ES2280125T3 - Metodo para la produccion de acidos carboxilicos quirales a partir de nitrilos con ayuda de una nitrilasa o microorganismos que contienen un gen para la nitrilasa. - Google Patents

Metodo para la produccion de acidos carboxilicos quirales a partir de nitrilos con ayuda de una nitrilasa o microorganismos que contienen un gen para la nitrilasa. Download PDF

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Abstract

Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de nitrilasa, seleccionada del grupo de a) una secuencia de ácido nucleico que tiene representada en la SEQ ID NO: 1, b) secuencias de ácido nucleico que se derivan de la secuencia de ácido representada en la SEQ ID NO: 1 como un resultado de la degeneración del código genético. c) homólogos de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 1, que codifican para polipéptidos que tienen al menos 98% de homología, por el rango entero de secuencia, a SEQ ID NO: 2, sin reducción en la acción enzimática de los polipéptidos.

Description

Método para la producción de ácidos carboxílicos quirales a partir de nitrilos con ayuda de una nitrilasa o microorganismos que contienen un gen para la nitrilasa.
La descripción se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido con actividad de nitrilasa, a las construcciones de ácido nucleico que comprenden secuencias de ácido nucleico o las construcciones de ácido nucleico. La invención además se refiere a secuencias de amino ácidos que se codifican por las secuencias de ácido nucleico, y a los microorganismos que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, las construcciones de ácido nucleico o vectores que comprenden las secuencias de ácido nucleico o las construcciones de ácido nucleico.
La invención además se refiere a un proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales de nitritos racémicos.
Los ácidos carboxílicos quirales son compuestos requeridos para la síntesis química orgánica. Son materiales de partida para un gran número de ingredientes farmacéuticos activos o ingredientes activos para protección de plantas vegetales. Los ácidos carboxílicos quirales se pueden usar para resolución de racematos clásica por sales diaesteroméricas. De esta manera, se emplea el ácido mandélico R-(-)- o S-(-), por ejemplo, para resolución de racematos de aminas racémicas. El ácido mandélico R-(-) se usa adicionalmente como intermediario para sintetizar antibióticos semisintéticos y un número grande de productos agrícolas.
En la literatura se divulgan diversas rutas sintéticas hacia los ácidos carboxílicos quirales. Así, por ejemplo, los aminoácidos óptimamente activos se obtienen industrialmente mediante procesos de fermentación. Esto ocasiona la desventaja de que se deba desarrollar un proceso específico para cada aminoácido. Es por esto que se usan procesos químicos o enzimáticos para poder preparar un rango amplio al máximo de compuestos diferentes. Una desventaja de los procesos químicos es que el estéreo-centro tiene que construirse en síntesis complicadas de múltiples etapas, no aplicables ampliamente.
La síntesis enzimática de los ácidos carboxílicos quirales deben deducirse de una serie de patentes o de solicitudes de patentes. WO92/05275 describe la síntesis de ácidos enantioméricos \alpha-hidroxi-\alpha-alquílico o \alpha-alquílcarboxílico en presencia de materiales. En EP-B-0 348 901 se reivindica un proceso para preparar ácidos orgánicos \alpha-substituidos usando microorganismos de las especies Alcaligenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium sp. cepa KO-2-4, Acinetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus y Candida. La preparación de L-\alpha-aminoácidos usando microorganismos se reivindica en la EP-B-0 332 379.
La preparación de ácidos \alpha-hidroxicarboxílicos, específicamente la preparación de ácido láctico o ácido mandélico óptimamente activos, usando diversos microorganismos, tales como microorganismos del género Alcaligenes, Aureobacterium, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Acinetobacter, Caseobacter, Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Nocardia, Variovorax, Arthrobacter y Candida o con enzimas, se describe las patentes EP-A-0 348 901 o su equivalente de EEUU US 5,283,193, EP-A-0 449 648, EP-B-0 473 328, EP-B-0 527 553 o su equivalente de EEUU US 5,296,373, EP-A-0 610 048, EP-A-0 610 049, EP-A-0 666 320 o WO97/32030.
Las desventajas de estos procesos es que con frecuencia conducen a productos con solo baja pureza óptica y/o que corren solo con rendimientos mínimos de espacio/tiempo. Esto conduce a procesos no atractivos, desde el punto de vista económico. Incluso el intento de aumentar la productividad adicionando substancias tales como sulfito, disulfito, ditionita, hipofosfito o fosfito (ver EP-A-0 486 289) o mediante uso de microorganismos que tienen una resistencia incrementada frente a \alpha-hidroxinitrilos (ver WO97/32030), no conduce a un incremento apreciable de la productividad.
Por lo tanto un objetivo de la invención era desarrollar un proceso fácil, favorable en costos, ampliamente aplicable para preparar ácidos carboxílicos quirales ópticamente activos que no tienen las desventajas arriba mencionadas.
Este objetivo se logra mediante el proceso de acuerdo con la invención para preparar ácidos carboxílicos quirales de la fórmula general I
1
caracterizado porque se convierten nitrilos racémicos de la fórmula general II
2
en presencia de una secuencia de aminoácidos que se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo de
a) una secuencia de ácido nucleico que tienen la secuencia representada en la SEQ ID NO: 1,
b) secuencias de ácido nucleico que se derivan de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 1,
c) homólogos de la secuencia de ácido nucleico representada en SEQ ID NO: 1, que codifican para polipéptidos que tienen al menos 98% de homología en todo el rango de secuencias a SEQ ID NO: 2 son que se reduzca el efecto enzimáticos del polipéptido,
o un microorganismo creciente, en reposo o desintegrado, que comprende ya sea una secuencia de ácido nucleico del grupo mencionado o una construcción de ácido nucleico que enlaza un ácido nucleico de dicho grupo con una o más señales de regulación, y donde se convierten al menos 25 mmol de nitrilo por hora y por miligramo de proteína o 25 mmol de nitrilo se convierten por h y por g de peso seco en ácidos carboxílicos quirales,
donde los substituyentes y variables en la fórmula I y II tienen los siguientes significados:
* un centro ópticamente activo
R^{1}, R^{2}, R^{3} independientemente unos de otros significan hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo, hetarilo substituidos o insubstituidos, OR^{4} o NR^{4}R^{5}, y los radicales R^{1}, R^{2} y R^{3} son siempre diferentes,
R^{4} es hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, alquilocarbonilo de C_{1}-C_{10}, alquenilcarbonilo de C_{2}-C_{10}, arilo, aril-carbonilo, hetarilo o hetarilcarbonilo,
R^{5} es hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10} substituido o insubstituido, ramificado o no ramificado, alquenilo de C_{2}-C_{10}, arilo o hetarilo.
R^{1}, R^{2}, R^{3} en los compuestos de las fórmulas I y II son, independientemente unos de otros, hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo, hetarilo, substituidos o insubstituidos, OR^{4} o NR^{4}R^{5} y los radicales R^{1}, R^{2} y R^{3} siempre son diferentes.
En calidad de radicales de alquilo se consideran las cadenas alquílicas de C_{1}-C_{10} substituidas o insubstituidas, ramificadas o no ramificadas como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo, 1-etil-2-metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i-propilo o i-butilo.
En calidad de radicales alquenilo se mencionan cadenas de alquenilo de C_{2}-C_{10} ramificadas o no ramificadas como por ejemplo etenilo, propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 2-metilpropenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metilo-1-butenilo, 2-metil-1-butenilo, 3-metil-1-butenilo, 1-metil-2-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-metil-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil-3-butenilo, 1,1-dimetil-2-propenilo, 1,2-dimetil-1-propenilo, 1,2-dimetil-2-propenilo, 1-etil-1-propenilo, 1-etil-2-propenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-metil-1-pentenilo, 2-metil-1-pentenilo, 3-metil-1-pentenilo, 4-metil-1-pentenilo, 1-metil-2-pentenilo, 2-metil-2-pentenilo, 3-metil-2-pentenilo, 4-metil-2-pentenilo, 1-metil-3-pentenilo, 2-metil-3-pentenilo, 3-metil-3-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, 1-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 3-metil-4-pentenilo, 4-metil-4-pentenilo, 1,1-dimetil-2-butenilo, 1,1-dimetil-3-butenilo, 1,2-dimetil-1-butenilo, 1,2-dimetil-2-butenilo, 1,2-dimetil-3-butenilo, 1,3-dimetil-1-butenilo, 1,3-dimetil-2-butenilo, 1,3-dimetil-3-butenil, 2,2-dimetil-3-butenilo, 2,3-dimetil-1-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 2,3-dimetil-3-butenilo, 3,3-dimetil-1-butenilo, 3,3-dimetil-2-butenilo, 1-etil-1-butenilo, 1-etil-2-butenilo, 1-etil-3-butenilo, 2-etil-1-butenilo, 2-etil-2-butenilo, 2-etil-3-butenil, 1,1,2-trimetil-2-propenilo, 1-etil-1-metil-2-propenilo, 1-etil-2-metil-1-propenilo, 1-etil-2-metil-2-propenilo, 1-heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 4-heptenilo, 5-heptenilo, 6-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 4-octenilo, 5-octenilo, 6-octenilo, 7-octenilo, nonenilo o dequenilo. Se prefieren etenilo, propenilo, butenilo o pentenilo.
