HU228092B1 - Method for producing chiral carboxylic acids from nitriles with the assistance of a nitrilase or microorganisms which contain a gene for the nitrilase - Google Patents

Description

Eljárás királis karbonsavak előállítására nhrilekből, mfrilázt kódoló g tartalmazó mikrporgardsmasokbói származó nitriiáz segítségével

A találmány tárgyát-nitrilázgaktivitással rendelkező polipeptidekét kódoló nukleinsav-szekvenciák, a nukleinsav-szekvenci á~ kat tartalmazó nukieinsav-konstrukciók, valamint a nukleinsav-szekvenciákat vagy a nukleinsav-konstrukciökat tartalmazó vektorok képezik. A találmány tárgyát képezik továbbá a nukleinsav-szekvenciák által kódolt .aminosav-szek.venciák, valamint a nufcleinsav-szekvenciákat, a nukleinsav-konstrukciökat vagy a nukleinsav-szekvenciákat vagy a nukleinsav-konstrukciökat tartalmazó vektorokat hordozó mikroorganizmusok.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás királis karbonsavak előállítására racém nitrilekből.

A .királis karbonsavak keresett vegyüietek szerves kémiai szintézisekhez. Kiindulási anyagként szolgálnak számos gyógyhatású hatóanyag vagy növényvédelemben alkalmazott hatóanyag előállításánál. Királis karbonsavak alkalmazhatók dlasztereomer sókon át végzett klasszikus racemát elválasztásokhoz. így például vagy S-(-j-mandulasav (a-hídro-xi-fenil-ecetsav) alkalmazható racém aminek racemát elválasztására. Ezenkívül az R- .(-> -mandulasávat köztitermékként alkalmazzák antibiotikumok, és számos mezőgazdasági termék £éIszíntézisénél.

A .szakirodalomból egy sor, különböző szintézisük ismeretes királis karbonsavak előállítására. Például optikailag aktív amisósavakat iparilag fermentációs eljárásokkal állítanak elő.. Ennek az a hátránya, hogy minden egyes aminosavrs egy egyedi eljárést kell kifej; les zteni. Különféle vegyületek lehető legszélesebb palettájának eiőállíthatősága céljából ezért kémiai vagy enzimes eljárást alkalmaznak. A kémiai eljárásoknak az a hátrányuk, hogy a szteraocentrvmot rendszerint többlépcsős, szűk körben alkalmazható szintézisben, .körülményesen kell felépíteni.

Kírális karbonsavak enzimes szintézisét egy sor szabadalmi leírásban vagy szabadalmi bejelentésben tárgyalják, A WG92/05275 számú szabadalmi iratban leírják enantiomer a-hidroxi-a-alkilvagy α-alkii-karbonsavak szintézisét biológiai anyagok jelenlétében. As EP-B-0 348 901 számú szabadalmi iratban .leírnak egy optikailag aktív, a-saubsztítuáit szerves savak előállítására szolgáló eljárást, amelyben Alcai.ígenes, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, Corynefoaeterlum (KO-2-4-törzs) , Aeinetóbacser, Bacillus, Myc-obacterium, Rhodocpoeus és Candida nemzetséghez tartozó mikroorganizmusokat alkalmaznak.. Az 'EP-B-Ö 332 379 számú szabadalmi iratban igényeltek szerint, L-a-aminosavakat mikroorganizmusok segítségével állítanak elő.

-Hídroxi-karbonsavak előállítását, konkrétan optikailag aktív tejsav vagy mandulasav előállítását különböző mikroorganizmusok,· például Alcaiigenes, Aureobactórium, C'aseobacter, Bacíllus, Mycobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Nocardia, Variovorax, Arthrobacter és Candida. nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok vagy enzimek alkalmazásával végzik az EP-A-G 348 GÖX vagy az ennek megfelelő USP 5,283,133, valamint az SP-A-0 449 648, EP-B-0 473 328, EP-B-0 527 553 vagy az ennek megfelelő USP 5,296,373, valamint az EP-A-Ö 610 048, EP-A-0 610 049, EP-A-0 666 320 vagy a

WO 97/32030 számú szabadalmi iratokban leírtak szerint.

72,3 72/SE

Szén eljárások hátránya az, hogy gyakran csak csekély optikai tisztaságú termékhez vezetnek, és/vagy csak alacsony tér-idő-kitermeléssel folynak le. Sz gazdaságilag nem vonzó eljáráshoz vezet. A termelékenység fokozása céljából hozzáadott bizonyos anyagok, például szulfát, di.szu.lfit, ditionit, hipofoszfit vagy foszfát (lásd δΡ-Α-Ο 486 289 számú szabadalmi iratot}, vagy a-hidrozi-nitrl'lekkel szemben fokozott rezisztenciával rendelkező mikroorganizmusok alkalmazása (lásd WO97/32Ö3-0 számú szabadalmi iratot) nem növelte jelentősen a termelékenységet.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztünk ki. könnyű, költ-ségkimélo, széles körben alkalmazható eljárás kidolgozását optikailag aktív kiráiis karbonsavak előállítására, amely nem rendelkezik a fentebb megnevezett hátrányokkal.

Ezt a feladatot az

R2·

COOH (Xj általános képletü kiráiis karbonsavak előállítására szolgáló, találmány szerinti eljárás kidolgozásával oldottuk, amelyben egy

R1 |

R2-—|—CN (2Xi

RS általános képletü racém nitrilt egy olyan amínosav-szekveneia jelenlétében alakítunk át kiráiis karbonsavvá, melyet az alábbiak közül választott nukieinsav-szekvencia kódol:

a) az 1. számú szekvenciával 1SEQ ID HO: 1) ábrázolt makiéin sav-szekvencia,

72. aíz/ss-zrisipz

b) olyan nakleínsav-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degeneráltsága eredményeként at I. számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1; ábrázolt nnkleinsav-szekvenciábói levezethetők,

c) az 1. számú szekvenciával(SEQ ID NO: 1) ábrázolt nnkieinsav-szekvencia olyan homológjai, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, melyek legalább 98% homológiával rendelkeznek a teljes szekvenciatartományon át a 2. számú szekvenciához (SEQ ID NO: 2) anélkül, hogy a polipeptid enzimhatása csökkenne, vagy olyan növekvő (tenyésztett), nyugalomban lévő vagy feltárt mikroorganizmusok jelenlétében, amelyek a fentebb leírt csoportban felsorolt bármelyik nukleinsav-szekvenciát vagy olyan nukleinsav-konstrukcibt tartalmaznak, amelyben a fentebb leirt csoportban felsorolt bármelyik nnkieinsavhoz egy vagy több szabályzó szignál van kapcsolva, és amelyben óránként legalább 25 mmol nitrii (mg fehérjére vagy gramm szárazanyag-tömegre vonatkoztatva) képes átalakulni.

Az (I) és (II) általános képletben a szubsztituensek és szimbólumok jelentése az alábbi:

* optikailag aktív centrum;

R, R^z, E~ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szubsztituáit. vagy szubsztíéüálaílsn, elágazó vagy egyenes láncú, 1-10 szénatomos alkílcsoport, 2-10 szénaromos aikenii·csoport, szubsztituáit vagy szubsztituálatian arilcsoport, hetercarli-csöport, -OR⁴ vagy -NR^Rf általános képletü csoport, és RÉ Ph és R“ jelentése mindig egymástól eltérő;

Ph jelentése hidrogénatom, szubsztituáit vagy szubsztituálatlan, elágazó vagy egyenes láncú, 1-10 szénatomos alkil2 . W ,'S'S/?A2ip2 φφ<

csoport, 2-10 szénatomos aikenilcsoport# 1-10 szénatomo alkil-karbonil-csoport# 2:-20 szénatomos aikenil-karbonil

-csoport, arilcsoport# aril-karbon!i-csoport, heteroarii

-csoport vagy heteroaril-karbonil-csoport;

H jelentése hidrogénatom# szubsztituált vagy szubsztituá lattan# elágazó vagy egyenes láncú# 1-10 szénatomos alkil csoport, 2-10 szénatomos aikenilcsoport# arilcsoport vág heteroari1-csoport.

R^l# R'', R⁵ jelentése az {!) és (II) általános képletben egy mástól függetlenül hidrogénatom# szubsztituált vagy szubsztituá lation, elágazó vagy egyenes láncú, 1-10- szénatomos alkiicso port, 2-10 szénatomos aikenilcsoport, szubsztituált vagy szufo-sz tituálatlan arilcsoport, heteroari 1-csoport, -OF? vagy -NR/’R'¹ ál talános képletö csoport, és R, Fh, R³ jelentése mindig különböző

Alkilesoport lehet szubsztituált vagy szubsztituálatlan# el ágazó vagy egyenes láncú, 1-10 szénatomos alkillánc, például me tii-, etil-, propil-, izopropil-, butil, 1-metll-propil-# 2 -metil -p r op i 1 -, tere -bút i 1 -, pen t i 1 -1 -me t i 1 -fou t ί 1 -, 2 -me t i 1 -bút i.l 3-metil-butil-, 2,2~dímetíi-propii~, .1.-etil ~prop.il™, hexil1,1-dimetil-propil-# 1,2-dímetil-propil-, I-metil-pentil-, 2 -metii-pentil-f 3-met il -pent.il-, 4-metil-pentil-# 1,1-dimetii -buti.!-, 1, .2-dimetil-butil.-# 1,3-dimetii-butii-, 2,2-dimet.Í.l

-butil-, 2,3-dímetil-butíi-, 3,3-dimetil-butil-, i-etii-butil2-etí1—butiI —, 1,1,2~trimetil~pröpil~, 1,2,2-trimetil-propil-, 1

-etil-l-metii-prcpil-, l-etiÍ-2-metil-prcpii-, heptil™, oktiinonil™ vagy decil-csopcrt. Előnyösen alkalmazott csoport a me tii-, etil-, propil-, butil-, izopropil- vagy ízobutil-csoport. 72.372/BE vagy ♦ ·*

-meti1-3-pen fcen11-, 3-met il-3-penteni1-, nterui

Az aíkenilcsoport lehet elágazó vagy egyenes láncú, 2-l< szénatomos alkenil-lánc, például vínii-, propenil.-, 1-butenil-,

2- butenil-, 3-butenil-, 2-metiI-propenii-, 1-pentenil-, 2-pentenil-,

3- pe.nteni 1-, 4~pentenil.~, l-metil-l-buteníl-, 2-metíl-l-butení1-,

3-me ti 1-1 -butenil··-, l-metíl-2-butenil-, 2-metil~2-but.enil-, 3-iRet.il-2-butenil-, l-me.til-3~butenil-, 2-metil~3~butenil-_f 3-metil-3-butenil-, 1, I~dimetíl~2-proponál-, 1,2-dimeti.l-l.-propen.il-,

1.2- di-meti.i-2-propeni.l-, l-etil-l-propenii-, l-etii-2-propeni 1-,

1-hexenil-, 2-hexeni.l-, 3-hexen.il-, 4-he-xenil~, 5-hexen.il-, 1-metíl-I-penteni.l-, 2-met.il~l-pentenil-, 3~met.ii-l-pe.nten.il-, 4-meti.l~l-penteni.l-, i-metil-2-penten.il-, 2~raetil-2~pent.en.il-, 3· ~raefc.il-2-pentenil-, 4-raeti1-2-penteni1~, l~met.il-3~pente.nil~, 24-metil-3-pentenii-, 1teni.l-f 2-meti.l-4-penten.il-, 3-metí Ι-4-pentenii-, 4-metil-4-pentenil-, 1, l-dimétil~2~bu.teníl~, 1, l-dímetil-3-butenil1.2- áimetiI-l-bütéhí 1-, 1, 2-dimetil--2~buten.il·--, . 1,2-dimetí 1-3· -butenil-, 1, 3-dimetil-i-bufcénil-, i,3-dí.metil-2-.feuten.il~, 1,3· -dimetíI~3~butsnll-_f 2,2-dimet.il-3-buteníi-, 2,3-dimetii-l· -butenil-, 2, 3-dimeti 1-2-butenil.-, 2,3-dímetíi-3-buteníl~, 3,3· -dimetil-l-buten.il-, 3,3-dimeti.Ι-2-butenil-, l-etil-l-buteni 1 -. l-eti Ι-2-butenil-, l-efcil-3—butenil-, 2-etil~l-buten.il-, 2-etii· -2-butenil-, 2-etii-3~buteniI-, 1, l,2-trimetil-2-.propenil-, 1-et il-1 -met il-2-propeni 1-, 1-ef il-'2-metil~l-propenil-, 1-e ti 1-2· -meti 1-2— propenil-, l-hepten.il-, 2-heptenil~, 3-hepten.il-, 4· -hepteníl-, 5-heptení 1-, 6-hepte.nil-, 1-ok.tenil-, 2-oktenil-, 3-oktenil-, 4~o.ktenil~, 5-okten.il-,

6-oktenil-, 7-ok.tenilnonenil- vagy decenil-csonort. Előnyösen alkalmazott csoport

72,372/BE

X # ♦ «

vinil-, propenil-, fouteníl- vagy pentenil-csoport,.

