 구조일 수 있다. 20종의 단백질성 아미노산 각각의 생합성 및 분해 경로의 특징은 원핵세포 및 진핵세포 둘다에서 잘 규명되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition, p. 578-590 (1988)] 참조). 생합성의 복잡성으로 인해 음식물에 의해 공급되어야 하기 때문에 그렇게 불리는 "필수" 아미노산 (히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판 및 발린)은 단순한 생합성 경로에 의해 나머지 11종의 "비필수" 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르테이트, 시스테인, 글루타메이트, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신)으로 전환된다. 고등 동물은 필수 아미노산 중 일부를 합성할 수 있지만, 정상적인 단백질 합성이 일어나기 위해서는 상기 필수 아미노산은 음식물로부터 공급되어야 한다.

단백질 생합성에서의 아미노산의 기능 이외에, 이들 아미노산은 그 자체가 흥미로운 화학물질이고, 다수의 아미노산이 식품, 사료, 화학물질, 화장품, 농업 및 제약 산업에 다양하게 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 리신은 인간 뿐만 아니라 가금 및 돼지와 같은 단위 (monogastric) 동물의 영양에 있어서도 중요한 아미노산이다. 글루타메이트는 향미제 첨가물 (모노소듐 글루타메이트, MSG)로서 가장 흔히 사용되고, 아스파르테이트, 페닐알라닌, 글리신 및 시트테인도 식품 산업 전반에 걸쳐 사용된다. 글리신, L-메티오닌 및 트립토판은 모두 제약 산업에 사용된다. 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 히스티딘, 아르기닌, 프롤린, 세린 및 알라닌은 제약 및 화장품 산업에 사용된다. 트레오닌, 트립토판 및 D/L-메티오닌은 광범위하게 사용되는 사료 첨가제이다 (문헌 [Leuchtenberger, W. (1996) Amino acid - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al. (editors) Biotechnology Vol. 6, Chapter 14a, VCH: Weinheim] 참조). 또한, 이들 아미노산은 합성 아미노산 및 단백질, 예를 들어, N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸-L-시스테인, (S)-5-히드록시트립토판, 및 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97, VCH: Weinheim, 1985]에 기재된 다른 것의 합성을 위한 전구체로 적합하다는 것이 밝혀졌다.

이들 천연 아미노산을 생산할 수 있는 유기체, 예를 들어, 세균에서의 이들 천연 아미노산의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (세균 아미노산 생합성 및 그의 조절에 대한 자세한 것은 문헌 [Umbarger, H. E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 533-606] 참조). 글루타메이트는 시트르산 회로의 중간 산물인 α-케토글루타레이트의 환원 아미노화에 의해 합성된다. 글루타민, 프롤린 및 아르기닌이 각각 글루타메이트로부터 연속적으로 생성된다. 세린의 생합성은 3 단계 과정으로 일어나며, 3-포스포글리세레이트 (당분해작용의 중간 산물)에서 시작되고, 산화, 트랜스아민화 및 가수분해 단계 후 세린이 생성된다. 시스테인 및 글리신은 각각 세린으로부터 생성되는데, 시스테인은 호모시스테인과 세린의 축합에 의해 생성되며, 글리신은 세린 트랜스히드록시메틸라제에 의해 촉매되는 반응에서 측쇄 β-탄소 원자가 테트라히드로폴레이트로 전혼되어 생성된다. 페닐알라닌 및 티로신은 당분해작용 및 펜토스 포스페이트 경로의 전구체, 및 프레페네이트의 합성 후 최종 두 단계에서만 다른 9 단계 생합성 경로의 에리트로스 4-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트로부터 합성된다. 또한, 트립토판은 이들 두 출발 분자로부터 생성되지만, 이는 11 단계 경로에 의한 합성이다. 티로신은 또한 페닐알라닌 히드록실라제에 의해 촉매되는 반응에서 페닐알라닌으로부터 제조될 수도 있다. 알라닌, 발린 및 류신은 당분해작용의 최종 생성물인 피루베이트로부터 유래된 각각의 생합성 산물이다. 아스파르테이트는 시트르산 회로의 중간 산물인 옥살로아세테이트로부터 형성된다. 아스파라긴, 메티오닌, 트레오닌 및 리신은 각각 아스파르테이트의 전환에 의해 생성된다. 이소류신은 트레오닌으로부터 형성된다. 히스티딘은 복잡한 9 단계 경로에서 활성화된 당인 5-포스포리보실-1-피로포스페이트로부터 형성된다.

세포에 의한 단백질 합성에 필요한 양을 초과하는 양의 아미노산은 저장될 수 없고, 그 대신에 분해되어 세포의 주요 대사 경로에 대한 중간 산물로 제공된다 (자세한 것은 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition Chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; pp. 495-516 (1988)] 참조). 세포가 불필요한 아미노산을 유용한 대사 중간 산물로 전환시킬 수 있다 하더라도, 아미노산 생성은 이들 아미노산의 합성에 필요한 에너지, 전구체 분자, 및 효소를 고려할 때 손실이 크다. 따라서, 특정 아미노산의 존재가 그 자신의 생성을 감속하거나 완전히 중지시키는 피드백 억제에 의해 아미노산의 생합성이 조절된다는 것은 놀라운 일이 아니다 (아미노산 생합성 경로의 피드백 기작에 대한 자세한 것은 문헌 [Stryer, L. Biochemistry, 3^rd edition Chatper 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)] 참조). 따라서, 특정 아미노산의 산출량은 상기 세포에 존재하는 아미노산의 양에 의해 제한된다.

B. 비타민, 보조인자 및 영양제의 대사 및 용도

비타민, 보조인자 및 영양제는 세균과 같은 다른 유기체에 의해 쉽게 합성되지만, 고등 동물이 합성 능력을 상실하여 섭취해야 하는 분자의 또 다른 군을 구성한다. 이들 분자는 그 자체가 생활성 물질이거나, 다수의 대사 경로에서 전자 운반체 또는 중간 산물로 작용할 수 있는 생활성 물질의 전구체이다. 이들의 영양적 가치 이외에, 이들 화합물은 색소, 항산화제 및 촉매로서, 또는 다른 과정의 보조제로서 상당한 산업적 가치를 갖는다 (이들 화합물의 구조, 활성 및 산업적 용도에 대한 자세한 것은 예를 들어, 문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996] 참조). 용어 "비타민"은 당업계에 공지되어 있고, 유기체의 정상적인 기능을 위해서는 필요하지만 유기체가 스스로 합성할 수 없는 영양분을 포함한다. 비타민 군은 보조인자 및 영양제 화합물도 포함할 수 있다. 용어 "보조인자"는 정상적인 효소 활성이 나타나는 데 필요한 비단백질성 화합물을 포함한다. 이들 화합물은 유기성 또는 무기성일 수 있고, 본 발명의 보조인자 분자는 바람직하게는 유기성이다. 용어 "영양제"는 식물 및 동물, 특히 인간에게 건강상 유익한 식품 첨가제를 포함한다. 이러한 분자의 예로는 비타민, 항산화제 및 특정 지질 (예를 들어, 폴리불포화 지방산)이 있다.

이들을 생성할 수 있는 세균과 같은 유기체에서 일어나는 이들 분자의 생합성의 특징은 잘 규명되어 있다 (문헌 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins" Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A. S., Niki, E. & Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health, and Disease "Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia, and the Society for free Radical Research - Asia, held on Sept. 1-3, 1994, in Penang, Malaysia, AOCS Press: Champaign, IL X, 374 S] 참조).

티아민 (비타민 B₁)은 피리미딘 및 티아졸 단위의 화학적 커플링에 의해 형성된다. 리보플라빈 (비타민 B₂)은 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP) 및 리보스-5'-포스페이트로부터 합성된다. 그 다음, 리보플라빈은 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMN) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)의 합성에 사용된다. 총칭하여 "비타민 B6"로 불리는 화합물 족 (예를 들어, 피리독신, 피리독사민, 피리독살-5'-포스페이트 및 시판되는 피리독신 히드로클로라이드)은 모두 통상적인 구조 단위인 5-히드록시-6-메틸피리딘의 유도체이다. 판토테네이트 (판토텐산, (R)-(+)-N-(2,4-디히드록시-3,3-디메틸-1-옥소부틸)-β-알라닌)은 화학적인 합성 또는 발효에 의해 제조될 수 있다. 판토테네이트의 생합성의 최종 단계는 β-알라닌과 판토산의 ATP-유도 축합으로 구성된다. 판토산으로 전환하는 생합성 단계, β-알라닌으로 전환하는 생합성 단계 및 판토텐산으로의 축합에 관여하는 효소는 공지되어 있다. 판토테네이트의 대사적 활성 형태는 조효소 A인데, 이의 생합성은 5 단계 효소 반응으로 진행된다. 판토테네이트, 피리독살 5'-포스페이트, 시스테인 및 ATP는 조효소 A의 전구체이다. 이들 효소는 판토테네이트의 형성을 촉매할 뿐만 아니라 (R)-판토산, (R)-판토락톤, (R)-판테놀 (프로비타민 B₅), 판테테인 (및 그의 유도체) 및 조효소 A의 형성도 촉매한다.

미생물에서 전구체 분자인 피멜로일-CoA로부터 바이오틴이 생합성되는 것은 자세히 연구되어 있고 관련된 몇 가지 유전자가 확인되어 있다. 상응하는 다수의 단백질이 Fe 클러스터 합성에도 관여하고 이들 단백질은 nifS 단백질의 군에 속하는 것으로 밝혀져 있다. 리포산은 옥타노산으로부터 유도되고, 에너지 대사에서 조효소로 작용하는데, 이는 피루베이트 탈수소효소 복합체 및 α-케토글루타레이트 탈수소효소 복합체의 구성 요소이다. 폴레이트는 모두 엽산으로부터 유도되는 물질의 군이고, 엽산은 L-글루탐산, p-아미노벤조산 및 6-메틸프테린으로부터 유도된다. 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP), L-글루탐산 및 p-아미노벤조산의 생체전환의 대사 중간 산물로부터 출발하는, 엽산 및 그의 유도체의 생합성은 특정 미생물에서 상세히 연구되어 있다.

코리노이드 (예를 들어, 코발라민 및 특히 비타민 B₁₂) 및 포르피린은 테트라피롤 고리계에 의해 구별되는 화학물질의 군에 속한다. 비타민 B₁₂의 생합성은 너무 복잡해서 그 특징이 완전히 규명되어 있지는 않지만, 관련된 다수의 효소 및 기질이 현재 공지되어 있다. 니코틴산 (니코티네이트) 및 니코틴아미드는 "니아신"으로도 불리는 피리딘 유도체이다. 니아신은 중요한 조효소인 NAD (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드), NADP (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트) 및 그들의 환원형의 전구체이다.

산업적 규모에서 이들 화합물의 생산은 이들 화학물질 중 일부, 예를 들어, 리보플라빈, 비타민 B₆, 판토테네이트 및 바이오틴이 미생물의 대규모 배양에 의해서도 생산되지만, 세포와 무관한 화학 합성에 주로 의존한다. 비타민 B₁₂만이 합성의 복잡성 때문에 발효에 의해서만 생성된다. 시험관내 방법은 재료 및 시간, 종종 많은 비용의 상당한 투입을 요구한다.

C. 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드의 대사 및 용도

퓨린 및 피리미딘 대사 유전자 및 그의 상응하는 단백질은 종양 질환 및 바이러스 감염의 치료에 중요한 표적이다. 용어 "퓨린" 또는 "피리미딘"은 핵산, 조효소 및 뉴클레오티드의 일부를 형성하는 질소 함유 염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오티드"는 질소 함유 염기, 오탄당 (RNA의 경우, 상기 당은 리보스이고; DNA의 경우, 상기 당은 D-데옥시리보스임) 및 인산을 포함하는, 핵산 분자의 기본 구조 단위를 포괄한다. 용어 "뉴클레오시드"는 뉴클레오티드의 전구체로 작용하지만 뉴클레오티드에 반해 인산 단위를 갖지 않는 분자를 포함한다. 이들 분자의 생합성, 또는 핵산 분자를 형성하기 위한 이들 분자의 동원을 억제함으로써, RNA 및 DNA 합성을 억제하는 것이 가능하고, 암세포에 표적화시키는 방식으로 상기 활성을 억제함으로써 종양 세포의 분열 및 복제 능력을 억제할 수 있다.

또한, 핵산 분자를 형성하지 않지만 에너지 저장물 (즉, AMP) 또는 조효소 (즉, FAD 및 NAD)로 작용하는 뉴클레오티드도 있다.

이들 화학물질이 퓨린 및(또는) 피리미딘 대사에 영향을 주면서 상기 의학적 증상에 사용될 수 있다는 것은 몇 가지 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Christopherson, R. I. and Lyons, S. D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10: 505-548] 참조). 퓨린 및 피리미딘 대사에 관여하는 효소의 연구는 예를 들어, 면역억제제 또는 항증식제로 사용할 수 있는 신약의 개발에 집중되어 있다 (문헌 [Smith, J. L., "Enzymes in Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol. 5 (1995) 752-757; [Simmonds, H. A., Biochem Soc. Transact. 23 (1995) 877-902] 참조). 그러나, 퓨린 및 피리미딘 염기, 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 다양한 정밀화학물질 (예를 들어, 티아민, S-아데노실메티오닌, 폴레이트 또는 리보플라빈)의 생합성에 있어서 중간 산물로서, 그리고 세포를 위한 에너지 운반체 (예를 들어, ATP 또는 GTP), 그리고 화학물질 그 자체를 위한 에너지 운반체로서의 다른 가능한 용도, 및 통상적으로 향 증진제로 사용되는 화학물질 (예를 들어, IMP 또는 GMP) 자체를 위한 용도 또는 많은 의학 용도를 갖는다 (예를 들어, 문헌 [Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology" Vol. 6, Rehm et al., editors VCH: Weinheim, pp. 561-612] 참조). 또한, 퓨린, 피리미딘, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대사에 관여하는 효소를 표적으로 사용하여 살진균제, 제초제 및 살충제를 비롯한, 농작물 보호용 화학물질을 개발하는 연구가 증가하고 있다.