En calidad de arilo se consideran radicales arilo substituidos o insubstituidos, que contienen 6 hasta 20 átomos de carbono en el anillo o sistema de anillo. En tal caso se puede tratar de anillos aromáticos condensados uno al lado de otro y de anillos aromáticos que están unidos por puentes de cadenas de alquilo, alquilcarbonilo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Los radicales arilo pueden eventualmente enlazarse también por una cadena de alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{3}-C_{8}, alquinilo de C_{3}-C_{6} o cicloalquilo de C_{3}-C_{8} a la estructura básica. Se prefieren fenilo o naftilo.
En calidad de hetarilo se consideran sistemas aromáticos de anillo, substituidos o insubstituidos, sencillos o condensados con uno o más anillos heteroaromáticos de 3 hasta 7 miembros, que pueden contener uno o más heteroátomos, como N, O o S y eventualmente pueden enlazarse por una cadena de alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{3}-C_{8} o cicloalquilo de C_{3}-C_{8} a la estructura básica. Ejemplos de radicales hetarilo de este tipo son pirazol, imidazol, oxazol, isooxazol, tiazol, triazol, piridin, quinolina, isoquinolina, acridina, pirimidina, piridazina, pirazina, fenazina, purina o pteridina. Los radicales hetarilo se pueden enlazar a la estructura base por los heteroátomos o por los diferentes átomos de carbono en el anillo o sistema de anillo o por los substituyentes. Se prefieren piridina, imidazol, pirimidina, purina, pirazina o quinolina.
Como substituyentes de los radicales R^{1}, R^{2} o R^{3} mencionados se consideran por ejemplo uno o más substituyentes como halógeno, como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxi, alquilo, alkoxi, alquenilo, alqueniloxi, alkinilo u otros anillos aromáticos u otros anillos, o sistemas de anillos, no aromáticos saturados o insaturados. Se prefieren radicales de alquilo como alquilo de C_{1}-C_{6}, como metilo, etilo, propilo o butilo; arilo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxi o amino.
R^{4} significa en los radicales OR^{4} o NR^{4}R^{5} hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, alquil-carbonilo de C_{1}-C_{10}, alquenilcarbonilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo, arilcarbonilo, hetarilo o hetarilcarbonilo.
En calidad de radicales alquilo se consideran cadenas de alquilo de C_{1}-C_{10} substituidas o insubstituidas, ramificadas o no ramificadas, como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo, n-butilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1,1-dimetiletilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo, n-hexilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 1-metilpentilo, 2-metilpentilo, 3-metilpentilo, 4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo, 1,2-dimetilbutilo, 1,3-dimetilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2,3-dimetilbutilo, 3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo, 2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo, 1,2,2-trimetilpropilo, 1-etil-1-metilpropilo, 1-etil-2-metilpropilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo o n-decilo. Se prefieren metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, i-propilo o i-butilo.
Como radicales alquenilo se mencionan cadenas de alquenilo de C_{2}-C_{10} ramificadas o no ramificadas como por ejemplo etenilo, propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 2-metilpropenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 1-metil-1-butenilo, 2-metil-1-butenilo, 3-metil-1-butenilo, 1-metil-2-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-metilo-3-butenilo, 2-metil-3-butenilo, 3-metil-3-butenilo, 1,1-dimetil-2-propenilo, 1,2-dimetil-1-propenilo, 1,2-dimetil-2-propenilo, 1-etil-1-propenilo, 1-etil-2-propenilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 4-hexenilo, 5-hexenilo, 1-metil-1-pentenilo, 2-metil-1-pentenilo, 3-metil-1-pentenilo, 4-metil-1-pentenilo, 1-metil-2-pentenilo, 2-metil-2-pentenilo, 3-metil-2-pentenilo, 4-metil-2-pentenilo, 1-metil-3-pentenilo, 2-metil-3-pentenil, 3-metil-3-pentenilo, 4-metil-3-pentenilo, 1-metil-4-pentenilo, 2-metil-4-pentenilo, 3-metil-4-pentenilo, 4-metil-4-pentenilo, 1,1-dimetil-2-butenilo, 1,1-dimetil-3-butenilo, 1,2-dimetil-1-butenilo, 1,2-dimetil-2-butenilo, 1,2-dimetil-3-butenilo, 1,3-dimetil-1-butenilo, 1,3-dimetil-2-butenilo, 1,3-dimetil-3-butenilo, 2,2-dimetil-3-butenilo, 2,3-dimetil-1-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo, 2,3-dimetil-3-butenilo, 3,3-dimetil-1-butenilo, 3,3-dimetil-2-butenilo, 1-etil-1-butenilo, 1-etil-2-butenilo, 1-etil-3-butenilo, 2-etil-1-butenilo, 2-etil-2-butenilo, 2-etil-3-butenilo, 1,1,2-trimetil-2-propenilo, 1-etil-1-metil-2-propenilo, 1-etil-2-metil-1-propenilo, 1-etil-2-metil-2-propenilo, 1-heptenilo, 2-heptenilo, 3-heptenilo, 4-heptenilo, 5-heptenilo, 6-heptenilo, 1-octenilo, 2-octenilo, 3-octenilo, 4-octenilo, 5-octenilo, 6-octenilo, 7-octenil, nonenilo o dequenilo. Se prefieren etenilo, propenilo, butenilo o pentenilo.
En calidad de radicales de alquilcarbonilo se consideran cadenas de alquilcarbonilo de C_{1}-C_{10} substituidos o insubstituidos ramificados o no ramificados, como por ejemplo metilcarbonilo, etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, 1-metiletilcarbonilo, n-butilcarbonilo, 1-metil-propilcarbonilo, 2-metilpropilcarbonilo, 1,1-dimetiletilcarbonilo, n-pentilcarbonilo, 1-metilbutilcarbonilo, 2-metilbutilcarbonilo, 3-metilbutilcarbonilo, 2,2-dimetilpropilcarbonilo, 1-etilpropilcarbonilo, n-hexilcarbonilo, 1,1-dimetilpropilcarbonilo, 1,2-dimetilpropilcarbonilo, 1-metilpentilcarbonilo, 2-metilpentilcarbonilo, 3-metilpentilcarbonilo, 4-metilpentilcarbonilo, 1,1-dimetilbutilcarbonilo, 1,2-dimetilbutilcarbonilo, 1,3-dimetilbutilcarbonilo, 2,2-dimetilbutilcarbonilo, 2,3-dimetilbutilcarbonilo, 3,3-dimetilbutilcarbonilo, 1-etilbutilcarbonilo, 2-etilbutilcarbonilo, 1,1,2-trimetilpropilcarbonilo, 1,2,2-trimetilpropilcarbonilo, 1-etil-1-metilpropilcarbonil, 1-etil-2-metilpropilcarbonilo, n-heptilcarbonilo, n-octilcarbonilo, n-nonilcarbonilo o n-decilcarbonilo. Se prefieren metilcarbonilo, etilcarbonilo, n-propilcarbonilo, n-butilcarbonilo, i-propilcarbonilo o i-butilcarbonilo.
En calidad de radicales alquenilcarbonilo se consideran cadenas de alquenilcarbonilo de C_{2}-C_{10}, ramificados o no ramificados, como por ejemplo etenilcarbonilo, propenilcarbonilo, 1-butenilcarbonilo, 2-butenilcarbonilo, 3-butenilcarbonilo, 2-metilpropenilcarbonilo, 1-pentenilcarbonilo, 2-pentenilcarbonilo, 3-pentenilcarbonilo, 4-pentenilcarbonilo, 1-metil-1-butenilcarbonilo, 2-metil-1-butenilcarbonilo, 3-metil-1-butenilcarbonilo, 1-metil-2-butenilcarbonilo, 2-metil-2-butenilcarbonilo, 3-metil-2-butenilcarbonilo, 1-metil-3-butenilcarbonilo, 2-metil-3-butenilcarbonilo, 3-metil-3-butenilcarbonilo, 1,1-dimetil-2-propenilcarbonilo, 1,2-dimetil-1-propenilcarbonilo, 1,2-dimetil-2-propenilcarbonilo, 1-etil-1-propenilcarbonilo, 1-etil-2-propenilcarbonilo, 1-hexenilcarbonilo, 2-hexenilcarbonilo, 3-hexenilcarbonilo, 4-hexenilcarbonilo, 5-hexenilcarbonilo, 1-metil-1-pentenilcarbonilo, 2-metil-1-pentenilcarbonilo, 3-metil-1-pentenilcarbonilo, 4-metil-1-pentenilcarbonilo, 1-metil-2-pentenilcarbonilo, 2-metil-2-pentenilcarbonilo, 3-metil-2-pentenilcarbonilo, 4-metil-2-pentenilcarbonilo, 1-metil-3-pentenilcarbonilo, 2-metil-3-pentenilcarbonilo, 3-metil-3-pentenilcarbonilo, 4-metil-3-pentenilcarbonilo, 1-metil-4-pentenilcarbonilo, 2-metil-4-pentenilcarbonilo, 3-metil-4-pentenilcarbonilo, 4-metil-4-pentenilcarbonil, 1,1-dimetil-2-butenilcarbonilo, 1,1-dimetil-3-butenilcarbonilo, 1,2-dimetil-1-butenilcarbonilo, 1,2-dimetil-2-butenilcarbonilo, 1,2-dimetil-3-butenilcarbonilo, 1,3-dimetil-1-butenilcarbonilo, 1,3-dimetil-2-butenilcarbonilo, 1,3-dimetil-3-butenilcarbonilo, 2,2-dimetil-3-butenilcarbonilo, 2,3-dimetil-1-butenilcarbonilo, 2,3-dimetil-2-butenilcarbonilo, 2,3-dimetil-3-butenilcarbonilo, 3,3-dimetil-1-butenilcarbonilo, 3,3-dimetil-2-butenilcarbonilo, 1-etil-1-butenilcarbonilo, 1-etil-2-butenilcarbonilo, 1-etil-3-butenilcarbonilo, 2-etil-1-butenilcarbonilo, 2-etil-2-butenilcarbonilo, 2-etil-3-butenilcarbonilo, 1,1,2-trimetil-2-propenilcarbonilo, 1-etil-1-metil-2-propenilcarbonilo, 1-etil-2-metil-1-propenilcarbonil, 1-etil-2-metil-2-propenilcarbonilo, 1-heptenilcarbonilo, 2-heptenilcarbonilo, 3-heptenilcarbonilo, 4-heptenilcarbonilo, 5-heptenilcarbonilo, 6-heptenilcarbonilo, 1-octenilcarbonilo, 2-octenilcarbonilo, 3-octenilcarbonilo, 4-octenilcarbonilo, 5-octenilcarbonilo, 6-octenilcarbonilo, 7-octenilcarbonilo, nonenilcarbonilo o dequenilcarbonilo. Se prefieren etenilcarbonilo, propenilcarbonilo, butenilcarbonilo o pentenilcarbonilo.