Árucsoportként olyan szubsztituált vagy szufosztxtuálst.lan aríIcsoportokat alkalmazunk, amelyek 6-20 szénatomot tartalmaznak gyűrűben vagy gyűrűrendszerben. Ezek. lehetnek egymással kondenzált aromás gyűrűk vagy olyan aromás gyűrűk, amelyek, alkxl-, alkii-karbonil-, aikenil- vagy alkenil-karfoonll-láncokon, 'karfocnil-csoporfcon, oxigén- vagy nitrogén-atomon, keresztül kapcsolódnak, Ariicsoportok adott esetben. 1-10 szénatomos alkii-, 3-8 szénatomos alken.il-, 3-6 szénatomos aikinil- vagy 3-8 szénatomos cikloalki1-láncokon keresztül az alapváznál még össze lehetnek kapcsolva. Előnyösen alkalmazott csoport a fenil- vagy naftilcsoport.

Heteroaril-csoportként szubsztituált vagy szuhsztítuálatian, egyszerű vagy kondenzált, aromás, .3-7 tagból álló gyűrűket alkalmazunk, amelyek egy vagy több heteroatomot, például nitrogénatomot., oxigénatomot vagy kénatomot tartalmazhatnak, és adott esetben 1-10 szénatomos alkii-, 3-8 szénatomos aikenil-, 3-6 szénatomos alkinil- vagy 3-8 szénatomos cíkioalkil-lánookon keresztül az alapváznál össze lehetnek 'kapcsolva, ilyen heteroaril-csoport lehet például pirazolil-, imidazolil-, oxazolil-, izooxazolil-, tiazolil-, triazolil-, piridil-, izoklnolil-, akriöíl-, pirímidinil-, piridazin.il-, kinoli1-, oirazin11-, fen.azini.l~, purinil- vagy pterídil-csoport. A heteroarilcsoportok heteroatomon vagy különböző szénatomokon keresztül gyűrűbe vagy gyűrörendszerhe kapcsolódhatnak, vagy szufosztituenseken keresztül az alapvázhoz kapcsolódhatnak. Előnyösen alkalmazott csoport a piridil-, imidazolil-, pirimidiní1-, purinil-, . O 1 2, / 5Ρ .Ϊ pirazinii- vagy kinoii 1-csoport.

As -említett R\ Pl vagy R³-csoport szubsztituense lehet például sgy vagy több szubsztituens- az alábbiak közül: halogénatom, például fluoratom, klóratom vagy brómatom, tio~, nitro-, amino-, hidroxi-, alkil-, alkoxi-, alkenil-, alkenil-oxi-, alkinil-csoport vagy további aromás vagy további telített vagy telítetlen, nem -aromás, kérdéses gyűrő vagy gyűrűrendszer♦ Előnyösen alkalmazhatók alkil-csoportok, például 1-6 szénatomos- alkilosoportok, például metil-, etil-, propil- vagy bútil-csoport, arilcsoport, például fenilesoport, haiogénatom, például klóratom, fluoratom vagy brómatom, hidroxi- vagy amino-csoport.

£V* jelentése az -OR⁴ vagy -NR⁴R⁵' általános k.épletű csoportokban hidrogénatom^ szubsztítuált vagy szubsztituálatlan, elágazó vagy egyenes láncú, 1-1Ö szénatomos alkilcsoport, 2-10 szénatomos a iken ile söpört, 1-10 szénatomos alkil-karbonil-csoport, 2-10 szénatomos alkenil-karbonil-csoport, árucsoport, aríl-karbonil-csoport, heteroaril- vagy heteroaril-karbon!1-csoport.

.Alkilcsoport lehet szubsztítuált vagy szubsztituálatlan, elágazó vagy egyenes láncú, 1-10 szénatomos alkilcsoport, például metil-, etil-, propil-, izopropii--,· buti!-,· l-metil~p.ropi.i~, 2-metil-propil-., terc-butil-, pentíl-, l-mefcil-butíl-, '2-metil-butil-, 3-metil-butil-, 2,2-dimetí1-propil-, l~etii-propíl-, he-xil-, 1, l-díxae-til-propil-, 1,2-dimetil-propil-, 1-metil-pentil-,

2-metíl-pentiI-, 3-metil-pentil-, 4-metil-pentíl-, 1,1-dimetil-butil-, 1,2~-dimetil~butil~, 1,3-d.imetil-foutil-, 2,2-dimet.il-fouti.l~,

2, 3-dimetiI-but.il-, 3,3-d-imetiI-butil-, 1-etil-butil-, 2-eti.l-butil-, 1,1,2-trimetíl-propí1-, 1,2,2-trimstíi-propíi~, 1-etilφ» ~1-metil-propil-, i-etil-S-metil-propil-, heptii-, oktil-, noníl vagy decil-csoport. Előnyösen alkalmazott csoport a metiletil-, propil-, buti'l-, izopropll- vagy izobutll-csoport.

A.1 keni lesöpört lehet elágazó vagy egyenes láncú# 2-10 szén atomos alfcenílesöpört, példáéi vinil-, propen.il-, 1-bufcanil-, 2 -hűteni 1—, 3-buten.il-, 2-metil-propenil-,· ί-pentenil-, 2-pentenii3-penteniI-, 4-pentení1-, 1-metíl-l-buteni1-, 2-met11-1-boténil3 -ise t i 1 -1 -butenil- , 1 -meti 1-2 -hűteni 1-, 2 -meti 1 - 2 -butenil -, 3 -metii-2-buteniI-ⁱ·, l-metil-S-butenil-, 2-metil-3-butsn.il-, 3-metil -3-butenil-, 1# l-dimetil~2-propenil~, 1, 2-.dimetíl-1—prope.ni.l1,2-dimetil~2~propenil~, l-etil~l~propenil~, l-et.i.l-2-propenÍ.lΙ-hexeniI-, z-hexenil-, 3-~hexen.il-, 4-hexeniI~, 5-hexenil-, 1

me 111	-1-penteni.l-,	2-meti1-1-penten í1-,	3-metil	-1 - p e n t e n i 1 -,
ΊΪΙΒ ti Ü	-1-pentenil-.	1-meti1-2-pentenil-,	2-metil	- 2 - p e n t en i i -,
metil	-2-pentenil-,	4 - me t í 1 - 2 - pen t en 11 -,	1-metil	-3-pentenil-,
metil	-3-pentenil-,	3-metil.-3 --pentenil -,	4-met11	-3-pentenil-,
metil	-4-pentenil-,	2-met11-4-pen teηí1-,	3-metil	-4-pentenil-,
met ii	-4-pentenil-,	1,1-dimetil-2-butenil-		me 111-3-búteη1

_f 2-dimstíI-l-buteníl-, 1, 2-dlmet i.I-2.-butenil-, 1# 2-d.imetí.1-3

-butenil-, 1,d-dimetil-i-bufcenil-, 1,3-dimetil~2~buteníl-, 1,3

-dímetíl-3~butenil-, 2# 2-dimetil-3~butenil-, 2, 3-dimetíl-l-butenii2, 3-dimeti.I-2-butenil-, 2, 3~d.imetil“3-butenil~, 3# 3-dÍmetíl-l

-butenil-, 3,3-dimetiI~2-buteríil~, l-etil-l-huten.il-, l-etil-2

-hűteni 1-, l-eti.l-3-buteníl-, .2-etil-l-bu.teniI-, 2~et.il-2-butenil-etil-3-buten.il-, 1,1,2-trlmetll-2~propeniI-, 1-et il-l-met.i.1-2 •propenil-, l~etil-2-met.il-l-propeni.i~, l-et.il~2~metil-2'-propenil-heptenil-, 2-hepten.il-, 3-hepteníI-, 4-heptenil~, 5-hepteníl~ *** φ * *·♦. φ

6-heptenil-, Ι-ckteniX-, 2-oktenil-, 3-oktenil-, 4-oktenil-, 5---oktenil-, 6-oktenil-, 7-oktenil-, nonenil- vagy decen.il-c.soport. Előnyösen alkalmazott csoport a vin.il-, propen.i.1 buteníivagy pentenil-csoport.

Az alkíl-karfoonii-csoport lehet, szubsztituált vagy szubsztituálatlan, elágazó vagy egyenes láncú, l-lö szénatomos alkilkarboni1-csoport, például metíI-karbon!1-, etil-karbohíl-, propil-karbonil-, izopropii-karbonil-, but.il-karbonil-, 1-metil~propil~karboh.il-, 2-metil-propil-ka.rbonii’-, terc-huiíi-karfoonil-, pentil-karhonil-, I-metíl~but.il-karbonil-, 2-metíl-butii’-karboni.i-,

3-rae t i 1 -bu t ί .1 - kar bon i 1 -, 2,2 - dime t. i 1 - prop 1.1 - ka rbo n i 1 - ,· 1 - e t i 1-propi.1-karbonil-, hexil-karbonil-, 1,1 -dimeti 1-propi 1-karbon! .1--, 1, 2~dimetil-propil~karbom.il-, I-metil-pentil-karbon 11-, 2-metil-pe.nt.il- karbonil-, 3-metiI-pent.il-karboníl-, 4-metí l-pentil-karboníl-, 1, l-dimetil~butil-karhon.il-, 1,2.~dimetil-buti i~ karbonil-,

1,3-dimetí l-butil-karboni!-,· 2,2-dímetíl-butil-karboni.l-, 2, 3-dimetil-butil-k.arhonii~, 3,3-dimetil-butil-karbonii-, 1-et.il-hutí 1-karboni 1-, 2-etil-butil-karbon.il-, 1,1,2-trimeti 1-propil-karbonil-, 1,2,2-trimetil-prop.il-karbonil-, 1-etil-l-metil-propíl- karbon.il-, l-ef.ií~2-metii~propil-karboni'i.~, heptil-karbonil-, oktíi-karbonil-, noníl-karboníl- vagy decil-karbonll-csoport. Előnyösen alkalmazott csoport a metil-karbon.il- (acetíl-), etil-karbonil- (propion.il-), propil-karbonil-, be tíl-karbont A.--, ízopropí 1-karbonil- vagy izohutil-ka.rbonil-csoport.

Alkenil-karbon!1-csoport lehet elágazó vagy egyenes láncú, 2-10 szénatomos alkemi 1-karboni'l-csoport, például vínil-karbonil-, propenil-karbon.il-, 1-fou.tení 1-karboni 1-, 2~foutenii~kar.bo.nil-, 311

-bntenil-karfoonil-·, 2-meti.l-p-ropeníl~karbO'ní.l-, 1-pentenil-karbonil-, 2-pentenil~karbonÍl-, 3-pentenii-karbonil-» 4-penten.í1-karbonil-, .i-metil-l-butenil-karb-oníl-, 2-Betil-l-buteníi-karbonil-, 3-metíl-i-bntení I---karboní1-, 1 -metál-2-buten.il-karbonil-, 2-metíl-2-butenil-karbonii-, S-metii-z-butenil-karbonli-, i-metil-3~butenii-karboní!-, z-metil-S-buteníl-karboníi-, 3-metíi-3-foutehil~karhanil-, 1, l-dixnetil-2-propenil~^:karfoonil~, 1,2-dímetil-í-propeníl-karbonii~, 1,2-dimetíi-2-propenil-karbon.il-> i-etil-i-propení i~kar.fo-onil-,

-et 11-2 -propeni i-ka rboni1 -, 1 -bekeni I. -ka rbon il -, 2 -hexeni 1 -karbonil”, 3-hexenil-karfooní 1-, 4-hexenil-karbonil-, 5-hexenil-karbonii-, I-metil-l-pentení1-karbonil-, 2 -met.il -1-pentenil -karboní 1-, 3-metil-l-pentenil-karbon.il-, -4-raetil-l-pentenil-karbonil-, 1 -metí 1-2-pentenil-karbonil-, 2-met il-2-pentenil-karbon.il-, 3-met.il- 2 - p en t en i 1 - ka rb on 11-, 4 -me t i 1 - 2. -pen t e ni 1 - ka r b on i 1 -, 1 -me til~3'~ -pentenil-karboní1-, 2 -met il-3-penteni 1-karbonil-, 3-metil-3~penten.il -ka rbon 11-, 4-metii— 3-pentenil -karbonil-, 1-m.etí l-4~pent en 11-ka rbon i1-, 2-met i1-4-pen teη í1-karbonil-, 3-meti1-4-penteni1-karboní1-, 4-me ti1-4-pentenil-karbonil-, 1,1-dímetil-2-buten i 1 - ka rbon i 1 -, 1,1 - dime t i 1 - 3 -bu ten i 1 - ka rbon i 1 -, 1, .2 - dime til -1 -hutenil-karbonii-, 1,2-dimetil-2-butenii~karbon.il-, 1,2-dimetíl-3-butenil-k.arfooni.l-, 1,3-dimet il-1-bnteníí-ka.rbonil-, 1, 3-dimetii-2-foutenil-karfoonil-, 1,3-dimefcíi~3-brteniI~kartooníl-, 2, 2-dimetÍl-3-foutení l~karboo.il-, 2, S-dimetil-X'-feutenil-karbonil-, 2, 3-dim.etii-2-bntenil~karbonil-, 2,3~dimetil-3-bn.tenii-karbonil-, 3, 3-dimet.il-1-hűteni 1-karbonil-, 3, 3-dimetil-2-butenil-karboni 1-, 1-etil-i-Önteni 1-karhoni‘l--, i-etil-2-buten.il-karbonil-, 'l-etil-3-buten.il~karbonil-, 2-étii-l-butenil-karbonil-, 2-etii“2~buteníl~karfoonii-, * φ

