CZ302494B6 - Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, konstrukt, vektor a mikroorganizmus s touto sekvencí a zpusob prípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilu - Google Patents

Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, konstrukt, vektor a mikroorganizmus s touto sekvencí a zpusob prípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilu Download PDF

Info

Publication number
CZ302494B6
CZ302494B6 CZ20011382A CZ20011382A CZ302494B6 CZ 302494 B6 CZ302494 B6 CZ 302494B6 CZ 20011382 A CZ20011382 A CZ 20011382A CZ 20011382 A CZ20011382 A CZ 20011382A CZ 302494 B6 CZ302494 B6 CZ 302494B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
seq
methyl
alas
Prior art date
Application number
CZ20011382A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20011382A3 (cs
Inventor
Ress-Löschke@Marion
Friedrich@Thomas
Hauer@Bernhard
Mattes@Ralf
Engels@Dirk
Original Assignee
Basf Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Basf Aktiengesellschaft filed Critical Basf Aktiengesellschaft
Publication of CZ20011382A3 publication Critical patent/CZ20011382A3/cs
Publication of CZ302494B6 publication Critical patent/CZ302494B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Rešení se týká sekvence nukleových kyselin, která kóduje polypeptid s nitrilázovou aktivitou, konstruktu nukleových kyselin, zahrnujících tuto sekvenci nukleových kyselin a vektoru, zahrnujících tuto sekvenci nukleových kyselin nebo uvedené konstrukty nukleových kyselin. Dále se týká aminokyselinových sekvencí, které jsou kódovány uvedenou sekvencí nukleových kyselin a mikroorganizmu, zahrnujících uvedené sekvence nukleových kyselin, konstrukty nukleových kyselin nebo vektory, obsahující uvedené sekvence nukleových kyselin nebo konstrukty nukleových kyselin. Rešení se rovnež týká zpusobu prípravy chirálních karboxylových kyselin z racemických nitrilu, který využívá pripravenou nitrilázu.

