KR100715744B1

KR100715744B1 - 니트릴라제 또는 니트릴라제의 유전자를 포함한 미생물을이용하여 니트릴로부터 키랄 카르복실산을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100715744B1
Application number: KR1020017004906A
Authority: KR
Inventors: 마리온 레스-로스케; 토마스 프레드릭; 버나드 호이어; 랄프 멧트; 덜크 엔젤
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2007-05-08
Anticipated expiration: 2019-10-13
Also published as: HUP0104802A2; US6869783B1; CA2347521C; NO327857B1; AU6470899A; DK1123386T3; CZ20011382A3; EP1123386A1; ATE349517T1; EE05008B1; EE200100232A; CZ302494B6; JP2002527106A; NO20011912D0; ES2280125T3; JP4489298B2; CN100422319C; CN1331743A; DE19848129A1; IL142397A0

Abstract

본 발명은 니트릴라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체, 및 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 아울러 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 핵산 구성체, 또는 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 라세미 니트릴로부터 키랄 카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

니트릴라제, 라세미 니트릴, 키랄 카르복실산

Description

니트릴라제 또는 니트릴라제의 유전자를 포함한 미생물을 이용하여 니트릴로부터 키랄 카르복실산을 제조하는 방법{Method for producing chiral carboxylic acids from nitriles with the assistance of a nitrilase or microorganisms which contain a gene for the nitrilase}

본 발명은 니트릴라제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 핵산 서열을 포함하는 핵산 구성체, 및 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 아울러 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 및 핵산 서열, 핵산 구성체, 또는 핵산 서열 또는 핵산 구성체를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 라세믹 니트릴로부터 키랄 카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

키랄 카르복실산은 유기 화학 합성에 요구되는 화합물이다. 이들은 많은 제약학적 활성 성분 또는 농작물 보호를 위한 활성 성분의 출발 물질이다. 키랄 카르복실산은 부분 입체 이성질체 염을 통한 전통적인 라세미체 분해에 사용될 수 있다. 따라서, R-(-)- 또는 S-(-)-만델산이, 예를 들어 라세미 아민의 라세미체 분할을 위해 사용될 수 있다. R-(-)만델산은 추가적으로 반합성 항생제 및 많은 농업 용 생성물을 위한 중간체로 사용된다.

키랄 카르복실산을 제조하기 위한 다양한 상이한 합성 경로가 문헌에 기재되어 있다. 따라서, 예를 들어, 광학 활성 아미노산이 발효 방법에 의해 공업적으로 얻어진다. 이들은 각각의 아미노산에 대해 특이적인 방법이 반드시 개발되어야 한다는 단점을 수반한다. 이 때문에 최대한 넓은 범위의 상이한 화합물을 제조할 수 있도록 하기 위해서 화학적 또는 효소적 방법이 사용된다. 화학적 방법의 단점은 입체 중심이 보통 복잡하고, 다단계의, 널리 적용될 수 없는 합성으로 구축되어야 한다는 것이다.

키랄 카르복실산의 효소적 합성은 많은 특허 또는 특허 출원에서 발견되었다. 국제 특허 출원 공개 제WO92/05275는 생물학적 물질 존재하에서의 α-히드록시-α-알킬- 또는 α-알킬 카르복실산의 거울상 이성질체의 합성을 기술하고 있다. 유럽 특허 등록 공고 제0 348 901호은 알칼리제네스 (Alcaligenes), 슈도모나스 (Pseudomonas), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 코리네박테리엄 (Corynebacterium) 종 균주 KO-2-4, 아시네토박터 (Acinetobacter), 바실러스 (Bacillus), 마이코박테리엄 (Mycobacterium), 로도코쿠스 (Rhodococcus) 및 캔디다 (Candida) 속의 미생물을 이용하여 광학 활성 α-치환 유기산을 제조하는 방법을 청구하고 있다. 미생물을 이용한 L-α-아미노산의 제조는 유럽 특허 등록 공고 제0 332 379호에 청구되어 있다.

유럽 특허 공개 제0 348 901호 또는 이에 대응하는 미국 특허 제5,283,193호, 유럽 특허 공개 제0 449 648호, 유럽 특허 등록 공고 제0 473 328호, 유럽 특허 등록 공고 제0 527 553호 또는 이에 대응하는 미국 특허 제5,296,373호, 유럽 특허 공개 제0 610 048호, 유럽 특허 공개 제0 610 049호, 유럽 특허 공개 제0 666 320 호 또는 국제 공개 제WO97/32030호는 다양한 미생물, 예를 들어 알칼리제네스 (Alcaligenes), 오레오박테리엄 (Aureobacterium), 슈도모나스 (Pseudomonas), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 코리네박테리엄 (Corynebacterium), 아시네토박터 (Acinetobacter), 카세오박터 (Caseobacter), 바실러스 (Bacillus), 마이코박테리엄 (Mycobacterium), 로도코쿠스 (Rhodococcus), 브레비박테리엄 (Brevibacterium), 노르카르디아 (Nocardia), 베리오보렉스 (Variovorax), 아트로박터 (Arthrobacter) 및 캔디다 (Candida), 또는 효소를 사용한 α-히드록시카르복실산, 특히 광학 활성 젖산 또는 만델산의 제조를 개시하고 있다.

이들 방법의 단점은 흔히 극히 낮은 광학적 순도를 가진 생성물을 생성하고(또는) 극히 낮은 시공 수율로 수행된다는 것이다. 이는 경제적으로 매력이 없는 방법이다. 심지어 아황산염, 이아황산염, 아디티온산염, 차아인산염, 아인산염과 같은 물질을 첨가하거나 (유럽 특허 공개 제0 486 289호 참조) 또는 α-히드록시니트릴에 대한 증가된 내성을 가진 미생물을 사용하여(국제 공개 제WO97/32030호 참조) 생산성을 높이는 시도조차도 미약한 생산성의 증가를 가져왔다.

본 발명의 목적은 앞서 언급한 단점을 가지지 않으며 광학 활성 키랄 카르복실산을 제조하는 쉽고 비용 효과적이며 널리 적용이 가능한 방법을 개발하는 것이다.

본 발명자들은 본 목적이,

a) 서열 확인 번호 1에 개시된 서열을 가진 핵산 서열,

b) 유전자 암호의 중첩에 의한 결과로 서열 확인 번호 1에 개시된 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열, 및

c) 서열 확인 번호 2에 개시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하며 아미노산 수준에서 80% 이상의 상동성을 가지고 폴리펩타이드의 효소 작용의 감소가 무시할 수 있는 정도인 서열 확인 번호 1에 개시된 핵산 서열의 유도체

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열,

또는 상기 언급된 군의 핵산 서열 또는 상기 군의 핵산 서열을 하나 이상의 조절 신호 서열과 연결시킨 핵산 구성체를 포함하는, 성장하는, 발육 정지중인 또는 파쇄된 미생물의 존재하에서, 단백질 1mg당 1시간 당 니트릴 25mmmol이상 또는 미생물 건조 중량 1g당 1시간 당 니트릴 25mmol이상의 전환율로 하기 화학식 (II)의 라세믹 니트릴을 하기 화학식(I)의 키랄카르복실산으로 전환시키는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 하기 화학식 I의 키랄카르복실산의 제조 방법에 의해 달성된다는 것을 발견하였다.

*는 광학 활성 중심이고,

R¹, R², R³는 독립적으로 각각 수소, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀- 알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 헤트아릴, OR⁴ 또는 NR⁴R⁵이고 여기서 R¹, R², R³ 라디칼은 언제나 상이하며,

R⁴는 수소, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀- 알킬, C₂-C₁₀-알케닐, C₁-C₁₀- 알킬카르보닐, C₂-C₁₀-알케닐카르보닐, 아릴, 아릴카르보닐, 헤트아릴 또는 헤트아릴카르보닐이고,

R⁵는 수소, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀- 알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 아릴 또는 헤트아릴이다.

화학식 I 및 II의 화합물에서의 R¹, R², R³은 독립적으로 각각 수소, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀- 알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 헤트아릴, OR⁴ 또는 NR⁴R⁵이고 여기서 R¹, R², R³ 라디칼은 언제나 상이하다.

언급될 수 있는 알킬 라디칼은 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인C₁-C₁₀- 알킬 사슬, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸, n-부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필,1,1-디메틸에틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, n-헥실, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸-1-메틸프로필, 1-에틸-2-메틸프로필, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 또는 n-데실과 같은 것이 있다. 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-프로필 또는 i-부틸이 바람직하다.

언급될 수 있는 알케닐 라디칼은 분지쇄 또는 비분지쇄인C₂-C₁₀-알케닐 사슬, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐, 2-메틸프로페닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-메틸-1-부테닐, 2-메틸-1-부테닐, 3-메틸-1-부테닐, 1-메틸-2-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-메틸-3-부테닐, 2-메틸-3-부테닐, 3-메틸-3-부테닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 1,2-디메틸-1-프로페닐, 1,2-디메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-프로페닐, 1-에틸-2-프로페닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 1-메틸-1-펜테닐, 2-메틸-1-펜테닐, 3-메틸-1-펜테닐, 4-메틸-1-펜테닐, 1-메틸-2-펜테닐, 2-메틸-2-펜테닐, 3-메틸-2-펜테닐, 4-메틸-2-펜테닐, 1-메틸-3-펜테닐, 2-메틸-3-펜테닐, 3-메틸-3-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-메틸-4-펜테닐, 2-메틸-4-펜테닐, 3-메틸-4-펜테닐, 4-메틸-4-펜테닐, 1,1-디메틸-2-부테닐, 1,1-디메틸-3-부테닐, 1,2-디메틸-1-부테닐, 1,2-디메틸-2-부테닐, 1,2-디메틸-3-부테닐, 1,3-디메틸-1-부테닐, 1,3-디메틸-2-부테닐, 1,3-디메틸-3-부테닐, 2,2-디메틸-3-부테닐, 2,3-디메틸-1-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-3-부테닐, 3,3-디메틸-1-부테닐, 3,3-디메틸-2-부테닐, 1-에틸-1-부테닐, 1-에틸-2-부테닐, 1-에틸-3-부테닐, 2-에틸-1-부테닐, 2-에틸-2-부테닐, 2-에틸-3-부테닐, 1,1,2-트리메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-메틸-2-프로페닐, 1-에틸-2-메틸-1-프로페닐, 1-에틸-2-메틸-2-프로페닐, 1-헵테닐, 2-헵테닐, 3-헵테닐, 4-헵테닐, 5-헵테닐, 6-헵테닐, 1-옥테닐, 2-옥테닐, 3-옥테닐, 4-옥테닐, 5-옥테닐, 6-옥테닐, 7-옥테닐, 노네닐 또는 데세닐같은 것이 있다. 에테닐, 프로페닐, 부테닐 또는 펜테닐이 바람직하다.