2~etil~3-b^:utenil~karbonií~, 1,1,2-trimetil-2~propenil-karbon.il-, 1-e t i I - 1 -met i 1 - 2-pr openi 1 - tarboni 1-, 1-et ί 1 - 2 -met ί 1 -1 -propeni 1 karbon i l.~ , 1-eti I-2~met il-2-propenil -karbonil-,

-karbonil-, 2-hepteníl-karbonil-, l-hepteaíl-karbonil-karboníl-, 5-heptenil-karbonii-,· 6-heptenll-karbonili-neptenxi 4-heptenil1-ottenil-karbonil-, S-oktenil-karhonii-, 3-oktenil-ka.rbonii-, 4-oktenil- ka r bon 11 -, 5 - o kte n i l - kar bon i 1 -, 6- o kt en ί 1 - ka rbon i 1 -, 7 - ok ten i1-karbonil-, noneníl~karbon.il vagy decenil-karfooníl-csoport. Előnyösen alkalmazott csoport a vinil-karbonil-, propenil-karbonil-, foutenil-karbonil- vagy pentenil-karbonil-csoport,

Aralcsoportként olyan ssubsztituált vagy szubsztituálatlan árucsoportokat alkalmazunk, amelyek 6-20 szénatomot tartalmaznak gyűrűben vagy gyűrűrendszerben. Egymással, kondenzált aromás gyűrűk vagy olyan aromás gyűrűk lehetnek, amelyek, alkil-, alkil-karbonil-, alkenil- vagy alkenil-ka/rbonil-láncokon,· karbonilcsoporton, oxigén- vagy nitrogéné tömön keresztül kapcsolódnak. Árucsoportok adott esetben 1-1Q szénatomos alkil-, 3-3 szénatomos alkenil-, 3-β szénatomos alkinil- vagy 3-8 szénatomos cikloalkil-láncon keresztül az alapváznál még össze lehetnek kapcsolóvá. Előnyösen alkalmazott csoport a fenii- vagy naftil-csoport.

Aril-karbonil-csoportként olyan szubsztituált vagy szubsztituála-tlan aril-karbonil-csoportokat alkalmazunk, amelyek 6-20 szénatomot, tartalmaznak gyűrűben vagy gyűrűrendsserben. Egymással kondenzált aromás gyűrűk vagy olyan aromás gyűrök lehetnek, amelyek alkil-, alkil-karbonil-, .alkenil- vagy elkeni1-karbonil-láncokon, karbon! lesöpör tón. Oxigén- vagy nitrogéné tömön keresztül kapcsolódnak. Előnyösen alkalmazott csoport fenii-kar9 9 9' X a bo-nil- (henzo.il~> vagy naf ti.1-karbonil-csoport.

Heteroaril-esoportként .szubsztituált vagy szubsztituálatlan, egyszerű vagy kondenzált.,, aromás, 3-7 tagból álló gyűrűket alkalmazunk, amelyek egy vagy több heteroatomot, például nitrogén-, oxigén- vagy kénatomot tartalmazhatnak, és adott esetben 1-10 szénatomon alkil-, 3-8 szénatomos aikenli- vagy 3-8 szénatomos cl kloal ki 1~ láncokon keresztül .as alapváznál összekapcsolva lehetnek, Ilyen heteroari1-csoport lehet például pirazolil-, imida Zolii-, oxazolil-, izoox.azol.il-, tiazolil-, triazolil-, piridil-, ki.noli.l-, izokinolil-, akridii-, pirímidinil-, piridazinil-, piraziníl-, fenazínil-, purinil- vagy pteridí1-csoport. A heteroari1-csoportok heteroatomon vagy különböző szénatomokon keresztül gyűrűbe vagy gyűrűrendszerbe kapcsolódhatnak, vagy szubszti.fcu.en.seken keresztül az alapvázhoz kapcsolódhatnak. Heteroaril-karfoonil-csoportokon olyan heteroaromás csoportokat értünk, amelyek karfoo.nilcsoport.on keresztül az. alapvázhoz kapcsolódnak, Előnyösen alkalmazott csoport a piridil-, imídazolil-, plriraidinil-, purinil-, piraziníl- vagy kinolii-esoport.

Az említett R⁴ csoport szubsztituense lehet például egy vagy több szubsztituens az alábbiak közül: halogénatom, például fluor-, klór- vagy brómatom, tiocsoport, nitro-, amino-, hidroxi-, alkil-, alkoxi-, aikenli-, alkeníl-oxi-, alkínil-csoport vagy további aromás vagy további telített vagy telítetlen, nem aromás gyűrű vagy gyűrürendszer. Előnyösen alkalmazhatók alkilcsoportok, például 1-6 szénatomos alkilcsoportok, például met.il-, etil-, propil- vagy butilesöpört, halogénatom, például klór-, fluor- vagy brómatom, hidroxi- vagy amino-csoport.

* fi * * * X ’>*«·*

F? jelentése előnyösen hidrogénatom.

Fi jelentése az -NR^4:R^S' általános képletű csoportban hidrogénatom, szuhsztituált vagy szubsztituálatlan, elágazó vagy egyenes láncú, 1-10 szénatomos: alkil-, 2-10 szénatomos alkan.il-, arilvagy heteroaril—csoport, ahol az alkil-, alkeni!-,· aril- és heteroarii-csoport jelentését lásd fentebb. Előnyösen hidrogénatom vagy 1-iö szénatomos alkil-, például metil-, etil- vagy p r op i. 1 — c s op o r t„

Az említett R“ csoport szubsztituense lehet például egy vagy több szubsztituens az alábbiak közül: halogénatom, például fluor-, klór- vagy brómatom, tiocsoport, nitro-, amino-, hídroxi-, alkil-, alkoxi-, alkeni!-, .alkenil-oxi-, alklnil-csoport vagy további aromás vagy további telített vagy telítetlen, nem aromás gyűrű vagy gyűrűrendszer. Előnyösen alkalmazhatók aikilcsoportok, például l-S szénatomos alkil-, igy metil-, etil-, propilvagy foutil-esoport, arilcsoport, például fenilcsoport, halogénatom, például klór-, fluor— vagy brómatom, hidroxx- vagy aminocsoport .

Továbbá két szomszédos R⁴ vagy R^s együtt kialakíthat egy további szuhsztituált vagy szubsztituálatlan, aromás, telített vagy részben telített, 5-6 atomos gyűrűt, amely egy vagy több heteroatomot, például oxigén-, nitrogén- vagy kénatomot tartalmazhat..

R‘, R^z, Fi szubsztituensek egyikének jelentése az (I.) és (11) általános képletben előnyösen aril-, például fenilcsoport. Továbbá Rí, R², R-^! szubsztituensek egyikének jelentése az (I) és (II) általános képletben előnyösen hidroxilcsoport és hidrogénatóra vagy metilosoport.

,3/SE

A találmány szerinti, eljárást előnyösen 4 és 11 közötti,, előnyösebben 4 és 9 közötti pK-nál végezzük.

Az eljárásban, továbbá előnyösen Ö,ül és 10 tömeg! .közötti nitriit vagy 0,01 ás 10 tömeg% közötti, megfelelő aldehidet vagy ketont, és 0,01 és 10 tömeg! közötti hídrogén-cianidot alkalmazunk. Az eljárást előnyösen hidrogén-cianid-felesleggel hajtjuk végre. Sz bizonyos- körülmények között a beadottnál magasabb hidrogén-cíanid-arányhoz vezet. Ami a nitriit illeti, különböző mennyiségű nitriit alkalmazhatunk a reakcióban. A legkisebb mennyiségben 0, 01 és 5 tömeg! közötti mennyiség) alkalmazott nitril (-ciánhidrin) előnyösen annyi, amennyi a megfelelő aldehiddel és hidrogén-cianiddai egyensúlyban van. Az aldehid a mikroorganizmusokra vagy enzimre rendszerint toxikus. A nitríle-ket, amelyek könnyen párolognak, előnyösén szintén. 0,01 és 5 tömeg! közötti mennyiségben alkalmazzuk. Magasabb ciánhidrin- illetve nitrílmennyiség késlelteti a reakciót. Az olyan nitrileket, amelyek csak csekély vagy szinte semmilyen oldószer-tulajdonsággal sem rendelkeznek, vagy az olyan nitrileket, amelyek vizes közegben nagyon rosszul oldódnak, előnyösen a fentebb megadott menynyi ségnél nagyobb mennyiségben alkalmazzuk. Az átalakult mennyiség és a- kitermelés növelése céljából a reakciót úgy végezzük, hogy folyamatosan adagolunk racém. nitrileket. A terméket a reakció befejezése után izoláljuk, vagy egy leágaztatott vezetéken folyamatosan eltávolítjuk.

A fentebb- említett, megfelelő aldehideken vagy ketonokon olyan vegyületeket értünk, amelyek alkalmazásával az aldehid vagy keton és a hidrogén-cianid közötti reakcióban, adott eset72.372/SE ben savfcataií'zí's-sel, nifcril keletkezik. Aldehid és hidrogén-cianid közötti reakció ciánhidrínekhsz vezet, amelyeknek az az előnyük, hogy az aldehiddel és a hidrogén-cianidda.1 egyensúlyban vannak. A cíánnídrínek egyensúlyának beállásával enzimet alkalmazva lehetőség van arra, hogy csak az egyik nitril-enantiomsr .alakuljon át, ennek ellenére elméletileg löö%-os kitermelést elérve, minthogy a. racém nitrilt állandóan pótoljuk. Az összes többi, enzimesen át nem alakítható nitrilt fals illetve másik enantiomer) előnyösen kémiai reakcióval racemizáijuk, és az eljárás számára újra rendelkezésre áll a löO%~os elméleti kitermelés elérhetőségét biztosítva, az egyensúly tehát beáll, és a sztereocentrum megtartásával lezajlik a kémiai, els zappanosl tás .

A találmány szerinti eljárást előnyösen CŐC és S0°C közötti, előnyösebben 10°C és 6Q°C közötti, különösen előnyösen 15®C és öö°C közötti hőmérsékleten végezzük.

A találmány szerinti eljárásban racém nitrileken olyan nitrileket értünk, amelyek mindkét enantiomer 50:5ö-arányú keverékéből állnak, vagy tetszés szerinti másik keverékből, amelyben a kettő közül bármelyik anantiomerre nézve dúsított a keverék.

A találmány szerint előállított királis karbonsavakon az egyik enantíomerre nézve dúsított karbonsavakat értünk. Az eljárás alkalmazásával előnyösen legalább röi-os, előnyösebben minimálisan 9o%—os, különösen előnyösen minimálisan 03%-os, nagyon különösen előnyösen minimálisan 90%-os enantiomer-tisztaságot érünk si,

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, nagyszámú racém.

nítril átalakítását királis karbonsavakká. Az eljárásban órán~Z. m/.BE/:RMip2 * Ά * * φ <· * y 04 ként legalább 25 írnol nitril (mg fehérjére vonatkoztatva) , vagy óránként legalább 25 mmol nitril (g mikroorganizmusból származó szárazanyag-tartalomra vonatkoztatva), előnyösen legalább 30 mmol nitril (mg fehérjére vonatkoztatva), vagy óránként legalább 30 mmol nitril (g mikroorganizmusból származó szárazanyagtartalomra vonatkoztatva), különösen előnyösen 40 mmol nitril (mg fehérjére vonatkoztatva)# vagy óránként legalább 40 mmol nitril (g mikroorganizmusból származó szárazanyag-tartalomra vonatkoztatva) , nagyon különösen előnyösen 50 mmol nitril (mg fehérjére vonatkoztatva)# vagy óránként legalább 50 mmol nitril <g mi kroorganízmusbó 1 s zármazó s -zár a z anyag- ta rt al ómra vonat ko z tat va) kepes átalakulni.