Description

Oblast teclmiky
Vynález se týká sekvencí nukleových kyselin, které kódují polypeptid, jež má aktivitu nítrilázy, konstruktů nukleových kyselin, které obsahují tyto sekvence a vektorů, obsahujících sekvence ío nukleových kyselin nebo konstrukty nukleových kyselin. Vynález se dále týká sekvencí aminokyselin, které jsou kódovány sekvencemi nukleových kyselin a mikroorganizmů, obsahujících tyto nukleotidové sekvence, dále se vynález týká konstruktů nukleových kyselin nebo vektorů, obsahujících tyto sekvence nukleových kyselin nebo tyto konstrukty nukleových kyselin.
i5 Vynález se dále také týká způsobu přípravy chirálních karboxylových kyselin z racemických nitrilů.
Dosavadní stav techniky
Existuje potřeba chemické syntézy chirálních karboxylových kyselin. Jsou to výchozí sloučeniny pro velké množství farmaceutických účinných látek nebo účinných složek, používaných v prostředcích pro ochranu úrody. Chirální karboxylové kyseliny se mohou používat ke klasickému dělení racemátů pomocí diastereomemích solí. Tak, R-(-)- nebo S (-)-rnandlová [sic] kyselina se používá např. pro dělení racemických aminů. R-(-}-mandlová kyselina se kromě toho používá jako meziprodukt pro syntézu semisyntetických antibiotik a velkého počtu zemědělských produktů.
Různé syntetické cesty k chirálním karboxylovým kyselinám jsou známy z literatury. Tak např.
opticky aktivní aminokyseliny se získají průmyslově fermentačními procesy. Tyto metody mají nevýhodu, která spočívá v tom, že specifické procesy se musí vyvinout pro každou aminokyselinu zvlášť. To je důvod, proč se používají enzymatické nebo chemické procesy, kteréjsou schopny připravit velmi široký rozsah různých sloučenin. Nevýhodou chemických procesů je, že opticky aktivní centrum se obvykle konstruuje komplikovaně, získává se ve více stupních a není možné aplikovat běžnou syntézu.
Enzymatické syntézy chirálních karboxylových kyselin lze nalézt v řadě patentů nebo patentových přihlášek. WO 92/05 275 popisuje syntézu enantiomemí ch α-hydroxy-aalkyl-nebo aalkylkarboxylových kyselin za přítomnosti biologických materiálů. ΕΡ-Β0 348 901 chrání způ40 sob přípravy opticky aktivních α-substituováných organických kyselin, využívající mikroorganizmy rodů Aícaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. kmen KO-24, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus a Candida. Příprava L-a-aminokyselin s použitím mikroorganizmů je chráněná v ΕΡ-Β0 332 379.
Příprava α-hydroxykarboxylových kyselin, zejména příprava opticky aktivní kyseliny mléčné nebo kyseliny mandlové, s použitím různých mikroorganizmů, jako jsou mikroorganizmy rodů Aícaligenes, Aureobacterium, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Caseobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Nocardia, Variovorax, Arthrobacter a Candida nebo s použitím enzymů je popsána v patentech
EP AO 348 901 nebo jeho US ekvivalent US 5 283 193, EP-A 0 449 648, EP-B 0 473 328,
EP-B 0 527 553 nebo jeho US ekvivalent US 5 296 373, EP-A 0 610 048, EP-A 0 610 049, EP-A 0 666 320 nebo WO 97/32 030.
Nevýhody těchto postupů spočívají v tom, že často vedou k produktům, které mají pouze nízkou optickou čistotu a/nebo v tom, že probíhají pouze s malým výtěžkem na jednotku objemu za jed- 1 CZ 302494 B6 notku času. Toto vede k ekonomicky neatraktivním procesům. Byly dokonce provedeny pokusy zvýšit produktivitu přidáním látek jako je siřičitan, disiřičitan, dithiouhličitan, fosfoman nebo fosforitan (viz EP-A 0 486 289) nebo použitím mikroorganizmů, které mají zvýšenou rezistenci vůči a- hydroxy ni trii um (viz WO 97/32 030), tyto však vedly k zanedbatelnému růstu produkti5 vity.
Podstata vynálezu io Předmětem vynálezu je vyvinout snadno, po stránce nákladů efektivně, široce aplikovatelný proces pro přípravu opticky aktivních chirálních karboxylových kyselin, který by neměl shora zmíněné nevýhody.
Bylo zjištěno, že lze tento úkol vyřešit pomocí způsobu podle vynálezu pro přípravu chirálních is karboxylových kyselin obecného vzorce I
R1 b’ který se vyznačuje tím, že racemické nitrily obecného vzorce II r‘ rM-CR lID
R1 reagují za přítomnosti sekvence aminokyselin, která je kódována sekvencí nukleových kyselin, vybrané ze skupiny, kterou tvoří:
a) sekvence nukleových kyselin, která má sekvenci znázorněnou v příloze jako SEQ ID NO: 1,
b) sekvence nukleových kyselin, které jsou odvozeny od sekvence nukleových kyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 1, jako výsledek degenerace genetického kódu,
c) homology sekvence nukleových kyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 1, které kódují polypeptidy, které mají v celé své délce alespoň 98% homologií se sekvencí SEQ ID NO: 2 a jejichž enzymatická účinnost není snížena oproti sekvenci SEQ ID NO: 2, nebo rostoucího, latentního nebo porušeného mikroorganizmu, který obsahuje buď sekvenci nukleových kyselin ze shora uvedeného souboru, nebo konstrukt nukleových kyselin, který spojuje nukleovou kyselinu z uvedeného souboru s jedním nebo více regulačními signály, přičemž reaguje alespoň 25 mmol nitrilu za hodinu na 1 mg proteinu nebo 25 mmol za hodinu na 1 g suché hmotnosti mikroorganizmu na chirální karboxylové kyseliny, přičemž substituenty ve vzorcích I a II mají následující významy:
* znamená opticky aktivní centrum,
Rl, R2, R3 nezávisle na sobě znamenají vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární C|-Cto-alkyl, C;>-C]0-alkenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR4 nebo NR4R5 a kde radikály Rl, R2 a R3 jsou vždy navzájem od sebe odlišné,
R4 značí vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární C|Cio—alkyl, C> Cio-alkenyl, C|-C]o-alkylkarbonyl, C2-C Hy-alkenyl karbony I, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo h eteroary 1 karbony 1, .
R5 značí vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární Ci-Cjq-alkyl, C3Cjo-alkenyl, aryl nebo heteroaryl.
R1, R2, R3 ve sloučeninách vzorců I a II jsou nezávisle na sobě vodík, substituovaný nebo nesub5 stítuovaný, větvený nebo lineární C|-Cio-alkyl, C2-C[o-alkenyl. substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR4 nebo NR4R5 a kde radikály R1, R2 a R3 jsou vždy různé.
Alkylové radikály, které lze uvést, jsou: substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární C]—Cio-alkyl řetězec jako je, například methyl, ehyl, π-propyl, 1-methylethyl, n-butyl, io 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethy lethy 1, n-pentyl, 1-methy lbutyl, 2-methylbutyl,
3-methylbutyI, 2,2-dimethyIpropyl, 1—ethylpropyl, n-hexyl, 1,1-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 1-methyIpentyl, 2—methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 1,1-dimethy lbutyl,
1.2- dÍmethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethy lbutyl, 3,3-dimethylbutyl,
-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1,1,2-trimethyIpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1-ethyl-l-methyl15 propyl, l-ethyl-2-methylpropyl, n-heptyl, n—oktyl, n-nonyl nebo n-decyl. Methyl, ethyl, npropyl, n-butyl, i-propyl nebo i-butyl jsou výhodné.
Alkenylové radikály které lze zmínit, jsou rozvětvený nebo lineární Cr-Cio-alkenylový řetězec jako je například, ethenyl, propeny 1, 1-buteny 1, 2-butenyl, 3-butenyl, 2-methylpropenyl, 12o pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-l-butenyl, 2-methy!-l-butenyl, 3methyl-l-butenyl, 1 -methy 1-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-methy 13-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, l,l-dimethyl-2-propenyl, 1,2-dimethyl1-propenyl, l,2-dimethyl-2~propenyl, 1-ethyl-I-propenyl, l-ethyl-2-propenyl, 1-hexenyl, 2hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyI, 1-methyl-1-pentenyl, 2-methyl-l-pentenyl, 325 methyl-l-pentenyl, 4-methyI-l-pentenyl, l-methyl-2-pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl, 3methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyI, l-methyI-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyI, 3methyI-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, 1-methy 1-4—pentenyl, 2-methyl—4-pentenyl, 3methy I—4-pentenyl, 4-methyl-4—pentenyl, 1,1 -dimethyl-2-buteny 1, 1,1 -dimethyI-3-butenyl,
1.2- dimethyl-l-butenyl, 1,2-dimethyl-2-butenyl, 1,2—dimethyl-3-butenyl, 1,3-dimethyl-l30 butenyl, 1,3-d i methy 1-2-butenyl, l,3-dimethyl-3-butenyl, 2,2-dimethy 1-3 -buteny 1, 2,3dimethyl-1—butenyl, 2,3-dimethyI-2-butenyl, 2, 3—dimethyl-3-butenyl, 3,3—d i methy 1-1butenyl, 3,3-dimethyl-2-butenyl, 1-ethyl-l-butenyl, l-ethyl-2-butenyl, l-ethyl-3-butenyl, 2ethyl-l-butenyl, 2-ethyl-2-butenyl, 2—ethy 1-3-butenyl, l,l,2-trimethyl-2-propenyl, l—ethyl— l-methyl-2-propenyl, l-ethyl-2-methyl-l-propenyl, l-ethyl-2-methyl-2-propenyl, 135 heptenyl, 2—heptenyl, 3-heptenyl, 4-heptenyl, 5-heptenyl, 6—heptenyl, 1-oktenyl, 2-oktenyl, 3oktenyl, 4—oktenyl, 5-oktenyl, 6-oktenyl, 7-oktenyl, nonenyl nebo decenyl. Ethenyl, propenyl, butenyl nebo pentenyl jsou výhodné.
Arylové radikály, které lze zmínit, jsou substituované a nesubstituované arylové radikály, které obsahují 6 až 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může zahrnovat aromatické kruhy, které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aromatické kruhy navázané přes alkylový, alkyl-karbonylový, alkenylový nebo alkenyl karbony lový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Arylové radikály mohou být, pokud je to žádoucí, také k základnímu skeletu navázány přes C|-C|o-alky1ový, C^-Cg—alkenylový, Cr-C6-alkynylový nebo C3-Cg45 cykloalkylový řetězec. Fenyl nebo naftyl jsou výhodné.
Heteroary ly, které lze zmínit, jsou substituované nebo nesubstituované, monocyklické nebo kondenzované aromatické cyklické systémy s jedním nebo více heteroaromatickými 3- až 7-člennými kruhy, které mohou obsahovat jeden nebo více heteroatomů jako je N, O nebo S a mohou, pokud je to vhodné, být navázány přes Ci-Cio-alkylový, C3-Cg-a lkeny lový nebo Cs-Cg-cykioalkylový řetězec k základnímu skeletu. Příklady heteroarylových radikálů tohoto typu jsou pyrazol, imidazol, oxazol, isooxazol, thiazol, triazol, pyridin, chinolin, isochinolin, akridin, pyrimidin, pyridazin, pyrazin, fenazin, purin nebo pteridin. Heteroarylové radikály mohou být navázány k základnímu skeletu přes heteroatomy nebo pres různé uhlíkové atomy v kruhu nebo v cyklic-3 CZ 302494 B6 kém systému nebo přes substituenty. Výhodné jsou pyridin, imidazol, pyrimidin, purin, pyrazin nebo chinolin.
Vhodnými substituenty na místě uvedených radikálů R1, R2 nebo R1 jsou například jeden nebo více substituentů jako je halogen, jako je fluor, chlor nebo brom, thioskupina, nitroskupina, aminoskupina, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkenyloxyl, alkynyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Důraz je kladen na alkylové radikály jako je C'-C(-alkyl jakoje methyl, ethyl, propyl nebo butyl, aryl jakoje fenyl, halogen jako je chlor, fluor nebo brom, hydroxyl nebo aminoskupina.
io
R4 v OR4 nebo v radikálech NR4R5 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-C|0-alkyl, C2-Ci0-alkenyl, C]-Ci0-alky lkarbonyl, C2-C]0-alkenylkarbonyl, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo hetary lkarbonyl.
Alkylové radikály, které lze zmínit, jsou substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-C'ic,-alkylový řetězec jako je, například, methyl, ethyl, n-propyl, 1-methylethyI, n-butyl, 1 -methy(propyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, n-pentyl, 1-methylbutyl, 2methylbutyl, 3-methyl butyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 1,1-dimethylpropyl,
1.2- dimethylpropyl, 1 -methy Ipentyl, 2-methyl pentyl, 3-methyl pentyl, 4-methylpentyl, 1,1-di20 methyl butyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethy lbutyl, 2,2-dimethy lbutyl, 2,3-d i methyl butyl, 3,3di methyl butyl, 1-ethy lbutyl, 2-ethy lbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1ethyl-l-methylpropyl, l-ethyl-2-methylpropyl, n-heptyí, n-oktyl, n-nonyl nebo n-decyl. Methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, i-propyl nebo i—butyl jsou výhodné.
Alkenylové radikály, které lze zmínit, jsou rozvětvený nebo lineární C2-Cio-alkenylový řetězec jako je, například, ethenyl, propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyI, 2-methyl propeny 1, 1pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-l-butenyl, 2-methyl-l-butenyl, 3methyl-l-butenyl, l-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-buthenyl, 1-methyl3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, l,l-dimethyl-2-propenyl, 1,2-dimethyl30 1-propenyl, l,2-dimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-1-propenyl, l-ethyl-2-propenyl, 1-hexenyl, 2hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1-methyl-l-pentenyl, 2-methyl-l-pentenyl, 3methyl-l-pentenyl, 4-methyl-l-pentenyl, 1-methyl-2-pentenyl, 2-methyl~2-pentenyI, 3methyl-2-pentenyl, 4—methyl-2-pentenyl, l-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 3methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, l-methyl-4-pentenyl, 2-methyM-pentenyl, 335 methy l-4-pentenyl, 4-methyM—pentenyl, 1,1-dimethy 1-2-butenyl, 1,1-dimethyl-3-butenyl,
1.2- dimethyl-l -butenyl, 1,2~d i methy 1-2-butenyl, 1,2-di methy l-3-butenyl, 1,3-dimethyl-lbutenyl, l,3-dimethyl-2-butenyl, l,3-dimethyl-3-butenyl, 2,2-dimethyI-3-butenyl, 2,3d imethyl-1-butenyl, 2,3-d i methy 1-2-butenyl, 2,3-dimethyl-3-butenyl, 3,3-d i methy 1-1butenyl, 3,3-d i methy 1-2-butenyl, 1-ethyl-1-butenyl, 1-ethy 1-2-butenyl, l-ethyl-3-butenyl, 240 ethyl-l-butenyl, 2 ethy 1-2-butenyl, 2-ethyl-3-butenyl, l,l,2-trimethyl-2-propenyl, 1—ethyl—
1- methy l-2-propenyl, l-ethyl-2-methyl-l-propenyl, l-ethyl-2-methyl-2-propenyl, 1heptenyl, 2-heptenyl, 3-heptenyl, 4—heptenyl, 5-heptenyl, 6-heptenyl, 1-oktenyl, 2-oktenyl, 3oktenyl, 4-oktenyl, 5-oktenyl, 6-oktenyl, 7-OktenyI, nonenyl nebo decenyl. Ethenyl, propenyl, butenyl nebo pentenyl jsou výhodné.