언급될 수 있는 아릴 라디칼은 환 또는 환 시스템에 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 아릴 라디칼이다. 환 시스템은 서로 융합된 방향족 환이거나 또는 알킬, 알킬카르보닐, 알케닐 또는 알케닐카르보닐 사슬, 카르보닐, 산소 또는 질소에 의해 연결된 방향족 환을 포함할 수 있다. 아릴 라디칼은 적절한 경우, C₁-C₁₀-알킬, C₃-C₈-알케닐, C₃-C ₆ 알키닐 또는 C₃-C₈-시클로알킬 사슬에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있다. 페닐 또는 나프틸이 바람직하다.

언급될 수 있는 헤트아릴은 치환 또는 비치환된, 단일 또는 하나 이상의 N, O 또는 S와 같은 헤테로 원자를 가질 수 있으며, 적절한 경우 C₁-C₁₀-알킬, C₃-C₈-알케닐, 또는 C₃-C₈-시클로알킬 사슬에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있는 하나 이상의 헤테로방향족 3- 내지 7원 환을 가진 치환 도는 비치환 단일 방향족 환 또는 융합된 방향족 환 시스템이다. 이러한 유형의 헤트아릴 라디칼의 예는 피라졸, 이미다졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 티아졸, 트리아졸, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 아크리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 페나진, 푸린 또는 프테리딘이다. 헤트아릴 라디칼은 헤테로 원자에 의해 또는 환 또는 환 시스템 중의 여러 탄소 원자에 의해 또는 치환기에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있다. 피리딘, 이미다졸, 피리미딘, 푸린, 피라진 또는 퀴놀린이 바람직하다.

상기 R¹, R² 또는 R³ 라디칼의 적절한 치환기는 예를 들어 플루오로, 염소 또는 브롬과 같은 할로겐, 티오, 니트로, 아미노, 히드록시, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐 또는 다른 방항족 또는 다른 포화 또는 불포화 비방향족 환 또는 환 시스템과 같은 하나 이상의 치환기이다. 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸과 같은 C₁-C₆-알킬과 같은 알킬 라디칼, 페닐과 같은 아릴, 염소, 플루오로 또는 브롬과 같은 할로겐, 히드록시 또는 아미노가 바람직하다.

OR⁴ 또는 NR⁴R⁵ 라디칼에서의 R⁴는 수소,치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, C₁-C ₁₀-알킬카르보닐, C₂-C₁₀-알케닐카르보닐, 아릴, 아릴카르보닐, 헤트아릴 또는 헤트아릴카르보닐이다.

언급될 수 있는 알킬 라디칼은 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀- 알킬 사슬로, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸, n-부틸, 1-메틸프로필, 2-메틸프로필, 1,1-디메틸에틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, n-헥실, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 2,3-디메틸부틸, 3,3-디메틸부틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,2,2-트리메틸프로필, 1-에틸-1-메틸프로필, 1-에틸-2-메틸프로필, n-헵틸, n-옥틸, n-노닐 또는 n-데실과 같 은 것이다. 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, i-프로필 또는 i-부틸이 바람직하다.

언급될 수 있는 알케닐 라디칼은 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₂-C₁₀-알케닐 사슬, 예를 들어, 에테닐, 프로페닐, 1-부테닐, 2-부테틸, 3-부테닐, 2-메틸프로페닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-펜테닐, 4-펜테닐, 1-메틸-1-부테닐, 2-메틸-1-부테닐, 3-메틸-1-부테닐, 1-메틸-2-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 1-메틸-3-부테닐, 2-메틸-3-부테닐, 3-메틸-3-부테닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐, 1,2-디메틸-1-프로페닐, 1,2-디메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-프로페닐, 1-에틸-2-프로페닐, 1-헥세닐, 2-헥세닐, 3-헥세닐, 4-헥세닐, 5-헥세닐, 1-메틸-1-펜테닐, 2-메틸-1-펜테닐, 3-메틸-1-펜테닐, 4-메틸-1-펜테닐, 1-메틸-2-펜테닐, 2-메틸-2-펜테닐, 3-메틸-2-펜테닐, 4-메틸-2-펜테닐, 1-메틸-3-펜테닐, 2-메틸-3-펜테닐, 3-메틸-3-펜테닐, 4-메틸-3-펜테닐, 1-메틸-4-펜테닐, 2-메틸-4-펜테닐, 3-메틸-4-펜테닐, 4-메틸-4-펜테닐, 1,1-디메틸-2-부테닐, 1,1-디메틸-3-부테닐, 1,2-디메틸-1-부테닐, 1,2-디메틸-2-부테닐, 1,2-디메틸-3-부테닐, 1,3-디메틸-1-부테닐, 1,3-디메틸-2-부테닐, 1,3-디메틸-3-부테닐, 2,2-디메틸-3-부테닐, 2,3-디메틸-1-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-3-부테닐, 3,3-디메틸-1-부테닐, 3,3-디메틸-2-부테닐, 1-에틸-1-부테닐, 1-에틸-2-부테닐, 1-에틸-3-부테닐, 2-에틸-1-부테닐, 2-에틸-2-부테닐, 2-에틸-3-부테닐, 1,1,2-트리메틸-2-프로페닐, 1-에틸-1-메틸-2-프로페닐, 1-에틸-2-메틸-1-프로페닐, 1-에틸-2-메틸-2-프로페닐, 1-헵테닐, 2-헵테닐, 3-헵테닐, 4-헵테닐, 5-헵테닐, 6-헵테닐, 1-옥테닐, 2-옥테닐, 3-옥테닐, 4-옥테닐, 5-옥테닐, 6-옥테닐, 7-옥테닐, 노네닐 또는 데세닐 같은 것이 있다. 에테닐, 프로페닐, 부테닐 또는 펜테닐이 바람직하다.

언급될 수 있는 알킬카르보닐 라디칼은 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀-알킬카르보닐 사슬로, 예를 들어, 메틸카르보닐, 에틸카르보닐, n-프로필카르보닐, 1-메틸에틸카르보닐, n-부틸카르보닐, 1-메틸프로필카르보닐, 2-메틸프로필카르보닐, 1,1-디메틸에틸카르보닐, n-펜틸카르보닐, 1-메틸부틸카르보닐, 2-메틸부틸카르보닐, 3-메틸부틸카르보닐, 2,2-디메틸프로필카르보닐, 1-에틸프로필카르보닐, n-헥실카르보닐, 1,1-디메틸프로필카르보닐, 1,2-디메틸프로필카르보닐, 1-메틸펜틸카르보닐, 2-메틸펜틸카르보닐, 3-메틸펜틸카르보닐, 4-메틸펜틸카르보닐, 1,1-디메틸부틸카르보닐, 1,2-디메틸부틸카르보닐, 1,3-디메틸부틸카르보닐, 2,2-디메틸부틸카르보닐, 2,3-디메틸부틸카르보닐, 3,3-디메틸부틸카르보닐, 1-에틸부틸카르보닐, 2-에틸부틸카르보닐, 1,1,2-트리메틸프로필카르보닐, 1,2,2-트리메틸프로필카르보닐, 1-에틸-1-메틸프로필카르보닐, 1-에틸-2-메틸프로필카르보닐, n-헵틸카르보닐, n-옥틸카르보닐, n-노닐카르보닐 또는 n-데실카르보닐과 같은 것이 있다. 메틸카르보닐, 에틸카르보닐, n-프로필카르보닐, n-부틸카르보닐, i-프로필카르보닐 또는 i-부틸카르보닐이 바람직하다.

언급될 수 있는 알케닐카르보닐 라디칼은 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₂-C₁₀-알케닐카르보닐 사슬로, 예를 들어, 에테닐카르보닐, 프로페닐카르보닐, 1-부테닐카르보닐, 2-부테닐카르보닐, 3-부테닐카르보닐, 2-메틸프로페닐카르보닐, 1-펜테닐카르보닐, 2-펜테닐카르보닐, 3-펜테닐카르보닐, 4-펜테닐카르보닐, 1-메틸-1-부테닐카르보닐, 2-메틸-1-부테닐카르보닐, 3-메틸-1-부테닐카르보닐, 1-메틸-2-부테닐카르보닐, 2-메틸-2-부테닐카르보닐, 3-메틸-2-부테닐카르보닐, 1-메틸-3-부테닐카르보닐, 2-메틸-3-부테닐카르보닐, 3-메틸-3-부테닐카르보닐, 1,1-디메틸-2-프로페닐카르보닐, 1,2-디메틸-1-프로페닐카르보닐, 1,2-디메틸-2-프로페닐카르보닐, 1-에틸-1-프로페닐카르보닐, 1-에틸-2-프로페닐카르보닐, 1-헥세닐카르보닐, 2-헥세닐카르보닐, 3-헥세닐카르보닐, 4-헥세닐카르보닐, 5-헥세닐카르보닐, 1-메틸-1-펜테닐카르보닐, 2-메틸-1-펜테닐카르보닐, 3-메틸-1-펜테닐카르보닐, 4-메틸-1-펜테닐카르보닐, 1-메틸-2-펜테닐카르보닐, 2-메틸-2-펜테닐카르보닐, 3-메틸-2-펜테닐카르보닐, 4-메틸-2-펜테닐카르보닐, 1-메틸-3-펜테닐카르보닐, 2-메틸-3-펜테닐카르보닐, 3-메틸-3-펜테닐카르보닐, 4-메틸-3-펜테닐카르보닐, 1-메틸-4-펜테닐카르보닐, 2-메틸-4-펜테닐카르보닐, 3-메틸-4-펜테닐카르보닐, 4-메틸-4-펜테닐카르보닐, 1,1-디메틸-2-부테닐카르보닐, 1,1-디메틸-3-부테닐카르보닐, 1,2-디메틸-1-부테닐카르보닐, 1,2-디메틸-2-부테닐카르보닐, 1,2-디메틸-3-부테닐카르보닐, 1,3-디메틸-1-부테닐카르보닐, 1,3-디메틸-2-부테닐카르보닐, 1,3-디메틸-3-부테닐카르보닐, 2,2-디메틸-3-부테닐카르보닐, 2,3-디메틸-1-부테닐카르보닐, 2,3-디메틸-2-부테닐카르보닐, 2,3-디메틸-3-부테닐카르보닐, 3,3-디메틸-1-부테닐카르보닐, 3,3-디메틸-2-부테닐카르보닐, 1-에틸-1-부테닐카르보닐, 1-에틸-2-부테닐카르보닐, 1-에틸-3-부테닐카르보닐, 2-에틸-1-부테닐카르보닐, 2-에틸-2-부테닐카르보닐, 2-에틸-3-부테닐카르보닐, 1,1,2-트리메틸-2-프로페닐카르보닐, 1-에틸-1-메틸-2-프로페닐카르보닐, 1-에틸-2-메틸-1-프로페닐카르보닐, 1-에틸-2-메틸-2-프로페닐카르보닐, 1-헵테닐카르보닐, 2-헵테닐카르보닐, 3-헵테닐카르보닐, 4-헵테닐카르보닐, 5-헵테닐카르보닐, 6-헵테닐카르보닐, 1-옥테닐카르보닐, 2-옥테닐카르보닐, 3-옥테닐카르보닐, 4-옥테닐카르보닐, 5-옥테닐카르보닐, 6-옥테닐카르보닐, 7-옥테닐카르보닐, 노네닐카르보닐 또는 데세닐카르보닐과 같은 것이 있다. 에테닐카르보닐, 프로페닐카르보닐, 부테닐카르보닐 또는 펜테닐카르보닐이 바람직하다.