A találmány szerinti eljárásban olyan növekvő fázisban levő sejteket lehet alkalmazni, amelyek tartalmazzák a találmány szerinti nukleinsavakat# nukleinsav-konstrukciókat vagy vektorokat. Nyugvó vagy feltárt sejteket is lehet alkalmazni. Feltárt sejteken például olyan sejteket értünk, amelyeket valamilyen kezeléssel, például oldószerekkel való kezeléssel átjárhatóvá tettünk, vagy olyan sejteket# amelyeket enzimes kezeléssel, mechanikai kezeléssel (például Frenoh-press vagy ultrahangos kezeléssel) vagy egyéb módszerrel szétroncsoltunk. Az igy kapott nyers ext-

raktam	előnyösen me	gfelelö a tál	• fi i if:»
Tisztit	ott enzim is	alkalmazható	az
leinek	immobílizált .	mi xro-o-rgan i zmu	sok
nyosen	a1kalmazhat ők	a reakcióban.
A 'fc	alálmány szeri	ntí eljárásban	« t ζ

kát előnyösen extrakciőval, vagy kristályosítással# vagy extrak72.O? 2/SS

cióval és kristályosítással nyerjük ki a reakciőoldatból. Ebből a célból a vizes reakció-oldatot savval_f például ásványi savval (például sósavval vagy kenssvval) vagy szerves savval megsavanyítjuk, előnyösen 2 alatti pfí-értékre, és azután egy szerves oldószerrel extraháijuk, Az sxtrakciót a kitermelés növelése céljából többször megismételhetjük, Szerves oldószerként elvileg bármilyen oldószert alkalmazhatunk, amely víztől, adott esetben só hozzáadására elváló fázist képes. Előnyösen alkalmazható oldószer példánl toiuol, benzol, hexán, metil-terc-butil-éter vagy eti'l-acetát

A szerves fázis hetöményítése után a terméket rendszerint jó kémiai tisztasággal, azaz 90%-nál nagyobb· kémiai tisztasággal tudjuk kinyerni, Extrakció után a terméket tartalmazó szerves fázist azónban csak részben tudjuk betöményítení és a terméket kíkristályosítani. Ebből a célhői az. oldatot előnyösen lehűtjük Ö°C és 1Q°C hőmérséklet közé, A kristályosodás bekövetkezhet közvetlenül a szerves oldatból, is. Átkristályositás céljából a kikristályosított terméket feloldhatjuk mégegyszer ugyanabban vagy agy másik oldószerben, és mégegyszer kristályosíthatjuk. A további, legalább még egyszer végzett kristályosítás az eutektikum. állapotától függően tovább növelheti a termék tisztaságát az enantíomerre nézve, & királis karbonsavak közvetlenül savval való·, előnyösen 2 alatti pH-ra savanyítás után kíkristályosíthatők a vizes reakcíőoldatböl, Ebből a célból a vizes oldatot előnyösen melegítés közben betőményitjük, térfogatát a kiindulási 10-90%-ára, előnyösen 20—3Ö%~ára, különösen előnyösen 30—70%-ára csökkentjük- A c, j'v/sr »Κ Φ ♦ φ · « * »*♦ φ φ * φ φ »·♦·♦. ΦΛ ΦΦ» ί« kristályosítást előnyösen hűtés közben végezzük. A kristályos!tásra. előnyösen ű°C és 1011 közötti hőmérsékletet alkalmazzuk. A költségek szempontjából előnyős a vizes oldattól való közvetlen ki kristályosítás - Ugyanakkor előnyös a. királis karbonsavak feldolgozása extrakcióval, és adott esetben további kristályosítással.

Ezeket az előnyös feldolgozási módszereket alkalmazva a találmány szerinti eljárással előállított terméket a reakcióba bevitt nítrilre vonatkoztatva 60-100%, előnyösen 00-100%, különösen. előnyösen 90-100% kitermeléssel izoláljak. Az izolált termék nagymértékű, 9Q%~nái nagyobb, előnyösen 95%-nái nagyobb, különösen előnyösen 98%-nál nagyobb kémiai tisztaságot mutat. Továbbá a termék nagymértékű anantiomer-tlsztaságot matat, ami kristályosítással tovább növelhető.

Az így kapott termékeket szerves szintézisekben kiindulási anyagként lehet alkalmazni gyógyszer vagy agrokémiai vegyszer előállításához vagy racemizáiáshoz.

A találmány további tárgya egy nitriláz-aktivitással rendelkező polipeptidet kódoló, a. következő csoportból kiválasztott izolált nukiéinsav-szekvencia.:

a) az 1. számú szekvenciával (SEQ ID NO: 1} ábrázolt nnkleinsav-szekvencía, foj olyan nukleinsav-szekvenciák, amelyek a genetikai kőd degeneráltsága eredményeként az 1. számú szekvenciával (SEQ 10 NO: 1) ábrázolt nu.kleinsav-szekvencíáoöl levezethetők, ej az 1. számú szekvenciával(SEQ ID NO: 1} ábrázolt nukiéinsav-szekvencia olyan homológjai, amelyek olyan polípeptideket kódolnak, melyek legalább 98% homoiógiával rendelkeznek a teljes szekvenciatartománycn át a 2. számú szék72.3?2/3S:/S&2ip2 *< * véneiához ÍSEQ ID NO: 2) anélkül, hogy & poiipeptid enzimhatása csökkenne.

A találmány szerinti, 1. számú, szekvenciával rendelkező nukleinsav-szekvencia homológján például olyan allélvaríánsokat értünk, amelyek levezetett aminosav-szinten legalább 95% homológiát, előnyösen legalább 97% homológiát, különösen előnyösen legalább 98%-os homo lóg iát mutatnak a. teljes hosszúságú szekvenciát véve, A szekvencia részleteit véve a homológra előnyösen nagyobb is lehet. Az 1. számú szekvenciából. levezetett aminosavszekvencián a 2. számú szekvenciát értjük, Alléivariánsokon különösen olyan funkcionális variánsokat értünk, amelyekhez az 1. számú szekvenciában lévő nukleotídok. deiécíőjával, ina ze.rc iájával vagy szubsztitúciójával jutunk, amelyből levezetett, szintetizált fehérje enz ima kfci vitásának, lényegesen nem szabad csökkennie , egy vagy több gén mikroorganizmusba való bevitele esetén. A találmány tárgyát képezik ezáltal olyan aminosav-szekvencíák is, amelyeket a fentebb leírt csoportban lévő n.ukle insav-szekvenciák kódolnak. A találmány tárgyát előnyösen olyan aminosav-szekvenciák képezik, amelyeket az 1. számú szekvencia kódol.

Az 1. számú szekvencia homológjain értünk továbbá például gomhaeredetü vagy bakteriális homológokat, rövidített szekvenciákat, egyszálű DNS-t, vagy kódoló vagy nem-kódoló DNS-szekvenciának megfelelő RNS-t. Az 1. számú szekvencia homológjai esetén DNS-szlnten legalább 60%-os, előnyösen legalább 70%-os, különösen előnyösen legalább 8ű%~os, nagyon előnyösen legalább 90%-os homoióoiát értünk az 1, számú szekvenciában megadott teljes DNS-szekvencián.

72.372/':U:/SB,Kip2 « *

Ezenkívül az 1. számú szekvencia homológjain értünk származékokat , például promótervariánsokat. Az adott nukleotid-szekven— ciátői szintézisiránnyal szemben működőképesen kapcsolt promóterek módosítva lehetnek egy vagy több nukleotídcserévei, ínszercióval {inssereiókkal) és/vagy deMelóval ídsiéeíökkal) anélkül, hogy ez a promóterek funkcióját illetve hatékonyságát hátrányosan befolyásolná. A promóterek hatékonyságát növelni is lehet szekvenciájuk módosításával, vagy teljesen helyettesíteni lehet azokat egy hatékonyabb pxomó terekkel, heterológ szervezetből s z á rma zó promót e re kke1 is.

Származékokon olyan variánsokat is értünk, amelyek .nukleotid-szekvenciája, a start-kódon előtt. -1-től -200-ig· terjedő szakaszon vagy a stop-kódon utáni Ö'-tól 1000. bázispárig terjedő szakasza ágy van megváltoztatva,, hogy a génexpresszió és/vagy fehérjeexpresszíó mértéke megváltozott, előnyösen fokozódott.

Az 1, számú szekvenciát vagy homológjait baktériumokból, előnyösen gram-negafciv baktériumokból, különösen előnyösen az Alcaligenes nemzetséghez tartozó baktériumokból, nagyon különösen előnyösen Alcaligenes nemzetségből és Alcaligenes faecalis fajból lehet izolálni a szakember által ismert módszerek alkalmazásával .

Az 1. számú szekvenciát vagy homológjait, vagy ezen szekvenciák részleteit például szokásos hibridizációs eljárás vagy PGE-technika alkalmazásával, más gombákból vagy baktériumokból lehet izolálni. Ezek a DNS-szekvenciák standard hibridizációs körülmények között képesek hibrídizáiódni a találmány szerinti szekvenciákkal. Hibrid!zálásra előnyösen rövid, olyan konzerva22 # « tív részletből, például az aktív centrumból származó oiigonukleotidot alkalmazunk, amely más nitríiázokk-al vagy n.ítrilhidratázokkal való összehasonlítás útján, szakember által ismert módon lehet meghatározni. A találmány szerinti nukleinsavak hosszabb fragmentumait vagy teljes szekvenciákat is lehet hibridizálásra alkalmazni. Aszerint, hogy milyen nukieinsav-oligonukleotidot alkalmazunk, hosszabb fragmentumokat vagy teljes szekvenciát, vagy milyen nuklei.nsav-tipust, DNS-t vagy RNS-t alkalmazunk hibridizálásra, lehet variálni ezeket, a standard körülményeket. Például az olvadáspont. DNS-DSN-hibridre körülbelül lö®C-ai alacsonyabb, mint ugyanilyen hosszúságú DNS-RNS-hibrídre.

Standard körülményeken értünk, például nukleinsavtó'l függően. 42^ftC és 58^eC közötti hőmérsékletet vizes puffer-oldatban, 0,1-5 x SSC u X SSC: 0,15 M NaCl, 15 mM nátrinm-citrát, pH ?,2) koncentrációban., vagy még 50% formamid jelenlétében, 42C~ot 5 x SSC-ben, 50% formamidban. A. hibridizációs körülmények DNS-DNS-hibridre előnyösen 0,1 x SSC és körülbelül 2Ö°C és 45°C közötti, előnyösen körülbelül 3ö°C és 45*C közötti hőmérséklet. A hibridizációs körülmények DNS-RNS-hibridre előnyösen 0,1 x SSC és körülbelül 30°C és 55°C közötti, előnyösen körülbelül 45^cC és 55°C közötti hőmérséklet. A hibridizációra fentebb megadott hőmérsékletek egy konkrét példában számított olvadáspontok, amelyek körülbelül 100 nnkleotid. hosszúságú és 50%-os G+C~ tártál ómmal rendelkező nukleinsavra vonatkoznak. DNS-híbridizálásban alkalmazható kísérleti körülményeket leírnak ide vonatkoző genetikai tankönyvekben, például Sambrook és munkatársai Moleeuiar Cloning című könyvében (Cold Spríng Harbor Laboratory Press,

1989), amelyben szakember által ismert képletek alkalmazásával, kiszámítható például a nukieinsav hosszúságától, a hibrid fajtájától vagy a GtC-tartaloratól való függés.. Szakember további, hibridizációval kapcsolatos információt találhat az alábbi tankönyvekben: Ausufoel és munkatársai {szerk.}, Current Protocols in Molecuiar Biology, John ’diley and Sons, New York (1994); Hámes and Higgins (szerk.}, „Nucieic Acids Hybrídization: A Practicai Approach, XRL Press at Oxford U-niversity Press (.1985) -, Oxford; Brown {szerk.}, „Essential Molecuiar Biology: A Practicai Approach, IRL Press at Oxford üniversíty Press {1991}_f Ο xford.

A találmány szerinti nnkleinsav-konstrukoiókon 1. számú szekvenciával rendelkező nitriláz-gént és homológjait értjük, amelyek előnyösen egy vagy több szabályzó szignállal vannak Összekapcsolva az génexpresszió fokozása céljából. Ilyen szabályzó szekvenciákon értünk például olyan szekvenciákat, amelyek induktörhoz vagy represszorhoz képesek kötődni, igy szabályozni képesek a nukieinsav expressz lóját. Az új szabályzó szekvenciákon kivüi még természetes szabályzó- szekvenciák ís jelen lehetnek az aktuális strukturális gének előtt úgy,, hogy a természetes szabályzást, adott esetben genetikai módosítással le lehet kapcsolni, és a gének expressziéjának mértéke növekszik. Azonban a génkonstrukciók rendelkezhetnek egyszerűbb struktúrával., azaz hozzáadott szabályzó szignálok, nincsenek ínszertálva az 1. számú szekvencia vagy homológjai elé, és a természetes promóter, szabályzó funkciójával nincs eltávolítva. Helyette, a természetes szabályzó- szekvencia úgy van .mutálva, hogy a szabályzás tovább C2 .3 ?2/S£ már nem működik, és a génexpresszíó fokozódik. A génkonstrukciók előnyösen továbbá tartalmazhatnak egy vagy több, úgynevezett „enbanszerszekvenciát funkcionálisan a promoterhez kapcsolva, amely lehetővé teszi a nukleinsav-szekvencia fokozott mértékű expresszióját. További előnyös szekvenciák, például más -szabályzó elemek vagy terminátorok inszertál-á-sára is vas lehetőség a DNS-szekvenciák 3*-végéhez. A találmány szerinti nukíelnsavak egy vagy több kópiában, lehetnek jelen a konstrukcióban. A konstrukcióban további markerek lehetnek, például. antibiotikumrezisztenciát meghatározó- vagy a.uxotrőflát komp lamentáló gén, adott esetben a konstrukció szelektálása céljából.

A találmány szerinti eljárásban előnyösen alkalmazható szabályzó szekvenciák vannak például az alábbi promó-terekben: cos-, tac-# trp-, tét-, trp-tet~, Ip-p-, lac-, Ιρρ-lac-, laclq-, T?~, T5-# T3-, -gal-# trc-·, ara-, SPő-, λ-PR-promóterek'ben vagy λ-PLpromóterben# amelyek előnyösen alkalmazhatók g.ram-negatív baktériumokban. További előnyös szabályzó szekvenciák vannak például gram-pozitiv, árny- és SP-ö2~promóte-rekbe-n# élesztő eredetű ADCT-, MFa-, AC-, P-6G-, CICI™, GAPfoH-# TEF-, rp2S~, ADH-promoterekhen. Ebben az összefüggésben előnyös még piruvát karboxiláz és például Hansenula-ból származó metanol oxidáz- promótere. Mesterséges promőtereket is lehet szabályzásra alkalmazni.