Como arilo se considera un radical substituido o insubstituido que contienen 6 a 20 átomos de carbono en el anillo o sistema de anillo. Se puede tratar en tal caso de anillos aromáticos condensados uno junto a otro o de anillos aromáticos unidos mediante puentes de cadenas de alquilo, alquilcarbonilo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Los radicales arilo pueden eventualmente enlazarse en la estructura básica con cadenas de alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{3}-C_{8}, alquinilo de C_{3}-C_{6} o de cicloalquilo de C_{3}-C_{8}. Se prefieren fenilo o naftilo.
En calidad de arilcarbonilo se consideran radicales de arilcarbonilo substituidos o insubstituidos que contienen 6 hasta 20 átomos de carbono en el anillo o sistema de anillo. En tal caso se puede tratar de anillos aromáticos condensados uno al lado de otro o de anillos aromáticos que estén unidos mediante puentes de cadenas de alquilo, alquilcarbonilo, alquenilo o alquenilcarbonilo, carbonilo, oxígeno o nitrógeno. Se prefieren fenilcarbonilo o naftilcarbonilo.
En calidad de hetarilo se consideran sistemas aromáticos de anillos condensados o simples, substituidos o insubstituidos con uno o más anillos heteroaromáticos de 3 hasta 7 miembros, que contienen uno o varios heteroátomos como N, O o S y pueden enlazarse por la estructura básica con cadenas de alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{3}-C_{8} o de cicloalquilo de C_{3}-C_{8}. Ejemplos de radicales hetarilo de tal tipo son pirazol, imidazol, oxazol, isooxazol, tiazol, triazol, piridina, quinolina, isoquinolina, acridina, pirimidina, piridazina, pirazina, fenazina, purina o pteridina.
Los radicales hetarilo pueden enlazarse por heteroátomos o por los diferentes átomos de carbono en el anillo o sistema de anillo o por los substituyentes a la estructura básica. Por radicales hetarilcarbonilo se deben entender radicales heteroaromáticos que se enlazan por un radical carbonilo a la estructura básica. Se prefieren piridina, imidazol, pirimidina, purina, pirazina o quinolina.
En calidad de substituyentes de los radicales mencionados de R^{4} se consideran por ejemplo uno o varios substituyentes como halógeno, como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo u otros anillos, o sistemas de anillos aromáticos, saturados o insaturados. Se prefieren radicales de alquilo como alquilo de C_{1}-C_{6}, como metilo, etilo, propilo o butilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxi o amino.
Para el radical R^{4} se prefiere hidrógeno.
R^{5}, en el radical NR^{4}R^{5}, significa hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o in substituidos, ramificados o no ramificados, arilo o hetarilo, y los radicales de alquilo, alquenilo, arilo y hetarilo tienen el significado mencionado arriba. Se prefiere hidrógeno o alquilo de C_{1}-C_{10}, como metilo, etilo o propilo.
Como substituyentes de los radicales mencionados de R^{5} se consideran por ejemplo uno o más substituyentes como halógeno como flúor, cloro o bromo, tio, nitro, amino, hidroxi, alquilo, alcoxi, alquenilo, alqueniloxi, alquinilo u otros anillos, o sistemas de anillos, no aromáticos saturados o insaturados. Se prefieren radicales alquilo como alquilo de C_{1}-C_{6}, como metilo, etilo, propilo o butilo, arilo como fenilo, halógeno como cloro, flúor o bromo, hidroxi o amino.
Además, dos substituyentes vecinos R^{4} o R^{5}, juntos pueden formar otro anillo aromático, saturado o saturado parcialmente, substituido o insubstituido, con 5 hasta 6 átomos en el anillo, el cual puede contener uno o más heteroátomos como O, N o S.
Ventajosamente uno de los substituyentes R^{1}, R^{2} o R^{3} en las fórmulas I y II significa arilo como fenilo. Además, uno de los substituyentes R^{1}, R^{2} o R^{3} en las fórmulas I y II es preferible un hidroxi y un hidrógeno o metilo.
El método de la invención se realiza ventajosamente a un valor de pH de 4 hasta 11, preferiblemente de 4 hasta 9.
Además, en el método se utilizan ventajosamente de 0,01 hasta 10% en peso de nitrilo ó 0,01 hasta 10% en peso de un aldehído o cetona correspondiente y 0,01 hasta 10% en peso de ácido prúsico (hidrociánico). Ventajosamente, el método se realiza con un exceso de ácido prúsico. Esto conduce, en ciertas circunstancias, a contenidos de ácido prúsico más altos que los reportados. Diversas cantidades de nitrilo se pueden usar en la reacción, dependiendo del nitrilo. Las cantidades más pequeñas (= cantidades entre 0,01 hasta 5% en peso), de nitrilo se usan ventajosamente para nitrilos (cianohidrinos) que están en equilibrio con los aldehídos correspondientes y ácido prúsico. Puesto que el aldehído es usualmente tóxico para los microorganismos y enzimas. Los nitrilo volátiles se emplean así mismo ventajosamente en cantidades entre 0,01 hasta 5% en peso. La reacción se retarda con cantidades más grandes de cianohidrina o nitrilo. En el caso de los nitrilos que no tienen virtualmente propiedades de solvente o muy bajas, o nitrilos que disuelven en solo muy pequeñas cantidades en medio acuoso, es posible y ventajoso emplear cantidades más grandes que las indicadas arriba. Para aumentar la conversión y el rendimiento se lleva a cabo la reacción de manera ventajosa con la adición controlada del nitrilo racémico. El nitrilo se puede aislar después del final de la reacción o sino retirarse continuamente en bypass (tubo derivado).
Los aldehídos y cetonas mencionados arriba significan compuestos que forman el nitrilo después de la reacción entre el aldehído o la cetona y el ácido prúsico, cuando es apropiado con catálisis ácida. La reacción entre el aldehído y el ácido prúsico da lugar a cianohidrinas que tienen la ventaja de estar en equilibrio con el aldehído y el ácido prúsico. Establecer un equilibrio con la cianohidrina significa que es posible con una enzima, que convierte sólo un enantiómero del nitrilo, obtener sin embargo un rendimiento de 100% del valor teórico porque el nitrilo racémico se reaprovisiona continuamente. Con todos los otros nitrilos, el nitrilo que no se ha convertido enzimáticamente (="equivocado" u otro enantiómero) se racemiza ventajosamente mediante una reacción química y se retorna al proceso para poder alcanzar un rendimiento teórico de 100% o se descarta o purifica y se hidroliza químicamente con retención del estéreo - centro.
El proceso de la invención se realiza ventajosamente entre 0ºC hasta 80ºC, preferiblemente entre 10ºC hasta 60ºC, particularmente preferible entre 15ºC hasta 50ºC.
Los nitrilos racémicos en el proceso de acuerdo con la invención significan nitrilos que consisten de una mezcla 50:50 de los dos enantiómeros o de cualquier otra mezcla con enriquecimiento de uno de los dos enantiómeros en la mezcla.
Los ácidos carboxílicos quirales en el proceso de acuerdo con la invención son aquellos que muestran un enriquecimiento enantiomérico.
Preferiblemente, el proceso da lugar a purezas enantioméricas de al menos 90% ee, preferentemente de min. 95% ee, particularmente preferible de min. 98% ee, muy particularmente preferible min. 99% ee.