언급될 수 있는 아릴 라디칼은 환 또는 환 시스템에 6 내지 20개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 아릴 라디칼이다. 환 시스템은 서로 융합된 방향족 환, 또는 알킬, 알킬카르보닐, 알케닐 또는 알케닐카르보닐 사슬, 카르보닐, 산소 또는 질소에 의해 연결된 방향족 환을 포함할 수 있다. 아릴 라디칼은, 적절한 경우, C₁-C₁₀-알킬, C₃-C₈-알케닐, C₃-C₆ 알키닐 또는 C₃-C₈-시클로알킬 사슬에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있다. 페닐 또는 나프틸이 바람직하다.

언급될 수 있는 아릴카르보닐 라디칼은 환 또는 환 시스템에 6 내지 20 개의 탄소 원자를 포함하는 치환 또는 비치환된 아릴카르보닐 라디칼이다. 환 시스템은 서로 융합된 방향족 환, 또는 알킬, 알킬카르보닐, 알케닐 또는 알케닐카르보닐 사슬, 카르보닐, 산소 또는 질소에 의해 연결된 방향족 환을 포함할 수 있다. 페닐카르보닐 또는 나프틸카르보닐이 바람직하다.

언급될 수 있는 헤트아릴은 치환 또는 비치환된, 하나 이상의 N, O 또는 S와 같은 헤테로 원자를 가질 수 있으며, 적절한 경우 C₁-C₁₀-알킬, C₃-C₈-알케닐, 또는 C₃-C₈-시클로알킬 사슬에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있는 하나 이상의 헤테로방향족 3- 내지 7원 환을 가진 치환 또는 비치환 단일 방향족 환 또는 융합된 방향족 환 시스템이다. 이러한 유형의 헤트아릴 라디칼의 예는 피라졸, 이미다졸, 옥사졸, 이소옥사졸 , 티아졸, 트리아졸, 피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 아크리딘, 피리미딘, 피리다진, 피라진, 페나진, 푸린 또는 테리딘이다. 헤트아릴 라디칼은 헤테로 원자에 의해 또는 환 또는 환 시스템 중의 여러 탄소 원자에 의해 또는 치환기에 의해 기본 뼈대에 연결될 수 있다. 헤트아릴카르보닐 라디칼은 카르보닐 라디칼에 의해 기본 뼈대에 연결되는 헤테로방향족 라디칼을 의미한다. 피리딘, 이미다졸, 피리미딘, 퓨린, 피라진 또는 퀴놀린이 바람직하다.

상기 R⁴의 라디칼의 적절한 치환기는 예를 들어 플루오로, 염소 또는 브롬과 같은 할로겐, 티오, 니트로, 아미노, 히드록시, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐 또는 다른 방항족 또는 다른 포화 또는 불포화 비방향족 환 또는 환 시스템이 있다. 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸과 같은 C₁-C₆-알킬과 같은 알킬 라디칼, 염소, 플루오로 또는 브롬과 같은 할로겐, 히드록시 또는 아미노가 바람직하다.

R⁴ 라디칼은 바람직하게는 수소이다.

NR⁴R⁵ 라디칼에서의 R⁵는 수소, 치환 또는 비치환된, 분지쇄 또는 비분지쇄인C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 아릴, 또는 헤트아릴로 여기서, 알킬, 알케닐, 아릴 및 헤트아릴 라디칼은 앞서 언급한 의미를 지닌다. 수소 또는 메틸, 에틸, 또는 프로필과 같은 C₁-C₁₀-알킬이 바람직하다.

상기 R⁵의 라디칼의 적절한 치환기는 예를 들어 플루오로, 염소 또는 브롬과 같은 할로겐, 티오, 니트로, 아미노, 히드록시, 알킬, 알콕시, 알케닐, 알케닐옥시, 알키닐 또는 다른 방항족 또는 다른 포화 또는 불포화 비방향족 환 또는 환 시스템과 같은 하나 이상의 치환기이다. 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸과 같은 C₁-C₆-알킬과 같은 알킬 라디칼, 페닐과 같은 아릴, 염소, 플루오로 또는 브롬과 같은 할로겐, 히드록시 또는 아미노가 바람직하다.

게다가, 두 개의 인접한 R⁴또는 R⁵ 치환기가 함께 O, N 또는 S와 같은 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5 내지 6개의 환 원자를 가진 별개의 치환 또 는 비치환된 방향족, 포화 또는 부분적으로 포화 환을 형성하는 것이 가능한다.

화학식 I 및 II에서의 R¹, R², 또는 R³ 치환기 중 하나가 페닐과 같은 아릴인 것이 유리하다. 식 I 및 II에서의 R¹, R², 또는 R³ 치환기 중 하나가 히드록실이고 하나가 수소 또는 메틸인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 방법은 4 내지 11, 바람직하게는 4 내지 9의 pH에서 수행되는 것이 유리하다.

본 발명의 방법에서, 0.01 내지 10 중량%의 니트릴 또는 0.01 내지 10 중량% 의 상응하는 알데히드 또는 케톤 및 0.01 내지 10 중량%의 시안화수소산을 사용하는 것이 더욱 유리하다. 이 방법은 과량의 시안화수소산을 사용하여 수행하는 것이 유리하다. 이러한 이유로, 몇몇 경우에서는 언급된 것보다 높은 함량의 시안화수소산을 사용하게 된다. 니트릴에 따라, 다양한 양의 니트릴이 반응에 사용될 수 있다. 상응하는 알데히드와 시안화수소산 평형상태를 이루는 니트릴(시아노히드린)의 경우에는 가장 적은 양의 (약 0.01 내지 5 중량%의 양)니트릴을 사용하는 것이 유리하다. 알데히드가 일반적으로 미생물 또는 효소에 유해하기 때문이다. 마찬가지로 휘발성 니트릴은 0.01 내지 5중량 % 양으로 사용하는 것이 유리하다. 많은 양의 시아노히드린 또는 니트릴을 사용하면 반응이 지연된다. 극히 낮거나 또는 실질적으로 없는 니트릴 또는 수성 매질에 극히 매우 적은 양만이 용해되는 니트릴의 경우, 상기에서 언급된 것보다 많은 양을 사용하는 것이 가능하고 유리하 다. 전환과 수율을 증가시키기 위해서, 라세미 니트릴 첨가를 조절하면서 반응을 수행하는것이 유리하다. 생성물은 반응 종결 후에 분리하거나 측관에서 연속적으로 제거할 수 있다.

상기 언급된 적절한 알데히드 또는 케톤은 알데히드 또는 케톤과 시안화수소산의 필요한 경우 산 촉매 작용에 의해 반응한 후에 니트릴을 형성하는 화합물을 의미한다. 알데히드와 시안화수소산 사이의 반응은 알데히드 및 시안화수소산과 평형을 이룬다는 장점을 가진 시아노히드린을 생성한다. 시아노히드린과 평형을 이룬다는 것은 라세미 니트릴이 계속해서 공급되기 때문에 니트릴의 오직 하나의 거울상 이성질체만을 전환시키는 효소에 의해 이론치의 100% 수율을 얻는 것이 가능하다는 것을 의미한다. 다른 모든 니트릴의 경우에는, 효소에 의해 전환되지 않은 니트릴을 이론적 수율 100%에 도달하기 위해 화학 반응에 의해 라세미화하여 공정으로 되돌려 보내거나, 또는 폐기하거나 또는 정제해서 입체중심을 보유한 채로 화학적으로 가수분해하는 것이 유리하다.

본 발명에 의한 방법은 0℃ 내지 80℃, 바람직하게는 10℃ 내지 60℃, 특히 바람직하게는 15℃ 내지 50℃의 온도에서 유리하게 수행된다.

본 발명에 의한 방법에서 라세미 니트릴은 두 개의 거울상 이성질체의 50:50 혼합물로 구성되거나 또는 혼합물 중의 두 거울상 이성질체 중 하나의 함량이 더 높은 다른 어떠한 혼합물로 구성된 니트릴을 의미한다.

본 발명에 의한 방법 중의 키랄 카르복실산은 거울상 이성질체 농후를 보이는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 바람직하게는, 90%ee 이상, 바람직하게는 95%ee 이상, 특히 바람직하게는 98%ee 이상, 가장 특히 바람직하게는 99%ee이상의 거울상 이성질체 순도를 가져온다.

본 발명에 의한 방법에 의해 많은 라세미 니트릴을 키랄 카르복실산으로 전환시키는 것이 가능하다. 본 발명의 방법에서는 25 mmol 이상의 니트릴/h x 단백질 mg 또는 25 mmol 이상의 니트릴/h x 미생물 건조 중량 g, 바람직하게는 30 mmol 이상의 니트릴/h x 단백질mg 또는 30 mmol 이상의 니트릴/h x 미생물 건조 중량 g, 특히 바람직하게는 40 mmol 이상의 니트릴/h x 단백질 mg 또는 40 mmol이상의 니트릴/h x 미생물의 건조 중량 g, 매우 특히 바람직하게는 50 mmol 이상의 니트릴/h x 단백질 mg 또는 50 mmol 이상의 니트릴/h x 미생물 건조 중량 g을 전환하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 방법을 위해 본 발명에 따른 핵산, 핵산 구성체 또는 벡터를 포함하는 성장 세포를 사용하는 것이 가능하다. 발육 정지 또는 파쇄 세포도 또한 사용될 수 있다. 파쇄 세포는, 예를 들어, 처리, 예를 들어 용매에 의해 투과성을 가지게 된 세포, 또는 효소 처리, 기계적 처리(예를 들어 프렌치 프레스 또는 초음파) 또는 다른 어떠한 방법을 사용하여 분해된 세포를 의미한다. 이 같은 방식으로 얻어진 조추출물은 본 발명에 따른 방법에 적합하고 유익하다. 정제되거나 부분적으로 정제된 효소 또한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 고정화된 미생물 또는 효소가 유사하게 적합하고 반응에서 편리하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 제조된 키랄 카르복실산은 추출 또는 결정화에 의해 또는 추출 및 결정화에 의해 수성 반응 용액으로부터 편리하게 단리될 수 있다. 이 같은 목적을 위해, 수성 반응 용액은 무기산(예를 들어 HCl 또는 H₂SO₄) 또는 유기산과 같은 산에 의해 유익하게 pH 2이하로 산성화시킨 후에 유기 용매로 추출한다. 추출은 수율을 증가시키기 위해 수차례 반복될 수 있다. 주로 사용될 수 있는 유기 용매는, 필요한 경우에는 염 첨가 후에 물과 상 경계를 보이는 모든 용매이다. 유리한 용매는 톨루엔, 벤젠, 헥산, 메틸 3차 부틸 에테르 또는 에틸 아세테이트와 같은 용매이다.