A nukleínsav-konstrukciót gazdaszervezetben való expresszié céljából vektorba, előnyösen plazmádba# fágba vagy egyéb DNS-be inszertáljuk# amely lehetővé teszi a gén optimális expresszióját gazdaszervezetben. Esek a vektorok a találmány egy további előnyös megvalósítási módját jelentik. Alkalmas plazmid például E.

coll-ban pdd?. pLG338, pACYClÖá, pER322, püolS, pUC13, pKC30, pRepú, pHSl , pH32_; pPLc23ő, pMBhüá, pLG20ö, püRzlO, plh-llI^H?-BÍ, hgtll vagy pBdCI, Streptornycesben plJiOl, pIJ354, pIJ7G2 vagy pIJool, Bacillasban pOBllö, pC194 vagy pBD214, Corynebacteriírtban pSA77 vagy pAJű.6.7, gombákban oALSl, p!L2 vagy pBBllő, 2 pm élesztőkben pAG-l, Yepű., Yeplo vagy pBMBlYezo, vagy növényekben pLGV23, pGRlaey pB'INIS, pAC2Ö04 vagy pDHSl, Az említett plazmídok csak egy kis választékát jelentik, a lehetséges plazmidoknak. További plazmádon jól ismertek szakember számára, és leírásuk megtalálható például a fentebb említett., „Clcning Vectors· című könyvben (szerk. Pouwels Ρ. H, et al., Elsevisr,

Amsterdam-heo York-Oxford, 11S5, ISSE G 444 904013}.

A nukleínsav-konstrukció további, beépített gének expreszszálasa céljából előnyösen járulékos 3^f- és/vagy 5'-terminális szabályzó szekvenciákat tartalmaz az expressz.ió fokozása céljából, amelyeket optimális éxpréssziőhoz a kiválasztott gazdaszervezettől és géntől vagy génektől függően szelektálunk.

Ezeket a szabályzó szekvenciákat azért alkalmazzuk, hogy lehetővé tegyük a gén célzott expressziéját és a fehérje-expressziét. Ez jelentheti például a gazdaszervezettől függően, hogy a gén csak indukció után expresszálödik vagy fokozott mértékben exp.resszáiódik (a termék toitermelődik?·, vagy azt, hogy azonnal expresszálődik és/vagy fokozott mértékben expresszálödik,

A szabályzó szekvenciák illetve faktorok ezenkívül, előnyösen jótékony hatást képesek kifejteni a bevitt gén expressziőjára, és Így képesek annak mértékét növelni vagy csökkenteni. Tehát a szabályzó elemek fokozó hatása előnyösen transzkripció szintjén ?2.372/BE/XA2ip2 * χ * ♦ **·* ♦

X*«« » φ φ ♦ « *·* X* .« történhet meg, erős transzkripciós szignálok, például promőterek és/'va.gy ,, enhanszerek alkalmazásával. Azonban lehetőség van a transzláció fokozására is, például a mRNS stabilitásának javítáA találmány másik előnyös megvalósítási módja szerint, a vektorok vonatkozásában, a találmány szerinti nukleinsav-konstrukciót vagy a találmány szerinti nukleinsavat tartalmazó vektort előnyösen bevihetjük lineáris DNS formájában a mikroorganizmusokba, és heterológ vagy homológ rekombinációval integrálhatjuk a gazdaszervezet gonomjába. Ez a lineáris DNS állhat linearizált vektorból, például plazmidből, vagy csak a nukieinsav-konstrukcióból vagy nukleinsavból.

Heterológ génnek egy organizmusban való, optimális expreszs-zálása céljából előnyös megváltoztatni a nukleinsav-szekvenciákat olyanra, amely megfelel az. organizmus által alkalmazott, specifikus· „ kódonbasználatnak*. A ,, kódo.nhasználat könnyen meghatározható- az illető organizmus- más, ismert génjének .számítógépes kiértékelésének segítségével.

A találmány szerinti nukleinsavnak vagy nukleinsav-konstrukciónak megfelelő gazdaszervezet lehet elvileg minden prokarióta és eukariőta organizmus. -Gazdaszervezetként előnyösen alkalmazott mikroorganizmusok például baktériumok, gombák vagy élesztők. Előnyösen gram-pozífcív vagy gram-negatí.v baktériumokat, elsősorban Enterobacteriaceae vagy Noeardíaceae családhoz tartozó, különösen Escheri-chia, Pseudomonas vagy Rhodococcus nemzetséghez tartozó baktériumokat alkalmazunk. Különösen előnyösen alkalmazott nemzetség és faj az Escheríchia. coli.

♦ ♦X « * -Χχ χ χχ

Φ Φ X* X φ:

χ * ♦ ♦ ♦ φ φ χ

ΧΧΦΦ χ φ φ « χ * «-Χ )ΓΦ _ν φΜ·

A találmány szerinti gazdaszervezet előnyösen legalább egy, fehérje-szerű ágenst tartalmaz a szintetizált polipeptíd, és különösen a találmány szerinti nukieinsav-szekvenciák által kódolt ? nitri láz-a-kitivitással rendelkező polipeptíd konformációjának kialakítása céljából, és/vagy ezt az ágenst kódoló géneke' tartalmaz, ahol az ágens akkora mennyiségben áll rendelkezésre, amely több, mint az illető mikroorganizmusban lévő alapmennyiség. Az ágenst kódoló gének kromoszómában vagy extra'kromos zöméiig elemekben, például oiazmidokban találhatók.

^itriláz -tisztitása Alcaligenes Pascalis lő50-hol 1. Sejtek eiőáilitása .carigen?

;a.

1650-törzset 30 €8 óra hosszáig A-táp közegben tenyésztettünk .

A-tápközeg

siess t ő k i vo n a t	5	g/l
Pepton	> /	5 g/i
CH2CO.2NH4	5	g/i
ΕΗ,ΡΟ,	5	g/i
MgSO,	V f	2 g/l
FeSCh	Λ v /	03 g/i
NaCl	1	g/l
Butíronitril	1	g/l

300

Eszel az előrázott tenyészettel .beoltottunk 8 tápközeget., egy 10 literes fermentorba. A pH.-t 7 sékletet 30C-~on, a levegőztetés sebességét 300 1/ dúl átszámol 300 rpm-en tartjuk. 22 óra múlva 81 liter friss A ,2-n, a hőmér órán és a fór g nedves sejt *

X ** Φ ΦΦ λ w ** φ *

Φ Φ ΦΦν φ Φφ

ΦΦΦΧ ♦ Φ φ * Φ masszát nyertünk ki. A megfelelő száraz sejttömeg 3,8 g/1 volt, és az optikai sűrűség 600 nm-en 8 volt,

2, Bnzimakfci vitás maghatározása α-hidroxi-fánál-aoe tani trilla! (mandnlasavní tri! ) snemfoen

A sejteket az 1« pontban leírtak szerint állítottuk elő, és 10 mM .Na/K-f oszf át-pof ferben. (pH 7,2), kétszer mostuk azokat. 40 mg száraz sejtet fals-zuszpendáltunk 20 ml, 1.0 mM Na/K-foszfát-puf ferben (pH 6,8), és a reakciót 8,3 mM a-bidroxí-fenil-acetonitril hozzáadásával elindítottuk. A reakciót 4ö°C-on, rázatás közben végeztük. A raoemizácíó kinetikáját mintavétel, azután sejtek elkülönítése után nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (ODS Hypersii) segítségével követtük, Meghatároztuk a a-hidroxi-fenil-acetonítril, benzaldehid, maadulasavamid és mandulasav mennyiségét. Az eredményeket bemutatjuk az 1. ábrán (ct™ -hídroxi-fenil-acetonítril átalakulása mandulasavvá, batch). A manduíasav keletkezési, sebessége 41,3 U/g száraz sejttömegre vonatkoztatva, 30%-os átalakulásnál, ahol az 1 egységet úgy definiáljuk, mint amely 1 pmol mandulaaavat képes előállítani 1 perc alatt, 40°C~on„

3, féazisj-szeleátívitás asegfcafcározása «-hidroxi-fenii-acefeonitrilla! szemben

A sejteket az 1, pontban leírtak szerint állítottuk elő, és 10 mái Na/K-foszfát-pufferben (pH 7,2)·, kétszer mostuk azokat. 40 mg száraz sejtet felszuszpendáltunk 20 ml, 10 mM Na/K-foszfát-pufferben (pH 6,8), és a reakciót 8,3 mM «.-hidroxi-feni1-acetonitril hozzáadásával elindítottuk. A reakciót 3Ö®C-ou, rázatás közben végeztük. A raoemizáclő kinetikáját mintavétel, azután sejt elkülönítése után nagyhatékonyságú foiyadékkromatográfia

72.372/BE ί* χ »* φ φφ Φ X φ φ φ» φ *»

Φ Φ φ φ φ φ φ φ φ Φφ >ίΦ Φ φΛ (Hucleodex β-RM) segítségével követtük. Ebben meghatároztuk az

3-( + } és R~ (-} -mandulasavat. A keletkezett R- (-) -mandulasav (ee^l optikai tisztasága 98%-os volt# 50%-os átalakulásnál. Az enzim szelektivitása (=E) 50%-os átalakulásnál 499 volt.

A tisztításban alkalmazott valamennyi puffer# hacsak másképpen nem említjük, 10 mM DTT-t tartalmazott.

1,. lépés: Sejtfeltárás·

Az 1. példában leírt, lö literes fermentációból kinyert sejteket le-centrífugáltuk#. és kétszer mostuk 1 liter 0,1 M Tris/HCl-puf fer.rel (pH 7,2) . A kitermelés körülbelül 162 g nedves sejtmassza volt. SÍ g nedves sejfcmasszát felszuszpendáltunk 160 ml 0,1 M Tris/HCl-pufferben (pH 7,2), és négyszer feltártuk Menton-Gaulin-féle homogénísátorban, 750 bar nyomás alkalmazásával. A homogén!satumat azután 30 percig, 30.000 g-n centrifugáltuk# és az üledéket eldobtuk. A megmaradt rész (140 ml.) a kiindulási rész aktiváfásának 73%-át tartalmazta# az 1. táblázatban bemutatottak szerint.

2. lépés: Ioncserélő kromatográfla

A megmaradt részt A-pufíerrel (20 mM Tris/HCl# pH 8,5) 400 ml-re hígítottuk, és még egyszer .lecentrifugáltuk 23.000 g-n, 20 percig. Azután 350 ml~t felvittünk Q—Sepharose-oszlopra (átmérő 5 cm# magasság 22 cm# térfogat 432 ml.# Q-Sepharose Fást Flow a Pharmacia cégtől) A-pufferben. Azután 20 ml/perc áramlási sefoeséggei#· lö% B-pufferrel (ugyanaz, mint az A-puf fér# de 1 M NaCl-t tartalmaz) mostuk (a felvitt és mosótérfogat összesen 1,5 1} , Az elációs folyadékban 90 perc alatt lineárisan megnövekedett 100%-ra a β-puffer mennyisége. Azután a 01-120. percben

100-% B-pufferrel mostuk. 100 db, 40 ml-es frakciót szedtünk. A nitriláz az 50 és a β0. frakció között eluálődott. A frakciókat egyesítettük, és lö kDa molekulatömegnél kizáró membrán {Amícon} alkalmazásával, ultraszűréssel 10 mi térfogatra fcöraényxtettük.

3. lépés: Molekulaszürésen alapuló kromatográfla

Az ioncserélő kromatográf iából származó koncén t rá fáraót (2. lépés) két lépésben, egyenként 5-5 m.l~t, felvittük molekulaszűrésen alapuló kromatográfiás oszlopra {Superdex 200 perp. grade, Pharmacia, elválasztási tartomány 10 és 600 kDa között, 2,6' est átmérő, 60 cm magasság, 325 ml térfogat) további tisztítás céljából. A detektálást 280 nm-en végeztük. Az oszlopot 20 mM foszfát-puffért {pH 7,4), 5 mü DTl-t és 150 mM NaCl-t tartalmazó oldattal ekvilibráltuk, és 1,5 ml/perc áramlási sebességet alkalmaztunk. 40 frakciót szedtünk. Nitrilt elszappanosító aktivitást a 3-5. frakciókban találtunk.

4. lépés: Ioncserélő kromatográfla

A moleknlaszűrésen alapuló kromatográfiából származó, egyesített frakciókat {3. lépés) Mono Q oszlopot {oszl-optérfogat 1 ml, Mono Q HR 5/5, Pharmacia) alkalmazó, ioncserélő kromatográfIára, további tisztítás céljából. A-pufferként szolgált: 20 mM Tris/HCl, pH 8,5, 5 nái OTT, B-pufferként szolgált ugyanez a puffer, azaz A-puffer * 1 M NaCl. Az: áramlási sebesség 1 ml/perc volt. A molekulaszűrésen alapuló kromatográf iából származó, körülbelül 6 rnS/cm vezetőképességre hígított, aktivitást tartalmazó frakciókat {körülbelül 100 mi) közvetlenül felvittük a Mono Q oszlopra, és így a fehérjék adszorbeálódtak. A felvitel után az oszlopot 5% 8-puffe.rfc tartalmazó oldattal mostuk. Az oszlopot 30 perc alatt elváltuk, 5%-tói 40% B-t tartalmazó gradienssel, majd *·**·♦ φ

100% fo-vel mostuk 10 percig. A nitriláz a gradiens 1?.. és 18 frakciójában eluálódott.