Alkyl karbony lové radikály, které lze zmínit, jsou substituovaný nebo nesubstituovaný, rozvětvený nebo lineární Ci-Cto-aIkylkarbonylový řetězec jako je, například, methy lkarbonyl, ethylkarbonyl, n-propy lkarbonyl, 1-methylethylkarbonyl, n-butylkarbonyl, 1-methylpropylkarbonyl,
2- methylpropylkarbonyl, 1,1-dimethyletbylkarbonyl, n-pentylkarbonyl, 1-methylbutylkarbonyl,
2-methylbutyIkarbonyl, 3-methylbutylkarbonyI, 2,2-dimethylpropylkarbonyl, 1-ethylpropylkarbonyl, n-hexy lkarbonyl, 1,1-dimethylpropylkarbonyl, 1,2-dimethylpropylkarbonyl, 1methylpentylkarbonyl, 2-methy Ipentyl karbony 1, 3-methylpentylkarbonyl, 4-methylpentylkarbonyl, 1,1-dimethylbutylkarbonyl, 1,2-dim ethy Ibuty lkarbonyl, 1,3-d i methy Ibuty lkarbonyl,
2.2- dimethylbutylkarbonyl, 2,3-dimethylbutylkarbonyl, 3,3-dimethy Ibuty lkarbonyl, 1—ethyl55 butylkarbonyl, 2-ethylbuty)karbonyl, 1,1,2-trimethylpropylkarbonyl, 1,2,2-trimethylpropyl-4CZ 302494 B6 karbonyl, 1-ethyl-l-methylpropylkarbonyl, 1 -ethy 1-2-methyl propyl karbonyl, n-heptylkarbonyl, n-oktylkarbonyl, n-no nyl karbonyl nebo n-decylkarbonyl. Methyl karbonyl, ethylkarbonyl, n-propylkarbonyl, n-butylkarbonyl, i-propylkarbonyl nebo i-butyl karbonyl jsou výhodné.
Alkenyl karbony lové radikály, které lze zmínit, jsou rozvětvený nebo lineární C2-Ci0-aIkenylkarbonylový řetězec jako je, například, ethenylkarbonyl, propeny 1 karbonyl, 1-butenylkarbonyl, 2-butenyl karbonyl, 3-butenylkarbonyl, 2-methy Ipropenylkarbonyl, 1-pentenylkarbonyl, 2pentenylkarbonyl, 3-pentenyl karbonyl, 4~pentenylkarbonyl, l-methyl-l-butenylkarbonyl, 2methyl-l-butenylkarbonyl, 3-methyl-l-butenylkarbonyl, 1-methy 1-2-buteny lkarbony 1, 2io methy 1-2-buteny I karbonyl, 3-methy 1-2-buteny 1 karbonyl, l-methyl-3-butenylkarbonyl, 2methy 1-3-buteny 1 karbony 1, 3-methy 1-3 -butenyl karbony I, 1,1 -dimethy 1-2-propenyl karbony I,
1.2- dimethy l-l-propenylkarbonyl, l,2-dimethyl-2-propenylkarbonyI, 1-ethyl-l-propenylkarbonyl, l-ethyl-2-propenylkarbonyl, 1-hexenylkarbonyl, 2-hexenylkarbonyl, 3—hexenylkarbonyl, 4-hexenyIkarbonyl, 5-hexenylkarbonyl, l-methyl-l-pentenylkarbonyl, 2-methyl-Ιι 5 pentenylkarbonyl, 3-methy 1-1-pentenylkarbonyl, 4-methyl-l-pentenylkarbonyl, l-metbyl-2— pentenylkarbonyl, 2-methy 1-2-pentenylkarbonyl, 3-methy 1-2-pentenyl karbonyl, 4-methyl-2pentenylkarbonyl, l-methyl-3-pentenylkarbonyí, 2-methyI-3-pentenylkarbonyl, 3-methyl-3pentenylkarbonyl, 4-methy 1-3-pentenylkarbonyl, 1 -methyM-pentenylkarbonyl, 2-methyl—4— pentenylkarbonyl, 3-methyM-pentenylkarbonyl, 4-methy 1-4-pentenylkarbonyl, 1,1-dimethyl20 2-butenytkarbonyl, 1,1-dimethy 1-3-butenylkarbonyl, 1,2-dimethyl-l-butenylkarbonyl, 1,2-dimethy 1-2-butenylkarbonyl, l,2-dimethyl-3-butenylkarbonyl, 1,3-dimethyl-l-butenylkarbonyl,
1.3- dimethy l-2-butenyl karbonyl, 1,3-d i methy 1-3-butenylkarbonyl, 2,2-dimethy 1-3-buteny lkarbonyl, 2,3-dimethyl-l-butenylkarbonyI, 2,3-di methy l-2-butenyl karbonyl, 2,3-dimethyl-3butenylkarbonyl, 3,3-dimethyl-l-butenylkarbonyl, 3,3-dimethyl-2-butenylkarbonyl, 1—ethyl—
1-butenylkarbonyl, l-ethyl-2-butenylkarbonyl, l-ethyl-3-butenylkarbonyl, 2-ethyl-l-butenylkarbonyl, 2-ethyl-2-butenylkarbonyI, 2-ethyl-3-butenylkarbonyl, 1,l,2-trimethyl-2-propenyIkarbony I, 1 -ethy 1-1 -methy l-2-propenyl karbony 1, 1 -ethyl-2-methyl- 1-propeny lkarbony 1, 1 ethyl-2-methyl-2-propenylkarbonyl, 1-heptenylkarbonyl, 2-heptenyl karbonyl, 3-heptenylkarbonyl, 4-heptenylkarbonyl, 5-heptenyl karbonyl, 6-heptenyl karbonyl, 1-oktenylkarbonyl, 230 oktenylkarbonyl, 3-oktenylkarbonyl, 4-oktenyl karbonyl, 5-oktenyl karbonyl, 6-oktenylkarbonyl,
7—oktenyl karbonyl, nonenylkarbonyl nebo deceny lkarbony l. Výhodné jsou ethenylkarbonyl, propeny 1 karbonyl, butenylkarbony 1 nebo pentenylkarbonyl.
Arylové radikály, které lze zmínit, jsou substituované a nesubstituované arylové radikály, které obsahují 6 až 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může obsahovat aromatické kruhy které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aromatické kruhy, které jsou navázané přes alkylový, alkyl karbony lový, alkenylový nebo alkenylkarbonylový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Arylové radikály mohou, pokud je to vhodné, také být navázány přes Cj-Cio-alkýlový, C3-Cg-aIkenylový, C3-Có-alky nýtový nebo C3-Cg-cykloaIkylový řetězec k základnímu skeletu. Fenyl nebo naftyl jsou výhodné.
Arylkarbonylové radikály, které lze zmínit, jsou substituované a nesubstituované arylkarbonylové radikály, které obsahují 6 až 20 uhlíkových atomů v kruhu nebo cyklickém systému. Poslední z nich může obsahovat aromatické kruhy které jsou kondenzované spolu navzájem nebo aro45 matické kruhy, které jsou navázané přes alkyl, alky lkarbony lový, alkenylový nebo alkenylkarbonylový řetězec, karbonyl, kyslík nebo dusík. Fenylkarbonyl nebo naftylkarbonyl jsou výhodné.
Heteroaiyly, které lze zmínit, jsou substituované nebo nesubstituované, monocyklické nebo kondenzované aromatické cyklické systémy s jedním nebo více heteroaromatickými 3- až
7-ělennými kruhy, které mohou obsahovat jeden nebo více heteroatomů jako je N, O nebo S a může, pokud je to vhodné, být navázán přes Cj-Cjo-alkylový, Cr-Cg-alkenylový nebo C3-C8-cykloalkylový řetězec k základnímu skeletu. Příklady heteroarylových radikálů tohoto typu jsou pyrazol, imidazol, oxazol, isooxazol, thiazol, triazol, pyridin, chinolin, isochinolin, akridin, pyrimidin, pyridazin, pyrazin, fenazin, purin nebo pteridin. Heteroarylové radikály mohou být vázané k základnímu skeletu přes heteroatomy nebo přes různé uhlíkové atomy v kru-5CZ 302494 B6 hu nebo kruhovém systému nebo přes substituenty. Heterokarbonylové radikály je termín, kterým se rozumí heteroaromatické radiály, které jsou vázané přes karbonylové radiály na základní skelet. Výhodné jsou pyridin, imidazol, pyrimidin, purin, pyrazin nebo chinolin.
Vhodnými substituenty ve významu uvedeného radikálu R4 jsou např. jeden nebo více substituentů jako je halogen, jako je fluor, chlor, brom, thio, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkeny 1, alkenyloxy, alkynyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Důraz se zde klade na výhodné alkylové radikály jako jsou C]-C6alkyl jako methyl, ethyl, propyl nebo butyl, halogen jako je chlor, fluor nebo brom, hydroxyl io nebo aminoskupina.
Radikál R4 je výhodně vodík.
R5 v radikálu NR4R5 je vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo lineární C[15 Cin-alkyl, C2-C]0-alkenyl, aryl nebo heteroaryl, přičemž alkyl, alkenyl, aryl a heteroarylový radikál mají shora uvedené významy. Zde je výhodný vodík nebo C|-Cicr—alkyl jako je methyl, ethyl nebo propyl.
Vhodné substituenty ve významu R5 radikálu jsou např. jeden nebo více substituentů jako je
2o halogen, jako je fluor, chlor, brom, thioskupina, nitro, amino, hydroxyl, alkyl, alkoxy, alkenyl, alkeny 1, alkenyloxy, alkynyl nebo jiné aromatické nebo jiné nasycené nebo nenasycené nearomatické kruhy nebo cyklické systémy. Zde je důraz kladen na alkylové radikály jako je Ci —Cr,—alkyl jako je methyl, ethyl, propyl nebo butyl, aryl jako je fenyl, halogen jako chlor, fluor nebo brom, hydroxyl nebo aminoskupina.
Dále je možné, aby dva přiléhající R substituenty R4 nebo R5 spolu tvořily jiný substituovaný nebo nesubstituovaný aromatický, nasycený nebo částečně nasycený kruh s 5 až 6 atomy v kruhu, který může obsahovat jeden nebo více heteroatomů jako je O, N nebo S.
Je výhodné, když jeden ze substituentů R1, R2, nebo R3 ve vzorcích I a II je aryl, jako např. fenyl. Dále je výhodné, aby jeden ze substituentů Rl, R2, nebo R3 ve vzorcích I a II byl hydroxyl a jeden aby byl vodík nebo methyl.
Způsob podle vynálezu se výhodně provádí při pH v rozmezí od 4 do 11, výhodně od 4 do 9.
Dále je výhodné použít od 0,01 do 10 hmotnostních % nitrilu nebo 0,01 až 10 hmot. % odpovídajícího aldehydu nebo ketonu a 0,01 až 10 % hmot. kyanovodíkové kyseliny. Způsob se výhodně provádí v přebytku kyanovodíkové kyseliny. Za určitých okolností to vede k obsahům kyanovodíkové kyseliny, kteréjsou vyšší než ty, kteréjsou uvedeny. Pro reakci lze použít různá množství nitrilu, což závisí na povaze nitrilu. Nejmenší množství (= množství mezi 0,01 až 5 % hmotnostními) nitrilu se výhodně používá pokud jde o nitrily, (kyanhydriny), které jsou v rovnováze s odpovídajícími aldehydy a kyanovodíkovou kyselinou. Aldehyd je pochopitelně obvykle toxický pro organizmy nebo enzymy. Těkavé nitrily jsou obdobně výhodné v množstvích mezi 0,01 a 5 hmotn. %. Tato reakce se zpomaluje působením větších množství kyanhydrinu nebo nitrilu.
V případě nitrilu, které mají pouze nízkou nebo zdánlivou rozpouštěcí schopnost nebo nitrilu, které se rozpouštějí pouze v malých množstvích ve vodném prostředí je možné a výhodné použít větších množství, než jsou ta, která jsou uvedená shora. Ke zvýšení konverze a výtěžku se může reakce výhodně provádět za použití kontrolovaného přidávání racemického nitrilu. Produkt se dá po dokončení reakce izolovat nebo nějakým způsobem kontinuálně odstraňovat z reakce ve vedlejším proudu.
Shora uvedené aldehydy a ketony znamenají sloučeniny, které tvoří nitril po reakci mezi aldehydem a ketonem a kyanovodíkovou kyselinou, přičemž reakce je kysele katalyzována. Reakce mezi aldehydem a kyanovodíkovou kyselinou má za následek kyanhydriny, které mají výhodu v tom, že jsou v rovnováze s aldehydem a kyanovodíkovou kyselinou. Nastavení rovnováhy pomo-6CZ 302494 B6 cí kyanhy dřinu znamená, že je možné pomocí enzymu, který převádí pouze jeden enantiomer nitrilu, získat 100% výtěžek teorie tohoto enantiomeru, neboť racemický nitril se kontinuálně převádí zpět na výchozí složky. Všechny ostatní nitrily, vzhledem k tomu, že nejsou převáděny enzymem (= „špatný“ nebo jiný enantiomer) se výhodně racemizují pomocí chemické reakce a vracejí se do procesu s cílem dosáhnout opět teoretického výtěžku 100 %, nebo se musejí odstraňovat nebo čistit a chemicky hyarolyzovat, přičemž zůstává chirální centrum ve sloučenině.
Způsob podle vynálezu se výhodně provádí pri teplotě mezí 0 a 80 °C, výhodně mezi 10 a 60 °C, io mimořádně výhodně mezi 15 a 50 °C.
Racemické nitrily v tomto způsobu podle vynálezu znamenají nitrily, které sestávají ze směsi enantiomeru 50 : 50 nebo jakékoliv jiné směsi, ve které je obohacen jeden nebo druhý enantiomer.
Chirální karboxylové procesy pri popisu způsobu podle vynálezu znamenají ty, které jsou obohaceny o některý enantiomer. Způsob se výhodně vede tak, že výsledná látka je stereochemicky čistá alespoň do 90 %, výhodně minimálně 95 %. Zejména výhodně minimálně 98 %, velmi výhodně minimálně 99 %.
Způsob podle vynálezu umožňuje převádět velká množství racemických nitrilů na chirální karboxylové kyseliny. V tomto procesuje možno převést nejméně 25 mmol nitrilů za hodinu na mg proteinu nebo nejméně 25 mmol nitrilů za hodinu na g suché hmotnosti mikroorganizmů, výhodně nejméně 30 mmol nitrilů za hodinu na mg proteinu nebo nejméně 30 mmol nitrilů za hodinu na g suché hmotnosti, zejména výhodně nejméně 40 mmol nitrilu za hodinu na mg proteinu nebo nejméně 40 mmol nitrilu za hodinu na g suché hmotnosti, velmi výhodně nejméně 50 mmol nitrilu za hodinu na mg proteinu nebo nejméně 50 mmol nitrilu za hodinu na g suché hmotnosti.
Ve způsobu podle vynálezu je možné použít kultury buněk, které obsahují nukleové kyseliny, konstrukce nukleovýeh kyselin nebo vektory podle vynálezu. Je také možné použít spících (latentních) nebo narušených buněk. Narušené buňky znamená např. buňky, které jsou upraveny jako polopropustné působením např. rozpouštědel nebo buňky, které byly dezintegrovány ošetřením enzymem, mechanickým působením (např. francouzský Hs nebo ultrazvuk) nebo nějakou jinou metodou. Surové extrakty, získané tímto způsobem, jsou vhodné a dokonce výhodné pro způsob podle vynálezu. Čištěné nebo částečně čištěné enzymy se pro tento proces také dají použít. Pri reakci se mohou výhodně použít mobilizované mikroorganismy nebo enzymy.
Chirální karboxylové kyseliny, připravené způsobem podle vynálezu, se mohou výhodně izolovat z vodného reakčního roztoku extrakcí nebo krystalizaci nebo extrakcí a krystalizaci. Pro tento účel se okyselí reakční roztok kyselinou, např. jako je minerální kyselina (např. HCI, H?SO4) nebo organickou kyselinou, výhodně hodnoty pH pod 2, a poté se dá použít v extrakci organické rozpouštědlo. Extrakce se dá opakovat několikrát, Čímž je možné výtěžek zvýšit. Organická rozpouštědla, která se v tomto případě mohou použít, jsou v podstatě veškerá rozpouštědla, která vykazují fázovou hranici s vodou, přičemž po případě se přidává do směsi nějaká sůl. Vhodnými rozpouštědly jsou rozpouštědla jako je toluen, benzen, hexan, methylterc-butyléter nebo ethylacetát.
Po zahuštění organické fáze se může produkt obvykle izolovat v dobré chemické čistotě, což znamená chemickou čistotu větší než 90 %. Po extrakci se může produkt nicméně dále čistit a zahušťovat a krystalovat. Pro tyto účely se roztok výhodně ochladí na teplotu v rozmezí Oaž 10 °C. Krystalizace se také může provádět přímo z organického roztoku. Krystalizovaný produkt se může oddělit pomocí stejného rozpouštědla nebo různých rozpouštědel pro opakovanou krystalizaci a může se krystalovat opět. Následné krystalizace mohou být alespoň jednou
-7CZ 302494 B6 podle postavení eutektieké kompozice, dále čištěny za účelem zvýšení enantiomemí čistoty produktu.
Nicméně, chirální karboxylové kyseliny se mohou také vykrystalovat z vodného reakčního roztoku ihned po okyselení kyselinou na pH výhodně pod 2. Tento postup se výhodně provádí tak, že vodný roztok se zahustí zahřátím a snížením objemu o 10 až 90 %, výhodně o 20 až 80 %, zejména výhodně o 30 až 70 %. Krystalizace se výhodně provádí ochlazením. Teploty mezi 0 až 10°C jsou výhodné pro krystalizaci. Přímá krystalizace z vodného roztoku je výhodná, neboť nepředstavuje příliš velké náklady. Je také výhodné pracovat s chirálními kyselinami pomocí io extrakce a, pokud je to nutné, následné krystalizace.