El proceso de acuerdo con la invención hace posible convertir un número grande de nitrilos racémicos en ácidos carboxílicos quirales. Es posible en el proceso convertir al menos 25 mmol de nitrilo/h x mg de proteína o al menos 25 mmol nitrilo/h x g en peso seco de microorganismos, preferentemente al menos 30 mmol de nitrilo/h x mg proteína o al menos 30 mmol de nitrilo/h x g en peso seco, particularmente preferible al menos 40 mmol de nitrilo/h x mg de proteína o al menos 40 mmol de nitrilo/h x g en peso seco, muy particularmente preferible al menos 50 mmol de nitrilo/h x mg de proteína o al menos 50 mmol de nitrilo/h x g en peso seco.
Es posible, de acuerdo con la invención, usar células crecientes que comprenden a los ácidos nucleicos, estructuras de ácidos nucleicos o vectores para el proceso de acuerdo con la invención. Las células en reposo o desintegradas también se pueden usar. Células desintegradas significan, por ejemplo, células que se han hecho permeables con un tratamiento mediante, por ejemplo, solventes, o células desintegradas con un tratamiento enzimático, con un tratamiento mecánico (por ejemplo, prensa francesa o ultrasonido) o con cualquier otro método. Los extractos crudos obtenidos de esta manera son adecuados y ventajosos para el proceso según la invención. Se pueden usar enzimas purificadas o parcialmente purificadas para el proceso. Así mismo son adecuados los microorganismos inmovilizados o las enzimas y se pueden usar con ventaja en la reacción.
Los ácidos carboxílicos quirales preparados en el proceso según la invención se pueden aislar de la solución acuosa de la reacción mediante extracción o cristalización o mediante extracción y cristalización. Para este propósito, la solución de reacción acuosa se acidifica con un ácido tal como un ácido mineral (por ejemplo HCl o H_{2}SO_{4}) o un ácido orgánico, ventajosamente hasta valores de pH por debajo de 2, y luego se extrae con un solvente orgánico. La extracción se puede repetir varias veces para aumentar el rendimiento. Los solventes orgánicos que se usan son, en principio, todos solventes que muestran una frontera de fase con el agua después de adicionársele sal, cuando es apropiado. Solventes ventajosos son solventes tales como tolueno, benceno, hexano, éter metil tert.butílico o éster acético (acetato de etilo).
Después de concentrar la fase orgánica, se pueden aislar los productos usualmente con buenas purezas de más de 90%. Después de la extracción, la fase orgánica con el producto también puede, sin embargo, concentrarse solo parcialmente y el producto se puede cristalizar. Para este propósito se enfría ventajosamente la solución a una temperatura desde 0ºC hasta 10ºC. La cristalización puede tener lugar directamente de la solución orgánica. El producto cristalizado se puede tomar de nuevo en el mismo solvente o en uno diferente para cristalizar de nuevo y se cristaliza una vez más. La cristalización subsiguiente al menos una vez puede incrementar la pureza enantiomérica del producto, dependiendo de la posición de la composición eutéctica.
Los ácidos carboxílicos quirales pueden, sin embargo, cristalizarse también fuera de la solución acuosa de reacción inmediatamente después de la acidificación con un ácido hasta un pH ventajosamente por debajo de 2. Esto ocasiona ventajosamente que la solución acuosa que se concentra por calor reduzca su volumen en 10 hasta 90%, preferiblemente 20 hasta 80%, particularmente preferible 30 hasta 70%- La cristalización se realiza preferiblemente con enfriamiento. Para la cristalización se prefieren temperaturas entre 0ºC hasta 10ºC. Se prefiere cristalización directa desde la solución acuosa por razones de costes. Así mismo se prefiere procesar los ácidos carboxílicos quirales por extracción y, cuando sea apropiado, seguida de cristalización.
Con estos tipos preferidos de procesamiento el producto del método de la invención se puede aislar en rendimientos desde 60 hasta 100%, preferiblemente de 80 hasta 100%, particularmente preferible de 90 hasta 100%, con respecto al nitrilo empleado para la reacción. El producto aislado tiene una alta pureza química de >90%, preferiblemente de >95%, particularmente preferible >98%. Además, el producto tiene una alta pureza enantiomérica que puede aumentarse más mediante cristalización.
Los productos obtenidos de esta manera son adecuados como materiales de partida en síntesis orgánica para preparar drogas o agroquímicos o para resolución de racematos.
La invención además se refiere a una secuencia de ácido nucleico aislado que codifica para un polipéptido que tienen actividad de nitrilasa, seleccionado del grupo de:
a) una secuencia de ácido nucleico que tiene la secuencia representada con la SEQ ID NO: 1,
b) secuencias de ácido nucleico que se derivan de la secuencia de representada en SEQ ID NO: 1como resultado de la degeneración del código genético,
c) homólogos de la secuencia de ácido nucleico representados en la SEQ ID NO: 1 que codifican para polipéptidos que tienen las secuencias de aminoácido representadas en SEQ ID NO: 2 y tienen al menos 98% de homología en la totalidad del rango de secuencia sin que se reduzca la acción enzimática de los polipéptidos.
Por homólogos de la secuencia de ácido nucleico según la invención con la secuencia SEQ ID NO: 1 se deben entender por ejemplo las variantes alelos que tienen al menos 98% de homología por la totalidad del rango de la secuencia.
Es posible y ventajoso que las homologías sean más altas por regiones que forman parte de las secuencias. La secuencia de aminoácidos derivada de SEQ ID NO: 1 se debe ver en SEQ ID NO: 2. Las variantes de alelos comprenden, en particular, variantes funcionales que se pueden obtener mediante supresión, inserción o substitución de nucleótidos de la secuencia representada en SEQ ID NO: 1, y no debe haber una reducción esencial en la actividad enzimática de las proteínas sintetizadas derivadas para la introducción de uno o más genes dentro de un organismo, no obstante obtenido (sic).
La invención se refiere así a secuencias de aminoácido que se codifican por el grupo de secuencias de ácido nucleico descritas arriba. La invención se refiere ventajosamente a secuencias de aminoácido codificadas por la secuencia SEQ ID NO: 1.
Los homólogos de SEQ ID NO: 1 también significan, por ejemplo, homólogos de hongos o bacteriales, secuencias truncadas, DNA o RNA de una sola cadena de la secuencia de DNA codificante y no codificante. Los homólogos de la SEQ ID NO: 1 tienen a nivel del DNA una homología de al menos 60%, preferiblemente de al menos 70%, particularmente preferible de al menos 80%, muy particularmente preferible de al menos 90% por la totalidad de la región de DNA indicado en la SEQ ID NO: 1.
Además, por homólogos de la SEQ ID NO: 1 se deben entender derivados tales como, por ejemplo, variantes de promotor. Los promotores que preceden las secuencias indicadas de nucleótidos se pueden modificar mediante uno o más intercambios de nucleótidos mediante inserción(ones) y/o supresión(ones) sin, no obstante, afectar adversamente la funcionalidad o efectividad de los promotores. Los promotores pueden, además, aumentar su efectividad modificando su secuencia o reemplazarse completamente con más promotores efectivos incluso de organismos de tipos diferentes.
Por derivados también se deben entender variantes cuya secuencia de nucleótidos está en la región de -1 hasta -200 en frente del codón de inicio ó 0 hasta 1000 pares de base después de haber cambiado el codón de parar, De manera que la expresión del gene y/o expresión de la proteína se altera, preferiblemente aumenta.
Ventajosamente se puede aislar la SEQ ID NO: 1 o sus homólogos mediante métodos conocidos por el técnico en la materia a partir de bacterias, preferiblemente de bacterias gram-negativas, particularmente preferible de bacterias de la especie Alcaligenes, muy particularmente preferible de bacterias de la especie y tipo Alcaligenes faecalis.
SEQ ID No: 1 o sus homólogos o partes de estas secuencias se pueden aislar a partir de hongos o bacterias por ejemplo usando procesos convencionales de hibridización o la técnica de PCR. Estas secuencias de ADN se hibridan en condiciones estándar con las secuencias según la invención. La hibridación se lleva a cabo preferiblemente con oligonucleótidos cortos de las regiones conservadas, por ejemplo del centro activo, y estas se pueden identificar de una manera conocida al técnico en la materia mediante comparaciones con otras nitrilasas o hidratasas de nitrilo. Sin embargo, también es posible usar fragmentos más largos de los ácidos nucleicos de la invención o las secuencias completas para la hibridación. Estas condiciones estándar varían dependiendo del oligonucleótido de ácido nucleico usado, del fragmento más largo o secuencia completa, o dependiendo de cual tipo de ácido nucleico, ADN o ARN, se use para hibridación. Así, por ejemplo, las temperaturas de fusión de ADN: híbridos de ADN son de alrededor de 10ºC menos que aquellas de ADN:híbridos de ARN de la misma longitud.