세균에 있어서 이들 화합물의 대사의 특징은 규명되어 있다 (예를 들어, 자세한 것에 대해서는 문헌 [Zalkin, H. and Dixon, J. E. (1992) "De novo purine nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Vol. 42, Academic Press:, pp. 259-287; 및 Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleosides"; Chapter 8 in: Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York] 참조). 집중적인 연구의 대상인 퓨린 대사는 세포의 정상적인 기능에 필수적이다. 고등 동물의 손상된 퓨린 대사는 예를 들어 통풍과 같은 심각한 질환을 초래할 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드는 뉴클레오티드로 사용되는 트리포스페이트 형태가 용이하게 제조되는 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP) 또는 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP)를 생성시키는 중간체 화합물인 이노신-5'-포스페이트 (IMP)를 통해 다수의 단계에 의해 리보스-5-포스페이트로부터 합성된다. 이들 화합물은 또한 에너지 저장물로도 사용되므로, 그의 분해는 세포에서 다수의 상이한 생합성 과정을 위한 에너지를 공급한다. 피리미딘 생합성은 리보스 5-포스페이트로부터의 유리딘 5'-모노포스페이트 (UMP)의 형성을 통해 일어난다. 그 다음, UMP가 시티딘 5'-트리포스페이트 (CTP)로 전환된다. 모든 뉴클레오티드의 데옥시 형태는 뉴클레오티드의 디포스페이트 리보스 형태가 뉴클레오티드의 디포스페이트 데옥시리보스 형태로 되는 1 단계 환원 반응에서 제조된다. 인산화 후, 이들 분자는 DNA 합성에 참여할 수 있다.

D. 트레할로스의 대사 및 용도

트레할로스는 α,α-1,1 결합에 의해 함께 결합된 두 가지 글루코스 분자로 구성된다. 트레할로스는 통상적으로 감미료, 건조 또는 동결 식품용 첨가제로서 식품 산업, 및 음료 산업에 사용된다. 그러나, 이는 또한 제약, 화장품 및 생물공학 산업에도 사용된다 (예를 들어, Nishimoto et al., (1998) 미국 특허 제 5,759,610호; 문헌 [Singer, M. A. and Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467]; [Paiva, C.L.A. and Panek, A. D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314]; 및 [Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102] 참조). 트레할로스는 다수의 미생물로부터 효소에 의해 생성되고 주위 배지내로 자연적으로 방출되는데, 이는 당업계에 공지된 방법에 의해 상기 배지로부터 단리할 수 있다.

II. 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템

세포가 배양물에서 생장하고 급속하게 분열하는 능력은 상기 세포가 글루코스 및 다른 당과 같은 고에너지 분자를 유입하고 사용할 수 있는 정도에 높은 정도로 의존한다. 상이한 수송 단백질은 서로 다른 탄소원을 세포 내에 수송하기 위해 존재하는데, 예를 들어 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스 또는 라피노스와 같은 당 수송 단백질, 및 전문 또는 셀룰로스 분해물의 수송 단백질이 있다. 다른 수송계는 알코올 (예를 들어, 메탄올 또는 에탄올), 알칸, 지방산, 및 아세트산 또는 젖산과 같은 유기산을 유입하기 위해 작용한다. 세균에서, 당은 다양한 기작에 의해 세포막을 통해 세포 내로 수송될 수 있다. 당 양성자 심포트 (symport) 외에, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)은 당의 유입을 위한 가장 통상적인 방법이다. 상기 시스템은 당과 헥시톨의 (인산화와 동시에 일어나는) 이동을 촉매할 뿐만 아니라, 탄수화물의 이용가능성의 기능으로서의 세포 대사를 조절하기도 한다. 이들 PTS 시스템은 세균에 편재하지만, 고세균이나 진핵세포에서는 발견되지 않는 것이다. 기능적으로, PTS 시스템은 두 개의 세포질 단백질인 엔자임 I (Enzyme I) 및 HPr과 다수의 당 특이적 내재성 및 외재성 막수송 복합체 (이들은 각 경우에 특이성을 갖는 당을 윗첨자로서 함께 기입한 '엔자임 II (Enzyme II)'로 지칭되며, 예를 들어 '엔자임 II^Glu'는 글루코스 결합 엔자임 II 복합체임)를 포함한다. 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불루스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스 등과 같은 단당류, 이당류 또는 다당류에 특이적인 엔자임 II가 공지되어 있다. 엔자임 I은 포스포에놀피루베이트 (PEP)로부터 인산기 운반체 단백질인 HPr로 인산기를 전달한다. 그후 HPr은 상기 인산기를 다양한 엔자임 II 수송 복합체로 전달한다. 엔자임 I과 HPr의 아미노산 서열은 모든 세균에서 매우 유사하지만, PTS 수송체 서열은 이들과는 구조적으로 연관성이 없는 족으로 분류될 수 있다. 이들 유전자의 개수와 상동성도 세균마다 다양하다. 대장균 게놈은 38개의 상이한 PTS 단백질을 코딩하며, 그중 33개는 22개의 다른 수송체에 속한 서브유닛이다. 엠. 게니탈리움 (M. genitalium) 게놈은 엔자임 I과 HPr의 유전자를 각각 하나씩 함유하며, 단지 2개의 PTS 수송체 유전자를 함유하고 있다. 티. 팔라듐 (T. palladium) 및 씨. 트라코마티스 (C. trachomatis)의 게놈은 엔자임 I 및 HPr 유사 단백질의 유전자를 함유하지만, PTS 수송체의 유전자는 없다.

모든 PTS 수송체는 세 개의 기능 단위인 IIA, IIB 및 IIC로 구성되어 있으며, 이들은 복합체에서 단백질의 서브유닛 (예를 들어, IIA^GlcIICB^Glc)으로서, 또는 단일 폴리펩티드쇄의 도메인 (예를 들어, IICBA^GlcNAc)으로서 나타난다. IIA 및 IIB는 HPr로부터 수송된 당까지 인산기를 연속적으로 전달한다. IIC는 당 결합 부위를 함유하며 내막을 6 또는 8회 횡단한다. 당의 이동은 IIB 도메인의 일시적인 인산화와 함께 이루어진다. 엔자임 I, HPr 및 IIA는 히스티딘 잔기에서 인산화가 되는 반면, IIB 서브유닛은 관련된 수송체에 따라 시스테인 또는 히스티딘 잔기에서 인산화된다. 유입되는 당이 인산화되면 상기 당이 세포막을 통해 세포외 배지로 다시 확산되어 나가는 것을 방지할 수 있는 이점이 있는데, 이는 전하를 띤 인산기가 막의 소수성 중심을 용이하게 횡단할 수 없기 때문이다.

당의 능동 수송 기능 이외에도, 일부 PTS 단백질은 세포내 신호 전달에서 역할을 담당하고 있다. 이들 서브유닛은 그의 표적을 다른 자리 입체성 (allosteric)에 의해 또는 인산화에 의해 조절한다. 그의 조절 활성은 그의 인산화 정도 (즉, 비인산화 형태 대 인산화 형태의 비율)에 따라 다양하고, 당의존적 탈인산화 및 포스포에놀피루베이트 의존적 재인산화의 비율에 따라 다양하다. 대장균에서 PTS 단백질에 의한 이러한 세포내 조절의 예로는 탈인산화된 IIA^Glc에 의한 글리세롤 키나제의 억제 작용과 상기 단백질의 인산화된 형태에 의한 아데닐레이트 시클라제의 활성화를 들 수 있다. 이들 미생물 내에서 일부 수송체의 HPr 및 IIB 도메인은 전사 항종결제의 가역적인 인산화에 의해 유전자 발현을 조절한다. 그람 양성 세균에서, HPr의 활성은 HPr 특이적 세린 키나제 및 포스파타제에 의해 조절된다. 예를 들어, 세린 46번에 인산화된 HPr은 전사 리프레서 CcpA의 보조리프레서로서 작용한다. 마지막으로, 비인산화 엔자임 I은 세균의 화학 주성 기관 중 센서 키나제인 CheA를 저해하며, 당 결합과 세균의 수송계와 세균의 이동을 관장하는 계가 직접적으로 연계되도록 한다 (문헌 [Sonenshein, A.L. et al.,editors Bacillus subtilis und andere gram positive Bakterien. ASM: Washington, D.C.]; [Neidhard, F.C., et al., editors (1996) Escherichia coli und Salmonella. ASM Press Washington, D.C.], [Lengeler et al., (1999) Biology of Prokaryotes. Section II, pp.68-87, Thieme Verlag, Stuttgart] 참조).

III. 발명의 요소 및 방법

본 발명은, 적어도 부분적으로, 고에너지 탄소 분자 (예를 들어, 글루코스, 수크로스 및 프룩토스)의 씨.글루타미쿰 내로의 유입에 관여하고, 또한 이들 미생물의 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있는, 본 명세서에서 PTS 핵산 및 PTS 단백질 분자로 지칭되는 신규 분자의 발견을 기초로 한다. 한 실시양태에서, 상기 PTS 분자는 고에너지 탄소 분자를 세포 내로 유입하며, 상기 고에너지 탄소 분자의 분해에 의해 발생한 에너지는 에너지론적으로는 일어나기 힘든 생화학적 반응을 일으키는데 사용된다. 그 분해 산물은 다수의 다른 대사 경로를 위한 중간체 또는 전구체로서 사용될 수 있다. 또다른 실시양태에서, PTS 분자는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여하며, PTS 분자의 변형된 형태 (예를 들어, 인산화된 PTS 단백질)가 하나 이상의 세포 과정을 조절하는 신호 전달 캐스케이드에 참여할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PTS 분자의 활성은 상기 유기체에 의한 목적하는 정밀화학물질의 생산에 영향을 준다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PTS 분자는 씨. 글루타미쿰으로부터 하나 이상의 정밀화학물질에 대한 수율, 생산량 및 생산 효율이 또한 조절되도록 활성이 조절된다.

용어 "PTS 단백질" 또는 "PTS 폴리펩티드"는 하나 이상의 고에너지 탄소 화합물 (예를 들어, 프룩토스, 만노스, 수크로스, 글루코스, 라피노스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 말토스 및 리불로스와 같은 단당류, 이당류 또는 다당류)이 세포외 배지로부터 세포 내로 유입되는데 관여하는 단백질을 포함한다. 또한 이들 PTS 단백질은 예를 들어 다양한 당이 세포내로 유입되게 하는 것과 같은, 그러나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있다. PTS 단백질의 예로는 표 1 및 첨부문서 A에 열거된 PTS 유전자에 의해 코딩되는 것들을 들 수 있다. PTS 시스템에 관한 일반적인 참고문헌은 문헌 [Stryer, L., (1988) Biochemistry. Chapter 37: "Membrane Transport", W.H. Freeman: New York, pp. 959-961], [Darnell, J. et al. (1990) Molecular Cell Biology, Scientific American Books: New York, pp. 552-553] 및 [Michal, G., editor (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Chapter 15 "Special Bacterial Metabolism"]을 참조한다. 용어 "PTS 유전자" 및 "PTS 핵산 서열"은 코딩 영역 및 상응하는 비번역 5' 및 3' 서열 영역을 포함하는 PTS 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. PTS 유전자의 예로는 표 1에 열거된 것을 들 수 있다. 용어 "생산량" 또는 "생산성"은 당업계에 공지되어 있으며, 발효 산물의 (예를 들어, 주어진 시간 간격과 주어진 발효 부피 내에서 생산된 (예를 들어, 단위 리터당 단위 시간 당 생산량 kg) 목적하는 정밀화학물질의) 농도를 포함한다. 용어 "생산 효율"은 특정 생산량 수준에 이르기 위해 세포에 의해 요구되는 시간 (예를 들어, 정밀화학물질의 특정 산출 속도에 이르기 위해 세포에 의해 요구되는 시간)을 포함한다. 용어 "수율" 또는 "산물/탄소 수율"은 당업계에 공지되어 있으며, 탄소원이 산물 (즉, 정밀화학물질)로 전환되는 효율을 포함한다. 이는 예를 들어, 통상적으로, 단위 kg의 탄소원 당 산물의 kg으로 표현된다. 화합물의 수율 또는 생산량이 증가하면 주어진 시간에 걸쳐 특정 배양물의 양에서 상기 화합물의 수득된 분자의 양 또는 적합한 수득된 분자의 양은 증가한다. 용어 "생합성" 또는 "생합성 경로"는 당업계에서 공지되어 있으며, 중간체로부터의 화합물, 바람직하게는 유기 화합물이 예를 들어 다단계 프로세스 또는 고도로 조절되는 프로세스에 따라 세포에 의해 합성되는 것을 포함한다. 용어 "분해" 또는 "분해 경로"는 당업계에 공지되어 있으며, 화합물, 바람직하게는 유기 화합물이 분해 산물 (보다 일반적인 용어로, 더 작거나 덜 복잡한 분자)로 예를 들어 다단계 프로세스 또는 고도로 조절되는 프로세스에 따라 세포에 의해 분해되는 것을 포함한다. 용어 "대사"는 당업계에 공지되어 있으며, 유기체에서 일어나는 생화학 반응 전체를 포함한다. 그러면, 특정 화합물의 대사 (예를 들어, 글리신 등의 아미노산의 대사)는 상기 화합물과 관련되는 세포의 모든 생합성, 변형, 및 분해 경로가 포함된다. 용어 "수송" 또는 "유입"은 당업계에 공지되어 있으며, 하나 이상의 분자가 다른 식으로는 통과할 수 없는 세포막을 통해 촉진 이동을 하는 것을 포함한다.