Pomocí těchto typů zpracování je možné získat způsobem podle vynálezu produkt ve výtěžku od 60 do 100 %, výhodně od 80 do 100 %, zejména výhodně od 90 do 100 %, počítáno na nitril použitý pro reakci. Izolovaný produkt má vysokou chemickou čistotu větší než 90 %, výhodně větší než 95 %, zejména výhodně větší než 98 %. Kromě toho má produkt vysokou enantiomemí čistotu, která se dá ještě zvýšit další krystalizaci.
Produkty získané touto cestou jsou použitelné jako výchozí látky pro organické syntézy k přípravě účinných látek nebo agrochemikálií nebo pro dělení racemátu.
Vynález se dále týká izolované sekvence nukleových kyselin, která kóduje peptid, který má nitrilázovou aktivitu, vybrané ze skupiny, kterou tvoří:
a) sekvence nukleových kyselin, která má sekvenci, znázorněnou jako SEQ ID NO: 1,
b) sekvence nukleových kyselin, které jsou odvozeny od sekvence nukleových kyselin, znázorněné na SEQ ID NO: 1, jako výsledek degenerace genetického kódu,
c) homology sekvence nukleových kyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 1, které kódují poly30 peptidy, které mají v celé své délce alespoň 98% homologii se sekvencí, znázorněnou jako
SEQ ID NO: 2 a jejichž enzymatická účinnost není snížena oproti SEQ ID NO: 2.
Pod pojmem homology sekvence nukleových kyselin podle vynálezu, které mají sekvenci SEQ ID NO: 1, se rozumí např. alelové varianty, které mají alespoň 98% homologii se sekvencí
SEQ ID NO: 2, přičemž tato homologie se počítá po celé délce sekvence. Je možné a výhodné, aby byly homologie v oblasti regionu, tvořícího část sekvencí vyšší. Sekvence aminokyselin, odvozené od SEQ ID NO: 1, jsou patrné z SEQ ID NO: 2. Alelové varianty zahrnují zejména funkční varianty, které jsou získatelné delecí nebo insercí nukleotidů ze sekvence, znázorněné na SEQ ID NO: 1, přičemž získané odvozené syntetizované proteiny organismu, který se po zave40 dění jednoho nebo více těchto genů získá, by neměly mít znatelně nižší enzymatickou aktivitu. Vynález se také týká sekvenci aminokyselin, které jsou kódovány souborem sekvencí nukleových kyselin, který byl popsán shora. Vynález se výhodně týká sekvencí aminokyselin, kódovaných sekvencí SEQ ID NO; 1.
Výraz „homology SEQ ID NO: 1“ také znamená např. houbové nebo bakteriální homology, omezené sekvence, jednořetězcové DNA nebo RNA kódujících nebo nekódujících DNA sekvenci. Homology SEQ ID NO: 1 mají na DNA úrovni homologii nejméně 60 %, výhodně alespoň 70 %, velmi výhodně alespoň 80 %, mimořádně velmi výhodně alespoň 90 %, počítáno přes celý DNA region, uvedený v SEQ ID NO: 1.
Termín homology SEQ ID NO: 1 kromě toho také znamená deriváty jako jsou např. promotorové varianty. Tyto promotory, které předcházejí uvedeným nukleotidovým sekvencím, se mohou modifikovat jednou nebo více výměnami nukleotidů, insercí (emi) a/nebo delecí (emi), bez toho, že by při těchto změnách došlo k nežádoucímu vlivu na funkcionalitu nebo účinnost promotoru.
-8CZ 302494 B6
Promotory se mohou kromě toho vylepšit po stránce účinnosti změnou jejich sekvence nebo úplným zaměněním více účinnými promotory, dokonce z organismů jiného druhu.
Termín „deriváty“ také znamená varianty, jejichž sekvence nukleových kyselin v regionu od -1 do -200 v řadě od výchozího kodonu nebo od 0 do 1000 párů bází po stop kodonu jsou modifikovány takovým způsobem, Že exprese genu a/nebo exprese proteinu je pozměněná, výhodně zvýšená.
SEQ ID NO; 1 nebo její homology se mohou výhodně izolovat způsoby, které jsou odborníkům io z oboru známy, z bakterií, výhodně z gram-negativních bakterií, zejména výhodně z bakterie rodu Alcaligenes, velmi výhodně z bakterie rodu a druhu Alcaligenes faecalis.
SEQ ID NO: l nebo její homology nebo částí těchto sekvencí se mohou připravit z jiných druhů hub nebo bakterií, např. s použitím běžných hybridizačních technik nebo PCR technik. Tyto
DNA sekvence hybridizují za standardních podmínek se sekvencemi podle vynálezu. Hybridizace se výhodně provádí s krátkými oligonukleotidy konzervovaných regionů, např. z aktivního centra a tyto připravené meziprodukty se pak identifikují způsobem, který je pracovníkovi zběhlému v oboru známý, přičemž se provádějí srovnání s jinými nitrilázami nebo nitrilhydratázami. Nicméně pro hybridizací je také možné použít delších fragmentů nukleových kyselin podle vyná2o lezu nebo úplných sekvencí. Tyto standardní podmínky se mohou poněkud měnit v závislosti na použitém oligonukleotidu nukleové kyseliny, délce fragmentu nebo úplné sekvenci nebo v závislosti na tom, jaký typ nukleové kyseliny, DNA nebo RNA, se používá pro hybridizací. Takže např. teploty tání hybridů DNA: DNA jsou o zhruba 10 % nižší, než teploty tání hybridů DNA:RNA stejné délky.
Termín „standardní podmínky“ znamená, např. v závislosti na nukleové kyselině, teploty mezi 42 a 58 °C ve vodném pufrovaném roztoku s koncentrací mezi 0,1 až 5 x SSC (1 x SSC = 0,15M NaCl, 15mM citronan sodný, pH 7,2) nebo přídavně za přítomnosti 50% formamidu, jako je např. 42 °C v 5 x SSC, 50% formamid. Hybridizační podmínky DNA:DNA hybridy výhodně zahrnují 0,1 x SSC a teploty mezi asi 20 až 45 °C, výhodně mezi 30 a 45 °C. Hybridizační podmínky pro hybridy DNA:RNA výhodně zahrnují 0,1 x SSC a teploty mezi asi 30 a 55 °C, výhodně mezi asi 45 a 55 °C, Tyto teploty, které jsou zde uvedeny pro hybridizací, jsou teploty tání, vypočtené pomocí příkladu nukleové kyseliny s délkou asi 100 nukleotidů a obsahem G + C 50 % při absenci formamidu. Experimentální podmínky pro DNA hybridizací jsou popsány v odpovídajících příručkách a textech z oboru genetiky jako je např. Sambrook et al„ „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, a mohou být stanoveny pomocí vzorců, které jsou známy odborníkům v oboru, např. v závislosti na délce nukleové kyseliny, povaze hybridů nebo obsahu G + C. Zkušený pracovník může další informace o hybridizací najít v následujících publikacích: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Výraz konstrukt nebo konstrukce nukleové kyseliny podle vynálezu znamená nitrilázový gen sekvence SEQ ID NO: 1 a jeho homology, který má výhodně funkční napojení na jeden nebo více regulačních signálů, které zvyšují expresi genu. Tyto regulační sekvence jsou např. sekvence, ke kterým se indukční členy nebo represory váží a tím regulují expresi nukleové kyseliny. Kromě těchto nových regulačních sekvencí je také možné, aby byla přítomna přírodní regulace těchto sekvencí před vlastními strukturálními geny a pokud je to žádoucí, aby byly geneticky modifikovány tak, že přírodní regulace je vypnuta a exprese genů je zvýšena. Konstrukt nukleové kyseliny může, nicméně, také mít jednodušší strukturu, což znamená, že nejsou vloženy žádné regulační signály před sekvenci SEQ ID NO: 1 nebo její homology a přírodní promotor s regulací není zrušen. Místo toho je přírodní regulační sekvence mutována takovým způsobem, že regulace se již neuplatňuje a je zvýšená exprese genu. Konstrukt nukleové kyseliny může kromě toho výhodně zahrnovat jednu nebo dvě podpůrné sekvence, které zvyšují expresi možné sekvence
-9CZ 302494 B6 aminokyselin, funkčně napojené na promotor. Je také možné vložit výhodné přídavné sekvence na 3'- konec DNA sekvence tak, jako by to byly jiné regulační elementy nebo terminátory. Nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být přítomny v konstruktu v jedné nebo více kopiích. Konstrukt může také zahrnovat další markéry jako jsou geny rezistence proti antibiotikům nebo auxotrofně komplementaění, pokud je to vhodné pro výběr konstruktu.
Výhodné regulační sekvence pro způsob podle vynálezu jsou např. přítomny v promotorech jako je cos, tac, trp, tet, trp-tet, 1 pp, lac, 1 pp-lac, lacf, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-Ρκ nebo Á-PL promotor, které jsou výhodně používány v gram- negativních bakteriích. Další výhodné reguio lační sekvence jsou, např. gram-pozitivní promotory amy a SPO2, v houbových nebo kvasinkových promotorech ADCI, MFa, AC, P-60, CYCI, GAPDH, TEF, rp28 a ADH. V tomto směru jsou také výhodné promotory i pyruvátdekarboxylázy a methanoloxidázy např. z Hansenuly. Pro regulaci je také možné použít umělé promotory.
Konstrukt nukleové kyseliny se výhodně vkládá do vektoru jako je např. plazmid, fág nebojiná DNA pro expresi v hostitelském organismu, což způsobuje optimální expresi genů v hostiteli, která je možná. Tyto vektory představuje další vývoj vynálezu. Příklady vhodných plazmidů vE.Coli jsou pLG338, pACYC184, pBR322, pUCI8, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-111 -Β 1, Agtl 1 nebo pBdCl, u Streptomyces jsou
2o to plJlOl, pIJ364, pIJ702 nebo plJ361, u Bacillusjsou to pUBl 10, pC194 nebo pBD214, u Corynebacterium jsou to pSA77 nebo pAJ667, u hub jsou to pALSl, plL2 nebo pBBl 16, v kvasinkách jsou 2 μΜ, pAG-1, Yep6, Yepl3 nebo pEMBLYe23 nebo v rostlinách jsou pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 nebo pDH51. Uvedené plazmidy představují malý výběr možných plazmidů. Další plazmidy jsou dobře známy odborníků v oboru a lze je nalézt např. v knize Clo2? ning Vectors (eds. Pouwels P. H. et ak Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
Konstrukt nukleové kyseliny také výhodně obsahuje, za účelem exprese jiných přítomných genů, navíc 3' a/nebo 5' terminální regulační sekvence, které zvyšují expresi, což je zvoleno pro opti30 mál ní expresi v závislosti na zvoleném hostitelském organismu a genu nebo genech.
Tyto regulační sekvence jsou připojovány za tím účelem, aby se dosáhlo nejlépe specifické exprese genů a proteinů, která je možná. To může znamenat, že např. v závislosti na hostitelském organismu, ve kterém je gen exprimován nebo exprimován pouze po indukci nebo že je ihned exprimován nebo exprimován.
Regulační sekvence nebo faktory mohou kromě toho výhodně mít vliv pozitivní a tím zvyšovat expresi zaváděných genů. Podpora regulačních elementů se také může výhodně provádět na úrovni transkripce, použitím ostrých transkřípěních signálů jako jsou promotory a/nebo podpůrné elementy.
V dalším provedení mohou vektory podle vynálezu obsahovat konstrukt nukleové kyseliny nebo nukleovou kyselinu podle vynálezu obsahující vektor ve formě lineární DNA v mikroorganismech, a dokonce heterologní nebo homologní rekombinace v genomu účinného organismu, které jsou tam integrovány. Tyto lineární DNA mohou být z linearizovaného vektoru jako je plazmid nebo pouze mohou představovat konstrukt nukleové kyseliny nebo nukleovou kyselinu.
Pro optimální expresi heterologních genů v organismu je výhodné modifikovat sekvence nukleových kyselin v souladu s kodonem, specificky používaném v daném organismu. Použití kodonu se dá snadno navrhnout na základě počítačové analýzy jiných známých genů v relevantním organismu.
Vhodnými hostitelskými organismy pro nukleovou kyselinu podle vynálezu nebo pro konstrukt nukleových kyselin jsou principiálně všechny prokaryotické nebo eukaryotické organismy. Hosti55 telskými organismy, které se dají výhodně použít, jsou mikroorganismy jako jsou bakterie, houby
- 10CZ 302494 B6 nebo kvasinky. Je výhodně používat gram-pozitivní nebo gram-negativní bakterie, výhodně bakterie čeledi Enterobacteriaceae nebo Nocardiaceae, zejména výhodně bakterie rodu Escherichia pseudomonas nebo Rhodococcus. Velmi významné jsou rody a druhy Escherichia coli.
Hostitelský organismus podle vynálezu kromě toho může výhodně obsahovat nejméně jedno proteinové činidlo pro zachycování polypeptidu, kteréjsou syntetizovány a zejména sekvencí nukleových kyselin, které mají nitrílázovou aktivitu, popsaných v tomto vynálezu a/nebo geny kódující toto činidlo, přičemž množství tohoto činidla, které je přítomno, by mělo být větší než odpovídající základní množství v mikroorganismu. Geny, kódující toto činidlo jsou přítomny v chroio mozomu nebo v extrachromozomálních útvarech jako jsou např. plazmídy.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Čištění nitrilázy od směsi získané kultivací Alcaligenes faecalis 1650
1. Namnožení buněk
2o Alcaligenes faecalis 1650 byl kultivován s pomocí třepáni v kultivačním roztoku A při 35 °C po dobu 8 hodin.
Kultivační roztok A:
Kvasinkový extrakt 5 g/i
pepton 3,5 g/i
CH3CO2NH4 5 g/i
kh2po4 5 g/i
MgS04 0,2 g/i
KeSC>4 0, 03 g/i
NaCl i g/i
Butyronitril 1 g/i
200 ml této předem připravené kultury bylo použito k inokulaci 10 1 fermentoru, obsahujícího 8 1 čerstvého kultivačního roztoku A. pH, teplota, průtok vzduchu a rychlost míchání byly 7,2; 30 °C, 300 1/h a 300 otáček/min. Po 22 hodinách bylo získáno 81 g vlhké biomasy. To odpovídá suché hmotnosti buněk 3,8 g/1 a optické hustotě při 600 nm 8.
2. Stanovení enzymatické aktivity nitrilu kyseliny mandlové
Buňky byly získány způsobem, který je popsán v příkladu 1 a dvakrát promyty v lOmM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 40 mg suché hmotnosti buněk bylo resuspendováno ve 20 ml lOnM
Na/K fosfátového pufru, pH 6,8 a reakce byla zahájena přidáním 8,3mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna při 40 °C, přičemž byla reakění směs protřepávána. Kinetika dělení racemátu byla sledována odebíráním vzorku a následným odstraňováním buněk s použitím vysoce výkonné kapalinové chromatografíe (ODS Hypersil). V tomto případě byly stanoveny nitril kyseliny mandlové, benzaldehyd, amid kyseliny mandlové a mandlová kyselina. Výsledky jsou znázorněny na obr. 1 (konverze nitrilu kyseliny mandlové na mandlovou kyselinu, vsázky). Rychlost vzniku kyseliny mandlové je 41,3 U/g suché hmotnosti buněk s 30% konverzí, přičemž 1 U je definováno jako vznik 1 pmol kyseliny mandlové za minutu při 40 °C.
3. Stanovení enzymatické selektivity na nitril kyseliny mandlové
Buňky byly získány jak je popsáno v příkladu I a promyty dvakrát 10 mmol/1 Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 40 mg suché hmotnosti buněk bylo resuspendováno ve 20 ml 10 mmol/1 Na/K fosfátového pufru, pH 6,8 a reakce byla zahájena přidáním 8,3mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna s použitím třepáni při 30 °C. Kinetika byla sledována odebíráním vzorků a následným odstraněním buněk s přídavnou vysoko účinnou kapalinou chromatografii (Nucleodex β-ΡΜ). V tomto případě byla stanovena S-(+)- a R-(-)- mandlová kyselina. Optická čistota io vytvořené R-(-)-mandlové kyseliny (R MA) byla 98 % při 50% konverzi. Selektivita enzymů (= E) byla 499 při 50% konverzi.
