JP2023526068A

JP2023526068A - イソプレノイド生成の改善方法

Info

Publication number: JP2023526068A
Application number: JP2022569024A
Authority: JP
Inventors: ステファンポット，モリッツ; シーマイヤー，ステファン; ブロイアー，マイケル; ウィルロッド，クリスティアン; クラウスプラスマイヤー，イェンス; マーラー，エヴァ; トコヴェンコ，ボグダン
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2023-06-20
Also published as: KR20230012530A; CA3172001A1; BR112022022933A2; CN115605589A; AU2021272383A1; WO2021229106A1; US20230383321A1; EP4150064A1

Abstract

本発明は、生体触媒、生物変換及び発酵の分野に属し、イソペンテニルジホスフェート、ジメチルアリルジホスフェート及び/又はそれに由来するイソプレノイドを生成する方法を対象とする。【選択図】図１

Description

発明の説明
本発明は、生体触媒、生物変換及び発酵の分野に属し、イソペンテニルジホスフェート、ジメチルアリルジホスフェート及び/又はそれに由来するイソプレノイドを生成する方法を対象とする。

緒言
イソプレノイドは、フレーバー及び香料、化粧品、農業、栄養、並びに医薬の構成ブロックにおいて膨大に適用されている驚くべき程に多様なクラスの天然物を提示する(Chandran, S.S., J.T. Kealey, and C.D. Reeves, Microbial production of isoprenoids. Process Biochemistry, 2011. 46(9): p. 1703-1710)。イソプレノイドの生物学的合成は、キー中間体であるイソペンテニルジホスフェート(IPP)及びその異性体であるジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)を介して進行する。天然では、これらの中間体は、共に一次代謝の分岐であるメバロン酸経路又は1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸経路のいずれかを介して組み立てられる。両経路共に産生生物体にとってエネルギー消費的であり、両経路はどちらも高度に複雑な調節の支配下にある。最終的には、このことによって、理論的に達成可能な炭素収量が制限され、したがって、このルートを介したイソプレノイドの最小生産コストが制限される。それに関連して、メバロン酸経路及び1-デオキシ-D-キシルロース-5-リン酸経路を回避するIPP又はDMAPPへの代替アクセスによれば、イソプレノイド生成の劇的なコスト削減を達成する巨大な可能性が提供される。最近、Stephanopoulos(Chatzivasileiou, A.O., et al., Two-step pathway for isoprenoid synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(2): p. 506-511; Ward, V.C.A., A.O. Chatzivasileiou, and G. Stephanopoulos, Cell free biosynthesis of isoprenoids from isopentenol. Biotechnol Bioeng, 2019. 116(12): p. 3269-3281)、Gonzalez(Clomburg, J.M., et al., The isoprenoid alcohol pathway, a synthetic route for isoprenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(26): p. 12810-12815)、及びWilliams(Lund, S., R. Hall, and G.J. Williams, An Artificial Pathway for Isoprenoid Biosynthesis Decoupled from Native Hemiterpene Metabolism. ACS Synth Biol, 2019. 8(2): p. 232-238)の研究グループによって、そのような代替ルートが提唱されてきた。彼らは、容易に入手可能な化学的に合成されたイソプレノール又はプレノールから開始し、その後に行う2つのリン酸化反応を介してIPP及びDMAPPを構築する人工経路を考え付いた。第1の段階では、酵素であるキナーゼ1によって、イソプレノールからイソペンテニルホスフェート(IP)を、又はプレノールからジメチルアリルジホスフェート(DMAP)を合成する。2つの生成物は次にキナーゼ2の基質であり、キナーゼ2は第2のリン酸部分を転移してIPP又はDMAPPをもたらす。人工経路内では、効率的なキナーゼ1並びに効率的なキナーゼ2を特定することが大きな課題となっているが、なぜなら、天然でのキナーゼ1の反応性については記載されておらず、キナーゼ2は多くの場合効率が低いからである。

Chandran, S.S., J.T. Kealey, and C.D. Reeves, Microbial production of isoprenoids. Process Biochemistry, 2011. 46(9): p. 1703-1710 Stephanopoulos(Chatzivasileiou, A.O., et al., Two-step pathway for isoprenoid synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(2): p. 506-511 Ward, V.C.A., A.O. Chatzivasileiou, and G. Stephanopoulos, Cell free biosynthesis of isoprenoids from isopentenol. Biotechnol Bioeng, 2019. 116(12): p. 3269-3281) Gonzalez(Clomburg, J.M., et al., The isoprenoid alcohol pathway, a synthetic route for isoprenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2019. 116(26): p. 12810-12815) Williams(Lund, S., R. Hall, and G.J. Williams, An Artificial Pathway for Isoprenoid Biosynthesis Decoupled from Native Hemiterpene Metabolism. ACS Synth Biol, 2019. 8(2): p. 232-238