•A tisztítás 1-4, lépéseit az 1, táblázatban mutatjuk be,

1. táblásat: A tisztítási eljárás vázlata

MonoQ ioncserélő· kromatográfiából (4. lépés) származó, aktivitást tartalmazó frakciókat (az 1, táblázatban WF-ként jelöltük) SDS-PAGE alkalmazásával vizsgáltuk# melyeket a 2, ábrán bemuta5, lépés; Fordított Fázisé

A KonoQ ioncserélő kromatográfiából H- lépés) származó# ak tivitást tartalmazó frakciókat (1?. és 18. frakció) fordított fázisú kromatográfiával homogenitásra vizsgáltunk, és tovább tisztítottuk tripszines hasításra való előkészítés céljából. Az elválasztáshoz Abimed-cszlopot (3 cm) felszereltünk egy Hewlett-Packard készülékre (HP 10800. Mozgó fázisként szolgáltak az alábbi pufferek: A-puffer: víz 0,1% TFA-va'l., és B-pufrer: acetonitrii 0,1% TFA-val. Injektált térfogat 0,1 ml, az áramlási sebesség 0,5 ml/perc volt. Az elúcíós gradiens lefutása az alábbi volt:

— Perc	% A-puffer	% B-puffer
0	8 0	20
xi	80	20
xí xi	30	70
22,1	0	100
24	0	100
25	100-	0
30-	100-	0

A nitril-áz a 12. és 13. perc között eiuálódott. Ez SDS-PAGEbán megfelelt egy 37 kDa méretű csíknak.. Ezt a csíkot szökvenáltuk. Applied Bíosystems cégtől beszerzett, „494 Procise Protein Seque'ozer*' szekvenálő-t alkalmaztunk.. Az így kapott,· 3S amisósavból álló N-termínális szekvenciát a továbbiakban 3. számú szekvenciaként jelöljük (SEQ ID NO: 3) . A szekvenciát a mellékelt szekvenciánstábén közöljük, amely az alábbi: Met Gin Thr Arg Lys lle val Arg Alá Alá Alá Val Gin Alá Aia Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Alá Thr Gly Val Asp Lys thr lle Glu Leu Aia Arg Gin Alá Arg Asp Glu Gly.

72. mmee/BAZíöZ *· χ '

A > * }t &

Mono Q kromatográf iából (4, lépés) származó mintát az alábbiak szerint kezeltünk: a fehérjét (körülbelül 0,6 mg) 12,5%-os TCA-val kicsaptuk, és az üledéket háromszor mostuk 1 mi dietil-éter/etanol 1:1 arányú elegyével, Az üledéket feloldottuk 0,2 ml, 6 H guanídin~HCI~t és 25 mM Tris/HCl-t tartalmazó puff erben (pH 8,5) . Ehhez az oldathoz, hozzáadtunk. 2,6 pl, 1 M DTT-olda tót a díszuifid-hídak redukálása céljából, A mintát 1 óra hosszáig, sötétben rázattuk. Azután a fehérjét 1,5 ul 4~vinii~piridín~ -oldattal (35%~os), 2 óra hosszáig, sötétben reagálhattuk. A reakciót ügy állítottuk le, hogy 1 óra. hosszáig inkubáltuk. 2,6 pl, 1 M DTT-oIdáttál. A viníl-píridinnel kezelt enzimet fordított fázisú HPLC-n tisztítottuk a fentebb leírtak szerint. A retencíós idő ebben az esetben 10 és 11 perc között volt. Az aktivitást tartalmazó frakciót molekulatömege alapján azonosítottuk, szedtük és 0,02 ml-re he tömén vitet tűk. Bhhez hozzáadtunk 0,01 ml acetonitrilt és 0,1 M Tris/HCl-ot (pH 8,5} tartalmazó puffért, 0,2 ml-re kiegészítve. A pfí-értékek korrigálása céljából még hozzáadtunk körülbelül 0,05 ml, 0,1 M NaOH-oldatot. A mintát (0,3 mg becsült fehérjemennyiség} összekevertük 0,032 ml, 1 mg/ml-es tripssin-oldattal, 0,1 M Trís/HCl-t (pH 8,5) és 5% acetonitrilt tartalmazó puíferben, és egy éjszakán át inkubáltuk 3'7°c~on. Az emésztést ö, 01 ml ecetsavval. állítottuk le, és azután .lecentrifugáltuk.. A felüiúszót fordított fázisú HPLC-ή.., Cl 8-oszlopon elválasztottuk, (Mozgófázis:: A-puffer: viz 0,1% TFA-val, és B-puffer: acetonitril 0,1% TFA-vai.) A peptideket (detektálás

205 nm-en. és 280 nm-en) gyűjtöttük és szekvenáltuk. Applied ?2.3?'2/3E ♦ *

XX

Blosystems cégtől beszerzett, .-,494 Procíse Protein Sequenzer szekvenálót alkalmaztunk. Az így kapott, 21 aminosavhói álló, belső szekvenciát a továbbiakban 4. számú szekvenciaként jelöljük (SSQ ID NO: 4), és egy 11 aminosavból álló, belső szekvenciát. a továbbiakban 5. számú szekvenciaként jelöljük (SSQ ID NO: 5) . A szekvenciákat, a mellékelt szekvencialistában közöljük, amelyek az alábbiak:

4. számú szekvencia:

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala

Ile Ser Kis Pro Gin

5. számú szekvencia:

Glu Glu Ala Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lys <?. S’iszfcí totfe ni triász aktivitása fz-hidrojfi-i'eaii-scetonitri1 i el szebben

A tisztított nitriláz aktivitását a-hidroxi-fenil-acefconitrillel szemben a 2. példában leírtak szerint határoztuk meg. A tisztított fehérjék specifikus aktivitása a~hídroxi~fenil~acetonítrillel szemben körülbelül 1238Q ü/mg fehérje volt.

2. példa

Alcaligenes faecalis 1650-ből származó nitríláz klónozása

Az 1. példában bemutatott, 3. számú és 4. számú peptídszefcvencíáfcól levezettünk nukleotidszcndákat és megszintetizártak azokat. A 3. számú, K-terminális peptídszekveneiáből levezetett nukleotidszonda 23 tagú volt, Si-sseresen dsgenerált (a nukleotidszondóban „A, C, G vagy T N-re; ,,A vagy G R~re? „C vagy

S-re lett cserélve). Kivel az irodalomban, Alcaligenes törφ * « « zsekre leírt { Wada et al,, Nucl. Aclds Rés. 20, 2111-2118 {1992)1 szekvenciákban GC aránya magas, gintaminek és izoleucinok esetén a kódonok. harmadik helyére a választás adott volt. A nukieotidszonda, melyet a továbbiakban 6. számú szekvenciaként (SEQ ID NO: 6) jelölünk,· meghatározta az alábbi 5' -végi prímért, ahol S ~ C vagy G, és M ® A, C, G vagy T.

6. számú szekvencia:

5' -ATGGAGACRAGNAARATCGTSCG-3

A 4« számú, belső peptidszekvenciából levezetett nukleotids.zonda 20 tagú volt, 256-szeresen degenerált (a nukleotidszondában „A, C, G vagy T N~re; ,,A vagy G'^f R-re; ,,C vagy G^Zf S-re lett cserélve), Alcaligenes törzsekre leírt szekvenciákban GC aránya magas, lizinek esetén a kódonok harmadik helyére a választás adott volt. Ez a nukleotidszonda, melyet a továbbiakban

7. számú szekvenciaként (SSQ ID- NO: 7) jelölünk, meghatározta az alábbi 3' -végi primert. A szekvenciát a mellékelt szekvencialistában közöljük, amely az alábbi:

7, számú szekvencia:

5' -TNGGSAGNGANGCRATCTTG-y

A 6. és 7. számú szekvenciával rendelkező, primer-párok segítségével PCR-t végeztünk Acalígenes faeca'lis 1650-ből származó kromoszómái! s DNS-en. Kromoszómái is DNS-t lízozím- és pro-teináz-K-kezeléssel elért sejtiízis után ízoláinuk, Fachmann klasszikus módszerét követve | Ausubel,- F. M. et al., “Current Protocols ín molecular bioiogy, John Wiley and Sons (1994)1 Fwo-políme ráz alkalmazásával végzett PCR az alábbi lépésekből állt: denaturálás 3- percig,- 95*C~on; 35 ciklus denaturálás 1 percig, 95^e'C“On, primer-hibrídisálás· 1 perc 3Q másodpercig 58°C-on és polimerizálás 1 perc 30 másodpercig ?2:^β€-ο·η; és záró pclimeri.sálás 5 percig, ?2°C-on.

Ilyen körülmények között Acaiigenes faecalis 165-0-bői származó kromoszómái is DNS-ből körülbelül .1 kb méretű fragmentum amplifíkálódott. A PCR-termék klónozása céljából a már említett prímereket megtoldottak egy Xbal-hasi tóhellyel és két további nukleotíööal (%' -AATCTAGá illetve 5' -ATTCTAGA) , és a RCR-reakciót a. fenti körülmények alkalmazásával megismételtük, újra egy körülbelül 1 kb méretű fragmentum arplifikálódott, amit tisztítás és Xbal-enzimes emésztés után ugyanígy emésztett pUCIS-ba ligáitünk. E. coli JM109 transzformálása és az eredményül kapott plazmid izolálása után a DNS összetételét szekvenálással és azt követően genomi Southern-felot alkalmazásával igazoltuk. A teljes nitriláz-gén (nít) izolálására szolgáló molekuláris biológiai és mikrobiológiai módszereket Fachmann ismert, klasszikus módszerei szerint végeztük. A teljes nitriiás-szekvenciát bemutatjuk 1.

számú szekvenciaként.

Homológra más fehérjékkel, homológ szekvenciák azonosítása

SWISSFROT fehérje-adatbásísból származó szekvenciákkal való összehasonlításban kimutattuk, hogy a találmány szerinti nitriiás-gén aminosav-szinten 11-96%-os homológiát mutat ismert nitrilázokkal, A legnagyobb mértékű szekvencia-homológiát

Alcaligenes faecalis JR3 törzsből származó, aríl-acetonitril-specifikus nitriiáz { Nagasawa et al., Eur. J. Bioehem. 194, « φφ*

765-772 (1.990)} esetén találtuk. A két nifriláz-gén 93,2%-os azonosságot mutatott nukleotid-szinten, 1071 bp hosszúságú szakaszon. A levezetett aminosav-szekvencia 96,1%-os azonosságot mutatott 356 aminosav hosszúságú szakaszon. A legkisebb mértékű, 11,4%-os homológiát Rhodococcus erythropolis SK92 (ΕΕ-Ά-0 71.9 862 számú szabadalmi írat) törzsből származó nitriiázra találtuk,

534 amninosav hosszúságú, szakaszon.

,óg expresszi©ja E. coliban

A pJOE27Ö^:2-jelű expressziós vektorba való klónozás céljából amplifikáltuk a nit-gént. Ehhez 5^f -printerként PCR céljára kiválasztottuk a 3. számú szekvenciát, amelyben az 5^r-nit-véghez a transzlációs starthellyel átfedő Ndel-hasítóhelyet kapcsoltunk. Ezt a prímért a továbbiakban 8. számú szekvenciának (SEQ ID NO: 8) jelöltük, és a mellékeit szekvencialistában közöljük. 3' -primerként egy 24-tagú szakaszt választottunk a nit-gén 3' -végéről, amelyhez BanHI-hasítóhelyekkel szegélyezett stop-kódont kapcsoltunk. Ezt a továbbiakban 9. számú szekvenciának jelöljük (SEQ ID NO: 9), és a mellékelt szekvencialistában közöljük.

5^f -TTAATCATATGCAGACAAGAAAAA7CGTCCG-3^f (8. számú szekvencia)

5^f-AAGGATCCTGAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-S^ (.9, számú szekvencia)

Pwo-polimeráz alkalmazásával végzett PCR az alábbi lépésekből állt: denaturálás 3 percig, 94°C-on; 25 ciklus denaturálás 1 percig, 93^:0C-on, primer-hibridizálás 1 perc 30 másodpercig S5⁰C~on és pollmerizálás 1 perc 30 másodpercig 72'°C-on; és záró polimerizálás 5 percig, 72°C~en. A POR-fragmentumot tisztítottuk.