4. Čištění
Pokud není stanoveno jinak, ve všech pufrech v průběhu čištění bylo přítomno lOmM DTT.
Krok I: Narušení buněk
Buňky byly získány podle postupu, který je popsán v příkladě 1 ze dvou 10 I fermentací v kaž20 dém případě a byly odstředěny a dvakrát promyty 1 I 0,lM Tris/HCl pufru pH 7,2. Výtěžek byl asi 162 g vlhké hmotnosti buněk. V každém z případů bylo 81 g vlhkých buněk resuspendováno v 160 ml 0,lM Tris/HCl pufru, pH 7,2 a byly narušeny čtyřikrát v zařízení Menton-Gaulin při tlaku 750 barů. Homogenizát byl pak odstředěn při 30 000 g po dobu 39 minut a peleta byla odstraněna. Supernatant (140 ml) měl zbytkovou aktivitu 73 %, jakje ukázáno v tabulce 1.
Krok 2: Chromatografie na iontoměniči
Supernatant byl zředěn na 400 ml pufrem A (20mM Tris/HCl, pH 8,5) a odstředěn ještě jednou při 23 000 g po dobu 20 min. 350 ml bylo pak vloženo na Q-sepharosovou kolonu (průměr 5 cm, výška 22 cm, objem 432 ml, náplň: „Q-sepharose Fast Flow“ od firmy Pharmacia) v pufru A. Zprvu bylo použito pro promývání kolony 10% pufru B (jako pufr A s přídavkem ÍM NaCl) při průtoku 20 ml/min, (celkové množství přivedeného objemu odpovídalo 1,5 I). V průběhu 90 min. byl objem zvýšen na 60 % B, přičemž zvýšení bylo lineární. Od 91. do 120. minuty byl pak použit k vymytí kolony 100% pufr B. Na výstupu kolony bylo odebráno 100 40ml frakcí, Nitrilá35 za byla eluována mezi frakcemi 50 a 60. Frakce byly spojeny a zahuštěny na objem 10 ml ultrafíltrací přes membránu o propustnosti lOkDa(Amicon).
Krok 3: Chromatografie na molekulárním sítě
Koncentrát z chromatografie na iontoměniči (z kroku 2) byl dále čištěn ve dvou částech, z nichž každá byla 5 ml, pomocí chromatografie na molekulárním sítě (Superdex 200 preparativní kvalita, Pharmacia, separační interval 10 až 600 kDa, průměr 2,6 cm, výška 60 cm, objem 325 ml). Detekce se prováděla při 280 nm. Kolona byla ekvilibrována 20mM fosfátovým pufrem, pH 7,4; 5 mM DTT a 150mM NaCl a byla používána při průtoku 1,5 ml/min. Bylo shromážděno
40 frakcí a nitrilově-hydrolyzační aktivita byla nalezena ve frakcích 3 až 5.
Krok 4: Chromatografie na iontoměniči
Spojené frakce z chromatografie na molekulárním sítě (z kroku 3) byly čištěny dále iontoměničo50 vou chromatografii na koloně Mono Q (objem kolony 1 ml. Mono Q HR5I5, Pharmacia). Byl použit pufr A, 20mM Tris/HCl, pH 8,5; 5mM DTT a pufr B byl stejný jako A s přídavkem ÍM NaCl. Průtok byl 1 ml/min. Účinná frakce z molekulárního síta (asi lOOml) byla zředěna na vodivost asi 6 mS/cm a byla nanesena přímo kolonu Mono Q, přičemž protein byl tímto způsobem adsorbován. Kolona byla promyta 5 % pufru ihned po nanesení dělené směsi. Kolona pak
- 12CZ 302494 B6 byla eluována s gradientem od 5 do 40 % B v průběhu 30 min., načež následovalo promytí 100 % B po dobu 10 min. Nitriláza byla eluována ve frakcích 17 a 18, v průběhu gradientu.
Kroky 1 až 4 jsou znázorněny v tabulce I.
Tabulka I: Schéma čištění
Vzorek Objem (ml) Aktivita (U/1) Celková aktivita (mU) Výtěžek í%) Protein (mg/ml) Celkový protein (mg) Specií. aktivita (U/g)
Před narušením 160 430 76 300 . 100 — - -
Po narušení 140 400 56 000 72,9 — - -
Q-Sepharose
Naneseno Γ 140 192 26 380 35 12,4 1736 15
AF 1 400 77 30 800 40,1 0,26 104 296
Superdex 200
Naneseno 9,5 >378 >3591 4,7 2,41 22,90 | >157
AF 43 59 2537 3,3 0,21 9,03 { 231
Mono Q
Naneseno ICO 4,3 480 0,6 0,06 6,33 76
AF 4 >77 308 0,4 0,19 0,76 >405
Aktivní frakce (= AF, v tab. I) z chromatografíe na molekulárním sítě (krok 3) až iontoměničové io chromatografíe (krok 4) byly frakcionovány na Mono Q pomocí SDS-PAGE, jak je znázorněno na obr. 2.
Krok 5: Kapalinová chromatografíe na reverzní fázi (RP) s vysokou účinností [lacuna]
Aktivní frakce (frakce 17 a 18) z chromatografíe na Mono Q (krok 4) byly kontrolovány na homogenitu pomocí RP y chromatografíe a dále čištěny, aby se připravilo trypsinové štěpení. Oddělování bylo prováděno pomocí kolony Abimed (3 cm) na zařízení Hewlett-Packard (HP 1090). Mobilní fáze byla pufr A: voda s 0,1 % TFA a pufr B: acetonitril s 0,1 % TFA. Vstřikovaný objem byl 0,1 ml, průtok byl 0,5 ml/min.
Ruční gradient měl následující profil:
Minuty % pufru A % pufru B
0 80 20
2 80 20
22 30 70
22,1 0 100
24 0 100
25 100 0
30 100 0
Nitriláza se vymývala mezi 12. a 13. minutou. To odpovídá pásmu 37 kDa v SDS-PAGE. Toto pásmo bylo potom specielně sekvencováno pomocí proteinového sekvenátoru Applied Biosys25 tems 494 Procise. N-terminální sekvence 39 aminokyselin, která byla získána touto cestou, je uvedena jako SEQ ID NO: 3 v dalším textu. Tato sekvence je zahrnuta v příloze sekvencí a je:
- 13 CZ 302494 B6
Met Gin Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gin Ala Ala Ser
Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Tie Glu Leu Ala
Arg Gin Ala Arg Asp Glu Gly.
Příprava tryptických peptidů
Vzorek z Mono O ehromatografle (krok 4) byl předběžně zpracován následovně: protein (asi
0,6 mg) byl vysrážen přídavkem 12,5 % TCA a peleta byla promyta třikrát 1 ml směsi éteru s ctanolem (1:1). Tato peleta byla pak rozpuštěna v 0,2 ml 6M guanidinu HCl, 25mM tris/HCl, pH 8,5. K tomuto roztoku pak bylo přidáno 2,6 μΙ 1M DTT, aby se omezily disulfidové můstky. Získaný vzorek byl třepán v temném prostředí po dobu I hodiny. Protein pak byl uveden do reakce s 1,5 μΐ 4-vinylpyridinového roztoku (35 %) v temném prostředí a po dobu 2 hodin. Reakce ío byla ukončena s inkubací s 2,6 μΙ 1M DTT roztoku po dobu 1 hodiny. Vinylpyridovaný enzym byl čištěn pomocí RPHPLC, jak je popsáno shora. Doba zdržení byla v tomto případě mezi 10 a 11 minutami. Aktivní frakce, která byla identifikována podle molekulové hmotnosti, byla shromážděna a zahuštěna na objem 0,02 ml. Takto získaný produkt byl adjustován na objem 0,2 ml přidáním 0,01 ml acetonitrilu a 0,lM Tris/HCl, pH 8,5. pH bylo upraveno také, což bylo prove15 děno přidáním 0,05 ml 0,lM NaOH. Tento vzorek (odhadnuté množství proteinu 0,3 mg) byl smíchán s 0,032 ml roztoku s obsahem 1 mg/ml trypsinu v 0,lM Tris/HCl, pH 8,5; 5 % acetonitrilu a inkubován při 37 °C přes noc. Digesce byla zastavena přidáním 0,01 ml kyseliny octové, načež následovalo odstředění. Supematant byl oddělen pomocí RP-HPLC na Cl 8 (eluční systém: pufr A: voda, 0,01 % TFA, pufr B: acetonitril, 0,1 % TFA). Peptidy (detekce při 205 nm a 280 nm) byly odděleny a sekvencovány. Při tom byl použit sekvenátor Applied Biosystems 494 Procise pro sekvencování proteinů. Vnitřní peptidová sekvence 21 aminokyselin je uvedena dále jako SEQ ID NO: 4 a vnitrní sekvence 11 aminokyselin je dále uvedena jako SEQ ID NO: 5. Obě tyto sekvence jsou také přiloženy v seznamu sekvencí, a jsou:
SEQ ID NO: 4
Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala Tle Ser His Pro Gin
SEQ ID NO: 5
Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys
6. Aktivita čištěné nitrilázy na nitril kyseliny mandlové
Aktivita čištěné nitrilázy na nitril kyseliny mandlové byla zkoumána způsobem, který je popsán v příkladu 2. Specifická aktivita čištěného proteinu na nitril kyseliny mandlové byla 12 380 U/g proteinu.
Příklad 2: Klonování nitrilázy z mikroorganismu Alcaligenes faecalis 1650
Nejprve byly syntetizovány nukleotidové próby, odvozené od peptidových sekvencí SEQ ID NO:
3 a 4, které jsou popsány v příkladu 1. Nukleotidová próba, odvozená od SEQ ID NO: 3,
N-terminální peptidová sekvence, byla 64krát degenerována 23 memími (v sekvenci nukleotidové próby A, C, G nebo T je nahrazeno N; A nebo G je nahrazeno R; C nebo G je nahrazeno S). Vysoké procento GC v kmenech Alcaligenes, popsaných v literatuře (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111 až 2118) znamená, že v tomto případě byl ve třetí pozici kodonu předpově40 zen glutamin a izoleucin. Nukleotidová próba, o které se zde hovoří, dále jako SEQ ID NO: 6, je 5' primer pro následné PCR, přičemž S - C nebo G a N = A, C, G nebo T a je:
- 14CZ 302494 B6
SEQ ID NO: 6
5'-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3'
256krát degenerovaný 20 mer byl odvozen jako nukleotidová próba z SEQ ID NO: 4, což je vnitrní peptidová sekvence (v sekvenci nukleotidových bází je A, C, G nebo T nahrazeno N; A nebo G je nahrazeno R; C nebo G je nahrazeno S). Vysoké procento GC v kmenech Alcalige5 nes, které v tomto případě znamenalo předpověď lysinu na třetí pozici v kodonu. Tato nukleotidová próba je 3-primer pro následné PCR aje uvedena v následujícím textu jako SEQ ID NO: 7. Je také zahrnutá do přiloženého seznamu sekvencí aje:
SEQ ID NO: 7
5'-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3'
Tyto párové primery, SEQ ID NO: 6 a 7, byly použity k uskutečnění PCR na chromozomální ío DNA z organismu Aícaligenes faecalis 1650. Izolace chromozomální DNA se prováděla po rozkladu buněk lysozymem a proteinázou K. klasickou metodou, která je odborníkům v oboru známá (Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current protocols in molecular biology“, John Wiley and
Sons).
PCR pomocí polymerázy Pwo zahrnovala denaturaci pri 95 °C po dobu 3 minut, 35 cyklů denaturace pri 95 °C po dobu 1 minuty, annealiny primeru pri 58 °C po dobu 1 min. 30 sekund a polymeraci pri 72 °C po dobu l min. 30 sec.; a následnou polymeraci pri 72 °C po dobu 5 min.
Za těchto podmínek byl amplifikován fragment o velikosti asi 1 kb chromozomální DNA z Alca2o ligenes faecalis 1650. Aby se nakloňoval PCR produkt, byly připojeny ke každému ze shora uvedených primérů dva přídavné nukleotidy (5-AATCTAGA a 5'-ATTCTAGA), což bylo provedeno v Xbal restrikčním štěpném místě a reakce PCR byla opakována za shora uvedených podmínek. Poté byla znovu opakována amplifíkace fragmentu o velikosti asi 1 kb, který po čištění a Xbal digesci, byl napojen na analogně digestovaný pUC18. Po transformaci E. coli JMI09 a izolaci výsledného plazmidů byla DNA čištěna sekvencováním a následným geonomovým Southern blotem. Metody používané v molekulární biologii a mikrobiologii, pro izolaci úplného nitrilázového genu, byly použity v souladu s klasickými metodami, kteréjsou odborníkovi v oboru známy. Úplná nitrilázová sekvence je znázorněna jako SEQ ID NO: I.
Příklad 3: Homologie s jinými proteiny, identifikace homologní sekvence
Srovnání se sekvencemi z databáze proteinů SWISSPROT ukázalo, že nitrilázový gen v tomto vynálezu má 11 až 96% homologii se známými nitrilázami na úrovni aminokyselin. Největší homologie sekvence byla nalezena s arylacetonitrilově-specifickou nitrilázou z Aícaligenes faecalis JM3 (Nagasawa et al,, Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765 až 772). Tyto dva nitrilázové geny mají identitu 93,2 % na nukleotidové úrovni v regionu 1071 bp. Odvozená aminokyselinová sekvence má identitu 96,1 % v regionu 356 aminokyselin. Nejmenší homologie 11,4 % v průběhu regionu 534 aminokyselin byla nalezena s nitrilázou z Rhodococcus erythropolis SK92 (EP-A
0 719 862).
Příklad 4: Heterologní exprese nitrilázy v E. coli
Gen nit byl amplifikován pro klonování do expresního vektoru pJOE2702. 5-primer, zvolený v tomto případě pro PCR, byl shora zmíněná SEQ ID NO: 3, přičemž se používalo štěpné místo Ndel s překrytími s translačním startem, připojeném na zakončení nit 5'. Primer je zde uveden jako SEQ ID NO: 8 a je také přiložen v seznamu sekvencí. Zvoleným 3 '-primerem byl 24 mer
- 15 CZ 302494 B6 z 3'-regionu genu nit, se štěpnými místy BamHI přiléhajícími k stop kodonu. Je veden v dalším textu jako SEQ ID NO: 9 a je přiložen v seznamu sekvencí.
5'-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3' (= SEQ ID NO: 8}
5'-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3' ( = SEQ ID NO: 9)
Použití PCR s použitím Pwo polymerázy zahrnovalo denaturaci při 94 °C po dobu 3 minut,
25 cyklů denaturace při 93 °C po dobu 1 minuty, annealiny primerů při 55 °C po dobu 1 min.
sek. a polymeraci při 72 °C po dobu 1 min. 30 sek. a závěrečnou polymeraci při 72 °C po dobu 5 min. Výsledný PCR fragment byl čištěn, digestován pomocí Ndel/BamHI a zaveden do analogně digestovaného vektoru pJOE2702 (Volff et al., 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037 až 1047). Výsledný plazmid byl nazván pDHE 19.2 a je znázorněn na obr.3. Zapojení přes io Ndel/BamHI štěpné místo znamená, že v plazmidů pDHE19.2 je gen nit transkripčně kontrolován promotorem rha;>, který je přítomen v zmíněném vektoru pJOE2702 a pochází z pozitivně regulovaného L-rhamnožového operonu rhaBAD v E. coli (Egan & Schleíf, 1994, J.Mol. Biol., 243, 821 až 829). Zakončení transkripce nit genu a iniciace translace byla podobně provedena přes sekvence vektoru. Kromě toho plazmid obsahoval gen, který poskytuje rezistencí proti ampi15 cilinu ApR.
Heterologní exprese nitrilázy byla provedena s kmenem JMI09 E. coli, obsahujícím plazmid pDHEI9.2. Pro tyto účely byl s použitím třepání kultivován kmen JM109 (pDHE19.2) v kultivačním prostředí TB se 100 pg/ml ampicilinu (Tartof, Hobbs 1987). Při OD6oo ~L7 byla kultura přenesena v poměru 1 : 200 do čerstvého kultivačního roztoku TB, který obsahoval 0,2 % (hmotn./obj.) L-rhamnózy, aby se indukovala nitriláza a byla prováděna kultivace za současného třepání při 30 °C. Po 8 h byly buňky narušeny, promyty lOmM Na/K fosfátovým pufrem, pH =7,2, resuspendovány ve stejném pufru na OD6oo = 10 a poté byly narušeny působením ultrazvuku.
Příklad 5: Stanovení aktivity nitrilázy ve rekombinačním kmenu E. coli JMI09 (pDHE19.2)
1. Namnožení buněk
E. coli JM109 (pDHE19.2) byly kultivovány v TB živném roztoku + 100 pg/ml ampicilinu s použitím třepání při 37 °C po dobu 6 hodin. Při hodnotě OD6oo = 4 bylo použito 100 ml této předem připravené kultury k inokulaci 10 1 fermentorů obsahujícího 8 litrů čerstvého TB živného roztoku + 100 pg/ml ampicilinu + 2g L-rhamnózy. pH, teplota, průtok vzduchu a rychlost míchání byly 7,2; 30 °C, 300 1/h a 400 až 650 otáček za min. Buňky byly sklizeny po 16 h. Optická hustota při 600 nm byla v tomto případě 18, což odpovídá suché hmotnosti buněk 7,8 g/l.
2. Stanovení specifické aktivity na nitril kyseliny mandlové