유기 상을 농축한 후에, 생성물을 우수한 화학 순도 (90%를 넘는 화학 순도를 의미함)로 통상 단리할 수 있다. 추출 후에, 생성물을 포함하는 유기상을, 극히 부분적으로 농축시킬 수 있으며, 생성물을 결정화시킬 수 있다. 이 같은 목적을 위해, 용액을 0℃ 내지 10℃의 온도로 냉각시키는 것이 유리하다. 결정화는 또한 유기 용액으로부터 직접 일어날 수 있다. 결정화를 반복하기 위해 결정화된 생성물을 동일하거나 상이한 용매에 재차 용해하여 다시 한 번 결정화시킬 수 있다. 후속 결정화는 적어도 한 번의, 공정 조성물의 상태에 따라 생성물의 거울상 이성질체 순도를 더욱 증가시킬 수 있다.

그러나, 키랄 카르복실산은 산에 의해 유익하게는 pH 2이하로 산성화시킨 후 즉시 수성 반응 용액으로부터 또한 결정화시킬 수 있다. 이는 유익하게는 수용액을 가열에 의해 그 부피가 10 내지 90%, 바람직하게는 20 내지 80%, 특히 바람직하게는 30 내지 70% 정도로 감소되도록 농축시키는 것을 필요로 한다. 결정화는 바람직하게는 냉각에 의해 행해진다. 0℃ 내지 10℃ 온도가 결정화에 있어 바람직하 다. 수성 용액으로부터의 직접적인 결정화가 비용면에서 바람직하다. 유사하게, 추출 및 필요한 경우 후속 결정화에 의해 키랄 카르복실산을 워크업(work-up)하는 것이 바람직하다.

이러한 바람직한 유형의 워크업으로, 본 발명에 따른 방법의 생성물은 반응에 사용된 니트릴에 기초하여, 60 내지 100%, 바람직하게는 80 내지 100%, 특히 바람직하게는 90 내지 100%의 수율로 단리될 수 있다. 단리된 생성물은 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 특히 바람직하게는 98% 초과의 높은 화학 순도를 가진다. 아울러, 생성물은 높은 거울상 이성질체 순도를 가지며 이는 결정화에 의대 더욱 증가될 수 있다.

이 같은 방식으로 얻어진 생성물은 약품 또는 농약을 제조하는 유기 합성을 위한 또는 라세미체 분할을 위한 출발 물질로 적합하다.

본 발명은 또한

a) 서열 확인 번호 1에 개시된 서열을 가진 핵산 서열,

b) 유전자 암호의 중첩에 의한 결과 서열 확인 번호 1에 개시된 핵산 서열로부터 유도된 핵산 서열,

c) 서열 확인 번호 2에 기술된 개시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하며, 아미노산 수준에서 95% 이상의 상동성을 가지고, 폴리펩타이드의 효소 작용의 감소가 미약한, 서열 확인 번호 1에 개시된 핵산 서열의 유도체

로 이루어지는 군으로부터 선택된 니트릴라제 활성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는, 단리된 핵산 서열에 관한 것이다.

본 발명에 따른 서열 확인 번호 1의 핵산 서열의 상동체는 예를 들어, 유도된 아미노산 수준에서 전체 서열 범위에 걸쳐 95% 이상의 상동성, 바람직하게는 97% 이상의 상동성, 매우 특히 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 가진 대립 유전자 변이체를 의미한다. 서열의 일부를 형성하는 부위에 걸쳐 상동성이 더 높을 것이 가능하고 또한 유리하다. 서열 확인 번호 1에서 유래한 아미노산 서열을 서열 확인 번호 2에서 볼 수 있다. 대립 유전자 변이체는 특히, 서열 확인 번호 1에 개시된 서열로부터 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 얻어질 수 있는 기능적인 변이체를 포함하고 얻어진 생물체 안으로 하나 이상의 유전자를 도입하기 위해 유도된 합성 단백질의 효소 활성의 감소가 미약한 정도만이 있어야 한다. 따라서 본 발명은 또한 상기에서 언급된 핵산 서열의 군에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명은 유익하게도 서열 확인 번호 1에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

서열 확인 번호 1의 상동체는 또한 예를 들어 진균 또는 세균 상동체, 절단된 서열, 단일 가닥 DNA 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열의 RNA를 의미한다. 서열 확인 번호 1의 상동체는 DNA 수준에서 서열 확인 번호 1에 나타난 전체 DNA 부위에 걸쳐 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 특히 바람직하게는 80% 이상, 매우 특히 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가진다.

서열 확인 번호 1의 상동체는 또한 추가적으로 예를 들어, 프로모터 변이체와 같은 유도체를 의미한다. 언급된 핵산 서열에 선행하는 프로모터는 하나 이상 의 뉴클레오타이드 교환에 의해, 삽입(들) 및(또는) 결실(들)에 의해 프로모터의 기능성 또는 효율성에 해로운 영향을 주지 않으면서 변형될 수 있다. 프로모터는 더욱이 그 서열을 변형시킴으로 인해 그 효율성을 증가시키거나 또는 심지어 상이한 종의 생물체로부터 보다 효율적인 프로모터에 의해 완전히 대체될 수 있다.

유도체는 유전자 발현 및(또는) 단백질 발현이 바뀌는, 바람직하게는 증가되는 방식으로 개시 코돈 앞의 -1 내지 -200, 또는 개시 코돈 뒤의 0 내지 1000 염기쌍 부위에서 뉴클레오타이드 서열이 변형된 변이체를 또한 의미한다.

서열 확인 번호 1 또는 이의 상동체는 숙련된 기술자에게 알려진 방법에 의해 세균, 바람직하게는 그램 음성균, 특히 바람직하게는 알카리제네스 속, 매우 특히 바람직하게는 알칼리제네스 페칼리스 속 및 종의 세균으로부터 유효하게 분리될 수 있다.

서열 확인 번호 1 또는 이의 상동체 또는 이들 서열의 일부는 예를 들어 전통적인 혼성화 방법 또는 PCR 기술을 사용하여 다른 진균류 또는 세균으로부터 분리될 수 있다. 이들 DNA 서열은 표준 조건하에서 본 발명에 따른 서열과 혼성화한다. 혼성화는 바람직하게는 보존 부위의 짧은 올리고뉴클레오타이드에 의해, 예를 들어 활성 중심으로부터 수행되고 이는 숙련된 기술자에게 알려진 방법으로 다른 니트릴라제 또는 니트릴라제 가수분해 효소와의 비교에 의해 확인할 수 있다. 그러나, 혼성화를 위해 본 발명에 따른 핵산의 긴 절편 또는 전 서열을 사용하는 것이 또한 가능하다. 이들 표준 조건은 사용되는 핵산 올리고뉴클레오타이드, 긴 절편 또는 전 서열에 따라 변화하고 또는 혼성화를 위해 사용된 핵산, DNA 또는 RNA 의 종류에 따라 변화한다. 따라서, 예를 들어, DNA:DNA 혼성체의 융점은 같은 길이의 DNA:RNA 혼성체의 융점보다 약 10℃ 낮다.

표준 조건은 예를 들어, 핵산에 따라, 0.1 내지 5 x SSC(1x SSC=0.15M NaCl. 15mM 시트르산 나트륨, pH 7.2)의 농도의 수성 완충 용액에서 42 내지 58℃의 온도 또는, 추가적으로 50% 포름아미드 존재 하의, 예를 들어, 5x SSC, 50% 포름아미드 중의 42℃를 의미한다. DNA:DNA 혼성체를 위한 혼성화 조건은 유리하게는 0.1x SSC 및 약 20 ℃ 내지 45℃, 바람직하게는 약 30 ℃ 내지 45℃ 온도를 포함한다. DNA:RNA 혼성체를 위한 혼성화 조건은 바람직하게는 0.1x SSC 및 약 30 ℃ 내지 55℃, 바람직하게는 약 45 ℃ 내지 55℃ 온도를 포함한다. 이들 혼성화를 위해 지정된 온도는 포름아미드 부재 중의 약 100 뉴클레오타이드의 길이와 50% G+C 함량의 핵산의 예에 의해 계산된 융점이다. DNA 혼성화를 위한 실험 조건은 유전학 관련 교과서, 예를 들어 샘브룩 (Sambrook)등의 문헌("Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)에 서술되어 있으며, 숙련된 기술자에게 알려진 식에 의해, 예를 들어 핵산의 길이, 혼성체의 성질 또는 G+C 함량에 따라 계산될 수 있다. 숙련된 기술자는 하기 교과서에서 혼성화에 대한 추가 정보를 찾을 수 있다: 아수벨(Ausubel)등의 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1985,New York); 햄스(Hames) 및 히긴스(Higgins)등의 문헌( Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,1985, Oxford); 브라운(Brown)등의 문헌(Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1991, Oxford).

본 발명에 따른 핵산 구성체는 유전자 발현을 증가시키는 하나 이상의 조절 신호에 기능적으로 유리하게 연결된 서열 확인 번호 1 및 그의 상동체의 니트릴라제 유전자를 의미한다. 이들 조절 서열은 예를 들어 유도물질 또는 억제물질이 결합하여서 핵산의 발현을 조절하는 서열이다. 이들 신규한 조절 서열과 아울러, 이들 서열의 본래의 조절이 실제 구조 유전자 앞에 존재하고 또한 필요한 경우 본래의 조절이 닫히고 유전자의 발현이 증가되도록 유전적으로 변형되는 것이 가능하다. 그러나, 핵산 구성체는 또한 더욱 간단한 구조를 가질 수 있으며 다시 말해 서열 확인 번호 1 또는 그 상동체의 앞에 추가의 조절 서열이 삽입되지 않았으며, 조절을 받는 본래의 프로모터가 결실되지 않았다는 것이다. 대신에, 본래의 조절 서열은 조절이 더 이상 일어나지 않고, 유전자 발현이 증가되는 방식으로 돌연변이된다. 핵산 구성체는 유리하게는 핵산 서열의 발현을 가능케 하며, 프로모터에 기능적으로 연결된하나 이상의 증진자(enhancer) 서열을 포함한다. 또한 DNA 서열의 3' 끝에 다른 조절 성분이나 종결자와 같은 유익한 추가적인 서열을 삽입하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 핵산은 구성체 중에 하나 이상의 카피로 존재할 것이다. 구성체는 또한 필요한 경우 구성체의 선별을 위한 항생제 내성 또는 영양요구성-보완 유전자와 같은 그 밖의 마커(marker)를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 위한 유익한 조절 서열은 예를 들어, 그램음성균에서 유익하게 사용되는 cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacI^q, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-P_R또는 λ-P_L 프로모터와 같은 프로모터에 존재한다. 그 밖의 유익한 서열은 예를 들어 그램 양성 프로모터 amy 및 SPO2에 또는 진균 또는 효모 프로모터 ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH에 있다. 아울러, 예를 들어 한세뉼라(Hansenula)의 피루브산염 카르복실기 분해 효소의 프로모터 및 메탄올 산화 효소의 프로모터가 이와 관련해서 유리하다. 또한 조절을 위해 인공 프로모터를 사용하는 것도 가능하다.