또다른 실시양태에서, 본 발명의 PTS 분자는 씨. 글루타미쿰과 같은 미생물에서 정밀화학물질과 같은 목적하는 분자의 생산을 조절할 수 있다. 유전자 재조합 기술을 사용하여, 본 발명의 하나 이상의 PTS 단백질을 기능이 조절되도록 조작할 수 있다. 예를 들어, PTS가 매개하는 글루코스 유입에 관여하는 단백질은 이것이 최적 활성을 갖도록 변형될 수 있고, 따라서 글루코스의 유입을 위한 PTS 시스템은 세포 내로 보다 많은 양의 글루코스를 수송할 수 있다. 글루코스 분자는 정밀화학물질의 생합성과 같은 에너지론적으로는 일어나기 힘든 생화학 반응을 일으키는데 사용될 뿐만 아니라, 다수의 정밀화학물질의 생합성 경로에서 전구체 및 중간체로서도 사용된다 (예를 들어, 세린은 3-포스포글리세레이트로부터 합성된다). 임의의 경우에, 그러한 생산이 일어나는데 이용할 수 있는 에너지를 증가시키거나 그러한 생산이 일어나는데 필요한 화합물의 이용가능성을 증가시킴으로써 임의의 목적하는 이들 정밀화학물질의 전반적인 수율 또는 생산 속도를 증가시킬 수 있다.

더욱이, 많은 PTS 단백질이 탄소원의 이용 가능성을 유지시킴으로써 세포 대사 및 당 유입을 조절하는 세포내 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 프룩토스 1,6-비스포스페이트 (당분해작용동안 생성되는 화합물)의 세포내 수준이 증가하면 HPr의 세린 잔기에서 인산화가 일어나서 이 단백질은 PTS 당 수송 과정에서 인산화기 공여체로서 작용하지 못하게 되어, 그에 의해 추가의 당 유입이 차단되는 것이 공지되어 있다. HPr의 세린 잔기가 인산화될 수 없도록 HPr이 돌연변이되면, HPr을 구조적으로 활성화시키고, 따라서 세포내 당 수송을 증가시켜 세포내 에너지 저장물 및 하나 이상의 목적하는 정밀화학물질의 생합성을 위한 중간체/전구체를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 핵산 서열의 제조를 위한 적합한 출발점은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 명칭 ATCC 13032로 입수할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 게놈이다.

본 발명의 핵산 서열은 통상의 방법을 이용하여, 표 1에 나타난 변이를 통해 이들 핵산 서열로부터 제조할 수 있다.

본 발명의 PTS 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위 또는 단편은 씨. 글루타미쿰 내로 글루코스와 같은 고에너지 탄소-함유 분자를 수송하거나, 또는 상기 유기체에서 세포내 신호 전달에 관여할 수 있거나, 또는 표 1에 기재된 하나 이상의 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 다양한 측면은 하기 소단락에 보다 상세히 기재되어 있다.

A. 단리된 핵산 분자

본 발명의 한 측면은 PTS 폴리펩티드 또는 그의 생물학적 활성 부위를 코딩하는 단리된 핵산 분자, 및 PTS 코딩 핵산 (예를 들어, PTS DNA)을 확인 또는 증폭하기 위한 혼성화 프로브 또는 프라이머로 사용하기에 충분한 핵산 단편에 관한 것이다. 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) RNA 분자 (예를 들어, mRNA), 그리고 뉴클레오티드 유사체를 사용하여 생성되는 DNA 또는 RNA 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 이 용어는 코딩 유전자 영역의 3' 및 5' 말단에 위치한 비번역 서열, 코딩 영역의 5' 말단으로부터 상류의 약 100개 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 코딩 유전자 영역의 3' 말단으로부터 하류의 약 20개 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. "단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 제거되는 것이다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 상기 핵산이 유래하는 생물의 게놈 DNA에서 본래 핵산의 양측면에 있는 서열 (예를 들어, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)을 갖지 않는다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 단리된 PTS 핵산 분자는 상기 핵산이 유래하는 세포 (예를 들어, 씨. 글루타미쿰 세포)의 게놈 DNA에서 본래 핵산 분자의 양측면에 있는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 이하의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 게다가, DNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 또다른 세포 물질 또는 배양 배지를, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 함유하지 않는다.

본 발명의 핵산 분자, 예를 들어, 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 부위는 표준 분자 생물학 기술 및 본 명세서에 제공되는 서열 정보를 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 첨부문서 A의 전체 서열 또는 그의 부위를 혼성화 프로브로 사용하고, 표준 혼성화 기술 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기재된 바와 같은 것)을 사용함으로써 씨. 글루타미쿰 라이브러리로부터 씨. 글루타미쿰 PTS cDNA를 단리할 수 있다. 더욱기, 상기 서열을 기초로 하여 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 첨부문서 A로부터의 전체 서열 또는 그의 부위를 포함하는 핵산 분자를 단리할 수 있다 (예를 들어, 첨부문서 A의 상기 동일한 서열을 기초로 제조된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 통해 첨부문서 A로부터의 전체 서열 또는 그의 부위를 포함하는 핵산 분자를 단리할 수 있다). 예를 들어, mRNA는 정상 내피세포로부터 (예를 들어, 문헌 [Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18:5294-5299]의 구아니디늄 티오시아네이트 추출 방법에 의해) 단리할 수 있고, cDNA는 역전사효소 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 베네스다 소재, 지브코(Gibco)/BRL로부터 시판되는 몰로네이 (Moloney)-MLV 역전사효소; 또는 미국 플로리다주 페테르스버그 소재, 세이까가꾸 아메리카, 인크. (Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL)로부터 시판되는 AMV 역전사효소)를 사용하여 제조할 수 있다. 중합효소 연쇄반응 증폭을 위한 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머는 첨부문서 A에 나타난 임의의 서열을 기초로 하여 제조할 수 있다. 본 발명의 핵산은 PCR 표준 증폭 기술에 따라 cDNA 또는, 별법으로, 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 방식으로 증폭된 핵산을 적합한 벡터 내에 클로닝하고 DNA 서열 분석에 의해 특성화할 수 있다. PTS 뉴클레오티드 서열에 상응하는 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 사용한 표준 합성 기술에 의해 제조할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 첨부문서 A에 열거된 핵산 서열 중 하나를 포함한다.

또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 핵산 분자는 첨부문서 A에 나타난 임의의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부위와 상보적인 해산 분자를 포함하며, 상기 핵산 분자는 이것이 첨부문서 A에 기재된 임의의 서열과 혼성화되어 안정한 듀플렉스가 되도록 첨부문서 A에 나타난 임의의 뉴클레오티드 서열과 충분히 상보적이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 단백질 또는 그의 부위가 고에너지 탄소 분자 (예를 들어 글루코스)를 씨. 글루타미쿰 내로 수송하고 또한 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 참여할 수 있도록 첨부문서 B의 아미노산 서열과 충분히 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 그의 부위를 코딩한다. 본 명세서에 사용된 용어 "충분히 상동성인"은 단백질 또는 그의 부위가 글루코스와 같은 고에너지 탄소 분자를 씨. 글루타미쿰 내로 수송하고, 상기 미생물의 세포내 신호 전달에 참여할 수 있도록 첨부문서 B의 아미노산 서열에 비해 동일하거나 등가의 아미노산 잔기 (예를 들어 첨부문서 B의 임의의 서열의 아미노산 잔기와 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기)의 최소 수를 그 아미노산 서열이 갖는 단백질 또는 그의 부위에 관한 것이다. 이들 대사 경로의 단백질 성분은 본 명세서에 기재된 바와 같이 글루코스와 같은 고에너지 탄소 함유 분자를 씨. 글루타미쿰 내로 수송하고, 상기 미생물의 세포내 신호 전달에 참여할 수 있다. 이들 활성의 예는 또한 본 명세서에 기재되어 있다. 즉, "PTS 단백질의 기능"은 포스포에놀피루베이트에 기재한 하나 이상의 당 수송 경로의 완전한 기능 및(또는) 조절에 관한 것이다. 표 1에는 PTS 단백질 활성의 예를 열거되어 있다.

본 발명의 PTS 핵산 분자에 의해 코딩되는 단백질의 부위는 바람직하게는 임의의 PTS 단백질의 생물학적 활성 부위이다. 본 명세서에 사용된 용어 "PTS 단백질의 생물학적 활성 부위"는 글루코스와 같은 고에너지 탄소 함유 분자를 씨. 글루타미쿰 내로 수송하거나 상기 미생물의 세포내 신호 전달에 참여할 수 있는, 또는 표 1에 나타난 활성을 갖는 부위, 예를 들어 PTS 단백질의 도메인 또는 모티프를 포함하는 것을 의도한다. PTS 단백질 또는 그의 생물학적 활성 부위가 글루코스와 같은 고에너지 탄소 함유 분자의 씨. 글루타미쿰 내로의 수송 또는 상기 미생물의 세포내 신호 전달에 관여할 수 있는지를 측정하기 위해서, 효소 활성 분석을 수행할 수 있다. 상기 분석 방법은 실시예의 실시예 8에 상세히 기재된 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다.

개체군 내에 존재할 수 있는 PTS 서열의 자연 발생적인 변이체 이외에도, 당업자라면 또한 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열 내의 돌연변이에 의해, 상기 PTS 단백질의 기능성을 손상시키지 않고, 코딩된 PTS 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 일으킴으로써 변화를 도입할 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 첨부문서 A의 서열에서 뉴클레오티드를 치환하여 "비필수" 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 일으킬 수 있다. "비필수 아미노산" 잔기가 상기 PTS 단백질의 활성을 변화시키지 않으면서 임의의 PTS 단백질 (첨부문서 B)의 야생형 서열에서 변화될 수 있는 반면, "필수" 아미노산 잔기는 PTS 단백질 활성에 요구된다. 그러나, 다른 아미노산 잔기 (예를 들어, PTS 활성을 갖는 도메인에서 보존되지 않거나 또는 반보존된 아미노산 잔기)는 활성에 필수적이지 않을 수도 있으며, 따라서 PTS 활성을 변화시키지 않으면서도 변화시킬 수 있다.

첨부문서 B의 단백질 서열과 상동성인 PTS 단백질을 코딩하는 단리된 핵산 분자는 코딩되는 단백질 내에 하나 이상의 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 도입되도록 첨부문서 A의 뉴클레오티드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 부가 또는 결실을 도입시킴으로써 생성시킬 수 있다. 부위 지시적 돌연변이유발법 및 PCR 매개 돌연변이유발법과 같은 표준 기술에 의해 첨부문서 A의 임의의 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 도입할 수 있다. 바람직하게는, 예상되는 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 보존된 아미노산 치환을 도입할 수 있다. "보존된 아미노산 치환"이란 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 대체하는 것을 말한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 족은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 족에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서, PTS 단백질에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 족의 또다른 아미노산 잔기로 치환된다. 별법으로, 또다른 실시양태에서, 돌연변이는, 예를 들어, 포화 돌연변이유발법에 의해 PTS 코딩 서열의 전부 또는 일부에 걸쳐 무작위적으로 도입될 수 있으며, PTS 활성을 보유하는 돌연변이체를 확인하기 위해, 얻어진 돌연변이체를 본 명세서에 기재된 PTS 활성에 대하여 스크리닝할 수 있다. 첨부문서 A의 임의의 서열을 돌연변이유발시킨 후, 코딩된 단백질을 재조합적으로 발현시킬 수 있고, 예를 들어 본 명세서에 기재된 분석법을 이용하여 단백질의 활성을 측정할 수 있다 (실시예 8을 참조).

B. 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포

본 발명의 또다른 측면은 PTS 단백질 (또는 그의 부위)을 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "벡터"는 그에 결합된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자에 관한 것이다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"란 추가의 DNA 단편이 리게이션될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 고리를 의미한다. 벡터의 또다른 유형은 바이러스 벡터이며, 이는 추가의 DNA 단편을 바이러스 게놈 내로 리게이션시킬 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 세균 복제 원점을 갖는 세균 벡터 및 포유류의 에피솜 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 포유류의 비에피솜 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 게놈 내로 삽입되고, 그에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동 가능하게 결합된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이들 벡터는 "발현 벡터"로 지칭된다. 일반적으로, DNA 재조합 기술에 사용되는 발현 벡터는 플라스미드의 형태이다. 플라스미드는 가장 일반적으로 사용되는 유형의 벡터이기 때문에, 본 명세서에서는 "플라스미드"와 "벡터"를 혼용할 수 있다. 본 발명은 유사한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결손 레트로바이러스, 아데노 바이러스 및 아데노 관련 바이러스)와 같은 다른 유형의 발현 벡터도 포함하는 것으로 의도된다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 상기 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함하며, 적합한 형태란 상기 재조합 발현 벡터가 발현용 숙주 세포를 기준으로 선택되고 (발현되는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합됨) 하나 이상의 조절 서열을 포함하고 있음을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, "작동 가능하게 결합된"이란 목적하는 뉴클레오티드 서열이 발현되하도록 상기 뉴클레오티드 서열이 조절 서열(들)에 결합된 것을 의미한다 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내 또는 벡터가 상기 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내). 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 시그널)를 포함하는 것이다. 이들 조절 서열은, 예를 들어 문헌 [Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열에는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열이 구성적으로 발현되도록 조절하는 것들, 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열이 직접 발현되도록 하는 것들이 포함된다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 정도 등과 같은 인자에 따라 다를 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본 명세서에 기재된 것과 같은 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 융합 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다 (예를 들어, PTS 단백질, PTS 단백질의 돌연변이형, 융합 단백질 등).