Φ φ

φφ *

X * φτφ Φ Φ

Ndel/SamHI-enzimekkei emésztettük, és ugyanígy emésztett pJOE27ö2••vektorba integráltuk [ Volff et al., Mól. .Microbiol. 21# 1037-1047 (1996)3 · Az eredményül kapott plazmád jelölése pDHE19.2, és bemutatjuk a 3. ábrán. Ndel/BamKI-hasitóhelyek felhasználásával a pDHBIá.2~plazmidba integrált nit-gén a pJOE2702 által tartalmazott rha_ö-promóter transzkripciós szabályzása alatt áll, amely az E. coliban lévő, pozitívan szabály zott rhaEAD .1rámnóz-opexonból származik [Bgan és Schleíf# J. Mól. Bioi. 243# 821-829 (1994)] - Á nit-gén t.raszkripciójána'k termínálása és a transzláció iniciálása szintén vektorszekvenciákon keresztül zajlik le. Emellett a plazmádba, még egy gén, Ap^K—jel.ü ampí dilinre z i s z t en c i ágén va n be ép í t ve.

Nitriláz heterológ expressz lóját a pDHEl9.2-plazmi.dot tartalmazó# E. coli oMl09-ben mutattuk ki. Ebből a célból a JM109 (pDHEi9.2) törzset 100 pg/ml aiapi cill int tartalmazó TB-tápkczegben { Tartóz# Bobba (1987)3 .# 37°C-on# rázatva növesztettük.

Amikor az Οϋ_6δ0 elérte az 1,7 értéket# a tenyészetet 1:200 arányban átoltottuk friss TB-tápközegbe# amely a nitriláz indukciója céljából 0,2 tömeg% L-ramnózt tartalmazott, és rázatás közben, 3Ö*C“OO növesztettük, Nyolc óra hossza múlva a sejteket elkülönítettük# 10 mM Na/K-foszfát-pufférrel (pH 7#2) mostuk, ugyanebben a pufferben felszuszpendáitufc OD₆₈._a~lö-re# és ultrahangos kezeléssel feltártuk.

5. példa

Rekombínáns E. coli JMIÜS-törzs <pDHE19.2) nitríláz-aktivitásának meghatározása

72.2>/íiE go

1. Sejtek előállítás®

E, coli JM109 ípDHElk.2) törzset 37°C~on, rázatva tenyésztettünk, 6 óra hosszáig, 100 pg/ml ampícillint tartalmazó, TB-tápköregben. Amikor az GDgoo elérte a 4-et, ebbel as előrázott tenyészetből 100 ml-t beoltottunk 3 liter friss, 1ÖÖ pg/ml amplcíliínt és 2 g/1 L-ramnőzt tartalmazó TB-tápközegbe, egy 10 literes fermerxtorba. A pB-fc 7,2-n, a hőmérsékletet 30°C-on, a levegőztetés sebességét 300 i/órán és a fordulatszámot 400-650 £ordulat/pero-en (rpm) tartjuk. í€ óra múlva a sejteket kinyertük. Ekkor az optikai sűrűség 000 na-sn 18 vált, a megfelelő száraz sejttömeg 7,8 g/1 vo1t,

2. Specifikus sitivlPás meghetárcsása n-hl drcxl-feuil-acefeo-” nífcrillel szemben

A sejteket az 1. pontban leírtak szerint állítottuk elő, és 10 mM Ea/K-fos.zfát-puffőrben (pH 7,2) mostuk azokat. .2 mg száraz sejtet felsznszpendáltunk 1 ml, 10 mM Na/K-foszfát-pufferben (p.H 7,2), és a reakciót 8,3 mM α-hidroxi-fenii-aeetonitril hozzáadásával elindítottuk. A reakciót 4 0'’C-on, rásatás közben végeztük, A. kinetikát mintavétel, azután sejtek elkülönítése után nagyhatékonyságú folyadékkromaiográíia (ODS Hypers.il) segítségével követtük. Meghatároztuk a α-hidroKi-fonil-acetonit r 1.1, benzaldehid, mandul.asava.mid és mandulasav mennyiségét. A mandulassv keletkezési sebessége 403 u/g száraz sejttömegre vonatkoztatva, 30%-os: átalakulásnál, ahol az 1 egységet úgy definiáljuk, mint amely 1 μ mól mandulasavat képes előállítani 1 perc alatt, áO^C-on.

7Z.3VZ/3S/KASU?r

6. példa

R-mandulas&v szintézise a-hldrosi-fenll-acetoni-triX elszapparkosításával, g. coll JM109 (pDHEXS.2) segítségével, szuszpenzióban

X térfogatban, 2 g/1 koncentrációban, lö mM Na/K~fo-szfát-pufferben {pH 7,2) lévő, E. coli JM1Q9 (pDHE19.2> törzshöz rázatás körben, 40°C-on, 10 óra hossza alatt hozzáadtunk 1,3 g/1 a-hidroxi-fenil-acetonítríIt. áz adagolást a nitril-f-ogyasztás szabályozta. R-mandulasav keletkezésének sebességét az 5. .példában leírtak szerint határoztuk, meg. áz. eredményeket bemutatjuk a

4. ábrán.

R-mandulasav kinyerése extrakcióval a a-hidroxX-feniX-acetonitril elsz&ppanositéaára alkalmazott, E. coli JMlöS-at (pSHElS. 2-t) szuszpenzióban tartalmazó reakciókeverékből á €. példában- leirt, mandulasav előállítására alkalmazott, vizes reakciőelegyból centrífugálással eltávolíto-t'tuk a sejteket, sav alkalmazásával a pH-t beállítottuk 2-re, és. háromszor extraháltuk met il-terc-feutii-éterrel. á- madnlasav-extraktumban lévő szerves oldószer ledesztillálása után fehér mandulasavkristályokat kapunk, melyet visszaoldottunk, és nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával vizsgáltuk kémiai és- optikai tisztaságra. áz R~mandulasav kémiai tisztasága- .99% volt, optikai tisztasága 97,4% volt.

*:»·» σ-hxoroxx-fenzl-acetoaifcrrl ©Iszappaaosxtására alkalmazott, E. coli űMlÖ9-et (pBHElS.2-t) szuszpenz lóban tartalmazó reakciók®A 6. példában leírt, mandulasav előállítására alkalmazott, vizes reakcióé légyből centrifugálással eítávolitottuk a sejteket, melegítés és rázatás közben a 'kiindulási térfogat 40%-ára történ y.í tét tök, és sav alkalmazásával a pH-t beállítottuk. 2-re·.. A mandulása vat vízfürdőben való hűtéssel kikristályo-sí tottuk, és az így kapott., fehér manóulasav-krístályokat nuccson leszívtuk, és megszárítottuk. A kristályokat visszaoldottuk, és nagyteljesítményű folysöékkromafográf iával vizsgáltuk kémiai és optikai tisztaságra. Az R-mandulasav kémiai, tisztasága 99,1% volt, optikai tisztasága 99/8% volt.

Az S. coli törzzsel (lásd 6.. példát) vagy a kiindulási Alcaligenes törzzsel átalakítottunk különböző nitríleket, Alcaligenes sejteket felvettünk 400 ml Alcaligenes-tápközegben (lásd. fentebb A-tápköz égként), 30°C-oh és IS éra hosszáig rázattuk 160 .rpm-en.. A sejteket elkülönítettük centrif ugáíással (30 perc, 4C és 5000 rpm) . A sejtssuszpenzióből 150-150 μΙ-t pipettáztunk míkrotiter-táiea tenyésztőhelyeire. Ezután a tálcát lecentrifugáltuk. A felülúszót leszívtuk, és a sej'tüledéket kétszer mostuk Na^HPO^-al (1,42 g/i Finnaqua-ban, pH 7,2). Azután φφ

Φ * Φ X φφφ φ

Α Φ Φ X Φ Φ X Φ * Φ Φ hoszápipettáztunk 150 1 szubsztrát-oldatot, és a sejteket újra feiszuszpendáltuk. A .mikrotiter-tálca minden egyes 12-es sorába egy-egy fajta szubsztrátot helyeztünk. Kontrollként egy sor szubsztrát-oldatot sejtek nélkül készítettünk el {- „üres érték).

A mikrotíter-tálcákat inkufoátor-rázógéphen, 3Ö°C-on, 200 rps~ néi, 2 óra hosszáig rázattuk. Azután a sejteket iecentrifugáltűk, és a felülászóban meghatároztuk a keletkezett ammóníum~ion mennyiségét, Biomek-berenőezés .segítségével. A mérést 620 nm-en végeztük kalibrációs görbe felhasználásával, melyet különböző ammónium-hidroxid-oldatokkal állítottunk elő (lásd 5. ábrát) . Szubsztrát.ként alkalmaztuk az alábbi anyagokat: a-hidroxi-fenil-acetonitril {—1), 2-fenii-propion.itri 1 (-2), 2-fenil-butironitril (=3), benzil-cianid (-4), 4-klőr-benzil-cianid (=5), 4-bróm~ -benzil-cianid <-€), p-ropionitril (-7), 2-metil-butironitrí 1 (=8, 2-c.iano-bután), geranonitril (=9), valeronitríl (-IO) , 3-cíano-píridin (=11), 3-bífení 1-2-hidroxi-butironít.ril (=12), 4-fiuor-benzil-cianid (=13, 4~fluor-fenil~acetonitr.il) és a- (3-heptil) -nitrilo—triacetonitril (=14). A szubszfcráto-kból 0,2 m metanolos oldatot készítettünk, és ebből a törzsoldatból kiindulva Na₂HFQ₄-al (1,42 g/l Finnagua-ban, pH 7,2): lö mM-ra hígítottuk azokat, A se.jts-zuszpenziókat 2 g/l biológiai száras anyagra standardizáltuk. A 2, táblázatban megadjuk egy-egy mikrotiter-tálcasorban a konverzió átlagait.

»» *

<21G> 1 <211> 1071 <212> IMA <213> Alcaligenes faecaixs <220>

<22i> CDS <222> <1} . . (1071.) <4öö> 1

atg cag aca

aga aaa ate

gte egg

gca gcc

gcc Alá

gta cag gcc gcc. Val Gin Aia Aia 15

fcct Ser

48

Met Gin 1.

Thr

Arg

Lys 5

lle

Val

Arg

Aia.

Aia 10

CCC

aac

tac

gat

ctg

gca

aeg

ggt

ott

gat

aaa

acc

att

gag

ctg get

96

Pro

Asn

Tyr

Asp

Len

Alá

Thr

Gly

Val

Asp

Lys

Thr

lle

Glu

Leu

Aia.

20

25

30

cgt

cag

gcc

ege

gat

gag

ggc

tgt

gac

ctg

ate

gtg

ttt

ggt.

gaa

acc

144

Arg

Gin

Alá

Arg

Asp

Glu

Gly

Cys

Asp

Leu

lle

Val

Phe

Gly

Glu

Thr

35

40

45

tgo

ctg

ece

gga

tat

CCC

ttc

cac

gte tgg

ctg ggc

gca

ccg

gcc

tgg

192

Trp

Len

Pro

Gly

Tyr

Pro

Phe

His

Vai

Trp

Leu

Glv

Alá

Pro

Alá

Trp

50

55

60

teg

ctg

aaa

tac

agt

gcc

ege

tac

tat

gcc

aac

teg

ete

teg: ctg

gac

240

Ser-

Leu

Lys

Tyr

Ser

Alá

Arg

Tyr Tvr

Aia

Asn

Ser

Leu

Ser

len

Asp

SS

70

75

80

agt

gca

gag

ttt

caa

ege

att

gcc

cag

geo

gca

egg

acc

ttg

ggt

att

288

Ser

Alá

Gm

Phe

Gin

Arg

lle

Aia

Gin

Alá

Aia

Arg

Thr

Leu

Glv

lle

85

90

95

ttc

ate

goa

ctg

ggt

tat

agc

gag

ege

agc

ggc

ggc

agc

ctt

tac

ctg

336

Phe

Tle

Áia

Len

Gly

Tyr

Ser

Gin

Arg

Ser

Gly Giy

Ser

Leu

Tyr

Leu

100

105

110

ggc

caa

tgc

ctg

ate

gac gac

aag

ggc

gag

atg

ctg

tgg

teg cgt

ege

384

Gly

Gin

Cys

Lou

lle

.Asp Asp

Lys

Giy

Glu

Met

leu

Trp

Ser

Arg Arg

115

120

125

aaa

ete

aaa

CCC

aeg

oat

gts

gag

ege

acc

eta

ttt

gg~

gaa

ggt

tat

432

Lys

Len

Lys

Pro

Thr

His

Vál

Gin

Arg

Thr

Vai

Phe

Gly

Gru

Gly Tyr

130

135

140

gcc

cgt

gat

ctg

att

gtg

tcc

gac

aca

gaa.