핵산 구성체는 숙주에서 유전자의 최적의 발현을 가능케 하는, 숙주 생물체에서의 발현을 위한 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 다른 DNA에 삽입시키는 것이 유리하다. 이러한 벡터는 본 발명의 추가 발견이다. 적합한 플라스미드의 예는 이콜라이(E.coli)에서는 pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 또는 pBdCI, 스트렙토마이세스(Streptomyces)에서는 pIJ101, pIJ364, pIJ702 또는 pIJ361, 바실러스에서는 pUB110, pC194 또는 pBD214, 코리네박테륨에서는 pSA77 또는 pAJ 667, 진균에서는 pALS1, pIL2 또는 pBB116, 효모에서는 2μM, pAG-1,YEp6, YEp13 또는 pEMBLYe23 또는 식물에서는 pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 또는 pDH51이다. 상기 플라스미드는 가능한 플라스미드 중에서 일부만 선택하여 나타낸 것이다. 그 밖의 플라스미드가 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있으며 예를 들어, 클로닝 벡터(Cloning Vectors)(파우엘 P.H. ,등 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)책에서 찾아 낼 수 있다.

핵산 구성체는 또한 존재하는 다른 유전자의 발현을 위해서, 선별된 숙주 생물체 및 유전자 또는 유전자들에 따라 최적의 발현을 위해 선택된, 발현을 증가시키는 3' 및(또는) 5' 말단 조절 서열을 추가로 포함하는 것이 유리하다.

이들 조절 서열은 유전자 및 단백질의 특이적인 발현을 가능케하도록 의도되었다. 이는 예를 들어 숙주 생물체에 따라, 유도 후에만 유전자가 발현되거나 과발현되는 것 또는 즉시 발현되고(또는) 과발현되는 것을 의미한다.

조절 서열 또는 인자는 더욱이 바람직하게는 긍정적으로 영향을 줄 것이고, 따라서 도입된 유전자의 발현을 증가시킬 것이다. 따라서, 조절 성분의 증대는 프로모터 및(또는) 증진자과 같은 강한 전사 신호를 사용하여 전사 수준에서 유리하게 일어날 수 있다. 그러나, 예를 들어 mRNA의 안정성을 증가시킴으로써 추가적으로 번역을 증강시키는 것이 또한 가능하다.

벡터의 다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 핵산 구성체 또는 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터는 또한 유리하게 선형 DNA 형태로 미생물에 도입될 수 있고 이형 또는 동형 재조합에 의해 숙주 생물체의 게놈 안으로 삽입될 수 있다. 이 선형 DNA는 플라스미드와 같은 선형화된 벡터로, 또는 핵산 구성체만으로, 또는 핵산으로 구성될 수 있다.

생물체에서의 이형 유전자의 최적의 발현을 위해서, 그 생물체에서 특이하게 사용되는 코돈 사용에 일치하도록 핵산 서열을 변형하는 것이 유익하다. 코돈 사용은 관련된 생물체에서의 다른 알려진 유전자의 컴퓨터 분석에 기초하여 용이하게 정해질 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 또는 핵산 구성체를 위한 적합한 숙주 생물체는 주로 모든 원핵 또는 진핵 생물체이다. 유익하게 사용되는 숙주 생물체는 세균, 진균 또는 효모와 같은 미생물이다. 그램 양성균 또는 그램 음성균, 바람직하게는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 또는 노르카디아세(Norcardiaceae) 군의 세균, 특히 바람직하게는 에쉐리키아(Escherichia), 슈도모나스 또는 로도코쿠스 속의 세균을 사용할 수 있다. 에쉐리키아 콜라이 속 또는 종이 매우 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 숙주 생물체는 더욱이 바람직하게는 합성된 폴리펩타이드의 접힘을 위한 최소한 하나의 단백질성 물질 및 특히 본 발명에서 기술된 니트릴라제 활성을 가진 핵산 서열 및(또는) 이 물질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 물질의 존재량은 고려된 미생물에서의 기본 양에 상응하는 것보다 많다. 상기 물질을 코딩하는 유전자는 염색체 중 또는 예를 들어 플라스미드와 같은 염색체외 성분으로 존재한다.

실시예 1: 알칼리제네스 페칼리스(Alcaligenes faecalis))1650으로부터 니트릴라제의 정제.

1. 세포의 생산

알칼리제네스 페칼리스 1650을 8 시간 동안 30℃에서 배지 A에서 교반하면서 배양하였다.

배지 A

효모 추출물 5 g/l

펩톤 3.5 g/l

CH₃CO₂NH₄ 5 g/l

KH₂PO₄ 5 g/l

MgSO₄ 0.2 g/l

FeSO₄ 0.03 g/l

NaCl 1 g/l

부티로니트릴 1 g/l

200㎖의 상기 예비 배양물을 8ℓ의 신선한 배지 A를 포함한 10ℓ발효기를 접종하는 데 사용하였다. pH, 온도, 공기 유속 및 교반 속도는 각각 7.2, 30℃, 300 ℓ/h 및 300 rpm이었다. 22 시간 후에 81g의 습윤 생체량을 얻었다. 이는 3.8 g/l의 세포의 건조 중량 및 600nm에서의 광학 밀도 8에 해당한다.

2. 만델로니트릴에 대한 효소 활성의 결정

실시예1에서 기술된 대로 세포를 얻었으며 pH 7.2의 10mM Na/K 인산염 완충 용액에서 두 차례 세척하였다. 건조 중량 40mg의 세포를 pH 6.8의 10mM Na/K 인산염 완충 용액 20㎖ 중에 재현탁하였으며, 8.3mM 만델로니트릴을 첨가하여 반응을 개시하였다. 교반하면서 40℃에서 반응을 수행하였다. 샘플을 채취하고 이어서 고성능 액체 크로마토그래피(ODS Hypersil)를 이용하여 세포를 제거한 후 라세미체 분할의 동력학적 관찰을 하였다. 이 경우, 만델로니트릴, 벤즈알데히드, 만델아미드 및 만델산이 측정되었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다[만델로니트릴의 만델산으로의 전환, 1회분]. 만델산의 생성 속도는 30%의 전환으로 41.3 U/g (세포의 건조 중량)으로, 여기서 1U 는 40℃에서 분 당 1μmol의 만델산의 생성으로 정의된다.

3. 만델로니트릴에 대한 효소 선택성의 결정

실시예1 에서 기술된 대로 세포를 얻었으며, pH 7.2의 10mM Na/K 인산염 완충 용액에서 두 차례 세척하였다. 건조 중량 40mg의 세포를 pH 6.8의 10mM Na/K 인산염염 완충 용액 20㎖ 중에 재현탁하였으며, 8.3mM 만델로니트릴을 첨가하여 반응을 개시하였다. 교반하면서 30℃에서 반응을 수행하였다. 샘플을 채취하고 이어서 고성능 액체 크로마토그래피(Nucleodex β-PM)를 이용하여 세포를 제거한 후 동력학적 관찰을 하였다. S-(+)- 및 R-(-)- 만델산이 이 사례에서 측정되었다. 생성된 R-(-)- 만델산의 광학적 순도(ee_R-MA)는 50% 전환에서 98%이었다. 효소의 선택성(=E)는 50% 전환에서 499이었다.

4. 정제

달리 언급되지 않으면, 10mM DTT는 정제 중의 모든 완충 용액에 존재하였다.

단계 1: 세포 파쇄

실시예 1에서 기술된 대로 각각의 경우에 2 개의 10ℓ 발효조로부터 세포를 얻었으며, 회전시켜 가라앉혔고 pH 7.2의 0.1 M Tris/HCl 완충용액 1ℓ로 두 번 세척하였다. 수득량은 세포의 습윤 중량으로 약 162g이었다. 각 경우에 습윤 중량 81g의 세포를 pH 7.2의 0.1 M Tris/HCl 완충 용액 160㎖에 재현탁하였고, 멘톤-가울린(Menton-Gaulin) 에서 750 바아(bar)하에서 4차례 파쇄하였다. 그 다음 균질액을 39 분 동안 30,000g에서 원심분리하였고, 펠릿을 버렸다. 상징액 (140㎖)은 표 1에 나타난 바와 같이, 73%의 잔여 활성을 가졌다.

단계 2: 이온 교환 크로마토그래피

상징액을 완충 용액 A(20 mM Tris/ HCl, pH 8.5)으로 400㎖로 희석하였으며, 23,000g에서 20 분 동안 다시 한 번 원심분리하였다. 그 다음 350㎖를 완충 용액 A중의 Q-세파로즈(Q-Sepharose) 컬럼(직경 5㎝, 높이 22㎝, 부피 432㎖, 파마시아(Pharmacia) 사의 Q-세파로즈 고속 유동(Q-Sepharose Fast Flow))에 적재하였다. 초기에는 10% 완충용액 B(1M NaCl을 가진 완충 용액 A)를 이용하여 유속 20㎖/min에서 세척하였다(총 적재 및 세척 부피가 1.5ℓ에 해당). 90 분에 걸쳐 그 비율을 60% 완충용액 B까지 선형적으로 증가시켰다. 그 다음 100% 완충 용액 B를 사용하여 91 내지 120 분 동안 세척하였다. 40 ㎖ 분획물 100개를 수집하였다. 분획물 50 내지 60 사이에서 니트릴라제가 용출되었다. 분획물를 합하고 10 kDa 막(아미콘(Amicon))을 통한 한외여과에 의해 10㎖ 부피까지 농축하였다.

단계 3: 분자체 크로마토그래피

이온 교환 크로마토그래피로부터의 농축액(단계 2)을 각각 5ml씩 두 부분으로 나누어 분자체 크로마토그래피 (Superdex 200 prep. grade, Pharmacia, 분리 범위 10 내지 600 kDa, 직경 2.6 ㎝, 높이 60㎝, 부피 325㎖)에 의해 더 정제하였다. 검출는 280nm에서 수행하였다. 컬럼을 20mM 인산염염 완충 용액(pH 7.4, 5mM DTT 및 150mM NaCl 함유)중에서 평형화하였으며 유속 1.5㎖/min에서 작동시켰다. 40 분획물을 수집하였다. 니트릴 가수분해 활성은 분획물 3 내지 5에서 발견되었다.