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서의 PTS 단백질 발현용으로 설계될 수 있다. 예를 들어, PTS 유전자는 씨. 글루타미쿰과 같은 세균 세포, 곤충 세포 (바쿨로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 및 다른 진균류 세포 (문헌 [Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8:423-488]; [van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet ＆ L.L. Lasure, Editors, pp. 396-428: Academic Press: San Diego; 및 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] 참조), 조류 세포 및 다세포 식물 세포 (문헌 [Schmidt, R. and Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefactiens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell Rep.: 583-586] 참조) 또는 포유류 세포 에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌 [Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 더 기재되어 있다. 별법으로, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 재조합 발현 벡터를 시험관 내에서 전사 및 번역할 수 있다.

원핵 세포에서 단백질을 발현시키는 것은 주로 융합 또는 비융합 단백질의 발현을 조절하는 구성적 또는 유도적 프로모터를 함유하는 벡터를 이용하여 수행한다. 융합 벡터는 그의 코딩되는 단백질에, 통상적으로는 재조합 단백질의 아미노 말단에 다수의 아미노산을 조절한다. 이들 융합 벡터는 통상적으로 세 가지 목적: 1) 재조합 단백질의 발현 증진, 2) 재조합 단백질의 가용성 증가 및 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함에 의한 재조합 단백질 정제 상의 용이함을 위한 것이다. 대개 융합 발현 벡터 내에는 융합 단위와 재조합 단백질의 접합부에 단백질 절단 부위가 도입되어 있어서, 융합 단백질을 정제한 후 융합 단위로부터 재조합 단백질을 분리하는 것이 가능하다. 이들 효소 및 그의 상응하는 인식 서열에는 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제가 포함된다.

통상적인 융합 발현 벡터에는 pGEX (파마시아 바이오텍 인크 (Pharmacia Biotech Inc); 문헌 [Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40] 참조), pMAL (미국 메사추세스주 비벌리 소재, 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs)) 및 pRIT5 (미국 뉴저지주 피스캣어웨이 소재, 파마시아 (Pharmacia))가 포함되며, 이들은 각각 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 프로테인 A (protein A)를 재조합 표적 단백질에 융합시킨다. 한 실시양태에서는 PTS 단백질의 코딩 서열을 pGEX 발현 벡터 내로 클로닝하여 N 말단 내지 C 말단에 GST-트롬빈 절단 부위-X 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 벡터를 생성한다. 상기 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 수지를 사용하는 친화도 크로마토그래피를 통해 정제할 수 있다. GST에 융합되지 않은 재조합 PTS 단백질은 트롬빈으로 융합 단백질을 절단함으로써 얻을 수 있다.

적합한 유도적 비융합 대장균 발현 벡터의 예로는 pTrc (문헌 [Amann et al., (1988) Gene 69:301-315] 참조) 및 pET 11d (문헌 [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89] 참조)를 들 수 있다. pTrc로부터 표적 유전자가 발현되는 것은 숙주의 RNA 폴리머라제에 의한 혼성 trp-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의한 것이다. pET 11d 벡터로부터 표적 유전자가 발현되는 것은 동시 발현된 바이러스 RNA 폴리머라제 (T7 gn1)에 의해 매개되는 T7-gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의한 것이다. 상기 바이러스 폴리머라제는 lacUV 5 프로모터의 전사 조절 하에 T7 gn1 유전자를 함유하는 상재 λ프로파지에 의해 숙주 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 제공된다.

재조합 단백질의 발현을 극대화하는 전략의 일환으로, 상기 재조합 단백질을 단백질 분해에 의해 절단하는 능력을 감소시킨 숙주 세균 내에서 상기 단백질을 발현시키는 것이 있다 (문헌 [Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128] 참조). 또다른 전략으로는 발현 벡터 내로 삽입되는 핵산의 핵산 서열을 변형하여 각각의 아미노산에 대한 개별 코돈이 발현을 위해 선택된 세균 (예를 들어, 씨 글루타미쿰)에 바람직하게 사용되도록 하는 것이 있다 (문헌 [Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118] 참조). 이처럼 본 발명의 핵산 서열을 변형하는 것은 DNA 합성의 표준 기술에 의해 수행될 수 있다.

또다른 실시양태에서, PTS 단백질 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)의 발현 벡터의 예로는 pYepSec1 (문헌 [Baldari, et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (문헌 [Kurjan and Herskowitz,(1982) Cell 30:933-943] 참조), pJRY88 (문헌 [Shultz et al., (1987) Gene 54:113-123] 참조) 및 pYES2 (미국 캘리포니아주 샌디애고 소재, 인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corporation))를 들 수 있다. 사상 진균류와 같은 다른 진균류용으로 적합한 벡터 및 벡터의 제조 방법으로는 문헌 [van den Hondel, C.A.M.J.J. ＆ Punt, P.J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., Editors, pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge]에 상술된 것들을 들 수 있다.

별법으로, 바쿨로바이러스 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 PTS 단백질을 곤충 세포에서 발현시킬 수 있다. 배양된 곤충 세포 (예, Sf 9 세포)에서의 단백질 발현에 이용가능한 바쿨로바이러스 벡터로는 pAc 계열 (문헌 [Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165] 참조) 및 pVL 계열 (문헌 [Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39] 참조)를 들 수 있다.

또다른 실시양태에서, 단세포 식물 세포 (예를 들어, 조류)에서 또는 고등 식물 (예, 작물과 같은 종자 식물)의 세포에서 본 발명의 PTS 단백질을 발현시킬 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 문헌 [Bekker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197]; [Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721]에 상술된 것들을 들 수 있다.

또다른 실시양태에서는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 본 발명의 핵산을 발현시킨다. 포유류 발현 벡터의 예로는 pCDM8 (문헌 [Seed, B. (1987) Nature 329:840] 참조) 및 pMT2PC (문헌 [Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195] 참조)를 들 수 있다. 포유류 세포를 사용하는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 대개 바이러스 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40으로부터 유래된 것이다. 원핵 세포 및 진핵 세포에 적합한 다른 발현계에 대해서는 문헌 [Sambrook, J., Fritsh, E.F. and Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]의 16 및 17장을 참조한다.

또다른 실시양태에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 바람직하게는 특정 세포 유형에서의 차별적인 핵산 발현이 가능하도록 한다 (예를 들어, 조직 특이적 조절 요소가 핵산을 발현시키는데 사용된다). 조직 특이적 조절 요소는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 조직 특이적 프로모터에 대한 제한되지 않는 예로는 알부민 프로모터 (간 특이적; 문헌 [Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277] 참조), 림프양 특이적 프로모터 (문헌 [Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275] 참조), 특히 T 세포 수용체의 프로모터 (문헌 [Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733] 참조) 및 이뮤노글로불린의 프로모터 (문헌 [Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740]; [Queen and Baltimore (1983) Cell 33:741-748] 참조), 뉴런 특이적 프로모터 (예를 들어, 뉴로필라멘트 프로모터; 문헌 [Byrne and Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477] 참조), 췌장 특이적 프로모터 (문헌 [Edlund et al. (1985) Science 230:912-916] 참조) 및 유선(乳腺) 특이적 프로모터 (예, 유장(乳漿) 프로모터; 미국 특허 제 4,873,316호 및 유럽 출원 번호 제 264,166호 참조)를 들 수 있다. 또한, 발생 조절 프로모터, 예를 들어 쥐의 hox 프로모터 (문헌 [Kessel and Gruss (1990) Science 249:374-379] 참조) 및 α-페토프로테인 프로모터 (문헌 [Campes and Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546] 참조)를 들 수 있다.

더욱이, 본 발명은 안티센스 방향으로 발현 벡터 내로 클로닝된 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 이는 상기 DNA 분자가 PTS mRNA에 대해 안티센스인 RNA 분자가 (상기 DNA 분자의 전사를 통해) 발현될 수 있도록 조절 서열에 작동 가능하게 결합되는 것을 의미한다. 안티센스 방향으로 클로닝된 핵산에 작동 가능하게 결합되고, 다양한 세포 유형에서 안티센스 RNA 분자의 지속적 발현을 조절하는 조절 서열을 선택할 수 있으며, 또는 안티센스 RNA의 구성적, 조직 특이적 또는 세포형 특이적 발현을 조절하는 바이러스 프로모터 및 (또는) 조절 서열을 선택할 수 있다. 안티센스 발현 벡터는 고효율의 조절 영역의 조절 하에서 안티센스 핵산을 생산하는 재조합 플라스미드, 파지미드 또는 약독화 바이러스의 형태일 수 있으며, 그 활성은 상기 벡터가 도입된 세포 유형에 의해 결정될 수 있다. 안티센스 유전자를 사용하여 유전자 발현을 조절하는 것에 대해서는 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense - RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]에 논의되어 있다.

본 발명의 또다른 측면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본 명세서에서 혼용된다. 자연히, 이들 용어는 특정 표적 세포 뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손에 관한 것이다. 세대를 지나면서 돌연변이나 환경 인자로 인해 특정 변형이 나타날 수 있기 때문에, 그러한 자손은 부모 세포와 반드시 동일하지는 않지만, 여전히 본 명세서에서 사용된 용어의 범위에 포함된다.

숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, PTS 단백질은 씨. 글루타미쿰과 같은 세균 세포, 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유류 세포 (예를 들어, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 COS 세포)에서 발현될 수 있다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 위한 숙주 세포로서 적합하게 사용할 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 관련 미생물이 표 3에 기재되어 있다.

원핵 또는 진핵 세포 내로 도입하기 위해 벡터 DNA를 통상적인 형질전환 또는 형질감염 방법을 사용할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 이종 핵산 (예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내에 도입하기 위한, 당업계에 공지된 다양한 방법을 포함하는 것을 의도하며, 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시 침전법, DEAE 덱스트란 매개 형질감염법, 리포펙션법 (lipofection) 또는 전기천공법을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시키는데 적합한 방법은 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, Edition Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989] 및 다른 실험 안내서에서 찾을 수 있다.

포유류 세포의 안정적 형질감염에 대해서는, 사용된 발현 벡터와 사용된 형질감염 기술에 따라, 단지 적은 비율의 세포만이 그의 게놈 내로 이종 DNA를 삽입한다는 것이 공지되어 있다. 이들 삽입체는 통상적으로 일반적으로 선별 가능 마커 (예, 항생제 내성)를 코딩하는 유전자를 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입시킴으로써 확인하고 선별한다. 바람직한 선별 가능 마커의 예로는 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물 내성을 부여하는 것들을 들 수 있다. 선별 가능 마커를 코딩하는 핵산은 PTS 단백질을 코딩하는 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 별도의 벡터에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 확인할 수 있다 (예를 들어, 선별 가능 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하는 반면, 다른 세포는 사멸한다).

상동성 재조합 미생물은 결실, 부가 또는 치환을 도입시켜 PTS 유전자를 변형시킨, 예를 들어 기능적으로 파괴시킨 PTS 유전자의 한 부위 이상을 함유하는 벡터를 제조함으로써 제조한다. 바람직하게는 이 PTS 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 PTS 유전자이지만, 관련 세균으로부터의 상동체뿐만 아니라 포유류, 효모 또는 곤충 기원으로부터의 상동체일 수도 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 벡터는 상동 재조합에 의해 내인성 PTS 유전자가 기능적으로 파괴 (즉, 유전자가 더이상 기능적 단백질을 코딩하지 않음; 또는 "녹아웃 (knockout)" 벡터로도 지칭함)되도록 설계된다. 별법으로, 상기 벡터는 상동성 재조합에 의해 내인성 PTS 유전자가 돌연변이되거나 달리 변형되었지만 여전히 기능적 단백질을 코딩 (예를 들어, 상류에 위치한 조절 영역이 변형되어 내인성 PTS 단백질의 발현이 변형될 수 있음)하도록 설계된다. 상동 재조합 벡터에는 변형된 PTS 유전자 단편이 5' 및 3'의 측면에 PTS 유전자의 추가적인 핵산이 위치하여, 벡터에 의해 운반된 외래 PTS 유전자와 미생물의 내인성 PTS 유전자 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 한다. 추가된 측면 PTS 핵산의 길이는 내인성 유전자와 성공적으로 상동성 재조합 되기에 충분하다. 통상적으로, 벡터는 수 킬로베이스의 측면 DNA (5' 및 3' 말단 둘 다)를 함유한다 (예를 들어, 상동성 재조합 벡터에 대해 기재한 문헌 [Thomas, K.R., and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503] 참조). 상기 벡터는 (예를 들어, 전기천공법에 의해) 미생물 내로 도입되고, 도입된 PTS 유전자와 내인성 PTS 유전자가 상동성 재조합된 세포를 당업계에 공지된 기술을 이용하여 선별한다.

또다른 실시양태에서, 재조합 미생물은 도입된 유전자의 발현을 조절하도록 선별 시스템을 함유하는 것으로 제조할 수 있다. 예를 들어, lac 오페론의 조절 하에 벡터에 PTS 유전자가 삽입되면 오직 IPTG의 존재 하에서만 PTS 유전자의 발현이 가능하다. 이들 조절 시스템은 당업계에 공지되어 있다.