Condiciones estándar significan, dependiendo por ejemplo del ácido nucleico, temperaturas entre 42 y 58ºC en una solución tampón acuosa con una concentración entre 0,1 hasta 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M de NaCl, 15 mM de citrato de sodio, pH 7,2) o adicionalmente en presencia de 50% de formamida como por ejemplo 42ºC en 5 x SSC, 50% de formamida. Las condiciones de hibridación para ADN : híbridos de ADN comprenden 0,1 x SSC y temperaturas entre alrededor de 20ºC hasta 45ºC, preferiblemente entre cerca de 30ºC hasta 45ºC. Las condiciones de hibridación para ADN: híbridos de ARN comprenden ventajosamente 0,1 x SSC y temperaturas entre cerca de 30ºC hasta 55ºC, preferiblemente entre cerca de 45ºC hasta 55ºC. Estas temperaturas indicadas para la hibridación son temperaturas de fusión calculadas a manera de ejemplo para un ácido nucleico con una longitud de cerca de 100 nucleótidos y un contenido G+C de 50% en ausencia de formamida. Las condiciones experimentales para la hibridación de ADN se describen en libros de texto relevantes de genética tales como, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning" (Clonación molecular), Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, y pueden calcularse mediante fórmulas conocidas al técnico en la materia, por ejemplo dependiendo de la longitud de los ácidos nucleicos, la naturaleza de los híbridos o el contenido de G+C. El técnico en la materia puede encontrar más información sobre hibridación en los siguientes libros de texto: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, (Actas actuales cobre biología molecular), John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hibridization: A Practical Approach, (Hibridación de ácidos nucleicos: un enfoque práctico) IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach (Biología molecular esencial: un enfoque práctico), IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Por construcción de ácido nucleico según la invención se debe entender el gen nitrilasa de la secuencia SEQ ID No. 1 y sus homólogos, que se han enlazado ventajosamente a una o más señales regulatorias para aumentar la expresión del gen. Estas secuencias regulatorias son, por ejemplo, secuencias con las cuales se enlazan los inductores o represores y regulan así la expresión del ácido nucleico. Además de estas secuencias regulatorias novedosas también es posible que la regulación natural de estas secuencias esté presente ante los propios genes estructurales y, eventualmente, haberse modificado de modo que la regulación natural se desconecte y la expresión de los genes se haya aumentado. La construcción de ácido nucleico puede, sin embargo, tener también una estructura más simple, es decir que no se hayan insertado señales regulatorias adicionales antes de la secuencia SEQ ID No. 1 o de sus homólogos, y el promotor natural con su regulación no se haya suprimido. En lugar de eso, la secuencia regulatoria natural muta de tal manera que ya no tiene lugar la regulación y aumenta la expresión del gen. La construcción de ácido nucleico puede comprender adicionalmente de manera ventajosa una o más secuencias "enhancer" (refuerzos), la cuales hacen posible una expresión aumentada de la secuencia de ácido nucleico, funcionalmente enlazada con el promotor. También es posible insertar secuencias ventajosas adicionales en el extremo 3' de las secuencias de ADN, tal como otros elementos o terminadores regulatorios. Los ácidos nucleicos según la invención pueden estar presentes en una o más copias en la construcción. La construcción también puede comprender otros marcadores tales como resistencias antibióticas o genes que complementan auxotropía cuando es apropiado para selección de la construcción. Las secuencias regulatorias ventajosas para el proceso de la invención están presentes, por ejemplo, en promotores tales como cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, \lambda-PR o en el \lambda-PL-promotor, que se usan ventajosamente en bacterias Gram-negativas. Otras secuencias regulatorias ventajosas son, por ejemplo, los promotores Gram-positivos amy y SPO2, en los promotores de hongos y levaduras ADC1, MF\alpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. A este respecto también son ventajosos los promotores de la carboxilasa de piruvato y de la oxidasa de metanol a partir de, por ejemplo, Hansenula. Se pueden también usar promotores artificiales para la regulación.
La construcción de ácido nucleico se inserta ventajosamente a un vector tal como, por ejemplo, una plásmida, un fago u otro ADN para expresión en un organismo huésped, lo cual hace posible una expresión óptima de los genes en el huésped. Estos vectores representan un desarrollo avanzado de la invención. Ejemplos de tales plásmidas en E. Coli son pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, \lambdagt11 o pBdCI, en Streptomyces son pIJ101, pIJ364, pIJ702 o pIJ361, en Bacillus son pUB110, pC194 o pBD214, en Corynebacterium son pSA77 o pAJ667, en hongos son pALS1, pIL2 o pBB116, en levaduras son 2\proptoM, pAG-1, YEp6, YEp13 o pEMBLYe23 o en plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 o pDH51. las plásmidas mencionadas representan una selección corta de las posibles plásmidas. Otras plásmidas son bien conocidas para el técnico en la materia y se pueden encontrar, por ejemplo, en el libro Cloning Vectors (Vectores de clonación) (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018).
La construcción de ácido nucleico contiene también ventajosamente, para expresión de otros genes presentes, además, las secuencias regulatorias de Terminal 3' y/o 5' para incrementar expresión, las cuales se seleccionan para expresión óptima dependiendo del organismo huésped seleccionado y gen o genes.
Estas secuencias regulatorias están destinadas a hacer posible una expresión específica de los genes y una expresión de proteína. Esto puede significar, por ejemplo dependiendo del organismo huésped, que el gen se expresa y sobre-expresa solo después de inducción, o que inmediatamente se expresa y/o se sobre-expresa.
Las secuencias o factores regulatorios pueden además influenciar preferiblemente de manera positiva y así aumentar la expresión de los genes introducidos. Así, el fortalecimiento de los elementos regulatorios puede tener lugar ventajosamente a nivel de la trascripción usando señales fuertes de trascripción tales como promotores y/o "enhancer" (refuerzos). Sin embargo, también es posible reforzar la translación, por ejemplo, mejorando la estabilidad del mARN.
En otra modalidad del vector, el vector comprende la construcción de ácido nucleico según la invención o el ácido nucleico según la invención puede introducirse ventajosamente en forma un ADN lineal a los microorganismos e integrarse mediante recombinación heteróloga u homóloga al genoma del organismo huésped. El ADN lineal puede consistir en un vector linealizado tal como una plásmida o solo de la construcción de ácido nucleico del ácido nucleico.
Para expresión óptima de genes heterólogos en organismos, es ventajoso modificar las secuencias de ácido nucleico de acuerdo con el "codon usage" (uso de codón) específicamente utilizado en el organismo. El "codon usage" puede establecerse fácilmente por medio de análisis computacional de otros genes conocidos en el organismo relevante.
Organismos huéspedes adecuados para el ácido nucleico según la invención o la construcción de ácido nucleico son en principio todos los organismos procarióticos o eucarióticos. Los organismos huéspedes usados ventajosamente son microorganismos tales como bacterias, hongos o levaduras. Es ventajoso el uso de bacterias Gram-positivas o Gram-negativa, preferiblemente bacterias de la familia Enterobacteriaceae o Nocardiaceae, particularmente preferibles bacterias de las clases Escherichia, Pseudomonas o Rhodococcus. Muy particularmente preferible es la especie y tipo Escherichia coli.
Los organismos huéspedes según la invención comprenden además preferiblemente al menos un agente de proteína para doblar los polipéptidos que haya sintetizado y, en particular, las secuencias de ácido nucleico que tienen actividad de nitrilasa descritas en esta invención y/o los genes que codifican este agente, la cantidad de este agente presente siendo mayor que aquella que corresponde a la cantidad básica en el microorganismo considerado. Los genes que codifican para este agente están presentes en el cromosoma o en elementos extra-cromosomáticos tales como, por ejemplo, plásmidas.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de la nitrilasa a partir de Alcaligenes faecalis 1650 1. Preparación de las células
La Alcaligenes faecalis 1650 se cultivó agitando en un medio de cultivo A a 30ºC por una duración de 8 horas.
3
200 ml de este precultivo se usaron para inocular un fermentador de 10 L que contenía 8 L de media A fresco. El pH, la temperatura, la tasa de flujo de aire y la velocidad de agitación eran 7,2; 30ºC, 300 l/h y 300 upm. Después de 22 horas se obtuvieron 81 g de biomasa húmeda. Esto corresponde a un peso seco de células de 3,8 g/l y a una densidad óptica a 600 nm de 8.
2. Determinación de la actividad enzimática frente a mandelonitrilo
Las células se obtuvieron tal como se describe en el ejemplo 1 y se lavaron dos veces en 10 mM de un búfer de fosfato de Na/K, pH 7,2. Se re-suspendieron 40 mg peso seco de células en 20 ml de búfer fosfato de Na/K de 10 mM, pH 6,8 y la reacción se inició adicionando 8,3 mM de mandelonitrilo. La reacción se llevó a cabo a 400ºC con agitación. La cinética de la resolución de racemato se siguió tomando muestras y retirando a continuación células con la ayuda de cromatografía líquida de alto rendimiento (ODS Hipersil). En este caso se determinaros mandelonitrilo, benzaldehído, amida de ácido mandélico y ácido mandélico. Los resultados se representan en la figura 1[Conversión de mandelonitrilo (= nitrilo de ácido mandélico) en ácido mandélico, lote]. La velocidad de formación del ácido mandélico es de 41,3 U/g peso seco con una conversión de 30%, y 1U se define como 1 \mumol de ácido mandélico que se forma en un minuto a 40ºC.