단계 4: 이온 교환 크로마토그래피

분자체 크로마토그래피로부터 얻어서 합한 분획물(단계 3)을 모노(Mono) Q 컬럼(컬럼 부피 1㎖, Mono Q HR515, Pharmacia) 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 사용된 완충 용액 A는 20mM Tris/HCl(pH 8.5, 5mM DTT 함유)이며 완충 용액 B는 1M NaCl을 가진 완충 용액 A와 같다. 유속은 1㎖/min이었다. 분자체 크로마토그래피로부터의 활성 분획물(약 100 ㎖)을 약 6mS/㎝의 전도율로 희석하였고 모노 Q 컬럼에 직접 적재하였으며, 이렇게 단백질을 흡수시켰다. 적재 후에 컬럼을 5% 완충 용액 B로 세척하였다. 컬럼은 완충 용액 B에서 5% 에서 40%까지의 농도 구배로 30 분 동안 용출하였으며, 이어서 100% 완충용액 B로 10 분 동안 용출하였다. 농도 구배 17 및 18 분획물에서 니트릴라제가 용출되었다.

정제 단계 1-4를 표I에 나타내었다.

샘플	부피 [㎖]	활성 [U/ℓ]	총 활성 [mU]	수득량 [%]	단백질 [mg/㎖	총 단백질 [mg]	특이활성 [U/g]
파쇄 전	160	480	76,800	100	-	-	-
파쇄 후	140	400	56,000	72.9	-	-	-
Q-세파로즈
적재된 것	140	192	26,880	35	12.4	1736	15
AF	400	77	30,800	40.1	0.26	104	296
슈퍼덱스 200
적재된 것	9.5	>378	>3591	4.7	2.41	22.90	>157
AF	43	59	2537	3.3	0.21	9.03	281
모노 Q
적재된 것	100	4.8	480	0.6	0.06	6.33	76
AF	4	>77	308	0.4	0.19	0.76	>405

분자체 크로마토그래피 (단계 3) 및 모노 Q 상의 이온 교환 크로마토그래피(단계 4)의 활성 분획물 (=AF, 표 1)는 도 2에 나타난 것과 같이 SDS-PAGE에 의해 분별화하였다.

단계 5: 역상 (RP) 고성능 액체 크로마토그래피

역상 크로마토그래피에 의해 모노 Q 크로마토그래피 (단계 4)의 활성 분획물 (분획물 17 및 18)의 균질성을 확인하였고 트립신 절단을 준비하기 위해 힌층 더 정제하였다. 분리는 휴렛 패커드(Hewlett-Packard) 기구(HP 1090)로 아비메드(Abimed) 컬럼 (3㎝)으로 수행하였다. 사용된 이동상은 완충 용액 A : 0.1% TFA을 포함한 물 및 완충 용액 B : 0.1% TFA을 포함한 아세토니트릴이었다. 주입된 부피는 0.1㎖, 유속은 0.5 ㎖/min이었다. 용출 농도 구배는 하기의 프로파일을 가졌다.:

분	% 완충용액 A	% 완충용액 B
0	80	20
2	80	20
22	30	70
22.1	0	100
24	0	100
25	100	0
30	100	0

니트릴라제는 12 및 13분 사이에서 용출되었다. 이는 SDS-PAGE 중에서 37kDa 밴드에 해당한다. 이 밴드를 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystems) 494 정밀 단백질 서열 분석기를 사용하여 부분적으로 서열 분석하였다. 이 같은 방식으로 얻어진 39 아미노산의 N-말단 서열은 하기에 서열 확인 번호 3으로 나타내었다. 이 서열은 첨부된 서열 목록에 포함되었으며 다음과 같다.

서열 확인 번호 3:

Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly

트립틱 펩타이드의 제조

모노 Q 크로마토그래피로부터의 샘플 (단계 4)은 다음과 같이 전처리하였다: 단백질 (약 0.6mg)을 12.5% TCA으로 침전시켰으며 펠릿을 1㎖의 에테르/에탄올(1:1) 로 3차례 세척하였다. 펠릿을 0.2㎖의 6M 구아니딘 HCl, 25mM 트리스/HCl, pH 8.5에 용해시켰다. 상기 용액에 2.6㎕의 1 M DTT 용액을 첨가하여 이아황산염 브리지(bridge)를 감소시켰다. 어두운 곳에서 1시간 동안 샘플을 교반하였다. 그 다음 단백질을 어두운 곳에서 2 시간 동안 1.5㎕의 4-비닐피리딘 용액(35%)과 반응시켰다. 1 시간 동안 2.6㎕의 1 M DTT 용액과 배양하여 반응을 종결시켰다. 비닐피리딘화(vinylpyrrilidated)된 효소를 상기 언급된 대로 RP-HPLC에 의해 정제하였다. 체류 시간은 10 내지11 분이였다. 그 분자량에 의해 확인된 활성 분획물를 수집하였으며 0.02㎖로 농축하였다. 이는 0.01㎖의 아세토니트릴 및 0.1 M Tris/HcL, pH 8.5을 첨가하여서 0.2㎖로 조정하였다. 또한 약 0.05㎖의 0.1M NaOH을 첨가하여서 pH를 보정하였다. 샘플 (추정된 단백질 양 0.3mg)을 0.1 M Tris/HCl, pH 8.5, 5% 아세토니트릴 중의 1mg/ml 트립신 용액 0.032 ml와 혼합하였으며, 37℃에서 밤새 배양하였다. 소화작용을 0.01㎖의 아세트산으로 종결시키고나서 원심분리하였다. 상징액은 C18 (용출계: 완충 용액 A: 물, 0.1% TFA, 완충 용액 B: 아세토니트릴, 0.1% TFA) 상에서 RP-HPLC에 의해 분리하였다. 펩타이드 (205nm 및 280 nm에서 검출)를 수집하였으며 서열 분석하였다. 어플라이드 바이오시스템 494 정밀 단백질 서열분석기를 사용하였다. 21개의 아미노산을 갖는 내부 펩타이드 서열을 하기에 서열 확인 번호 4로 나타내었으며, 11 개의 아미노산을 갖는 내부 펩타이드 서열을 서열 확인 번호 5로 나타내었다. 서열 확인 번호 4 및 5는 첨부된 서열 목록에 포합되었으며 다음과 같다.

서열 확인 번호 4:

Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln

서열 확인 번호 5:

Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys

6. 만델로니트릴에 대한 정제된 니트릴라제의 활성

만델로니트릴에 대한 정제된 니트릴라제의 활성은 실시예 2에서 기술된 대로 조사되었다. 만델로니트릴에 대한 정제된 단백질의 특이 활성은 12,380 U/ 단백질 g이었다.

실시예 2: 알칼리제네스 페칼리스 1650으로부터 니트릴라제의 클로닝

뉴클레오타이드 프로브는 실시예 1에서 기술된 펩타이드 서열인 서열 확인 번호 3 및 4로부터 유래하였으며 합성하였다. 서열 확인 번호 3, N-말단 펩타이드 서열에서 유래한 뉴클레오타이드 프로브는 64 배 중첩된 23 mer이다 (뉴클레오타이드 프로브의 서열 중에서 A, C, G 또는 T가 N으로 치환됨 ; A 또는 G가 R로 치환됨 ; C 또는 G가 S로 치환됨). 문헌(와다(Wada) 등, 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111-2118)에 기술된 알칼리제네스 균주에서의 높은 GC 분율은 글루타민 및 이소루신의 경우 코돈의 세번째 위치의 선택이 미리 결정되어 있다는 것을 의미한다. 하기에서 서열 확인 번호 6으로 나타낸 뉴클레오타이드 프로브는 이후의 PCR을 위한 5' 프라이머로, 여기서 S=C 또는 G 이고 N=A, C, G 또는 T이며 다음과 같은 서열이다.

서열 확인 번호 6:

5'-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3'

내부 펩타이드 서열인 서열 확인 번호 4로부터 뉴클레오타이드 프로브로서 256 배 중첩된 20 mer가 유도되었다 (뉴클레오타이드 염기의 서열 중에서, A, C, G 또는 T가 N으로 치환됨 ; A 또는 G가 R로 치환됨 ; C 또는 G가 S로 치환됨). 알칼리제네스 균주에서의 높은 GC 분율은 라이신의 경우 코돈의 세번째 위치의 선택이 미리 결정되어 있다는 것을 의미한다. 하기에서 서열 확인 번호 7로 나타낸 뉴클레오타이드 프로브는 이후의 PCR을 위한 3'프라이머이다.

서열 확인 번호 7:

5'-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3'

서열 확인 번호 6 및 7의 한쌍의 프라이머는 알칼리제네스 페칼리스 1650으로부터의 염색체 DNA 상에서 PCR을 수행하는데 사용하였다. 숙련된 기술자에게 알려진 전통적인 방법 (아수벨, F. M. 등 (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons)에 의해 분해 효소 및 프로티네이즈 K에 의한 세포 용해 후에 염색체 DNA을 단리하였다.

Pwo 중합효소를 사용한 PCR은 95℃에서 3분간 변성; 95℃에서 1분간 변성, 58℃에서 1분 30초 동안 프라이머 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분 30초 동안 중합 반응을 35 사이클 수행; 및 72℃에서 5분간 종결 중합 반응을 포함한다.

이들 조건하에서, 알칼리제네스 페칼리스 1650의 염색체 DNA로부터 약 1kb 크기의 절편이 증폭되었다. PCR 생성물을 클로닝하기 위해서, XbaI 제한 효소 절단 자리 및 두 개의 추가적인 뉴클레오타이드(5'-AATCTAGA 및 5'-ATTCTAGA)를 상기에서 언급된 프라이머 각각에 부착하였으며, PCR 반응을 상기 언급된 조건하에서 반복하였다. 다시 한 번 약 1kb 크기의 절편을 증폭하였으며, 정제 및 XbaI 절단 후에, 유사하게 절단된 pUC18에 연결하였다. 이.콜라이 JM109의 형질 전환 및 생성된 플라스미드의 단리 후에, DNA 서열 분석 및 이후의 게놈 서던 블롯에 의해 정제하였다. 전체 니트릴라제 유전자 (nit)의 단리를 위한 분자 생물학적 및 미생물학적 방법은 숙련된 기술자에게 알려진 전통적인 방법에 의해 수행하였다. 전체 니트릴라제 서열은 서열 확인 번호 1로 개시하였다.

실시예 3: 다른 단백질들과의 상동성, 상동 서열의 확인

스위스프로트(SWISSPROT) 단백질 데이터베이스로부터의 서열과의 비교는 본 발명의 니트릴라제 유전자가 알려진 니트릴라제와 아미노산 수준에서 11 내지 96% 상동성을 가진다는 것을 보여주었다. 가장 큰 서열 상동성은 알칼리제네스 페칼리스 JM3으로부터의 아릴아세토니트릴 특이성 니트릴라제 (나가사와(Nagasawa) 등, Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765-772)에서 발견되었다. 두 니트릴라제 유전자는 1071bp 부위에 걸쳐 뉴클레오타이드 수준에서 93.2% 동일성을 가진다. 유래된 아미노산 서열은 356 아미노산 부위에 걸쳐 96.1%의 동일성을 가진다. 로도코쿠스 에리트로폴리스 SK92로부터의 니트릴라제 (유럽 특허 공개 제0 719 862호)에서는 534 아미노산 부위에 걸쳐 11.4%의 가장 작은 상동성이 발견되었다.