배양된 원핵 또는 진핵 숙주 세포와 같은 본 발명의 숙주 세포는 PTS 단백질의 생산 (즉, 발현)에 이용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 이용한 PTS 단백질의 생산 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 (PTS 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되거나, 야생형 또는 변형된 PTS 단백질을 코딩하는 유전자가 게놈 내로 도입된) 본 발명의 숙주 세포를 PTS 단백질이 생산될 때까지 적합한 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 상기 배지 또는 숙주 세포로부터 PTS 단백질을 단리하는 것을 포함한다.

C. 본 발명의 용도 및 발명

본 명세서에 기재된 핵산 분자, 단백질, 단백질 상동체, 융합 단백질, 프라이머, 벡터 및 숙주 세포는 씨. 글루타미쿰 및 관련 유기체의 확인, 씨. 글루타미쿰과 관련된 유기체의 게놈 맵핑, 씨. 글루타미쿰의 목적하는 서열의 확인 및 위치 확인, 진화 연구, 기능에 필요한 PTS 단백질 부위의 결정, PTS 단백질 활성의 조절, PTS 경로의 활성 조절 및 정밀화학물질과 같은 목적하는 화합물의 세포 생산 조절 등의 방법 중 하나 이상에 사용할 수 있다. 본 발명의 PTS 핵산 분자는 다양한 용도를 갖는다. 첫째, 씨. 글루타미쿰 또는 그의 가까운 동족체를 확인하는데 사용할 수 있다. 또한, 혼합된 미생물군에서 씨. 글루타미쿰 또는 그의 동족체를 확인하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명은 다수의 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 핵산 서열을 제공한다. 씨. 글루타미쿰에 고유한 유전자 영역을 포함하는 프로브로 엄격한 조건 하에서 단일 또는 혼합된 미생물군 배양물에서 추출한 게놈 DNA를 탐침함으로써 상기 미생물이 존재하는지를 결정할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰 그 자체는 비병원성이지만, 코리네박테리움 디프테리애와 같은 병원성 종과 관련이 있다. 이러한 유기체의 검출은 실질적인 임상적 중요성을 갖는다.

본 발명의 핵산 및 단백질 분자는 게놈의 특정 영역의 마커로 기능을 한다. 이는 게놈 맵핑 뿐만 아니라 씨. 글루타미쿰 단백질의 기능 연구에서도 유용성이 있다. 예를 들어, 씨. 글루타미쿰 게놈을 절단하여 단편을 DNA 결합 단백질과 인큐베이션시킴으로써 씨. 글루타미쿰의 특정 DNA 결합 단백질이 결합하는 게놈 영역을 확인할 수 있다. 단백질에 결합하는 상기 단편은 또한 본 발명의 핵산 분자로, 바람직하게는 용이하게 검출할 수 있는 표지로 탐침할 수 있으며, 상기 게놈 단편에 대한 이러한 핵산 분자를 결합시키면 씨. 글루타미쿰 게놈의 맵 상에 단편의 위치시킬 수 있으며, 상기 공정을 상이한 효소로 수회 수행하는 경우 단백질이 결합하는 핵산 서열을 신속하게 결정할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 핵산 분자는 관련된 종의 서열과 충분한 상동성을 가질 수 있어 브레비박테리움 락토페르멘툼과 같은 관련된 세균의 게놈 맵을 작성하기 위한 마커로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 PTS 핵산 분자는 진화 연구 및 단백질 구조 연구에 유용하다. 많은 세균은 본 발명의 분자가 관여하는 당 유입 시스템을 이용하며, 다른 유기체와 유사한 효소를 코딩하는 핵산 분자 서열과 본 발명의 핵산 분자의 서열을 비교함으로써 상기 유기체의 진화 관계의 정도를 결정할 수 있다. 유사하게, 이러한 비교로 서열 영역의 보존 여부를 결정할 수 있으며, 이는 효소 기능에 필수적인 단백질 영역을 결정하는데 도움이 될 수 있다. 이러한 유형의 결정은 단백질 공학 연구에 가치가 있으며, 단백질 기능의 손실 없이 단백질이 돌연변이유발법에 내성을 가질 수 있는지를 나타낼 수 있다.

본 발명의 PTS 핵산 분자의 조작으로 야생형 PTS 단백질과는 상이한 기능을 갖는 PTS 단백질을 생산할 수 있다. 이들 단백질은 효율 또는 활성이 개선될 수 있으며, 정상 세포보다 과량으로 존재할 수 있거나 효율 또는 활성이 감소될 수 있다.

본 발명의 PTS 분자는 하나 이상의 정밀화학물질의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율이 개선되도록 변형될 수 있다. 글루코스 유입에 관여하는 PTS 단백질을 활성이 최적화되도록 변형함으로써 글루코스 유입 정도 또는 글루코스가 세포 내로 수송되는 속도가 증가될 수 있다. 세포 내 글루코스 및 다른 당의 분해는 정밀화학물질의 생합성에 관여하는 반응과 같은 에너지론적으로 일어나기 힘든 생화학 반응을 일어나도록 하는데 사용될 수 있는 에너지를 제공한다. 또한 이러한 분해는 아미노산, 비타민 및 보조 인자와 같은 특정한 정밀화학물질의 생합성에 필요한 중간체 및 전구체를 제공한다. 본 발명의 PTS 분자를 변형함으로써 세포내 고에너지 탄소 분자의 양이 증가되면 하나 이상의 정밀화학물질의 생산에 필요한 대사 경로를 수행하는데 사용될 수 있는 에너지 및 그러한 생산에 필요한 대사 물질의 세포내 풀은 둘 다 증가될 수 있다. 역으로, 분해 산물이 효소, 보조 인자 또는 중간체를 위해 목적하는 정밀화학물질의 생산을 이한 대사 경로와 경쟁하는 대사 경로에만 사용되는 화합물을 포함하는 당의 유입을 감소시킴으로써, 상기 대사 경로를 감축할 수 있고, 따라서 목적하는 생합성 경로에 의한 생산을 증가시킬 수 있을 것이다.

본 발명의 PTS 분자는 씨. 글루타미쿰으로부터 하나 이상의 정밀화학물질의 수율 및(또는) 생산량에 영향을 주는 하나 이상의 세포내 신호 전달 경로에 관여할 수 있다. 예를 들어, 세포외 배지로부터 하나 이상의 당의 유입에 필요한 단백질 (예를 들어, HPr, 엔자임 I 또는 엔자임 II 복합체의 구성원)은 세포에 충분한 양의 상기 당의 존재 하에서, 그들이 더이상 상기 당을 유입하지 못하도록 대개 번역후 변형될 수 있다. 이러한 현상의 예로는 대장균에서 프룩토스 1,6-비스포스페이트가 높은 세포내 수준을 나타내면 HPr의 세린 46번을 인산화시켜 상기 분자가 더이상 어떠한 당의 수송에도 관여하지 못하도록 하는 것을 들 수 있다. 수송 시스템이 중단되는 세포내 당의 수준은 세포의 정상적인 기능을 유지하기에 충분할 수 있지만, 목적하는 정밀화학물질의 과생산은 제한된다. 따라서, 이러한 종류의 음성 조절에 더이상 반응하지 않도록 본 발명의 PTS 단백질을 변형시키는 것이 바람직하다. 결과, 신장에 의해 하나 이상의 당의 세포내 농도가 보다 높아지고, 상기 돌연변이 PTS 단백질을 함유하는 유기체로부터의 하나 이상의 정밀화학물질의 보다 효율적인 생산 또는 높은 수율이 달성된다.

목적 화합물의 수율을 증가시키도록 하는, PTS 단백질의 돌연변이유발법을 위한 상술한 목록의 전략은 제정되지 않으며, 이들 돌연변이유발법 전략의 변형은 당업자에게 자명할 것이다. 이들 기작에 의해, 본 발명의 핵산 및 단백질 분자를 돌연변이된 PTS 핵산 및 단백질 분자를 발현하는 씨. 글루타미쿰 또는 관련 세균 균주의 제조에 이용하여 목적하는 화합물의 수율, 생산량 및(또는) 생산 효율을 향상시킬 수 있다. 상기 목적하는 화합물은 생합성 경로의 최종 산물 및 자연 발생 대사 경로의 중간체 뿐만 아니라 씨. 글루타미쿰 대사에서는 본래 일어나지 않으나 본 발명의 씨. 글루타미쿰 균주에 의해 생산되는 분자를 포함한, 천연 씨. 코리네박테리움 글루타미쿰에 의해 생산되는 모든 산물일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 실시예에 의해 예시되나, 이에 제정되는 것으로 이해해서는 안된다. 본원에 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원, 특허, 공개 특허 출원의 내용은 참고로 인용된다.

실시예 1: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 전체 게놈 DNA의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032) 배양물을 BHI 배지 (디프코 (Difco) 제품)에서 30℃에서 격렬히 진탕시키면서 밤새 배양했다. 원심분리하여 세포를 회수하고, 상층액을 버리고, 세포를 5 ml 완충액 I (처음 배양물 부피의 5％에 해당함 - 나타낸 모든 부피는 배양물 부피 100 ml에 대해 계산한 값임) 중에 재현탁했다. 완충액 I의 조성은 다음과 같았다: 140.34 g/L 수크로스, 2.46 g/L MgS0₄ ·7 H₂O, 10 ml/L KH₂PO₄ 용액 (100 g/L, KOH로 pH 6.7로 조정), 50 ml/L M12 농축물 (10 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L NaCl, 2 g/L MgSO₄ ·7 H ₂O, 0.2 g/L CaCl₂, 0.5 g/L 효모 추출물 (디프코 제품), 10 ml/L 미량 원소 혼합물 (200 mg/L FeSO₄ ·H₂O, 10 mg/L ZnSO₄ ·7 H₂O, 3 mg/L MnCl₂ ·4 H₂O, 30 mg/L H₃ BO₃, 20 mg/L CoCl₂ ·6 H₂O, 1 mg/L NiCl₂ ·6 H₂O, 3 mg/L Na₂MoO₄ ·2 H₂O, 500 mg/L 착화제 (EDTA 또는 시트르산), 100 ml/L 비타민 혼합물 (0.2 mg/L 비오틴, 0.2 mg/L 엽산, 20 mg/L p-아미노 벤조산, 20 mg/L 리보플라빈, 40 mg/L Ca-판토테네이트, 140 mg/L 니코틴산, 40 mg/L 피리독살 히드로클로라이드, 200 mg/L 미오이노시톨). 리소짐을 상기 현탁액에 최종 농도 2.5 mg/ml로 첨가했다. 37℃에서 대략 4 시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 세포벽을 파괴하고, 수득된 원형질체를 원심분리에 의해 회수했다. 펠렛을 5 ml 완충액 I로 1 회 세척하고, 5 ml TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)으로 1 회 세척했다. 펠렛을 4 ml TE 완충액 중에 재현탁하고, 0.5 ml SDS 용액 (10％) 및 0.5 ml NaCl 용액 (5 M)을 첨가했다. 프로테이나제 K를 최종 농도 200 ㎍/ml로 첨가한 다음, 상기 현탁액을 37℃에서 약 18 시간 동안 인큐베이션시켰다. 표준 방법을 이용하여, 페놀, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 및 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하여 DNA를 정제했다. 그 다음, 1/50 부피의 3 M 아세트산 나트륨 및 2 배 부피의 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시킨 후, -20℃에서 30 분 동안 인큐베이션시키고, SS34 회전자 (소르볼 (Sorvall) 제품)를 사용한 고속 원심분리기로 12,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리했다. 상기 DNA를 20 ㎍/ml RNase A를 함유한 1 ml TE 완충액 중에 용해시키고, 4℃에서 3 시간 이상 동안 1000 ml TE-완충액 중에 투석했다. 투석 동안, 상기 완충액을 3 회 교환했다. 투석된 DNA 용액을 0.4 ml씩 분취하여, 0.4 ml 2 M LiCl 및 0.8 ml 에탄올을 첨가했다. -20℃에서 30 분 동안 인큐베이션시킨 다음, 원심분리 (13,000 rpm, 독일 하나우 헤래우스 소재, 바이오퓨즈 프레스코 (Biofuge Fresco) 제품)하여 DNA를 수집했다. DNA 펠렛을 TE 완충액 중에 용해했다. 이 방법으로 제조된 DNA를 서던 블롯팅 또는 게놈 라이브러리 제작을 비롯한 모든 목적에 이용했다.

실시예 2: 대장균에서 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 라이브러리 작성

실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 DNA로부터 출발하여, 공지되고 잘 수립된 방법 (예를 들어, 문헌 [Sambrook, J. et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons] 참조)에 따라 코스미드 및 플라스미드 라이브러리를 제작했다.

임의의 플라스미드 또는 코스미드를 사용할 수 있었다. 특히, 바람직한 것은 플라스미드 pBR322 (문헌 [Sutcliffe, J.G. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3737-3741]); pACYC177 (문헌 [Change ＆ Cohen (1978) J. Bacteriol 134:1141-1156]), pBS 계열의 플라스미드 (pBSSK+, pBSSK- 등; 문헌 [Stratagene, LaJolla, USA]), 또는 SuperCos 1 (문헌 [Stratagene, LaJolla, USA]) 또는 Lorist6 (문헌 [Gibson, T.J., Rosenthal A. and Waterson, R.H. (1987) Gene 53:283-286]) 등의 코스미드를 사용한 것이었다.