3. Determinación de la selectividad enzimática frente a mandelonitrilo
Las células fueron obtenidas según lo descrito en el ejemplo 1 y lavadas dos veces en 10 el búfer (solución tampón) de 10 mM fosfato de Na/K, pH 7,2. Se re-suspendieron 40 mg peso seco de células en 20 ml del búfer de 10 mM fosfato de Na/K, pH 6.8, y la reacción se inició agregando 8.3 mM de mandelonitrilo. La reacción se realizó agitando a 30ºC. La cinética fue controlada tomando muestras y a continuación retirando células con ayuda de cromatografía líquida de alto rendimiento (Nucleodex \beta-PM). Se determinó ácido S-(+) - y R-mandélico en este caso. La pureza óptica del ácido R-)-mandélico formado (ee_{R-AM}) fue de 98% con una conversión de 50%. La selectividad de la enzima (= E) fue de 499 con una conversión de 50%.
4. Purificación
A menos que se indique de otra manera, 10 mM de DTT estuvo presente en todos los búferes (soluciones tampón) durante la purificación.
Paso 1
Desintegración de las células
Las célula obtenidas según lo descrito en el ejemplo 1 a partir de dos fermentaciones de 10 L en cada caso, centrifugadas y lavadas dos veces con 1L del búfer de 0.1 M Tris/HCI, pH 7,2. El rendimiento fue cerca de 162 mg en peso mojado de células. En cada caso se resuspendieron 81 g peso mojado de células en 160 ml de búfer de 0.1 M Tris/HCl, pH 7,2, y se desintegraron cuatro veces en un Menton-Gaulin (sic) a 750 bar. El homogenizado se centrifugó luego a por 30 minutos a 30000 g y se descartaron las pelotillas (pellet). El sobrenadante (140 ml) tenía una actividad residual de 73% como se representa en la Tabla 1.
Paso 2
Cromatografía de intercambio iónico
El sobrenadante se diluyó a 400 ml con un búfer A (20 mM Tris/HCl, pH 8,5) y se centrifugó una vez más a 23000 g por 20 minutos. Se cargaron luego 350 ml a una columna de Q-sefarosa (diámetro de 5 cm, altura de 22 cm, volumen 432 ml, Q-Sepharose Fast Flow de la empresa Pharmacia) en el búfer A. Se usó inicialmente un búfer B al 10% (como el búfer A con 1 M NaCl) para lavar con un flujo de 20 ml/min (volumen total de carga y de lavado correspondía a 1,5 L). La proporción aumentó hasta 60% de B linealmente en el transcurso de 90 minutos. Se usó luego búfer B al 100% para lavar durante 91 hasta 120 minutos. Se recogieron 100 fracciones de 40 ml. Se eluyó la nitrilasa entre las fracciones 50 y 60. Se combinaron las fracciones y se concentraron hasta un volumen de 10 ml mediante ultrafiltración a través de una membrana de 10 kDa (Amicon).
Paso 3
Cromatografía con tamices moleculares
El concentrado de la cromatografía de intercambio molecular (paso 2) se purificó aún más en dos porciones cada una de 5 ml mediante cromatografía de tamices moleculares (Superdex 200 grado prep., Pharmacia, rango de separación 10 hasta 600 kDa, 2,6 cm de diámetro, 60 cm de altura, 325 ml de volumen). La detección se efectuó a 280 nm. La columna se equilibró en búfer de 20 mM fosfato, pH 7,4; 5 mM de DTT y 150 mM NaCl y se operó a un flujo de 1,5 ml/min. Se recogieron 40 fracciones. Se encontró actividad hidrolizante de nitrilo en las fracciones 3 a 5.
Paso 4
Cromatografía de intercambio iónico
Las fracciones combinadas de la cromatografía de tamices moleculares (paso 3) se purificaron más mediante cromatografía de intercambio iónico sobre una columna Mono Q (volumen de columna 1 ml, Mono Q HR515, Pharmacia). El búfer A usado fue 20 mM Tris/HCl, pH 8,5; 5 mM DTT; como búfer B fue el mismo búfer que en A con 1 M NaCl. La velocidad de flujo fue de 1 ml/min. La fracción activa de la cromatografía de tamices moleculares (cerca de 100 ml) se diluyó a una conductividad de cerca de 6 mS/cm y se cargó directamente a la columna Mono Q y de ese modo se adsorbió la columna. La columna se lavó con búfer B al 5% después de cargar. La columna se eluyó con un gradiente de 5% hasta 40% de B en 30 minutos, seguida de 100% de B por 10 minutos. La nitrilasa se eluyó en fracciones 17 y 18 del gradiente.
Los pasos 1-4 de la purificación se representan en la tabla 1
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Esquema de purificación
5
Las fracciones activas (=FA, en la tabla 1) de la cromatografía con filtros moleculares (paso 3) y cromatografía de intercambio iónico en Mono Q (paso 4) se fraccionaron mediante SDS-PAGE tal como se representa en la figura 2.
Paso 5
Cromatografía líquida de alto [sic] de fase revertida (FR)
La fracción activa (fracciones 17 y 18) de la cromatografía monoQ (paso 4) se verificó en su homogeneidad mediante cromatografía de FR y se purificó más para preparar una escisión de tripsina. Para la separación se empleó una columna (3 cm) de Abimed en un equipo Hewlett-Packard (HP 1090). La fase móvil usada fue el búfer A: agua con TFA al 0,1% y búfer B: acetonitrilo con TFA al 0,1%. El volumen inyectado fue 0,1 ml, la velocidad de flujo 0,5 ml/min. El gradiente de elusión tenía el siguiente perfil:
6
La nitrilasa eluyó entre 12 y 13 minutos. Esto corresponde a una banda de 37 kDa en el SDS-PAGE. Esta banda fue parcialmente secuenciada usando el secuenciador "494 Procise Protein Secuencier" de la empresa Applied Biosystems. La secuencia terminal de N obtenida de 39 aminoácidos se denomina de aquí en adelante como SEQ ID NO: 3. La secuencia se incluye en la lista anexa de secuencias y es: Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly.
Preparación de péptidos trípticos
La muestra de la cromatografía Mono Q (paso 4) fue pre-tratada como sigue: la proteína (cerca de 0,6 mg) se precipitó con 12,5% deTCA y la pelotilla se lavó tres veces con 1 ml de éter/etanol (1:1). La pelotilla se disolvió en 0,2 ml de 6M guanidina HCl, 25 mM Tris/HCl, pH 8,5. A esta solución se adicionaron 2,6 \mul de una solución de 1 M DTT para la reducción de los puentes bisulfito. La muestra se agitó por una hora en la oscuridad. Luego se hizo reaccionar la proteína con 1,5 \mu1 de una solución de 4-vinilpiridina (35%) por 2 horas en la oscuridad. La reacción se finalizó mediante incubación por 1 hora con 2,6 \mu1 de una solución de 1 M DTT. La enzima vinilpirrilada (sic) se purificó como se describió arriba mediante RP-HPLC. (RP por las siglas en inglés de fase revertida). El tiempo de retención fue entre 10 y 11 minutos. La fracción activa, identificada por su peso molecular, se recogió y se concentró a 0,02. A esto se adicionaron 0,01 ml de acetonitrilo y 0,2 ml de 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5. Para la corrección del valor de pH se adicionaron cerca de 0,05 ml de 0,1 M NaOH. La muestra (0,3 mg de cantidad estimada de proteína) se mezcló con 0,032 ml de una solución de 1 mg/ml tripsina en 0,1 M Tris/HCl, pH 8,5, 5% de acetonitrilo y se incubó por una noche a 37ºC. La digestión se detuvo con 0,01 ml de ácido acético y luego se centrifugó. El sobrenadante se separó mediante RP-HPLC en C18 (sistema eluyente: búfer A: agua, TFA al 0,1%, búfer B: acetonitrilo, TFA al 0,1%). Los péptidos (detección a 205 nm y 280 nm) se recogieron y secuenciaron. Se usó el secuenciador "494 Procise Protein Secuencier" de la empresa Applied Biosystems. La secuencia interna peptídico 21 aminoácidos se denominará de aquí en adelante SEQ ID NO : 4, la secuencia interna peptídico de 11 aminoácidos se denominará SEQ ID NO : 5. Las SEQ ID NO : 4 y 5 están en la lista anexa de secuencias y son:
SEQ ID NO : 4
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln
SEQ ID NO : 5
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys
6. Actividad de la nitrilasa purificada frente a mandelonitrilo
La actividad de la nitrilasa purificada frente al mandelonitrilo se investigó como se describió en el ejemplo 2. La actividad específica de la proteína purificada frente al mandelonitrilo estuvo en 12380 U/g de proteína.