실시예 4: 이.콜라이에서의 니트릴라제의 이형 발현

발현 벡터 pJOE2702 안으로 클로닝하기 위해서 nit 유전자를 증폭하였다. 이 경우 PCR을 위해 선택된 5' 프라이머는 상기 언급된 서열 확인 번호 3의 서열이었고 번역 시작점과 겹치는 NdeI 절단 부위가 nit 5' 말단에 부착된다. 이 프라이머는 하기에 서열 확인 번호 8로 나타내었고, 첨부된 서열 목록에 포함되었다. 선택된 3'프라이머는 nit 유전자의 3' 부위로부터의 24mer이었고 종결 코돈에 인접한 BamHI 절단 부위가 부착된다. 이는 하기에 서열 확인 번호 9로 나타내었고, 첨부된 서열 목록에 포함시켰다.

서열 확인 번호 8:

5'-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3'

서열 확인 번호 9:

5'-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3'

Pwo 중합 효소를 이용한 PCR은 94℃에서 3분간 변성; 93℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분 30초 동안 프라이머 어닐링 및 72℃에서 1분 30초 동안 중합 반응을 25사이클 수행; 및 72℃에서 5분간 종결 중합 반응을 포함하였다. 생성된 PCR 절편을 정제하였으며, NdeI/BamHI으로 절단하였으며, 유사하게 절단된 벡터 pJOE2702에 삽입하였다(볼프(Volff) 등, 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037-1047). 생성된 플라스미드는 pDHE19.2로 명명하였으며, 도 3에 도시하였다. NdeI/BamHI 절단 부위를 통한 삽입은 플라스미드 pDHE19.2 에서 nit 유전자가 pJOE2702에 존재하며 이.콜라이의 양성적으로 조절되는 L-람노스 오페론 rhaBAD로부터 유래한 프로모터rha _P 의 전사 조절하에 있다는 것을 의미한다(에간 & 쉬레이(Egan & Schleif), 1994, J. Mol. Biol., 243, 821-829). nit 유전자의 전사 종결과 번역의 개시는 벡터 서열을 통해서 유사하게 일어난다. 아울러, 플라스미드는 앰피실린 내성 Ap^R을 부여하는 유전자를 포함한다.

니트릴라제의 이형 발현은 플라스미드 pDHE19.2를 포함한 이.콜라이 JM109 균주를 이용하여 나타내었다. 상기 목적을 위해서, 균주 JM109(pDHE19.2)를 100㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 TB 배지에서 37℃에서 교반하면서 배양하였다(타토프(Tartof), 홉스(Hobbs) 1987). OD₆₀₀ 1.7에서 배양물을 0.2%(w/v) L-람노즈를 함유한 신선한 TB 배지 중으로 1:200 으로 옮겨서 니트릴라제를 유도하고, 30℃에서 교반하면서 배양하였다. 8시간 후에, 세포를 수집하였으며, pH 7.2, 10mM Na/K 인산염염 완충 용액으로 세척하였고, 동일한 완충 용액에 OD₆₀₀1.0으로 재현탁하였으며, 초음파에 의한 처리로 파쇄하였다.

실시예 5: 재조합 균주 이.콜라이 JM109(pDHE19.2)의 니트릴라제 활성 측정.

1. 세포의 생산

이.콜라이 JM109(pDHE19.2)을 100㎍/㎖ 앰피실린을 함유한 TB 배지에서 37℃에서 6시간 동안 교반하면서 배양하였다. OD₆₀₀4.0의 예비배양물 100㎖을 사용하여서 100㎍/㎖ 앰피실린 및 2g/ℓ L-람노즈를 함유한 8ℓ의 신선한 TB 배지를 함유하는 10ℓ 발효조를 접종하였다. pH, 온도, 공기 유속 및 교반 속도는 각각 7.2, 30℃, 300 ℓ/h 및 400-650 rpm이었다. 16 시간 후에 세포를 수거하였다. 이 시점에서 600nm에서의 광학 밀도는 18이었으며, 이는 7.8 g/l의 세포 건조 중량에 해당한다.

2. 만델로니트릴에 대한 특이 활성의 결정

실시예 1에서 기술된 대로 세포를 얻었으며 pH 7.2의 10mM Na/K 인산염 완충 용액에서 세척하였다. 건조 중량 2mg의 세포를 pH 7.2의 10mM Na/K 인산염 완충 용액 1㎖ 중에 재현탁하였으며, 8.3 mM 만델로니트릴을 첨가하여 반응을 개시하였다. 교반하면서 40℃에서 반응을 수행하였다. 샘플을 채취하고 이어서 고성능 액체 크로마토그래피(ODS Hypersil)로 반응의 동력학적 관찰을 수행하였다. 만델로니트릴, 벤즈알데히드, 만델아미드 및 만델산이 측정되었다. 만델산의 생성 속도는 30%의 전환으로 403 U/g 세포 건조 중량으로, 여기서 1U 는 40℃에서 분 당 1μmol의 만델산의 생성으로 정의된다.

실시예 6: 현탁액 중의 이.콜라이 JM109(pDHE19.2)를 이용한 만델로니트릴의 가수 분해에 의한 R-만델산의 합성

10 시간에 걸쳐 1.3g/ℓ 농도 중의 만델로니트릴을 이.콜라이 JM109(pDHE19.2) 균주를 2g/ℓ의 농도로 포함한 1ℓ의 10mM Na/K 인산염 완충 용액(pH7.2) 중으로 40℃에서 패들 교반기에 의해 교반하면서 계량 첨가하였다. 계량은 니트릴 소모량에 의해 조절하였다. R-만델산의 소모 속도 측정은 실시예 5에 기술된 대로 수행하였다. 상기 결과를 도 4에 도시하였다.

실시예 7: 현탁액 중의 이.콜라이 JM109(pDHE19.2)에 의한 만델로니트릴의 가수 분해로부터 얻은 반응 혼합물로부터의 추출에 의한 R-만델산의 단리

실시예 6에서 얻어진 수성 만델산 반응 혼합물을 원심분리하여 세포를 제거하였으며, 산에 의해 pH 2로 조정하였으며 메틸 3차 부틸 에테르(MTBE)로 3차례 추출하였다. 증발에 의해 만델산 추출물로부터 유기 용매를 제거한 후에, 생성된 흰색 만델산 결정을 재용해하였고, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 화학적 및 광학적 순도를 조사하였다. 화학적 순도는 99%이고, R-만델산의 광학적 순도는 97.4%ee이었다.

실시예 8:현탁액 중의 이.콜라이 JM109(pDHE19.2)에 의한 만델로니트릴의 가수 분해로부터 얻은 반응 혼합물로부터의 냉각에 의한 결정화에 의한 R-만델산의 단리.

실시예 6에서 얻은 수성 만델산 반응 혼합물을 원심분리하여 세포를 제거하였으며, 가열 및 교반에 의해 최초 부피의 40%로 농축하였으며 산으로 pH 2로 조정하였다. 얼음 수조에서 냉각에 의해 만델산을 결정화시켰으며, 생성된 흰색 만델산 결정을 흡인에 의해 여과시켰으며 건조시켰다. 결정을 재용해시켰으며 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 화학적 및 광학적 순도를 조사하였다. 화학적 순도는 99.1%이었으며, R-만델산의 광학적 순도는 99.8%ee이었다.

실시예 9: 다양한 니트릴의 전환

이.콜라이 균주 (실시예 6 참조) 또는 처음의 알칼리제네스 균주를 사용하여 다양한 니트릴을 전환시켰다. 알칼리제네스 세포를 400㎖ 알칼리제네스 배지 중 (상기 배지 A 참조)에서, 30℃ 및 160rpm으로 16 시간 동안 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 수집하였다 (4℃ 및 5000rpm, 30 분). 한 세포 현탁액의 150㎕ 분액들을 마이크로타이터 플레이트의 각 웰 중에 피펫으로 첨가하였다. 그 다음 플레이트를 원심분리하였다. 상징액을 흡인하였고, 세포 펠릿을 Na₂HPO₄ (핀나쿠아(Finnaqua) 중 1.42 g/ℓ, pH 7.2)으로 두 번 세척하였다. 그 다음 기질 용액(150㎕)을 피펫으로 첨가하였고, 세포를 재현탁시켰다. 마이크로타이터 플레이트 중의 12 홀의 각 열에 하나의 기질을 첨가하였다. 기질 용액을 포함하였으나 세포를 포함하지 않은 한 열을 대조군으로 사용하였다 (=대조 시험).

마이크로타이터 플레이트를 200rpm, 30℃에서 2시간 동안 교반 배양기에 두었다. 그 다음 세포를 원심분리하여 가라앉혔으며, 상징액 중의 생성된 NH₄ 이온의 양을 바이오멕(Biomeck) 장치를 사용하여 측정하였다. 다양한 NH₄OH 용액에 의해 구축된 검정 곡선을 사용하여 620nm에서 측정을 하였다(도 5 참조). 사용된 기질은 만델로니트릴(=1), 2-페닐프로피오니트릴(=2), 2-페닐부티로니트릴(=3), 벤질 시아나이드(=4), 4-클로로벤질 시아나이드(=5), 4-브로모벤질 시아나이드(=6), 프로피오니트릴(=7), 2-메틸부티로니트릴(=8, 2-시아노부탄), 게라노니트릴(=9), 발레로니트릴(=10), 3-시아노피리딘(=11), 3-바이페닐-2-히드록시부티로니트릴 (=12), 4-플루오로벤질 시아나이드(=13, 4-플루오로페닐아세토니트릴 및 α-(3-헵틸)-니트로-트리아세토니트릴(=14)이었다. 각각의 기질에 대해서 메탄올 중의 0.2 몰 원액을 만들었으며, 이를 Na₂HPO₄ (핀나쿠아 중의 1.42g/ℓ, pH 7.2) 를 이용하여 10mM로 희석시켰다. 세포 현탁액을 2g/ℓ 건조 생체중량으로 표준화시켰다. 하기 표 II는 전환 중의 마이크로타이터 플레이트열에 대한 평균을 나타낸다.

니트릴라제 1650에 의한 다양한 니트릴의 전환

기질 번호	μmol/ℓ	활성	전환율(%)
1	2141.2	8.9	86.3
2	1001.1	4.1	70.2
3	24.4	0.1	44.3
4	2210.5	9.2	100
5	2136.3	8.9	100
6	1500.8	6.2	100
7	4.9	0.02	NA
8	-	-	NA
9	-	-	NA
10	113.4	0.47	NA
11	-	-	NA
12	-	-	NA
13	2222.9	9.2	100
14	84.8	0.35	44.1

도 6에 전환의 결과를 활성으로 나타내었다.