실시예 3: DNA 서열분석 및 기능적 컴퓨터 분석

실시예 2에 기재된 바와 같은 게놈 라이브러리를 사용하여, 표준 방법, 특히 ABI377 서열분석기를 사용한 쇄 종결 방법 (예를 들어, 문헌 [Fleischman, R.D. et al. (1995) "Whole-genome Random Sequencing and Assembly of Haemophilus Influenzae Rd., Science, 269:496-512] 참조)에 따라 DNA 서열분석을 수행했다. 다음의 뉴클레오티드 서열을 갖는 서열분석 프라이머를 사용했다: 5'-GGAAACAGTATGACCATG-3' 또는 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'.

실시예 4: 생체내 돌연변이유발법

코리네박테리움 글루타미쿰의 생체내 돌연변이유발법은 유전 정보의 완전성을 유지할 수 없는 대장균 또는 다른 미생물 (예를 들어, 바실루스 종 (Bacillus spp.) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모)에 플라스미드 (또는 다른 벡터) DNA를 계대접종하여 수행할 수 있다. 통상적인 돌연변이유발 균주는 DNA 복구 시스템에 관한 유전자 (예를 들어, mutHLS, mutD, mutT 등; 참고를 위해서는, 문헌 [Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms in Escherichia coli and Salmonella, pp.2277-2294, ASM: Washington] 참조)에 돌연변이가 있다. 이들 균주는 당업자에게 공지되어 있다. 이들 균주의 용도는 예를 들어, 문헌 [Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7:32-34]에 설명되어 있다.

실시예 5: 대장균과 코리네박테리움 글루타미쿰 사이의 DNA 전달

여러 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종은 자율적으로 복제되는 내인성 플라스미드 (예를 들어, pHM1519 또는 pBL1)를 함유하고 있다 (이에 대해 자세한 것은, 예를 들어 문헌 [Martin, J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 참조). 대장균 및 코리네박테리움 글루타미쿰을 위한 셔틀 벡터는 코리네박테리움 글루타미쿰을 위한 복제 원점 및 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 적합한 마커를 첨가한, 대장균을 위한 표준 벡터 (문헌 [Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press] 또는 문헌 [Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley ＆ Sons])를 사용하여 쉽게 제작할 수 있다. 상기 복제 원점은 바람직하게는 코리네박테리움 및 브레비박테리움 종에서 단리한 내인성 플라스미드로부터 얻는다. 특히, 이들 종을 위한 형질전환 마커로 유용한 유전자는 카나마이신 내성 유전자 (예를 들어, Tn5 또는 Tn903 트란스포손으로부터 유래한 것) 또는 클로람페니콜 내성 유전자 (문헌 [Winnacker, E.L. (1987) "From Genes to Clones-Introduction to Gene Technology, VCH, Weinheim] 참조)이다. 대장균 및 씨. 글루타미쿰에서 복제되고, 유전자 과다발현을 포함하는 다양한 목적에 사용할 수 있는 매우 다양한 셔틀 벡터의 제작법에 관한 수많은 문헌이 있다 (예를 들어 문헌 [Yoshihama, M. et al. (1985) J. Bacteriol. 162:591-597], [Martin J.F. et al. (1987) Biotechnology, 5:137-146] 및 [Eikmanns, B.J. et al. (1991) Gene, 102:93-98] 참조).

표준 방법을 사용하여, 목적하는 유전자를 상기 기재된 셔틀 벡터 중 하나에 클로닝하고 이러한 하이브리드 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에 도입할 수 있다. 씨. 글루타미쿰은 원형질체 형질전환법 (문헌 [Kastsumata, R. et al. (1984) J. Bacteriol. 159:306-311]), 전기천공법 (문헌 [Liebl, E. et al. (1989) FEMS Microbiol. Letters, 53:399-303]) 및 특정 벡터가 사용되는 경우에는 접합법 (예를 들어, 문헌 [Schaefer, A et al. (1990) J. Bacteriol. 172:1663-1666]에 기재된 바와 같음)을 통해 형질전환될 수 있다. 또한, 씨. 글루타미쿰으로부터 플라스미드 DNA를 제조 (당업계에 공지된 표준 방법을 사용)하고, 이것을 대장균 내로 형질전환시켜 씨. 글루타미쿰을 위한 셔틀 벡터를 대장균에 전달할 수도 있다. 이러한 형질전환 단계는 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있지만, NM522 (문헌 [Gough ＆ Murray (1983) J. Mol. Biol. 166:1-19])와 같은 Mcr-결핍 대장균 균주를 사용하는 것이 유리하다.

실시예 6: 돌연변이된 단백질의 발현 평가

형질전환된 숙주 세포에서 돌연변이 단백질의 활성을 관찰하는 것은 상기 돌연변이 단백질이 야생형 단백질과 유사한 방식 및 유사한 양으로 발현된다는 사실에 기초한다. 돌연변이 유전자의 전사량 (유전자 산물의 번역에 이용가능한 mRNA 양에 관한 지표)을 측정하는 적합한 방법은 노던 블롯팅 (예를 들어 문헌 [Ausubel et al., (1988) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York] 참조)을 수행하는 것인데, 이는 목적하는 유전자에 결합하도록 고안된 검출가능한 (통상적으로 방사성 또는 화학발광성) 표지로 제공되는 프라이머를 이용하여, 유기체 배양물의 전체 RNA를 추출하여 겔상에서 전개시키고, 이를 안정한 기질로 전달하고, 프로브로 인큐베이션시키는 경우, 상기 프로브의 결합 및 그 결합량이 상기 목적하는 유전자의 mRNA 존재 여부 및 양을 지시하는 방법이다. 이러한 정보는 돌연변이 유전자가 전사되는 정도에 관한 지표가 된다. 전체 RNA는 문헌 [Bormann, E.R. et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:317-326]에 기재된 것과 같이 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 단리할 수 있다.

상기 mRNA로부터 번역된 단백질의 존재 여부 또는 그 상대량은 웨스턴 블롯팅과 같은 표준 기술을 이용하여 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. (1988) "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York] 참조). 상기 방법에서, 전체 세포 단백질을 추출하고, 겔 전기영동법으로 분리하고, 니트로셀룰로스와 같은 기질로 전달하고, 예를 들어 항체와 같은, 원하는 단백질에 특이적으로 결합하는 프로브와 인큐베이션시킨다. 통상적으로, 상기 프로브는 쉽게 검출될 수 있는 화학발광성 또는 비색성 표지로 제공된다. 관찰된 표지의 존재 여부 및 양은 상기 세포에서 원하는 돌연변이 단백질의 존재 여부 및 양을 지시한다.

실시예 7: 유전적으로 변형된 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장 - 배지 및 배양 조건

유전적으로 변형된 코리네박테리아를 합성 또는 천연 성장 배지에서 배양한다. 코리네박테리아의 수많은 상이한 성장 배지는 당업계에 공지되어 있으며, 또한 쉽게 입수가능하다 (문헌 [Lieb et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 32:205-210], [von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11:11-16], 독일 특허 제4,120,867호, [Liebl (1992) "The Genus Corynebacterium", in: The Procaryotes, Vol. II, Balows, A., et al., editors. Springer-Verlag]). 이들 배지는 1 종 이상의 탄소원, 질소원, 무기염, 비타민 및 미량 원소로 구성된다. 바람직한 탄소원은 단당류, 이당류, 또는 다당류와 같은 당이다. 매우 우수한 탄소원의 예는 글루코스, 프룩토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 및 셀룰로스이다. 또한, 당 정제시 생성되는 당밀 또는 기타 부산물 등과 같은 복합 화합물 등을 통해 당을 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 다양한 탄소원의 혼합물을 첨가하는 것도 유리할 수 있다. 다른 가능한 탄소원은 메탄올, 에탄올, 아세트산 또는 젖산과 같은 알코올 및 유기산이다. 질소원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물, 또는 이들 화합물을 함유하는 물질이다. 질소원의 예로는 암모니아 기체, 및 NH₄Cl 또는 (NH₄)₂SO ₄, NH₄0H 와 같은 암모니아염, 질산염, 우레아, 아미노산, 또는 옥수수 침유 (steep liquor), 대두 가루, 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등의 복합 질소 공급원 등이 있다.

배지에 존재할 수 있는 무기 염 화합물의 예로는 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 염산염, 인산염, 또는 황산염을 들 수 있다. 킬레이트제를 배지에 첨가하여 금속 이온을 용액 상태로 유지할 수 있다. 특히 적합한 킬레이트제의 예로는 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트 등의 디히드록시페놀, 및 시트르산 등의 유기산을 들 수 있다. 또한, 배지에는 통상적으로 비타민 또는 성장 촉진제와 같은 다른 성장 인자가 포함되어 있고, 이들의 예로는 비오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 들 수 있다. 성장 인자 및 염은 대개 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침유 등과 같은 복합 배지 성분에서 유래한다. 배지의 정확한 조성은 특정 실험에 따라 크게 달라지고, 각각의 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 배지의 최적화에 관한 정보는 문헌 ["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 찾을 수 있다. 또한, 상기 배지는 예를 들어 스탠다드 1 (머크 (Merck) 제품) 또는 BHI (곡물 속 침출물, 디프코 제품) 등과 같이 상업적인 공급원으로부터 입수할 수도 있다.

모든 배지 성분들을 열처리 (1.5 bar 및 121℃에서 20 분) 또는 멸균 여과로 멸균시킨다. 상기 성분들을 한꺼번에 멸균하거나, 필요에 따라 개별적으로 멸균할 수 있다. 모든 배지 성분들은 배양 초기부터 존재하거나, 경우에 따라 연속적으로 또는 배치식으로 (batchwise) 첨가될 수 있다.

배양 조건은 각 실험마다 개별적으로 정의된다. 온도는 15℃와 45℃ 사이의 범위여야 하며, 일정하게 유지하거나 실험하는 동안 변경할 수 있다. 배지의 pH는 5 내지 8.5의 범위, 바람직하게는 약 7.0이어야 하며, 배지에 완충액을 첨가하여 유지시킬 수 있다. 이러한 목적을 위한 완충액의 예는 인산칼륨 완충액이다. MOPS, HEPES, ACES 등과 같은 합성 완충액을 별법으로 또는 동시에 사용할 수 있다. 또한, NaOH 또는 NH₄OH를 첨가하여 배양하는 동안 배양물의 pH를 일정하게 유지시킬 수 있다. 효모 추출물과 같은 복합 배지 성분이 사용되는 경우, 많은 복합 화합물은 완충 성능이 높기 때문에, 추가의 완충액에 대한 요구를 감소시킬 수 있다. 미생물 배양에 발효기를 사용하는 경우, pH는 또한 암모니아 기체를 사용하여 조절할 수 있다.

인큐베이션 시간은 통상적으로 수 시간 내지 수 일이다. 상기 시간은 최대량의 생성물이 브로스 (broth)에 축적되도록 선택한다. 개시한 배양 실험을 상이한 크기의 마이크로타이터 플레이트, 유리관, 유리 플라스크 또는 유리 또는 금속 발효기 등의 다양한 용기에서 수행할 수 있다. 수많은 클론을 스크리닝하기 위해서는, 미생물을 배플 (baffle)이 있거나 없는 마이크로타이터 플레이트, 유리관 또는 진탕 플라스크에서 배양해야 한다. 필요한 성장 배지의 10％ (부피비)가 충전된 100 ml 진탕 플라스크를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 플라스크는 100-300 rpm 범위의 속도의 회전 진탕기 (진폭 25 mm) 상에서 진탕해야 한다. 증발에 의한 손실량은 대기를 습하게 유지함으로써 감소될 수 있고, 별법으로 증발에 의한 손실량을 수학적으로 보정해야 한다.

유전적으로 변형된 클론을 시험하는 경우, 비변형된 대조 클론 또는 인서트가 없는 기본 플라스미드를 함유하는 대조 클론도 분석해야 한다. 30℃에서 인큐베이션한 CM 플레이트 (10 g/L 글루코스, 2.5 g/L NaCl, 2 g/L 우레아, 10 g/L 폴리펩톤, 5 g/L 효모 추출물, 5 g/L 육류 추출물, 22 g/L 아가, 2 M NaOH로 pH 6.8로 조정)와 같은 아가 플레이트 상에서 성장된 세포로 OD₆₀₀ 0.5-1.5이 되도록 배지를 접종한다. 배지는 CM 플레이트로부터의 씨. 글루타미쿰 세포의 염수 용액을 도입하거나, 상기 세균의 액체 예비배양물을 첨가하여 접종한다.

실시예 8: 돌연변이 단백질의 기능에 관한 시험관내 분석

효소의 활성 및 반응 속도 파라미터의 측정 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 특정 변형된 효소의 활성 측정 실험은 야생형 효소의 비활성(比活性)에 맞추어야 하며, 당업자라면 이를 잘 수행할 수 있다. 효소에 관한 일반적인 개요 및 효소의 구조, 반응 속도, 원리, 방법, 적용에 관한 구체적인 세부사항, 및 많은 효소들의 활성 측정 방법의 예는 예를 들어 하기의 참고문헌에서 찾을 수 있다: 문헌 [Dixon, M., and Webb, E.C.: (1979) Enzymes, Longmans, London; [Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York]; [Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco]; [Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford]; [Boyer, P.D: editors (1983) The Enzymes, 3rd editon Academic Press, New York]; [Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2nd edition VCH, Weinheim (ISBN 3527300325)]; [Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Grassl, M. editors (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition Vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim]; 및 [Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Vol. A9, "Enzymes", VCH, Weinheim, pp. 352-363].