Ejemplo 2 Clonación de la nitrilasa de Alcaligenes faecalis 1650
Muestras nucleótidas se derivaron y sintetizaron de las secuencias SEQ ID NO : 3 y 4 representadas en el ejemplo 1. La muestra nucleótida derivada de SEQ ID NO : 3, la secuencia peptídica N-terminal, fue la muestra nucleótida 23 mer, degenerada 64 veces (en la secuencia de la muestra nucleótida, A, C, G o T se reemplazan por N; A o G por R; C o G por S). El alto porcentaje de GC en las cepas de Alcaligenes descritas en la literatura (Wada et al., 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111-2118) significaba que en el caso de glutamina e isoleuquina la selección de la tercera posición del codon estaba predeterminada. La muestra nucleótida, a la que nos referiremos de aquí en adelante como SEQ ID NO: 6, es el '5 primer para la PCR a continuación, donde S=C o G y N = A, C, G o T y es:
SEQ ID NO : 6
5'-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3'
Se derivó un 20 mer como muestra nucleótida de la SEQ ID NO : 4, de la secuencia interna peptídica, degenerada 256 veces (en la secuencia de las bases nucleótidas se reemplaza A, C, G o T por N ersetzt; A o G por R; C o G por S). El porcentaje alto de GC en las cepas Alcaligenes significaba que en el caso de lisina la selección de la tercera posición del codon era predeterminada. La muestra nucleótida representa el 3' primer para la PCR subsiguiente y es referido de aquí en adelante como la SEQ ID NO : 7. Se incluye en la lista anexa de secuencias y es:
SEQ ID NO : 7
5'-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3'
El par de primers, SEQ ID NO : 6 y 7, se usó para realizar la PCR sobre ADN cromosomático de Alcaligenes faecalis 1650. El aislamiento de ADN cromosomático tuvo lugar después de la lisis de célula con tratamiento de lisosoma y proteinasa K mediante el método clásico conocido por el técnico en la materia (Ausubel, F. M. et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons).
La PCR que usa polimerasa Pwo comprendía desnaturalización a 95ºC por 3 minutos; 35 ciclos con desnaturalización a 95ºC por 1 minuto, adsorción de primer a 58ºC por 1 minuto 30 segundos y polimerización a 72ºC por 1 minutos 30 segundos; y polimerización concluyendo a 72ºC por 5 minutos. En estas condiciones, se amplificó un fragmento de cerca de 1 kb en tamaño de ADN cromosomático a partir de Alcaligenes faecalis 1650. Para clonar el producto PCR, se pegaron un sitio de corte de restricción XbaI y dos nucleótidos adicionales (5'-AATCTAGA o 5'-ATTCTAGA) a cada uno de los primers mencionados arriba, y la reacción de PCR se repitió en las condiciones arriba mencionados. Una vez más hubo una amplificación de un fragmento cerca de 1 kb en tamaño el cual, después de la purificación y la digestión XbaI, se ligó a puC18 diferida análogamente. Después de la transformación de E. coli JM109 y aislamiento de la plásmida resultante, se purificó el ADN mediante secuenciación y a continuación Southern blot genómico. Los métodos biológicos y microbiológicos para aislar el gen de nitrilasa completo (nit) tuvo lugar mediante métodos clásicos (sic) conocidos por el técnico en la materia. La secuencia completa de nitrilasa se representa en la
SEQ ID NO: 1.
Ejemplo 3 Homología con otras proteínas, identificación de la secuencia homóloga
La comparación con secuencias del banco de datos de proteínas SWISSPROT mostró que el gen de nitrilasa es esta invención tiene 11 hasta 96% de homología con nitrilasas conocidas a nivel del aminoácido. La homología de secuencia más grande se encontró con la nitrilasa específica para arilacetonitrilo de la Alcalignes (sic) faecalis JM3 (Nagasawa et al., Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765-772). Los dos genes de nitrilasa tienen una identidad de 93,2% a nivel de nucleótido por una región de 1071 bp. La secuencia de aminoácido derivada tiene una identidad de 96,1% por una región de 356 aminoácidos. La homología más pequeña de 11,4% por una región 534 aminoácidos se encontró con la nitrilasa de Rhodococcus erythropolis SK92 (EP-A-0 719 862).
Ejemplo 4 Expresión heteróloga de la nitrilasa en E. coli
Para la clonación al vector de expresión pJOE2702 se amplificó el nit-gen.El 5' primer seleccionado en este caso para le PCR fue la SEQ ID NO : 3 arriba mencionada con un sitio de escisión NdeI que se solapa son el inicio de traslación que se pega en el extremo 51 nit. A este primer se le denomina de aqui en adelante SEQ ID NO : 8 y se incluye en la lista anexa de secuencias. El 3' primer seleccionado fue un 24 mer de la región 3' del gen nit, con un sitio de escisión BamHI adyacente al codon pegado de parada. Se le denomina de aquí en adelante SEQ ID NO : 9 y se incluyen en la lista de secuencias a continuación.
5'-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3' (= SEQ ID NO: 8) 5'-AAGGATCCTCAAGACGGCTCT
TGCACTAGCAG-3' (= SEQ ID NO : 9)
La PCR que usa polimerasa Pwo comprendía una desnaturalización a 94ºC por 3 minutos; 25 ciclos con una desnaturalización a 93ºC por 1 minuto, una adsorción de primer por 1 minuto 30 segundos a 55ºC y una polimerización por 1 min 30 seg a 72ºC o una polimerización de conclusión por 5 min a 72ºC. ]El fragmento de PCR obtenido se purificó, se hizo digestión con NdeI/BamHI y se integró al vector de digestión análogamente pJOE2702 (Volff et al., 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037-1047). La plásmida resultante fue llamada pDHE 19.2 y se muestra en la figura 3. La integración por los sitios de escisión NdeI/BamHI significa que en la plásmida pDHE19.2 el gen nit está bajo control de trascripción del rhap de promotor que está presente en pJOE2702 y se origina de la L-rhamnosa operon rhaBAD regulada positivamente en E. coli (Egan & Schleif, 1994, J.Mol. Biol., 243, 821-829). La terminación de transcripción del gen nit y la iniciación de traslación así mismo tiene lugar por secuencias de vector. Además, la plásmida contiene un gen que confiere resistencia a la amplicilina Ap^{R}.
La expresión heteróloga de la nitrilasa se mostró con la cepa E. coli JM109 que contiene la plásmida pDHE19.2. Para este propósito , la cepa JM109 (pDHE19.2) se cultivó en el medio de cultivo TB con 100 \mug/ml de ampicilina (Tartof, Hobbs 1987) agitando a 37ºC. ]A una OD_{600} de 1,7 se trasfirió el cultivo1:200 hacia medio TB fresco que contenía 0,2% (p/v) de L-rhamnosa para inducir la nitrilasa, y se cultivó agitando a 30ºC. Después de 8 horas, se cosecharon células, se lavaron con búfer de fosfato de Na/K a 10 mM, pH 7,2, se resuspensión en el mismo búfer hasta una OD_{600} de 10, y se desintegraron después del tratamiento con ultrasonido.
Ejemplo 5 Determinación de la nitrilasa de la cepa recombinada E. coli JM109 (pDHE19.2) 1. Preparación de las células
E. coli JM109 (pDHE19.2) se cultivó a 37ºC por 6 horas en medio TB + 100 \mug/ml de ampicilina con agitación. A una OD_{600} de 4 se usaron 100 ml de este precultivo para inocular un fermentador de 10 L que contenía 8 L de medio TB fresco + 100 \mug/ml de ampicilina + 2 g/l de L-rhamnose. El pH, la temperatura, la velocidad de flujo de aire y la velocidad de agitación fueron 7,2, 30ºC, 300 l/h y 400-650 rpm. Las células fueron cosechadas después de 16 horas. La densidad óptica a 600 nm esta vez fue de 18, correspondiente a un peso seco de células de 7,8 g/l.
2. Determinación de la actividad específica frente a mandelonitrilo
Las células se obtuvieron tal como se describe en el ejemplo 1 y se lavaron en búfer de fosfato de Na/K de 10 mM, pH 7,2. Se resuspendieron 2 mg peso seco de células en 1 ml de búfer de fosfato de Na/K de 10 mM, pH 7,2 y la reacción se inició adicionando 8,3 mM de mandelonitrilo. La reacción se efectuó con agitación a 40ºC. La cinética se controló tomando muestras y a continuación con HPLC (ODS Hypersil). Se determinaron mandelonitrilo, benzaldehído, mandelamida y ácido mandélico. La velocidad de formación de ácido mandélico fue de 403 U/g peso seco de células con una conversión de 30%; 1 U se define como la formación de 1 \mumol de ácido mandélico por minuto a 40ºC.
Ejemplo 6 Síntesis de ácido R-mandélico mediante hidrólisis de mandelonitrilo usando E. coli JM109 (pDHE19.2) en suspensión
Se dosificó mandelonitrilo en una concentración de 1,3 g/l en el transcurso de 10 horas a un volumen de 1 L de búfer de fosfato de Na/K de 10mM, pH 7,2, el cual contenía la cepa E coli JM109 (pDHE19.2) en una concentración de 2 g/l mientras se revolvía con un agitador de paleta a 40ºC. La dosificación se controló por el consumo de nitrilo. La velocidad de consumo de ácido R-mandélico se siguió tal como se describe en el ejemplo 5. Los resultados se presentan en la figura 4.