Buňky byly získány, jak je popsáno v příkladu 1 a promyty v lOmM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2. 2 ml suché hmotnosti buněk byly resuspendovány v 1 ml lOmM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2 a reakce byla zahájena přidáním 8,3mM nitrilu kyseliny mandlové. Reakce byla prováděna s použitím třepáni při 40 °C. Kinetika byla sledována odebíráním vzorků a následnou vysoko účinnou kapalinovou chromatografií (ODS Hypersil). Byl stanoven nitril kyseliny mandlové, benzaldehyd, amid kyseliny mandlové a dále byla stanovena samotná kyselina mandlová. Rychlost vzniku kyseliny mandlové je 403 U/g suché hmotnosti buněk s konverzí 30 %, přičemž 1 U je definována jako tvorba I pmol kyseliny mandlové za minutu při 40 °C.
- 16CZ 302494 B6
Příklad 6: Syntéza R-mandlové kyseliny hydrolýzou nitrilu kyseliny mandlové s použitím E. coli JMI09 (pDHE19.2) v suspenzi
Nitril kyseliny mandlové v koncentraci 1,3 g/l byl dávkován v průběhu 10 hodin do objemu
1 litru lOmM Na/K fosfátového pufru, pH 7,2, který obsahoval kmen E. coli JMI09 (pDHE19.2) v koncentraci 2 g/l, přičemž byla směs míchána lopatkovým míchadlem při 40 °C. Dávkování bylo kontrolováno pomocí měření spotřeby nitrilu. Rychlost spotřeby R-mandlové kyseliny byla sledována způsobem, kterýje popsaný v příkladu 5. Výsledky jsou znázorněny na obr. 4.
io
Příklad 7: Izolace R-mandlové kyseliny extrakcí z reakční směsi z hydrolýzy nitrilu kyseliny mandlové pomocí E. coli JMI09 (pDHE19.2) v suspenzi
Vodná reakční směs obsahující kyselinu mandlovou, získaná v příkladu 6 byla odstředěna, aby se odstranily buňky, pH bylo upraveno na 2 přidáním kyseliny a směs byla třikrát extrahována methylterc-butyléterem (MTBE). Po odstraněni organického rozpouštědla z extraktu kyseliny mandlové odpařením byly výsledné bílé krystaly kyseliny mandlové znovu rozpuštěny a testovány na chemickou a optickou čistotu pomocí vysoko účinné kapalinové chromatografíe. Chemická čistota byla 99 % a optická čistota R-mandlové kyseliny byla 97,4 %.
Příklad 8: Izolace R-mandlové kyseliny krystalizaci, která se provádí ochlazením reakční směsi z hydrolýzy nitrilu kyseliny mandlové pomocí E. coli JMI09 (pDHE19.2) v suspenzi
Vodná reakční směs s kyselinou mandlovou, získaná v příkladu 6, byla odstředěna, aby se odstranily buňky, zahuštěna na 40 % původního objemu zahříváním a mícháním, a její pH bylo upraveno kyselinou na pH = 2. Kyselina mandlová byla krystalizována ochlazením v ledové lázni a výsledné bílé krystaly kyseliny mandlové byly odfiltrovány s použitím odsávání a vysušeny. Tyto krystaly byly opět rozpuštěny a testovány na chemickou a optickou čistotu vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Chemická čistota byla 99,1 % a optická čistota R-mandlové kyseliny byla 99,8 %.
Příklad 9: Konverze různých nitrilu
Kmen E. coli (viz příklad 6) nebo výchozí kmen Alcaligenes byl použit ke konverzi různých nitrilu. Buňky Alcaligenes byly kultivovány ve 400 ml živného prostředí pro tento kmen (viz kultivační roztok shora) při 30 °C a 160 otáčkách za min. po dobu 16 hodin. Buňky byly sklizeny odstředěním (4 °C a 5000 otáček za min., 30 minut). Podíly 150 μΐ buněčné suspenze byly jed40 notlivě odpipetovány do jamek mikrotitrační destičky. Tato destička pak byla odstředěna. Supernatant byl odsát a buněčné pelety byly dvakrát promyty Na2HPO4 (1,42 g/l v Finnaqua, pH 7,2). Roztok substrátu (150 μΙ) pak byl pipetován a buňky byly resuspendovány. V každé řadě 12 jamek v mikrotitrační destičce byl použit jeden substrát. Řada s roztokem substrátu, ale bez buněk, byla použita jako kontrola (= slepý pokus).
Mikrotitrační destičky byly ponechány na třepačce v inkubátoru při 200 otáček za minutu a 30 °C 2 hodiny. Pak byly buňky odstředěny a bylo pomoci zařízení „Boomem“ stanoveno množství NH4 + iontů, vyprodukovaných do supematantu. Tato měření byla prováděna při 620 nm pomocí kalibrační křivky, vytvořené pomocí roztoků NH4OH o různé koncentraci (viz Obrázek 5). Jako testovací látky byly použity:
nitril kyseliny mandlové (= 1),
2-fenyIpropionitril (=2),
2-fenylbutyronitril (=3),
- 17CZ 302494 B6 benzylkyanid (=4),
4-chlorbenzylkyanid (= 5),
4-brombenzylkyanid (= 6), propionitri 1 (= 7),
2-methylbutyronitril (- 8, 2-kyanobutan), gcranonitril (= 9), valeronitril (= 10),
3-kyanopyridin (- 11),
3-bifenyi-2-hydroxybutyronitril (= 12), io 4-fluorbenzylkyanid (= 13,4-fluorfenylacetonitril) a a (3 hcpt\l) nitrotriacetonitril (- 14).
Každá testovací látka byla rozpuštěna na 0,2 molární zásobní roztok v metanolu a tyto roztoky byly zředěny na koncentraci 10mmol/l přídavkem NB2HPO4 (1/42 g/l Finnaqua, pH 7,2). Sus15 penze buněk byly standardizovány na 2 g/l suché biomasy. Tabulka II ukazuje průměrné konverze pro každou řadu mikrotitrové destičky.
Tabulka II: Konverze různých nitrilu nítrilázou 1650
Látka č. μπνοΐ/l Aktivita % konverze
1 2141,2 8,9 86,3
2 1001,1 4,1 70,2
3 24,4 0,1 44,3
4 2210,5 9,2 100
5 2136,3 8,9 100
6 1500,8 6,2 100
7 4,9 0,02 NA
8 - - NA
9 - - NA
10 113,4 0,47 NA
11 - - NA
12 - - NA
13 2222,9 9,2 100
14 84,8 0,35 44
Obrázek 6 znázorňuje tyto stanovené konverze, vyjádřené jako aktivity.
- 18CZ 302494 B6
PŘEHLED SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) JMÉNO: BASF Aktiengesellschaft (B) ULICE: Carl-Bosch-Strasse 38 io (C) MĚSTO: Ludwigshafen (D) STÁT: Porýní-Falc (E) ZEMĚ: Spolková republika Německo (F) POŠTOVNÍ KÓD: D-67056 (i i) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: „A proces s for preparing chiral carboxylic acids from nitril es using a nitrilase or microorganisms which comprise a gene for tne nitrilase“ (iii) POČET SEKVENCÍ: 9 20 (iv) POČÍTAČOVĚ ČITELNÁ FORMA:
(A) TYP MEDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (EPO) (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1071 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: dvě (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE 40 (iii) ANT1SENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/HESLO: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 1..1071
- 19CZ 302494 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: I:
ATG CAG ACA AGA AAA ATC Ile GTC CGG GCA GCC GCC GTA CAG GCC GCC Ala 15 TCT Ser
Met 1 Gin Thr Arg Lys 5 Val Arg Ala Ala 10 Ala Val Gin Ala
CCC AAC TAC GAT CTG GCA ACG GGT GTT GAT AAA ACC ATT GAG CTG GCT
Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala
20 25 30
CGT CAG GCC CGC GAT GAG GGC TGT GAC CTG ATC GTG TTT GGT GAA ACC
Arg Gin Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile val Phe Gly Glu Thr
35 40 45
TGG CTG CCC GGA TAT CCC TTC CAC GTC TGG CTG GGC GCA CCG GCC TGG
Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp
50 55 60
TCG CTG AAA TAC AGT GCC CGC TAC TAT GCC AAC TCG CTC TCG CTG GAC
Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp
65 70 75 80
AGT GCA GAG TTT CAA CGC ATT GCC CAG GCC GCA CGG ACC TTG GGT ATT
Ser Ala Glu phe Gin Arg ile Ala Gin Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile
85 90 95
TTC ATC GCA CTG GGT TAT AGC GAG CGC AGC GGC GGC AGC CTT TAC CTG
Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu
100 105 110
GGC CAA TGC CTG ATC GAC GAC AAG GGC GAG ATG CTG TGG TCG CGT CGC
Gly Gin Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg
115 120 125
-20CZ 302494 B6
aaa ctc Lys Leu AAA Lys CCC ACG CAT GTA GAG CGC ACC GTA TTT GGT GAA GGT TAT Tyr
Pro Thr His Val 135 Glu Arg Thr Val Phe 140 Gly Glu Gly
130
GCC CGT GAT CTG ATT GTG TCC GAC ACA GAA CTG GGA CGC GTC GGT GCT
Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala
145 150 155 160
CTA TGC TGC TGG GAG CAT TTG TCG CCC TTG AGC AAG TAC GCG CTG TAC
Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
165 170 175
TCC CAG CAT GAA GCC ATT CAC ATT GCT GCC TGG CCG TCG TTT TCG CTA
Ser Gin His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
ISO 185 190
TAC AGC GAA CAG GCC CAC GCC CTC AGT GCC AAG GTG AAC ATG GCT GCC
Tyr Ser Glu Gin Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
TCG CAA ATC TAT TCG GTT GAA GGC CAG TGC TTT ACC ATC GCC GCC AGC
Ser Gin Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gin Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser
210 215 220
AGT GTG GTC ACC CAA GAG ACG CTA GAC ATG CTG GAA GTG GGT GAA CAC
Ser Val Val Thr Gin Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His
225 230 235 240
AAC GCC CCC TTG CTG AAA GTG GGC GGC GGC AGT TCC ATG ATT TTT GCG
Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala
245 250 255
CCG GAC GGA CGC ACA CTG GCT CCC TAC CTG CCT CAC GAT GCC GAG GGC
Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly
260 265 270
TTG ATC ATT GCC GAT CTG AAT ATG GAG GAG ATT GCC TTC GCC AAA GCG
Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala
275 280 285
ATC AAT GAC CCC GTA GGC CAC TAT TCC AAA CCC GAG GCC ACC CGT CTG
Ile Asn ASp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
290 295 300
GTG CTG GAC TTG GGG CAC CGA GAC CCC ATG ACT CGG GTG CAC TCC AAA
Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys
305 310 315 320
AGC GTG ACC AGG GAA GAG GCT CCC GAG CAA GGT GTG CAA AGC AAG ATT
Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile
325 330 335
-21 CZ 302494 B6
GCC Ala TCA Ser GTC Val GCT ATC AGC Ser CAT KÍS CCA Pro CAG Gin 345 GAC ASp TCG Ser GAC Asp ACA Thr CTG Leu 350 CTA Leu GTG Val
Ala 340 ile
CAA GAG CCG TCT TGA
Gin Glu Pro Ser
355
(2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 356 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:
Met 1 Gin Thr Arg Lys 5 Ile Val Arg Ala Ala 10 Ala Val Gin Ala Ala 15 Ser
Pro Asn Tyr Asp 20 Leu Ala Thr Gly Val 25 Asp Lys Thr Ile Glu 30 Leu Ala
Arg Gin Ala 35 Arg Asp Glu Gly Cys 40 Asp Leu Ile Val Phe 45 Gly Glu Thr
Trp Leu 50 Pro Gly Tyr Pro Phe 5.5 His Val Trp Leu Gly 60 Ala Pro Ala Trp
Ser 65 Leu Lys Tyr Ser Ala 70 Arg Tyr Tyr Ala Asn 75 Ser Leu Ser Leu Asp 80
Ser Ala Glu Phe Gin 85 Arg ile Ala Gin Ala 90 Ala Arg Thr Leu Gly 95 Ile
Phe Ile Ala Leu 100 Gly Tyr Ser Glu Arg 105 Ser Gly Gly Ser Leu 110 Tyr Leu
Gly Gin Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg
115 120 125
-22CZ 302494 B6
Lys Leu Lys 130 Pro Thr His Val 135 Glu Arg Thr Val Phe 140 Gly Glu Gly Tyr
Ala Arg Asp Leu lle Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala
145 150 155 160
Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr
165 170 175
Ser Gin His Glu Ala lle His lle Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu
190 185 190
Tyr Ser Glu Gin Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala
195 200 205
Ser Gin lle Tyr Ser val Glu Gly Gin Cys Phe Thr Xle Ala Ala Ser
210 215 220
Ser val Val Thr Gin Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His
225 230 235 240
Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Xle Phe Ala
245 250 255
Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly
260 265 270
Leu lle lle Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu lle Ala Phe Ala Lys Ala
275 280 285
lle Asn Asp Pro val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu
290 295 300
Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys
305 310 315 320
Ser Val Thr Arg Glu 325 Glu Ala Pro Glu Gin 330 Gly Val Gin Ser Lys 335 Xle
Ala Ser Val Ala lle Ser His Pro Gin Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val
340 345 350
Gin Glu Pro Ser
355 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární
-23CZ 302494 B6 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE 5 (iii) ANTISENZE: NE (v) TYP FRAGMENTU: N-zakončení io (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:
Met Gin Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala I^al Gin Ala Ala Ser 15 10 15
Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr ile Glu Leu Ala 20 25 30
Arg Gin Ala Arg Asp Glu Gly 35 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 4:
(i) VLASTNOST] SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650
-24CZ 302494 B6 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitriázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:
Glu Glu Ala. Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala 15 10 15
Ile Ser His Pro Gin 20 (2) INFORMACE FOR SEQ ID NO: 5:
io (i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 11 aminokyselin (B) TYP: Aminokyselina (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: Peptid (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:
Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys 15 10 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 6:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYPE: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární
-25 CZ 302494 B6 (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecaiis io (B)KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový 15 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:
ATGCAGACNA GNAARATCGT SCG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 7:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYPE: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: Lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecaiis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:
TNCCSACNGA NGCRATCTTG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 8:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 31 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina
-26CZ 302494 B6 (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (ví) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B) KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:
TTAATCATAT GCAGACAAGA AAAATCGTCC G (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 9:
(i) VLASTNOSTI SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYPE: nukleová kyselina (C) POČET VLÁKEN: jedno (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (iii) HYPOTETICKÁ: NE (iii) ANTISENZE: NE (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Alcaligenes faecalis (B)KMEN: 1650 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ ZDROJ:
(B) KLON: nitrilázový 45 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:
AAGGATCCTC AAGACGGCTC TTGCACTAGC AG
-27CZ 302494 B6