DNA에 결합하는 단백질의 활성은 DNA 밴드변위 분석법 (겔 지연 분석법 (gel retardation assays)으로도 지칭됨)과 같은 잘 수립된 여러 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 다른 분자의 발현에 대한 이들 단백질들의 작용은 리포터 유전자 분석법 (문헌 [Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14:3895-3904] 및 그의 참고문헌에 기재된 바와 같음)을 이용하여 측정할 수 있다. 베타-갈락토시다제와 같은 효소, 녹색 형광 단백질 및 사용되는 몇몇 다른 효소를 사용하는 리포터 유전자 시험 시스템은 원핵 세포 및 진핵 세포의 적용에 대해 널리 공지되어 있으며, 잘 수립되어 있다.

막 수송 단백질의 활성은 문헌 [Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; 및 270-322]에 기재된 기술에 따라 측정될 수 있다.

실시예 9: 원하는 생성물 생산에 대한 돌연변이 단백질의 영향 분석

씨. 글루타미쿰에서의 유전적 변형이 목적하는 화합물 (예를 들어, 아미노산)의 생산에 미치는 영향은, 변형된 미생물을 적합한 조건 (예를 들어, 상기 기재한 바와 같은 것) 하에 성장시키고, 목적하는 생성물 (즉, 아미노산)의 생성 증가에 관여한 배지 성분 및(또는) 세포 성분을 시험하여 측정할 수 있다. 이러한 분석 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 그 예로는 분광분석법, 박층크로마토그래피법, 각종 염색법, 효소적 및 미생물학적 방법, 및 고성능 액체 크로마토그래피법 등과 같은 분석용 크로마토그래피법 등을 들 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 89-90 및 pp. 443-613, VCH: Weinheim (1985)]; [Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol.17]; [Rehm et al. (1993) Biotechnology, vol.3, Chapter III: "Product recovery and purification", pp. 469-714, VCH: Weinheim]; [Belter, P.A. et al. (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons]; [Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons]; [Shaeiwitz, J.A. and Henry, J.D. (1988) Biochemical Separations, in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3; Chapter 11, pp. 1-27, VCH: Weinheim] 및 [Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications] 참조).

최종 발효 생성물의 측정 뿐 아니라, 중간체 및 부산물과 같은 목적하는 화합물의 생산에 이용된 대사 경로의 다른 성분들을 분석하여 유기체의 전체적인 생산량, 수율 및(또는) 화합물의 생산 효율의 측정하는 것이 가능하다. 분석 방법의 예로는 배지의 영양분 (예를 들어, 당, 탄화수소, 질소원, 인산염 및 기타 이온)의 함량 측정, 생물자원 (biomass)의 조성 및 성장량 측정, 생합성 경로로부터의 공통 대사물질의 생산량 분석, 및 발효 동안에 생성된 기체 측정을 들 수 있다. 이들 측정을 위한 표준 방법은 문헌 [Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes and P.F. Stanbury, editors IRL Press, pp. 103-129, 131-163 및 165-192 (ISBN: 0199635773)] 및 그의 참고문헌에 기재되어 있다.

실시예 10: 씨. 글루타미쿰 배양물로부터의 목적하는 생성물의 정제

당업계에 공지된 다양한 방법에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 세포 또는 상기 기재한 배양물의 상층액으로부터 원하는 생성물을 수득할 수 있다. 목적하는 생성물이 세포로부터 분비되지 않는 경우, 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 회수하고, 기계적인 힘 또는 초음파 등의 표준 기술로 세포를 용균시킬 수 있다. 원심분리로 세포 부스러기를 제거하고, 가용성 단백질을 함유하는 상층액 분획을 수득하여 목적하는 화합물의 추가의 정제에 사용한다. 씨. 글루타미쿰 세포로부터 생성물이 분비되는 경우, 배양물을 저속 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액 분획은 남겨 추가의 정제에 사용한다.

상기 두 가지 정제 방법으로부터의 상층액 분획을 적합한 수지를 사용한 크로마토그래피에 적용하여, 목적하는 분자는 크로마토그래피 수지 상에 남지만 샘플 중의 많은 불순물은 남지 않게 하거나, 불순물들은 수지에 남지만 샘플은 남지 않게 한다. 필요에 따라, 동일하거나 상이한 크로마토그래피 수지를 사용하여 이러한 크로마토그래피 단계를 반복할 수 있다. 당업자는 적합한 크로마토그래피 수지를 선택하고 특정 분자의 정제에 대해 가장 효과적으로 이를 적용하는 것을 잘 알고 있을 것이다. 정제된 생성물을 여과법 또는 한외여과법으로 농축시켜, 생성물의 안정성이 최대가 되는 온도에서 보관할 수 있다.

상기 기재한 정제법에 제한되지 않는 많은 정제 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Bailey, J.E. ＆ Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986)]에 기재되어 있다.

단리된 화합물의 확인 및 순도는 당업계의 표준 기술로 측정될 수 있다. 이들 표준 기술에는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)법, 분광분석법, 염색법, 박층 크로마토그래피법, NIRS, 효소적 분석법, 또는 미생물학적 분석법 등이 포함된다. 이들 분석 방법은 하기 문헌에서 검토된다: 문헌 [Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140]; [Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11:27-32], [Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70]; [Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, pp. 521-540, pp. 540-547, pp. 559-566, pp. 575-581 및 pp. 581-587]; [Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons] 및 [Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17].

등가물

당업자라면 단순히 일상적인 방법을 이용하여 본 발명의 특정 실시양태의 많은 등가물을 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기의 청구항에 포함되는 것으로 의도된다.

표 1의 정보는 하기와 같이 이해된다.

컬럼 1에서, "DNA 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "DNA 서열 번호"의 "5"는 서열 5를 지칭한다.

컬럼 2에서, "아미노산 서열 번호"의 해당 번호는 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 각각을 지칭하는 것이다. 따라서, 컬럼 "아미노산 서열 번호"의 "6"은 서열 6을 지칭한다.

컬럼 3에서, "확인"은 각 서열에 대한 명확한 식별기호를 기재한 것이다.

컬럼 4에서, "아미노산 위치"의 해당 번호는 각 경우에서 동일행에 있는 "아미노산 서열 번호"에 기재된 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 위치를 지칭한다. 따라서, 컬럼 "아미노산 위치"의 "26"은 해당 폴리펩티드 서열의 아미노산 위치 26이다. 위치 번호는 N 말단을 +1로 하여 출발한다.

컬럼 5에서, "아미노산 야생형"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 야생형 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 6에서, "아미노산 돌연변이체"의 해당 문자는 각 경우의 컬럼 4에 표시한 돌연변이체 서열에서 해당 위치에 존재하는 아미노산을 지칭하며, 1문자 코드로 나타내었다.

컬럼 7에서, "기능"은 해당 폴리펩티드 서열의 생리적 기능을 기재한 것이다.

단백질성 아미노산의 한 글자 코드:

A 알라닌

C 시스테인

D 아스파르트산

E 글루탐산

F 페닐알라닌

G 글리신

H 히스티딘

I 이소류신

K 리신

L 류신

M 메티오닌

N 아스파라긴

P 프롤린

Q 글루타민

R 아르기닌

S 세린

T 트레오닌

V 발린

W 트립토판

Y 티로신

포스포에놀피루베이트 당 포스포트랜스퍼라제 단백질을 코딩하는 유전자
DNA 서열번호	아미노산 서열번호	확인	아미노산위치	아미노산야생형	아미노산돌연변이체	기능
1	2	RXA01244	108	E	K	포스포에놀피루베이트-단백질 포스포트랜스퍼라제
			137	R	C	포스포에놀피루베이트-단백질 포스포트랜스퍼라제
			166	A	T	포스포에놀피루베이트-단백질 포스포트랜스퍼라제
5	6	RXA01300	25	A	T	포스포캐리어 단백질 HPR
7	8	RXA04358	227	E	K	가상의 포스포트랜스퍼라제 엔자임 II, 구성원 SGCA (EC 2.7.1.69)
9	10	RXA06018	122	K	E	PTS 시스템, 프룩토스-특이적 IIBC 구성원 (EC 2.7.1.69)