Ejemplo 7 Obtención de ácido R-mandélico mediante extracción de la mezcla de reacción de la hidrólisis de mandelonitrilo por E. Coli (sic) JM109 (pDHE19.2) en suspensión
La mezcla acuosa de reacción de ácido mandélico obtenida en el ejemplo 6 se centrifugó para retirar las células, se ajustó a pH 2 con un ácido y se extrajo tres veces con éter de metil-tert.butílico (MTBE). Después de retirar el solvente orgánico del extracto de ácido mandélico mediante evaporación, los cristales blancos de ácido mandélico resultante se re-disolvieron e investigaron para pureza química y óptica mediante HPLC. La pureza química fue de 99% y la pureza óptica del ácido R-mandélico fue de 97,4% ee.
Ejemplo 8 Obtención de ácido R-mandélico mediante cristalización con enfriamiento de la mezcla de reacción de la hidrólisis de mandelonitrilo por E. coli JM109 (pDHE19.2) en suspensión
La mezcla de reacción acuosa de ácido mandélico obtenida en el ejemplo 6 se centrifugó para retirar las células, se concentró hasta 40% del volumen inicial calentando y agitando y se ajustó hasta pH 2 con un ácido. El ácido mandélico se cristalizó mediante enfriamiento en un baño de hielo y los cristales blancos de ácido mandélico resultante se filtraron con succión y se secaron. Los cristales se re-disolvieron e investigaron para la pureza química y óptica mediante HPLC. La pureza química fue de 99,1% y la pureza óptica del ácido R-mandélico fue de 99,8% ee.
Ejemplo 9 Conversión de diversos nitrilo
La cepa E. coli (ver ejemplo 6) o la cepa Alcaligenes inicial se usó para convertir diversos nitrilo. Las células de Alcaligenes se cultivaron en 400 ml de medio Alcaligenes(ver medio A de arriba) a 30ºC y 160 rpm durante 16 horas (= h). Las células se cosecharon mediante centrifugación (30 min, 4ºC y 5000 rpm). Se pipetearon porciones de 150 \mul de una suspensión de células en cada uno de los pozos de la placa de microtitulación. La placa se centrifugó después. El sobrenadante se aspiró y las pelotillas de célula se lavaron dos veces con Na_{2}HPO_{4} (1,42 g/l en Finnaqua, pH 7,2). La solución de substrato (150 \mul) se pipeteó luego y las células se resuspendieron. Se adicíonó un substrato a cada fila de 12 agujeros en la plancha de microtitulación. Se usó como control una fila con la solución de substrato pero sin células (blanco).
Las placas de microtitulación se dejaron en un incubador agitándose a 200 rpm y 30ºC por 2 horas. Las células se centrifugaron y se determinó la cantidad de iones NH_{4} producidos en el sobrenadante usando un aparato Biomek. Las mediciones se efectuaron a 620 nm usando una curva de calibración construida con diversas soluciones de NH_{4}OH (ver la figura 5). Los substratos usados fueron mandelonitrilo (= 1), 2-fenilpropionitrilo (= 2), 2-fenilbutironitrilo (= 3), benzilcianuro (= 4), 4-clorbenzilcianuro (= 5), 4-brombenzilcianuro (= 6), propionitrilo (= 7), 2-metilbutironitrilo (= 8, 2-cianobutano), geranonitrilo (= 9), valeronitrilo (= 10), 3-_cianpiridina (= 11), 3-bifenil-2-hidroxi-butironitrilo (= 12), 4-fluorbenzilcianuro (= 13), 4-fluorofenilacetronitrilo) y \alpha-(3-heptil)-nitro-triacetonitrilo (= 14). Fue hecha una solución stock de 0,2 molar en metanol para cada uno de los substratos y cada uno se diluyó hasta 10 mM con Na_{2}HPO_{4} (1,42 g/l en Finnaqua, pH 7,2). Las suspensiones de célula se estandarizaron hasta 2 g/l de biomasa seca. La tabla II muestra los promedios para una fila de placas de microtitulación en la conversión.
TABLA II Conversión de diversos nitrilos con nitrilasa 1650
7
La figura 6 muestra los resultados de la conversión como actividades.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: BASF Aktiengesellschaft
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(B)
CALLE: Carl-Bosch-Strasse 38
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(C)
CIUDAD: Ludwigshafen
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(D)
ESTADO FEDERADO: Rheinland-Pfalz
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(E)
PAÍS: República Federal de Alemania
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(F)
CÓDIGO POSTAL: D-67056
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(ii)
TÍTULO DE SOLICITUD: Método para la Producción de Ácidos Carboxílicos Quirales a partir de Nitrilos con ayuda de una nitrilasa o Microorganismos que contienen un Gen para la Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: Floppy disk (disquete)
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERACIONAL: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1071 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: Doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1.._1071
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
100
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 356 Aminosäuren
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminosäure
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: Protein
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 39 Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DEL FRAGMENTO: N-Terminus
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser}
\sac{Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala}
\sac{Arg Gln Ala ARg Asp Glu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DEL FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu GLu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala}
\sac{Ile Ser His Pro Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 11 Aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DEL FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGCAGACNA GNAARATCGT SCG 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TNGCSACNGA NGCRATCTTG 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTAATCATAT GCAGACAAGA AAAATCGTCC G 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICA DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE LA MOLÉCULA: DNS (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Alcaligenes faecalis
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 1650
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
PROCEDENCIA DIRECTA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CLON: Nitrilasa
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGATCCTC AAGACGGCTC TTGCACTAGC AG 
\hfill
32

Claims (15)

1. Una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica para un polipéptido que tiene una actividad de nitrilasa, seleccionada del grupo de
a) una secuencia de ácido nucleico que tiene representada en la SEQ ID NO: 1,
b) secuencias de ácido nucleico que se derivan de la secuencia de ácido representada en la SEQ ID NO: 1 como un resultado de la degeneración del código genético.
c) homólogos de la secuencia de ácido nucleico representada en la SEQ ID NO: 1, que codifican para polipéptidos que tienen al menos 98% de homología, por el rango entero de secuencia, a SEQ ID NO: 2, sin reducción en la acción enzimática de los polipéptidos.
2. Una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1.
3. La secuencia de aminoácido según la reivindicación 2, codificada por la secuencia representada en SEQ ID NO: 1.
4. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, y la secuencia de ácido nucleico está enlazada con una o más señales regulatorias.
5. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 o una construcción de ácido nucleico según la reivindicación 4.
6. Un microorganismo que comprende al menos una secuencia introducida de ácido nucleico según la reivindicación 1 o al menos una construcción introducida de ácido nucleico según la reivindicación 4.
7. El microorganismo según la reivindicación 6, donde el microorganismo es una bacteria de la especie Escherichia, Pseudomonas o Alcaligenes.
8. Un proceso para preparar ácidos carboxílicos quirales de la fórmula general I
13
Que comprende converter nitrilos racémicos de la formula general II
14
en presencia de una secuencia de aminoácido según la reivindicación 2 ó 3 o un microorganismo en reposo o desintegrado, en crecimiento, según la reivindicación 6 ó 7, y en el cual al menos 25 mmol de nitrilo se convierten por h y por mg de proteína, ó 25 mmol de nitrilo se convierten por h y por g de peso seco, en ácidos carboxílicos quirales, donde los substituyentes y variables en las fórmulas I y II tienen los siguientes significados:
* un centro ópticamente activo
R1, R2, R3 independientemente uno de otro es hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo, hetarilo,substituidos o no substituidos, OR^{4} o NR^{4}R^{5} y donde los radicales
R^{1}, R^{2} y R^{3} son siempre diferentes,
R^{4} es hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, alquilcarbonilo de C_{1}-C_{10}, alquenilcarbonilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo, arilcarbonilo, hetarilo o hetarilcarbonilo,
\newpage
R^{5} es hidrógeno, alquilo de C_{1}-C_{10}, alquenilo de C_{2}-C_{10}, substituidos o insubstituidos, ramificados o no ramificados, arilo o hetarilo.
9. El proceso según la reivindicación 8 en el cual uno de los substituyentes R^{1}, R^{2} ó R^{3} es OR^{4}.
10. El proceso según la reivindicación 8 ó 9, en el cual uno de los substituyentes R1, R2 ó R3 es arilo.
11. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en las que el proceso se realiza en una solución acuosa de reacción a un pH entre 4 y 11.
12. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el cual se hacen reaccionar desde 0.01 hasta 10% en peso de nitrilo ó desde 0.01 hasta 10% en peso un aldehído o cetona correspondientes y de 0.01 hasta 10% en peso de ácido prúsico (hidrociánico) en el proceso.
13. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 hasta 12, en las que el proceso se realiza a una temperature entre 0ºC y 80ºC.
14. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 8 hasta 13, en las que el ácido carboxílico quiral se aísla de la solución de reacción en rendimientos desde 60 hasta 100% por medio de extracción p cristalización o extracción y cristalización.
15. El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 hasta 14, en las que el ácido carboxílico quiral tiene una pureza óptica de al menos 90% ee.
ES99952558T 1998-10-19 1999-10-13 Metodo para la produccion de acidos carboxilicos quirales a partir de nitrilos con ayuda de una nitrilasa o microorganismos que contienen un gen para la nitrilasa. Expired - Lifetime ES2280125T3 (es)

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