ctg

gga

ege

gte ggt get

480

Aia

Arg

Ásp

Leu

lle

Val

Ser

Asp

Thr

Gin

Leu

Gly Arg

val

Gly

Alá

145

150

155

160

eta

tgc

tgc

tgg

gag

cat

ttg

teg

cce

ttg

agc

aag

tac

geg ctg

tac

528

Leu

Cys

Cys

Trp

Glu

His

Leu

Ser

Pro

Leu

Ser

Lys

Tyr

Aia

Leu

Tyr

165 170 175 ♦ φ φ V .-♦♦♦· * ΦΦ* ΦΦ>** * φ X **

tcc cag cat gaa gcc att	cac att His He	get gcc	tgg ccg tcg ttfc tcg cta
Ser	Sin	His	Glu Alá lle ISO	Alá 185	Alá	Trp	Pro Ser	Phe. Ser 190	Leu
fcae	agc	gaa	cag gcc cac	gcc ctc	ag t	gcc	aag	gtg a.ctc	atg get	gcc
Tyr	Ser	Glu 195	Gin Alá His	Alá Len 200	Ser	Alá	Lys	Vaí Asn 205	Met Alá	Ála
tcg	caa	atc	tat tcg ott	gaa ggc	cag	tgc	ttt	acc atc	ccc gcc	agc
Ser	Gin 210	lle	Tyr Ser Val	Glu Glv 215	Gin	Cys	Phe	Thr He 220	Ála Alá	Ser
agfc	gtg gtc	acc caa. gag	acg cta	gac	atg	ctg	gaa gtg ggt gaa	cac
Ser 225	Vei	Vei	Thr Gin Glu 230	Thr Leu	Asp	Met	Leu 235	Glu Val	Gly Gin	Hls 240
aac	gcc	ccc	tfcg ctg aaa	gtg ggc	ggc	ggv	agfc	tcc atg	att ttt	gcg
Asn	Alá	Pro	Leu Leu Lys 245	Val Gly Gly	Glv 250	Ser	Ser Met	lle Phe 255	Alá
ccg	gac	gga	ege aca ctg	get ccc	tac	ctg	cet	cac gat	gcc gag	gcc
Pro	Asp	Gly Arg Thr Len 260	Alá Pro	Tyr 265	leu	Pro	His Asp	/•ila Gru 270	Gly
ttg	atc	att	gcc gat ctg	aat a.fg	gag	gag	att	gcc ttc	gcc aaa	gcg
Leu	lle	lle 275	Alá Asp Leu	Asn Met 280	Glu	Glu	He Alá Phe 285	Ála Lys	Alá
atc	aat.	gac	ccc gta ggc	cac tat	tcc	aaa	ccc	gag gcc	acc cet	ctg
lle	Asn 290	Asp	Pro Val Gly	His Tyr 295	Ser	Lys	Pro	Glu A.ia 300	Thr Arg	Leu
gtg	ctg	gac	ttg ggg cac	cga gac	ccc	atg	act	egg gtg	cac tcc	aaa
Val 305	leu	Asp	Leu Glv His 310	Arg Asp	Pro Met	Thr 3.15	Arg Val	His Ser	Lys 320
agc	gtg	acc	agg gaa gag	get ccc	gag	caa	ggt	gtg caa	agc aag	att
Ser	Var	Thr	Ara Glu Glu 325	Alá Pro	Glu	iáin 330	GXy V3Í Gvln	Ser Lvs 335	He
gcc	tea	gtc	get atc agc	cat cca	cac	gac	tcg	gac aca	ctg cta	gtg
Alá	Ser	Val	Alá lle Ser 340	His Pro	Gin 345	Ásp	Ser	Asp Thr	Leu Leu 350	Val

caa gag ccg tct fcga Gin Glu Pro Ser

355

Φ «*

576

624

672.

720

768

816

864

912

960

1008

1056

1071 <210> 2 <211> 356 <212> ÉRT <2I3> Alcal.ígenes faeeaiis <40ű> 2

Met Gin Thr Arg Lys lle Val Arg Alá Alá Alá Val Gin Alá Alá Ser 1 5 ' 10 15

4 b

* X 4 A * * *

# ♦ ·* V « x * X φφ « X X *

Pro

Asn

Tyr

Asp

Leu

Alá

Thr

Gly

r.-γ ” Ά VCi.l ítejp

r V

i-Gi.

Xle

Gru len

A.i.a

20

25

30

Arg

uln

Alá

Arg

Asp

Glu

Giy

Cys

Asp Xau

lle

Vai

Phe

Giy Gru

’Τχ·; r-

35

40

45

Trp

Leu

Pro

Gly

Tyr

Pro

Pns·

His

Val Trp

Xi6U

Giy

Ara

Pro Ara

Trp

50

55

60

Ser

leu

Lys

'Tyr

Ser

Ara.

Arg

Tyr

Tyr Aia

Asn

Ser

Leu

Ser Len

Asp

65

70

75

80

Ser

Alá

Gin

Phe

Gin

Arg

Tie

Aia

Gin Alá

Alá

Arg

Thr

Leu Gry

Tie

35

90

95

Phe

lle

Al a

Leu

Gly

Tyr

Ser

Glu

Arg Ser

Gly

Gly

Ser

Leu Tvr

Leu

100

105

110

Gly

Gin

Cys

Leu

Tie

Asp

Asp

Lys

Gly Glu

Leu

Trp

Ser Arg

Arg

115

120

125

lys

Leu

Lys

Pro

Thr

.His

Val

Glu

Arg Thr

Val

Phe

Giy

Glu Gly

Tyr

130

135

140

Alá

Arg

Asp

lle

Val

Ser

Asp

Thr Glu

Len

Gl Vi. v

Arg

Val Gly

Ara

145

ISO

155

160

Leu

Cys

Cys

Trp

Glu

His

Leu

Ser

Pro len

Ser

TuVS

Tyr

Ar a Le u

Tyr

165

170

175

Ser

Gin

His

,’ T ,.

Alá

Xle

His

lle

Aia Aia

Trp

•Í3 yy\ A, LG

np.·.

Phe Ser

Len

isu

185

190

Tyr

Ser

Λ1 γγ VTi- W

01 .·. <J.i ! f

Aia

His

Aia

Leu

Ser Alá

£ys

Val

Asn

Met Alá

Aia

195

200

205

Ser

Gin

Λ.

Tyr

Ser-

Val

Glu

Glv

Gin Cys

PHp

Thr

Xle

Ara Alá

Ser

210

215

220

ser

Val

Val

Thr

Gin

Gin

Thr

Asp Met

Leu

Glu

Vai

Gry Glu

His

225

230

235

240

Asn

Ara

Pro

Leu

Leu

Vai.

Gly

Giy Glv

Ser

Ser

Met

Xle Phe

Al.a

245

250

255

Pro

Asp

Gly

Arg

Thr

Leu

Alá

Pro

Tyr Leu

Pro

His

Asp

Alá Glu

Gly

260

265

*‘1‘7 í>

Leu

Xle

Ara

Asp

Leu

Asn

Met

Glu Glu

Xle

Aia

?h·^

Alá Lys

Alá

275

280

285

Xle

Asn

Asp

Pro

Val

Giy

His

Tyr

Ser Lys

Pro

Gin

Ara

Thr Arg

Leu

290

295

300

Va.1

Leu

ÁS.p

Leu

Gly

His

Arg

Asp

Pro Met

Thr

Arg

Val

His Ser

Lys

ψ·» 9

Ser Val

Thr Arc Glu Gin Aia 325

Pro

Glu Gin Gly Val Gin Ser Lvs

Ile

330

335

Alá

Ser

Val

Alá

Ile Ser

Hís

Pro

Gin

Asp

Ser

Asp

Thr

Len

Leu

Val

340

345

350

Gin Glu Pro Ser 355 <21Q> 3 <211> 33 <212> PR?

<213> Alealigene© faecalís <400> 3

Met.

Gin

Thr

Arg

Lys

Ile

Val

Arg

Alá

Aia Alá

Val

Gin

Alá

Aia

Ser

1

~5

10

15

Pro

Asn

Tyr

Asp

len

Aia

Thr

Gly

Val

Asp Lys

Thr

Ile

Gin

Leu

Alá

20

25

30

Arg

Gin

Alá

Arg

Asp

Gin

Gly

<210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Alcaligenes íascalis <400> 4

Glu Glu Alá Pro Glu Gin Gly Val Gin Ser Lvs Ile Alá Ser Val Alá 1 5 10 15

Ile Ser His Pro Gin 20 <210> 5 <211> II <212> PR?

<213> Alcallgenes faeealis <400> 5

Gin Glu Alá Pro Glu Gin Glv Val. Gin Sér Lvs 1 5 10 <210 6 <212> 2.3 <212> DMA <213> Aieallgenes faecalis <4ö0> 6 atgcagacna gnaaratcgt scg *-« ♦

* Ί>

* « Φ *¥* ·»<* ΚΧ'ΦΦ * * » < ** <210> 7 <211> 20 <212> EW, <213> Alcaiigsnes faacalís

<400> L.X iCj Oa5 <	t acnga	ngcratettg
<210	8
<211>	31
<212>	DNA
<213>	Álca	1 igsí la-eoai a
<400	8
•*·'ΰ < UCÍCJÍ Ϊ..Λ	catat	gcagacaaga aaaafccgfccc g

.J .^\V-	M
<Z. 1 .1/
<212>	DIA
<213>	Αία
<400	Q
aaggat	CCt<

aagacggctc tfcgcactagc. ag

Claims (11)

1. Izolált nukleinsav-szekvencia, amely egy nitriiáz-aktivitásssl rendelkező polipeptidet ködei, as alábbi csoportból 'kiválasztva :

a) az 1. számú szekvenciával ábrázolt nukleinsav-szekveneia,

b) olyan nukleinsav-szekvenciák, amelyek a genetikai kód degeneráltsága eredményeként az 1. számú szekvenciával ábrázolt η u k 1 e i nsav-s ze k ven c iábó 1. Ievez e the tők, ci az 1. számú szekvenciával ábrázolt nukleinsav-szekveneia olyan homológjai, amelyek olyan polipeptideket kódolnak, melyek legalább 981 homolőgiávai rendelkeznek a teljes székvenc.iatartományon belül, a 2. számú szekvenciához anélkül, hogy a polipeptid enzimhatása csökkenne.

2. Aminosav-szekvenoia, amelyet egy 1. igénypont szerinti nukleinsav-szekveneia kódol.

.

3. A 2. igénypont szerinti sminosav-szekvencis, amelyet az 1. számú szekvenciával ábrázolt szekvencia kódol,

4. Nukleinsav-konstrakció, amely egy 1, igénypont szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmaz, ahol a nukleinsav-szekvencia egy vagy több szabályzó szignállal van összekapcsolva,

5, Vektor, amely eqy 1, igénypont szerinti nukleinsav-szekvenciát vagy egy 4, igénypont szerinti nnkieinsav-konstrokciót tartalmas,

δ. Mikroorganizmus, amely legalább egy 1, igénypont szerinti bevitt nnkleínsav-szekvenciát vagy legalább egy 4. igénypont szerinti bevitt nukleinsav-konstrukciöt tartalmaz.

7. A 6. igénypont szerinti mikroorganizmus, ahol a mikroorganizmus egy Escherichia, Pseudomonas vagy Alcalígenes nemzetséghez tartozó baktérium.

72.372/SK/KA2úp2

5δ

Eljárás az lemezve, hogy egy ί'Τί (XX) általános képletű racém nitrilt egy 2. vagy 3. igénypont szerinti aminosa.v-szekven.cia vagy egy 6, vagy 7. igénypont szerinti, növekvő, nyugalomban lévő vagy feltárt mikroorganizmus jelenlétében reagáitatunk, ahol mg fehérjére számítva óránként legalább 25 mól nitril, vagy g szárazanyagra számítva óránként legalább 25 mmol nitril alakul át a királis karbonsavakká, ahol az (X) és (11; általános képietekben a szubsztituensek és szimbólumok jelentése a következő:

* optikailag aktív centrum

R^:‘, R\ R· jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, szabsztituáit vagy szubsztituáiatlan, elágazó vagy el nem ágazó láncú, l-Iö szénatomos alkil-, 2-10 szénatomos alken.il-, szubsztituált vagy szubsztituáiatlan aril-, beteroaril-csoport, -OR^! vagy -MR’R'' általános képletű csoport, ahol E“, R' és E“ jelentése mindig eltérő,

2. jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy sznfcsztituálatian, elágazó vagy el nem ágazó láncú, 1-10 szénatomos alkil-, 2-10 szénatomos aiken.il-, 1-10 szénatomos aikil-karbonil-, 2-20 szénatomos aikenil-karbonii-, aril-, aril-karbonii-, heteroaril- vagy heteroaril-karbonil-csoport,

Rl jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztitnálata, 2U/as/muip2 lan, elágazó vagy el nem ágazó láncú, 1-10 szénatomos alkil-, 2-10 .szénatomos alkenil-, aril- vagy hetsroarii-csoport.

9·. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, ' P '1 ·<

hogy az Rl, Rt vagy R szubsztituensek egyikének jelentése -OR^-5' általános képletű csoport, lö, A 8. vagy :9, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 32 R¹, ΡΛ vagy R* szubsztituensek egyikének jelentése árilesöpört,

11. A 8-10. i g.-én ypo n t o k fc á rae 1 y i ke s zer inti eljá r á s, a z z a 1 jellemezve, hogy az eljárást vizes reakciócldatfoan, 4 - 11 közötti pH-η hajtjnk végre.

12. A 8--ΙΊ. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárásban 0^:,0-1-10- tömege nitrilt, vagy 0,-01-10 tömeg! megfelelő aldehidet vagy ketont és 0,01-10 tömeg % hiárogén-cíanidot reagáltatunk.

1.3, A 3-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást O^C és 80^eC közötti hőmérsékleten hajtjuk végre.

14. A 3-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a királis karbonsavat extráidévá! vagy kristályosítással vagy extrakoiéval és kristályosítással, 60% - 1003 kitermeléssel nyerjük ki a reakciöoldatból.

15. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a királis karbonsav legalább 90%-ee optikai tisztás ággal, rende 1 ke z i k.