SEQUENCE LISTING <110> BASF Aktiengesellschaft <120> Genes coding for phosphoenolpyruvate sugar phosphotransferase proteins <130> O.Z.0050/52969 <160> 8 <210> 1 <211> 1834 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (101)..(1804) <223> RXA01244 <400> 1 gatatgtgtt tgtttgtcaa tatccaaatg tttgaatagt tgcacaactg ttggttttgt 60 ggtgatcttg aggaaattaa ctcaatgatt gtgaggatgg gtg gct act gtg gct 115 Val Ala Thr Val Ala 1 5 gat gtg aat caa gac act gta ctg aag ggc acc ggc gtt gtc ggt gga 163 Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr Gly Val Val Gly Gly 10 15 20 gtc cgt tat gca agc gcg gtg tgg att acc cca cgc ccc gaa cta ccc 211 Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro Arg Pro Glu Leu Pro 25 30 35 caa gca ggc gaa gtc gtc gcc gaa gaa aac cgt gaa gca gag cag gag 259 Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg Glu Ala Glu Gln Glu 40 45 50 cgt ttc gac gcc gct gca gcc aca gtc tct tct cgt ttg ctt gag cgc 307 Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser Arg Leu Leu Glu Arg 55 60 65 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Ala Pro Met Val Ala Thr Ala Tyr 390 395 400 405 gaa gca aag tgg ttt gct gac atg tgc cgt gag cgt ggc cta atc gcc 1363 Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu Arg Gly Leu Ile Ala 410 415 420 ggc gcc atg atc gaa gtt cca gca gca tcc ctg atg gca gac aag atc 1411 Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu Met Ala Asp Lys Ile 425 430 435 atg cct cac ctg gac ttt gtt tcc atc ggt acc aac gac ctg acc cag 1459 Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr Asn Asp Leu Thr Gln 440 445 450 tac acc atg gca gcg gac cgc atg tct cct gag ctt gcc tac ctg acc 1507 Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu Leu Ala Tyr Leu Thr 455 460 465 gat cct tgg cag cca gca gtc ctg cgc ctg atc aag cac acc tgt gac 1555 Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile Lys His Thr Cys Asp 470 475 480 485 gaa ggt gct cgc ttt aac acc ccg gtc ggt gtt tgt ggt gaa gca gca 1603 Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val Cys Gly Glu Ala Ala 490 495 500 gca gac cca ctg ttg gca act gtc ctc acc ggt ctt ggc gtg aac tcc 1651 Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly Leu Gly Val Asn Ser 505 510 515 ctg tcc gca gca tcc act gct ctc gca gca gtc ggt gca aag ctg tca 1699 Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val Gly Ala Lys Leu Ser 520 525 530 gag gtc acc ctg gaa acc tgt aag aag gca gca gaa gca gca ctt gac 1747 Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala Glu Ala Ala Leu Asp 535 540 545 gct gaa ggt gca act gaa gca cgc gat gct gta cgc gca gtg atc gac 1795 Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val Arg Ala Val Ile Asp 550 555 560 565 gca gca gtc taaaccactg ttgagctaaa aagcctcaaa 1834 Ala Ala Val <210> 2 <211> 568 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Val Ala Thr Val Ala Asp Val Asn Gln Asp Thr Val Leu Lys Gly Thr 1 5 10 15 Gly Val Val Gly Gly Val Arg Tyr Ala Ser Ala Val Trp Ile Thr Pro 20 25 30 Arg Pro Glu Leu Pro Gln Ala Gly Glu Val Val Ala Glu Glu Asn Arg 35 40 45 Glu Ala Glu Gln Glu Arg Phe Asp Ala Ala Ala Ala Thr Val Ser Ser 50 55 60 Arg Leu Leu Glu Arg Ser Glu Ala Ala Glu Gly Pro Ala Ala Glu Val 65 70 75 80 Leu Lys Ala Thr Ala Gly Met Val Asn Asp Arg Gly Trp Arg Lys Ala 85 90 95 Val Ile Lys Gly Val Lys Gly Gly His Pro Ala Glu Tyr Ala Val Val 100 105 110 Ala Ala Thr Thr Lys Phe Ile Ser Met Phe Glu Ala Ala Gly Gly Leu 115 120 125 Ile Ala Glu Arg Thr Thr Asp Leu Arg Asp Ile Arg Asp Arg Val Ile 130 135 140 Ala Glu Leu Arg Gly Asp Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ala Val Ser Gly 145 150 155 160 Gln Val Ile Leu Phe Ala Asp Asp Leu Ser Pro Ala Asp Thr Ala Ala 165 170 175 Leu Asp Thr Asp Leu Phe Val Gly Leu Val Thr Glu Leu Gly Gly Pro 180 185 190 Thr Ser His Thr Ala Ile Ile Ala Arg Gln Leu Asn Val Pro Cys Ile 195 200 205 Val Ala Ser Gly Ala Gly Ile Lys Asp Ile Lys Ser Gly Glu Lys Val 210 215 220 Leu Ile Asp Gly Ser Leu Gly Thr Ile Asp Arg Asn Ala Asp Glu Ala 225 230 235 240 Glu Ala Thr Lys Leu Val Ser Glu Ser Leu Glu Arg Ala Ala Arg Ile 245 250 255 Ala Glu Trp Lys Gly Pro Ala Gln Thr Lys Asp Gly Tyr Arg Val Gln 260 265 270 Leu Leu Ala Asn Val Gln Asp Gly Asn Ser Ala Gln Gln Ala Ala Gln 275 280 285 Thr Glu Ala Glu Gly Ile Gly Leu Phe Arg Thr Glu Leu Cys Phe Leu 290 295 300 Ser Ala Thr Glu Glu Pro Ser Val Asp Glu Gln Ala Ala Val Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Val Leu Glu Ala Phe Pro Glu Ser Lys Val Val Val Arg Ser Leu 325 330 335 Asp Ala Gly Ser Asp Lys Pro Val Pro Phe Ala Ser Met Ala Asp Glu 340 345 350 Met Asn Pro Ala Leu Gly Val Arg Gly Leu Arg Ile Ala Arg Gly Gln 355 360 365 Val Asp Leu Leu Thr Arg Gln Leu Asp Ala Ile Ala Lys Ala Ser Glu 370 375 380 Glu Leu Gly Arg Gly Asp Asp Ala Pro Thr Trp Val Met Ala Pro Met 385 390 395 400 Val Ala Thr Ala Tyr Glu Ala Lys Trp Phe Ala Asp Met Cys Arg Glu 405 410 415 Arg Gly Leu Ile Ala Gly Ala Met Ile Glu Val Pro Ala Ala Ser Leu 420 425 430 Met Ala Asp Lys Ile Met Pro His Leu Asp Phe Val Ser Ile Gly Thr 435 440 445 Asn Asp Leu Thr Gln Tyr Thr Met Ala Ala Asp Arg Met Ser Pro Glu 450 455 460 Leu Ala Tyr Leu Thr Asp Pro Trp Gln Pro Ala Val Leu Arg Leu Ile 465 470 475 480 Lys His Thr Cys Asp Glu Gly Ala Arg Phe Asn Thr Pro Val Gly Val 485 490 495 Cys Gly Glu Ala Ala Ala Asp Pro Leu Leu Ala Thr Val Leu Thr Gly 500 505 510 Leu Gly Val Asn Ser Leu Ser Ala Ala Ser Thr Ala Leu Ala Ala Val 515 520 525 Gly Ala Lys Leu Ser Glu Val Thr Leu Glu Thr Cys Lys Lys Ala Ala 530 535 540 Glu Ala Ala Leu Asp Ala Glu Gly Ala Thr Glu Ala Arg Asp Ala Val 545 550 555 560 Arg Ala Val Ile Asp Ala Ala Val 565 <210> 3 <211> 397 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (101)..(367) <223> RXA01300 <400> 3 gatcgacatt aaatcccctc ccttgggggg tttaactaac aaatcgctgc gccctaatcc 60 gttcggatta acggcgtagc aacacgaaag gacactttcc atg gct tcc aag act 115 Met Ala Ser Lys Thr 1 5 gta acc gtc ggt tcc tcc gtt ggc ctg cac gca cgt cca gca tcc atc 163 Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala Arg Pro Ala Ser Ile 10 15 20 atc gct gaa gcg gct gct gag tac gac gac gaa atc ttg ctg acc ctg 211 Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu Ile Leu Leu Thr Leu 25 30 35 gtt ggc tcc gat gat gac gaa gag acc gac gcg tcc tct tcc ctc atg 259 Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala Ser Ser Ser Leu Met 40 45 50 atc atg gcg ctg ggc gca gag cac ggc aac gaa gtt acc gtc acc tcc 307 Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu Val Thr Val Thr Ser 55 60 65 gac aac gct gaa gct gtt gag aag atc gct gcg ctt atc gca cag gac 355 Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala Leu Ile Ala Gln Asp 70 75 80 85 ctt gac gct gag taaacaacgc tctgcttgtt aaaagctcgt 397 Leu Asp Ala Glu <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Ala Ser Lys Thr Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu His Ala 1 5 10 15 Arg Pro Ala Ser Ile Ile Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp Asp Glu 20 25 30 Ile Leu Leu Thr Leu Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Ala 35 40 45 Ser Ser Ser Leu Met Ile Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu 50 55 60 Val Thr Val Thr Ser Asp Asn Ala Glu Ala Val Glu Lys Ile Ala Ala 65 70 75 80 Leu Ile Ala Gln Asp Leu Asp Ala Glu 85 <210> 5 <211> 940 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (101)..(910) <223> RXA04358 <400> 5 ggaacttcga ggtgtcttcg tggggcgtac ggagatctag caagtgtggc tttatgtttg 60 accctatccg aatcaacatg cagtgaatta acatctactt atg ttt gta ctc aaa 115 Met Phe Val Leu Lys 1 5 gat ctg cta aag gca gaa cgc ata gaa ctc gac cgc acg gtc acc gat 163 Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp Arg Thr Val Thr Asp 10 15 20 tgg cgt gaa ggc atc cgc gcc gca ggt gta ctc cta gaa aag aca aac 211 Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu Leu Glu Lys Thr Asn 25 30 35 agc att gat tcc gcc tac acc gat gcc atg atc gcc agc gtg gaa gaa 259 Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile Ala Ser Val Glu Glu 40 45 50 aaa ggc ccc tac att gtg gtc gct cca ggt ttc gct ttc gcg cac gcc 307 Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe Ala Phe Ala His Ala 55 60 65 cgc ccc agc aga gca gtc cgc gag acc gct atg tcg tgg gtg cgc ctg 355 Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met Ser Trp Val Arg Leu 70 75 80 85 gcc tcc cct gtt tcc ttc ggt cac agt aag aat gat ccc gtc aat ctc 403 Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn Asp Pro Val Asn Leu 90 95 100 atc gtt gct ctc gct gcc aaa gat gcc acc gca cat acc caa gcg atg 451 Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala His Thr Gln Ala Met 105 110 115 gcg gca ttg gct aaa gct tta gga aaa tac cga aag gat ctc gac gag 499 Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg Lys Asp Leu Asp Glu 120 125 130 gca caa agt ccc gag gag atc caa gca atc tta gag aag gca gca gcg 547 Ala Gln Ser Pro Glu Glu Ile Gln Ala Ile Leu Glu Lys Ala Ala Ala 135 140 145 ccg gcg aag cag aag gct cct gct gtg gct cct gct gta aca ccc act 595 Pro Ala Lys Gln Lys Ala Pro Ala Val Ala Pro Ala Val Thr Pro Thr 150 155 160 165 gac gct cct gca gcc tca gtc caa tcc aaa acc cac gac aag atc ctc 643 Asp Ala Pro Ala Ala Ser Val Gln Ser Lys Thr His Asp Lys Ile Leu 170 175 180 acc gtc tgt ggc aac ggc ttg ggt acc tcc ctc ttc ctc aaa aac acc 691 Thr Val Cys Gly Asn Gly Leu Gly Thr Ser Leu Phe Leu Lys Asn Thr 185 190 195 ctt gag caa gtt ttc gac acc tgg ggt tgg ggt cca tac atg acg gtg 739 Leu Glu Gln Val Phe Asp Thr Trp Gly Trp Gly Pro Tyr Met Thr Val 200 205 210 gag gca acc gac act atc tcc gcc aag ggc aaa gcc aag gaa gct gat 787 Glu Ala Thr Asp Thr Ile Ser Ala Lys Gly Lys Ala Lys Glu Ala Asp 215 220 225 ctc atc atg acc tct ggt gaa atc gcc cgc acg ttg ggt gat gtt gga 835 Leu Ile Met Thr Ser Gly Glu Ile Ala Arg Thr Leu Gly Asp Val Gly 230 235 240 245 atc ccg gtt cac gtg atc aat gac ttc acg agc acc gat gaa atc gat 883 Ile Pro Val His Val Ile Asn Asp Phe Thr Ser Thr Asp Glu Ile Asp 250 255 260 gct gcg ctt cgt gaa cgc tac gac atc taactacttt aaaaggacga 930 Ala Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Asp Ile 265 270 aaatattatg 940 <210> 6 <211> 270 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 Met Phe Val Leu Lys Asp Leu Leu Lys Ala Glu Arg Ile Glu Leu Asp 1 5 10 15 Arg Thr Val Thr Asp Trp Arg Glu Gly Ile Arg Ala Ala Gly Val Leu 20 25 30 Leu Glu Lys Thr Asn Ser Ile Asp Ser Ala Tyr Thr Asp Ala Met Ile 35 40 45 Ala Ser Val Glu Glu Lys Gly Pro Tyr Ile Val Val Ala Pro Gly Phe 50 55 60 Ala Phe Ala His Ala Arg Pro Ser Arg Ala Val Arg Glu Thr Ala Met 65 70 75 80 Ser Trp Val Arg Leu Ala Ser Pro Val Ser Phe Gly His Ser Lys Asn 85 90 95 Asp Pro Val Asn Leu Ile Val Ala Leu Ala Ala Lys Asp Ala Thr Ala 100 105 110 His Thr Gln Ala Met Ala Ala Leu Ala Lys Ala Leu Gly Lys Tyr Arg 115 120 125 Lys Asp Leu Asp Glu Ala Gln Ser Pro Glu Glu Ile Gln Ala Ile Leu 130 135 140 Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Lys Gln Lys Ala Pro Ala Val Ala Pro 145 150 155 160 Ala Val Thr Pro Thr Asp Ala Pro Ala Ala Ser Val Gln Ser Lys Thr 165 170 175 His Asp Lys Ile Leu Thr Val Cys Gly Asn Gly Leu Gly Thr Ser Leu 180 185 190 Phe Leu Lys Asn Thr Leu Glu Gln Val Phe Asp Thr Trp Gly Trp Gly 195 200 205 Pro Tyr Met Thr Val Glu Ala Thr Asp Thr Ile Ser Ala Lys Gly Lys 210 215 220 Ala Lys Glu Ala Asp Leu Ile Met Thr Ser Gly Glu Ile Ala Arg Thr 225 230 235 240 Leu Gly Asp Val Gly Ile Pro Val His Val Ile Asn Asp Phe Thr Ser 245 250 255 Thr Asp Glu Ile Asp Ala Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Asp Ile 260 265 270 <210> 7 <211> 520 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (101)..(490) <223> RXA06018 <400> 7 agcctacctc tttggtaccg caggcctgtc taccggcgac caagcttcca tggaaatcat 60 ggccgcgatc atggcagctg gcatggtccc accaatcgcg ttg tcc att gct acc 115 Leu Ser Ile Ala Thr 1 5 ctg ctg cgc aag aag ctg ttc acc cca gca gag caa gaa aac ggc aag 163 Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu Gln Glu Asn Gly Lys 10 15 20 tct tcc tgg ctg ctt ggc ctg gca ttc gtc tcc gaa ggt gcc atc cca 211 Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser Glu Gly Ala Ile Pro 25 30 35 ttc gcc gca gct gac cca ttc cgt gtg atc cca gca atg atg gct ggc 259 Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro Ala Met Met Ala Gly 40 45 50 ggt gca acc act ggt gca atc tcc atg gca ctg ggc gtc ggc tct cgg 307 Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu Gly Val Gly Ser Arg 55 60 65 gct cca cac ggc ggt atc ttc gtg gtc tgg gca atc gaa cca tgg tgg 355 Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala Ile Glu Pro Trp Trp 70 75 80 85 ggc tgg ctc atc gca ctt gca gca ggc acc atc gtg tcc acc atc gtt 403 Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile Val Ser Thr Ile Val 90 95 100 gtc atc gca ctg aag cag ttc tgg cca aac aag gcc gtc gct gca gaa 451 Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys Ala Val Ala Ala Glu 105 110 115 gtc gcg aag caa aaa gca caa caa gca gct gta aac gca taatcggacc 500 Val Ala Lys Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Val Asn Ala 120 125 130 ttgacccgat gtctggtcgg 520 <210> 8 <211> 130 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8 Leu Ser Ile Ala Thr Leu Leu Arg Lys Lys Leu Phe Thr Pro Ala Glu 1 5 10 15 Gln Glu Asn Gly Lys Ser Ser Trp Leu Leu Gly Leu Ala Phe Val Ser 20 25 30 Glu Gly Ala Ile Pro Phe Ala Ala Ala Asp Pro Phe Arg Val Ile Pro 35 40 45 Ala Met Met Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Ala Ile Ser Met Ala Leu 50 55 60 Gly Val Gly Ser Arg Ala Pro His Gly Gly Ile Phe Val Val Trp Ala 65 70 75 80 Ile Glu Pro Trp Trp Gly Trp Leu Ile Ala Leu Ala Ala Gly Thr Ile 85 90 95 Val Ser Thr Ile Val Val Ile Ala Leu Lys Gln Phe Trp Pro Asn Lys 100 105 110 Ala Val Ala Ala Glu Val Ala Lys Gln Lys Ala Gln Gln Ala Ala Val 115 120 125 Asn Ala 130 PF 52969

Claims (8)

1. 표 1의 컬럼 4에 지시된 아미노산 위치의 핵산 분자가 동일행의 표 1의 컬럼 5에 지시된 특정 아미노산과 상이한 단백질성 아미노산을 코딩하는, 각 경우에 표 1의 컬럼 2에 지칭된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
2. 제1항에 있어서, 표 1의 컬럼 4에 지시된 아미노산 위치의 핵산 분자가 동일행의 표 1의 컬럼 6에 지시된 아미노산을 코딩하는 단리된 핵산 분자.
3. 제1항에 따른 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
4. 제3항에 따른 하나 이상의 벡터로 형질감염된 숙주 세포.
5. 제4항에 있어서, 상기 핵산 분자의 발현이 상기 세포로부터의 정밀화학물질 생산을 조절하는 것인 숙주 세포.
6. 제3항에 따른 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포를 배양하여 정밀화학물질이 생산되도록 하는 것을 포함하는, 정밀화학물질의 생산 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 정밀화학물질이 아미노산인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 아미노산이 리신인 방법.