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, 5 vybraná ze skupiny, kterou tvoří
    a) sekvence nukleových kyselin, která má sekvenci, znázorněnou jako SEQ ID NO; 1,
    b) sekvence nukleových kyselin, kteréjsou odvozeny od sekvence nukleových kyselin, znázorlo něné jako SEQ ID NO: 1, jako výsledek degenerace genetického kódu,
    c) homology sekvence nukleových kyselin, znázorněné jako SEQ ID NO: 1, kódující polypeptidy, které mají v celé své délce alespoň 98% homologii se sekvencí SEQ ID NO: 2 a jejichž enzymatická účinnost není snížena oproti sekvenci SEQ ID NO: 2.
  2. 2. Sekvence aminokyselin kódovaná sekvencí nukleových kyselin podle nároku 1.
  3. 3. Sekvence aminokyselin podle nároku 2, kódovaná sekvencí znázorněnou jako SEQ ID NO: I.
  4. 4. Konstrukt nukleových kyselin, obsahující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1, přičemž tato sekvence nukleových kyselin je spojena s jedním nebo více regulačními signály.
  5. 5. Vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1 nebo konstrukt nukleové 25 kyseliny podle nároku 4.
  6. 6. Mikroorganizmus, obsahující alespoň jednu vnesenou sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1 nebo alespoň jeden vnesený konstrukt nukleových kyselin podle nároku 4.
    jo
  7. 7. Mikroorganizmus podle nároku 6, kterým je bakterie rodu Escherichia, Pseudomonas nebo Aícaligenes.
  8. 8. Způsob přípravy chirálních karboxylových kyselin obecného vzorce I R1
    R'
    35 vyznačující se tím, že racemické nitrily obecného vzorce II Rl íf-4—CN ' í ’ >
    ť reagují za přítomnosti sekvence aminokyselin podle nároku 2 nebo 3 nebo rostoucího, latentního nebo porušeného mikroorganizmu podle nároku 6 nebo 7, přičemž reaguje alespoň 25 mmol nitrilů za hodinu na 1 mg proteinu nebo 25 mmol nitrilů za hodinu na 1 g suché hmotnosti mikro40 organizmu, na chirální karboxylové kyseliny vzorce I, přičemž substituenty a obecné zbytky ve vzorcích 1 a II mají následující významy;
    * značí opticky aktivní centrum,
    R1, R2, R3 značí nezávisle na sobe vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený C| C]0 alkyl, C2^Cio-alkenyl, substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, heteroaryl, OR4 nebo NR4R5, a kde radikály R1, R2, R3 jsou vždy navzájem odlišné,
    -28 CZ 302494 B6
    R4 značí vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený C)-C]0-alkyl, C2-Cio-aIkenyl, Ci-Cio-alkylkarbonyl, C2-C10-alkenylkarbonyl, aryl, arylkarbonyl, heteroaryl nebo heteroaryl karbony 1,
    Rs znamená vodík, substituovaný nebo nesubstituovaný, větvený nebo nevětvený C]_Cio-aIkyI, C2-CJ0-alkenyl, aryl nebo heteroaryl.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že jeden ze substituentů R1, R2 nebo io R3jeOR4.
  10. 10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se tím, že jeden ze substituentů Rl, R2 nebo R3 je aryl.
    i5
  11. 11. Způsob podle nároků 8 až 10, vyznačující se tím, že se provádí ve vodném reakčním roztoku a při pH mezi 4 a 11.
  12. 12. Způsob podle nároků 8ažll, vyznačující se tím, že se uvádí do reakce 0,01 až 10 % hmotnostních nitrilu nebo 0,01 až 10 % hmotnostních odpovídajícího aldehydu nebo ketonu
    20 a 0,01 až 10 % hmotnostních kyseliny kyanovodíkové.
  13. 13. Způsob podle nároků 8 až 12, vyznačující se tím, že se provádí pri teplotě 0 až 80 °C.
    25
  14. 14. Způsob podle nároků 8 až 13, vyznačující se tím, že se chirální karboxylová kyselina získává z reakčního roztoku ve výtěžcích od 60 do 100 % extrakcí nebo krystalizaci nebo extrakcí a krystalizaci.
  15. 15. Způsob podle nároků 8 až 14, vyznačující se tím, že chirální karboxylová kyse30 lina má optickou čistotu alespoň 90 %.
CZ20011382A 1998-10-19 1999-10-13 Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, konstrukt, vektor a mikroorganizmus s touto sekvencí a zpusob prípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilu CZ302494B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19848129A DE19848129A1 (de) 1998-10-19 1998-10-19 Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilase oder Mikroorganismen, die ein Gen für die Nitrilase enthalten