<110> BASF Aktiengesellschaft <120> Methods for producing chiral carboxylic acid from nitriles with the assistance of a nitrilase or microorganisms which contain a gene for the nitrilase <150> DE 198 48 129.2 <151> 1998-10-19 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1071 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis 1650 <220> <221> CDS <222> (1)..(1068) <400> 1 atg cag aca aga aaa atc gtc cgg gca gcc gcc gta cag gcc gcc tct 48 Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser 1 5 10 15 ccc aac tac gat ctg gca acg ggt gtt gat aaa acc att gag ctg gct 96 Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala 20 25 30 cgt cag gcc cgc gat gag ggc tgt gac ctg atc gtg ttt ggt gaa acc 144 Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr 35 40 45 tgg ctg ccc gga tat ccc ttc cac gtc tgg ctg ggc gca ccg gcc tgg 192 Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp 50 55 60 tcg ctg aaa tac agt gcc cgc tac tat gcc aac tcg ctc tcg ctg gac 240 Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp 65 70 75 80 agt gca gag ttt caa cgc att gcc cag gcc gca cgg acc ttg ggt att 288 Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile 85 90 95 ttc atc gca ctg ggt tat agc gag cgc agc ggc ggc agc ctt tac ctg 336 Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu 100 105 110 ggc caa tgc ctg atc gac gac aag ggc gag atg ctg tgg tcg cgt cgc 384 Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg 115 120 125 aaa ctc aaa ccc acg cat gta gag cgc acc gta ttt ggt gaa ggt tat 432 Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr 130 135 140 gcc cgt gat ctg att gtg tcc gac aca gaa ctg gga cgc gtc ggt gct 480 Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala 145 150 155 160 cta tgc tgc tgg gag cat ttg tcg ccc ttg agc aag tac gcg ctg tac 528 Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr 165 170 175 tcc cag cat gaa gcc att cac att gct gcc tgg ccg tcg ttt tcg cta 576 Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu 180 185 190 tac agc gaa cag gcc cac gcc ctc agt gcc aag gtg aac atg gct gcc 624 Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala 195 200 205 tcg caa atc tat tcg gtt gaa ggc cag tgc ttt acc atc gcc gcc agc 672 Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser 210 215 220 agt gtg gtc acc caa gag acg cta gac atg ctg gaa gtg ggt gaa cac 720 Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His 225 230 235 240 aac gcc ccc ttg ctg aaa gtg ggc ggc ggc agt tcc atg att ttt gcg 768 Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala 245 250 255 ccg gac gga cgc aca ctg gct ccc tac ctg cct cac gat gcc gag ggc 816 Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly 260 265 270 ttg atc att gcc gat ctg aat atg gag gag att gcc ttc gcc aaa gcg 864 Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala 275 280 285 atc aat gac ccc gta ggc cac tat tcc aaa ccc gag gcc acc cgt ctg 912 Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu 290 295 300 gtg ctg gac ttg ggg cac cga gac ccc atg act cgg gtg cac tcc aaa 960 Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys 305 310 315 320 agc gtg acc agg gaa gag gct ccc gag caa ggt gtg caa agc aag att 1008 Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile 325 330 335 gcc tca gtc gct atc agc cat cca cag gac tcg gac aca ctg cta gtg 1056 Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val 340 345 350 caa gag ccg tct tg a 1071 Gln Glu Pro Ser 355 <210> 2 <211> 356 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 2 Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala 20 25 30 Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly Cys Asp Leu Ile Val Phe Gly Glu Thr 35 40 45 Trp Leu Pro Gly Tyr Pro Phe His Val Trp Leu Gly Ala Pro Ala Trp 50 55 60 Ser Leu Lys Tyr Ser Ala Arg Tyr Tyr Ala Asn Ser Leu Ser Leu Asp 65 70 75 80 Ser Ala Glu Phe Gln Arg Ile Ala Gln Ala Ala Arg Thr Leu Gly Ile 85 90 95 Phe Ile Ala Leu Gly Tyr Ser Glu Arg Ser Gly Gly Ser Leu Tyr Leu 100 105 110 Gly Gln Cys Leu Ile Asp Asp Lys Gly Glu Met Leu Trp Ser Arg Arg 115 120 125 Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Phe Gly Glu Gly Tyr 130 135 140 Ala Arg Asp Leu Ile Val Ser Asp Thr Glu Leu Gly Arg Val Gly Ala 145 150 155 160 Leu Cys Cys Trp Glu His Leu Ser Pro Leu Ser Lys Tyr Ala Leu Tyr 165 170 175 Ser Gln His Glu Ala Ile His Ile Ala Ala Trp Pro Ser Phe Ser Leu 180 185 190 Tyr Ser Glu Gln Ala His Ala Leu Ser Ala Lys Val Asn Met Ala Ala 195 200 205 Ser Gln Ile Tyr Ser Val Glu Gly Gln Cys Phe Thr Ile Ala Ala Ser 210 215 220 Ser Val Val Thr Gln Glu Thr Leu Asp Met Leu Glu Val Gly Glu His 225 230 235 240 Asn Ala Pro Leu Leu Lys Val Gly Gly Gly Ser Ser Met Ile Phe Ala 245 250 255 Pro Asp Gly Arg Thr Leu Ala Pro Tyr Leu Pro His Asp Ala Glu Gly 260 265 270 Leu Ile Ile Ala Asp Leu Asn Met Glu Glu Ile Ala Phe Ala Lys Ala 275 280 285 Ile Asn Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Lys Pro Glu Ala Thr Arg Leu 290 295 300 Val Leu Asp Leu Gly His Arg Asp Pro Met Thr Arg Val His Ser Lys 305 310 315 320 Ser Val Thr Arg Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile 325 330 335 Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln Asp Ser Asp Thr Leu Leu Val 340 345 350 Gln Glu Pro Ser 355 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 3 Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser 1 5 10 15 Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala 20 25 30 Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly 35 <210> 4 <211> 21 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 4 Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala 1 5 10 15 Ile Ser His Pro Gln 20 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 5 Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 6 atgcagacna gnaaratcgt scg 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 7 tngcsacnga ngcratcttg 20 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 8 ttaatcatat gcagacaaga aaaatcgtcc g 31 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Alcaligenes faecalis 1650 <400> 9 aaggatcctc aagacggctc ttgcactagc ag 32

Claims

a) 서열 확인 번호 1에 개시된 서열을 가진 핵산 서열, 및

b) 유전자 암호의 중첩 (degeneracy)에 의한 결과로 서열 확인 번호 1에 개시된 핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는, 니트릴라제 활성을 가진 폴리펩타이드를 코딩하는 단리된 핵산.
제1항에서 청구된 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가진 단리된 폴리펩타이드.
제2항에 있어서, 서열 확인 번호 1에 개시된 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가진 단리된 폴리펩타이드.
하나 이상의 조절 신호에 연결된 제1항에 청구된 핵산을 포함하는, 핵산 구성체.
제1항에 청구된 핵산 또는 제4항에 청구된 핵산 구성체를 포함하는 벡터.
하나 이상의 제1항에 청구된 핵산 또는 하나 이상의 제4항에 청구된 핵산 구성체를 포함하는 형질전환된 미생물.
제6항에 있어서, 에쉐리키아 (Escherichia) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속 또는 알칼리제네스 (Alcaligenes) 속의 세균인 형질전환된 미생물.
제2항 또는 제3항에 청구된 단리된 폴리펩타이드 또는 제6항 또는 제7항에 청구된 생장중이거나, 발육 정지중이거나 또는 파쇄된 미생물의 존재하에서, 단백질 1mg당 1시간 당 니트릴 25 mmol이상 또는 건조 중량 1g당 1시간 당 니트릴 25 mmol이상의 전환율로 하기 화학식 II의 라세믹 니트릴을 하기 화학식 I의 키랄 카르복실산으로 전환시키는 것을 포함하는, 하기 화학식 I의 키랄 카르복실산의 제조 방법.

〈화학식 I〉

〈화학식 II〉

상기 식들에서,

*는 광학 활성 중심이고,

R¹, R²및 R³는 각각 독립적으로 수소, 치환 또는 비치환된 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 치환 또는 비치환된 아릴, 헤트아릴, OR⁴ 또는 NR⁴R⁵이고, 여기서 R¹, R² 및 R³ 라디칼은 언제나 상이하며,

R⁴는 수소, 치환 또는 비치환된 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, C₁-C₁₀-알킬카르보닐, C₂-C₁₀-알케닐카르보닐, 아릴, 아릴카르보닐, 헤트아릴 또는 헤트아릴카르보닐이고,

R⁵는 수소, 치환 또는 비치환된 분지쇄 또는 비분지쇄인 C₁-C₁₀-알킬, C₂-C₁₀-알케닐, 아릴 또는 헤트아릴이다.
제8항에 있어서, 치환기 R¹, R²또는 R³중 하나가 OR⁴ 인 방법.
제8항에 있어서, 치환기 R¹, R² 또는 R³중 하나가 아릴인 방법.
제8항에 있어서, pH 4 내지 11인 수성 반응 용액 상에서 수행되는 방법.
제8항에 있어서, 니트릴 0.01 내지 10 중량% 또는 상응하는 알데히드 또는 케톤 0.01 내지 10 중량% 및 시안화수소산 0.01 내지 10 중량%를 반응시킴으로써 수행되는 방법.
제8항에 있어서, 0℃ 내지 80℃ 온도에서 수행되는 방법.
제8항에 있어서, 키랄 카르복실산이 추출 또는 결정화 또는 추출 및 결정화에 의해 60 내지 100% 수율로 반응 용액에서 단리되는 방법.
제8항에 있어서, 키랄 카르복실산이 90%ee 이상의 광학적 순도를 가지는 방법.
제9항에 있어서, 치환기 R¹, R² 또는 R³중 하나가 아릴인 방법.
제9항, 제10항 및 제16항 중 어느 한항에 있어서, pH 4 내지 11인 수성 반응 용액 상에서 수행되는 방법.
제9항 내지 제11항 및 제16항 중 어느 한항에 있어서, 니트릴 0.01 내지 10 중량% 또는 상응하는 알데히드 또는 케톤 0.01 내지 10 중량% 및 시안화수소산 0.01 내지 10 중량%를 반응시킴으로써 수행되는 방법.
제9항 내지 제12항 및 제16항 중 어느 한항에 있어서, 0℃ 내지 80℃ 온도에서 수행되는 방법.
제9항 내지 제13항 및 제16항 중 어느 한항에 있어서, 키랄 카르복실산이 추출 또는 결정화 또는 추출 및 결정화에 의해 60 내지 100% 수율로 반응 용액에서 단리되는 방법.
제9항 내지 제14항 및 제16항 중 어느 한항에 있어서, 키랄 카르복실산이 90%ee 이상의 광학적 순도를 가지는 방법.