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20011382A3 CZ20011382A3 (cs) 2002-03-13
CZ302494B6 true CZ302494B6 (cs) 2011-06-15

Family

ID=7884933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011382A CZ302494B6 (cs) 1998-10-19 1999-10-13 Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, konstrukt, vektor a mikroorganizmus s touto sekvencí a zpusob prípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilu

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6869783B1 (cs)
EP (1) EP1123386B1 (cs)
JP (1) JP4489298B2 (cs)
KR (1) KR100715744B1 (cs)
CN (1) CN100422319C (cs)
AT (1) ATE349517T1 (cs)
AU (1) AU765480B2 (cs)
BR (1) BR9914629A (cs)
CA (1) CA2347521C (cs)
CZ (1) CZ302494B6 (cs)
DE (2) DE19848129A1 (cs)
DK (1) DK1123386T3 (cs)
EE (1) EE05008B1 (cs)
ES (1) ES2280125T3 (cs)
HU (1) HU228092B1 (cs)
ID (1) ID29136A (cs)
IL (2) IL142397A0 (cs)
NO (1) NO327857B1 (cs)
PT (1) PT1123386E (cs)
WO (1) WO2000023577A1 (cs)
ZA (1) ZA200104066B (cs)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19848129A1 (de) * 1998-10-19 2000-04-20 Basf Ag Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilase oder Mikroorganismen, die ein Gen für die Nitrilase enthalten
US20040002147A1 (en) * 1999-12-29 2004-01-01 Desantis Grace Nitrilases
DE10010149A1 (de) * 2000-03-03 2001-09-06 Basf Ag Nitrilase aus Rhodococcus rhodochrous NCIMB 11216
US6455730B1 (en) 2000-08-04 2002-09-24 E. I. Du Pont De Nemours & Company Preparation of dicarboxylic acid monoesters from cyanocarboxylic acid esters
US6562603B2 (en) * 2000-08-04 2003-05-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company 3-hydroxycarboxylic acid production and use in branched polymers
AU2001296653A1 (en) * 2000-10-04 2002-04-15 Maxygen, Inc. Enantioselective production of amino carboxylic acids
FR2822460B1 (fr) * 2001-03-26 2005-04-29 Rhodia Chimie Sa Procede de preparation enantioselectif d'acides carboxyliques optiquement actifs par hydrolyse enzymatique de nitriles
EP1578910A4 (en) 2001-06-21 2008-06-04 Verenium Corp NITRILASES
ITMI20011826A1 (it) * 2001-08-30 2003-03-02 Istituto Biochimico Italiano Microorganismo dotato di attivita' nitrile-idratasica/amidasica enantioselettiva e regioselettiva
DK1570060T3 (da) 2002-12-02 2007-11-05 Basf Ag L-rhamnoseinducerbare ekspressionssystemer
AU2003296731B2 (en) * 2003-01-08 2009-07-09 Basf Aktiengesellschaft Methods for preserving and/or storing cells having a nitrilase or nitrile hydratase activity
AT412092B (de) * 2003-02-27 2004-09-27 Dsm Fine Chem Austria Gmbh Verfahren zur herstellung chiraler alpha-hydroxycarbonsäuren durch enzymatische hydrolyse von chiralen cyanhydrinen
CN100445375C (zh) * 2003-02-27 2008-12-24 巴斯福股份公司 经修饰的腈水解酶及它们在产生羧酸的方法中的用途
CN102796770B (zh) * 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
US20100267100A1 (en) * 2007-03-21 2010-10-21 Ling Hua Enzymatic synthesis of optically pure beta-hydroxy carboxylic acids and their derivatives
US20090004720A1 (en) * 2007-06-26 2009-01-01 Ling Hua Smart Biocatalysts For Organic Synthesis
EP2338987A1 (en) 2009-11-16 2011-06-29 ZYRUS Beteiligungsgesellschaft mbH & Co. Patente I KG Whole cell biocatalyst
JP2013162746A (ja) * 2010-05-24 2013-08-22 Mitsui Chemicals Inc アミド化合物の製造方法
EP2643467A1 (de) 2010-11-24 2013-10-02 Basf Se Verfahren zur herstellung n-heterozyklischer optisch aktiver alkohole
KR101223664B1 (ko) * 2011-01-26 2013-01-17 재단법인 경북해양바이오산업연구원 나이트릴레이즈 ｒｍｎ１을 이용한 카르복실산의 제조방법
KR101223663B1 (ko) * 2011-01-26 2013-01-21 재단법인 경북해양바이오산업연구원 나이트릴레이즈 ｖｍｎ１을 이용한 카르복실산의 제조방법
KR101223666B1 (ko) * 2011-01-26 2013-01-17 재단법인 경북해양바이오산업연구원 나이트릴레이즈 ｏｒｎ을 이용한 카르복실산의 제조방법
KR101223665B1 (ko) * 2011-01-26 2013-01-17 재단법인 경북해양바이오산업연구원 나이트릴레이즈 ｒｍｎ２을 이용한 카르복실산의 제조방법
AU2021272383A1 (en) 2020-05-15 2022-12-08 Basf Se Improved method for the production of isoprenoids
WO2023105080A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Basf Se Synthesis of glufosinate using a hydantoinase-based process
WO2023105079A1 (en) 2021-12-10 2023-06-15 Basf Se Enzymatic decarbamoylation of glufosinate derivatives
AR127936A1 (es) 2021-12-10 2024-03-13 Basf Se Actividad herbicida de alquilfosfinatos

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0348901A2 (en) * 1988-06-27 1990-01-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing optically active alfa-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor
EP0449648A2 (en) * 1990-03-30 1991-10-02 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for producing R(-)-mandelic acid and derivatives thereof
EP1123386A1 (de) * 1998-10-19 2001-08-16 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung chiraler carbonsäuren aus nitrilen mit hilfe einer nitrilase oder mikroorganismen, die ein gen für die nitrilase enthalten

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68926922T2 (de) 1988-03-08 1996-12-19 Japan Energy Corp Verfahren zur Herstellung von L-alpha-Aminosäuren
US5283193A (en) 1988-06-27 1994-02-01 Asahi Kasei Kogyo K.K. Process for producing optically active α-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor
JPH0219577A (ja) 1988-07-04 1990-01-23 Nippon Saafuakutanto Kogyo Kk 反応染料用均染剤組成物
JP2974737B2 (ja) 1990-08-16 1999-11-10 三菱レイヨン株式会社 光学活性乳酸の製造法
DK0549710T3 (da) 1990-09-20 1996-03-18 Du Pont Fremgangsmåde til fremstilling af enantiomere 2-alkansyrer
JP2676568B2 (ja) 1991-06-26 1997-11-17 日東化学工業株式会社 Ｒ（−）−マンデル酸およびその誘導体の製造法
JP3093056B2 (ja) * 1992-11-17 2000-10-03 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａを含有する形質転換体による有機酸の製造法
JP3218133B2 (ja) 1993-02-03 2001-10-15 三菱レイヨン株式会社 フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法
JP2720140B2 (ja) 1993-02-03 1998-02-25 日東化学工業株式会社 フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法
JP3354688B2 (ja) 1994-01-28 2002-12-09 三菱レイヨン株式会社 微生物によるα−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドの製造法
JP3154633B2 (ja) 1994-12-28 2001-04-09 三菱レイヨン株式会社 ニトリラーゼ遺伝子発現のための調節因子およびその遺伝子
DE69737696T2 (de) 1996-02-29 2008-01-10 Nippon Soda Co. Ltd. Prozess für die herstellung von alpha-hydroxysäuren mit hilfe eines mikroorganismus und eines neuen mikroorganismus.

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0348901A2 (en) * 1988-06-27 1990-01-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Process for producing optically active alfa-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor
EP0449648A2 (en) * 1990-03-30 1991-10-02 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for producing R(-)-mandelic acid and derivatives thereof
EP1123386A1 (de) * 1998-10-19 2001-08-16 Basf Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung chiraler carbonsäuren aus nitrilen mit hilfe einer nitrilase oder mikroorganismen, die ein gen für die nitrilase enthalten

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Kobayashi a kol. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 247-251, viz Obr. 1 na str. 249 *
Nagasawa a kol. (1990) Eur. J. Biochem. 194, 765-772 *

Also Published As

Publication number Publication date
ATE349517T1 (de) 2007-01-15
CZ20011382A3 (cs) 2002-03-13
KR20010085938A (ko) 2001-09-07
IL142397A0 (en) 2002-03-10
CN100422319C (zh) 2008-10-01
CN1331743A (zh) 2002-01-16
EP1123386A1 (de) 2001-08-16
CA2347521C (en) 2010-02-23
NO327857B1 (no) 2009-10-05
IL142397A (en) 2008-03-20
DE59914102D1 (de) 2007-02-08
PT1123386E (pt) 2007-03-30
US6869783B1 (en) 2005-03-22
AU765480B2 (en) 2003-09-18
CA2347521A1 (en) 2000-04-27
ES2280125T3 (es) 2007-09-01
DE19848129A1 (de) 2000-04-20
JP2002527106A (ja) 2002-08-27
ZA200104066B (en) 2002-07-01
DK1123386T3 (da) 2007-05-07
WO2000023577A1 (de) 2000-04-27
HU228092B1 (en) 2012-10-29
NO20011912L (no) 2001-04-18
EE200100232A (et) 2002-08-15
NO20011912D0 (no) 2001-04-18
AU6470899A (en) 2000-05-08
JP4489298B2 (ja) 2010-06-23
HUP0104802A2 (hu) 2002-04-29
EP1123386B1 (de) 2006-12-27
KR100715744B1 (ko) 2007-05-08
BR9914629A (pt) 2001-06-26
HUP0104802A3 (en) 2005-10-28
ID29136A (id) 2001-08-02
EE05008B1 (et) 2008-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ302494B6 (cs) Izolovaná sekvence nukleových kyselin, kódující polypeptid, který má nitrilázovou aktivitu, konstrukt, vektor a mikroorganizmus s touto sekvencí a zpusob prípravy chirálních karboxylových kyselin z nitrilu
Hanson et al. Preparation of (R)‐amines from racemic amines with an (S)‐amine transaminase from Bacillus megaterium
CN1384880A (zh) L－泛内酯水解酶和一种d－泛内酯的制备方法
KR20020097210A (ko) 아시도보락스 파실리스 ７２ｗ로부터의 니트릴라제에 대한유전자의 단리 및 발현 방법
JP2002325587A (ja) ニトリルヒドラターゼ、およびアミドの製造方法
AU2001233802B2 (en) Nitrilase from rhodococcus rhodochrous ncimb 11216
CA2259954C (en) Process for the preparation of (s)- or (r)-3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methylpropionic acid
CN101341251A (zh) 由5-降冰片烯-2-甲腈使用芳基乙腈水解酶制备5-降冰片烯-2-甲酸的方法
Lee et al. Mass production of thermostable D‐hydantoinase by batch culture of recombinant Escherichia coli with a constitutive expression system
KR20040010202A (ko) α-케토 산 환원효소, 이의 제조방법, 및 이를 이용한광학적으로 활성인 α-히드록시 산의 제조방법
JP2023522406A (ja) 光学活性アミノアミド化合物のエナンチオ選択的化学酵素的合成
JP4319260B2 (ja) エステラーゼ遺伝子及びその利用
MXPA01003893A (en) Method for producing chiral carboxylic acids from nitriles with the assistance of a nitrilase or microorganisms which contain a gene for the nitrilase
JP4984925B2 (ja) アミノアシラーゼ遺伝子
JP4274767B2 (ja) （ｒ）−体のアミド結合を選択的に加水分解するアミダーゼ遺伝子及びその利用
EP0644940A1 (en) PROCESS FOR ENZYMATIC PREPARATION OF -i(S)-6-METHOXY-A-METHYL-2-MAPHTHALENEACETIC ACID
JP2003061682A (ja) 還元酵素遺伝子及びその利用
KR20060113697A (ko) 신규 아세토아세틸-ＣｏＡ 환원 효소 및 광학 활성알코올의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20191013