本発明者らは、イソプレノール/プレノールからIP/DMAPの高収率生成を可能とする効率的なキナーゼ1触媒である酵素、並びにIP/DMAPから高収率のIPP/DMAPPを生成する効率的なキナーゼ2触媒を特定した。更に、これらの中間体から開始するイソプレノイドの高効率生成を確立することができた。

本発明の第1の実施形態は、水、キナーゼ1並びにイソプレノール及び/又はプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体中で、イソプレノール(3-メチル-3-ブテン-1-オール)及び/又はプレノール(3,3-ジメチルアリルアルコール、3-メチル-2-ブテン-1-オール)からイソペンテニルホスフェート(イソペンテニルモノホスフェート、3-メチルブタ-3-エニルジハイドロジェンホスフェート)若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート(3-メチルブタ-2-エニルジハイドロジェンホスフェート)若しくはその塩への反応を触媒することができる単離されたキナーゼ1であって、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、単離されたキナーゼ1を含む。

水性媒体のインキュベーション時間は、少なくとも0.5時間、少なくとも1時間、少なくとも1.5時間、少なくとも2時間、少なくとも2.5時間、少なくとも5時間、少なくとも10時間又は少なくとも12時間とし得る。

一実施形態では、インキュベーションは、10℃～50℃で、好ましくは15℃～40℃で、より好ましくは20℃～40℃で、更により好ましくは24℃～37℃で、最も好ましくは36℃～38℃で実施される。

好ましい実施形態では、37℃で10時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。より好ましい実施形態では、37℃で7時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。更により好ましい実施形態では、37℃で7時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも25%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。更により好ましい実施形態では、37℃で18時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも40%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。最も好ましい実施形態では、37℃で5時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも25%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。

本発明の一実施形態では、単離されたキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、14Aを有しておらず、122Aを有しておらず、174Mを有しておらず、及び/又は217Tを有しない。好ましくは、本発明のキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、14Y、K若しくはT、122S若しくはT、174K若しくはV及び/又は217E若しくはMのうちの少なくとも3個、好ましくは少なくとも4個を含む。

本発明の更なる実施形態では、単離されたキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、30D、E、S若しくはYを有しておらず；33G若しくはSを有しておらず；125S若しくはTを有しておらず；及び/又は201A、I若しくはSを有しない。好ましくは、本発明のキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、30N、33T、125K、及び/又は201C若しくはDのうちの少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、好ましくは少なくとも4個を含む。

一実施形態では、単離されたキナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒しており、
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。

本発明の一実施形態では、b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、14Aを有しておらず、122Aを有しておらず、174Mを有しておらず、及び/又は217Tを有しない。好ましくは、本発明のキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、14Y、K若しくはT、122S若しくはT、174K若しくはV及び/又は217E若しくはMのうちの少なくとも3個、好ましくは少なくとも4個を含む。

本発明の更なる実施形態では、b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、30D、E、S若しくはYを有しておらず；33G若しくはSを有しておらず；125S若しくはTを有しておらず；及び/又は201A、I若しくはSを有しない。好ましくは、本発明のキナーゼ1は、配列番号37のそれぞれの位置に相当する位置に、30N、33T、125K、及び/又は201C若しくはDのうちの少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、好ましくは少なくとも4個を含む。

本発明の更なる実施形態は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでいる、
単離されたキナーゼ1であって、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、単離されたキナーゼ1である。

本発明の更なる実施形態は、
i. 水、1つ以上のキナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体を用意するステップ、並びに
ii. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
iii. 必要に応じて、イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、水、キナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体中での、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、方法である。

水性媒体は、溶液若しくは懸濁液であってもよく、又は溶液と懸濁液であってもよく、この場合、前記水性媒体に含まれる物質のいずれもが、完全に若しくは部分的に溶解していてもよく及び/又は部分的に若しくは完全に懸濁していてもよい。

本発明の方法の一実施形態では、キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒しており、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている。

本発明の更なる実施形態は、
i. 水、1つ以上のキナーゼ1並びにイソプレノール及び/又はプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体を用意するステップ、並びに
ii. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
iii. 必要に応じて、イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、方法である。

本発明の更なる実施形態は、キナーゼ1を含む組換え構築物であって、
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、組換え構築物である。

キナーゼ1を発現するための前記組換え構築物は、生物体のゲノムに統合されてもよく、キナーゼ1を発現するための組換え構築物は、生物体に導入されるベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターに含まれてもよい。

組換え構築物中のキナーゼ1は、異種プロモーター、異種ターミネーター及び/又は他の任意の異種遺伝要素に機能的に連結され得る。

本発明の更なる実施形態は、前記組換え構築物を含む組換えベクター、例えば発現ベクター又はウイルスベクターである。

特に好ましい実施形態では、前記ベクターは配列番号109、110又は491の配列を含む。

本発明の更なる実施形態は、前記組換え構築物又は前記組換えベクターを含む組換え微生物である。

一部の実施形態では、組換え微生物は原核細胞である。適切な原核細胞には、グラム陽性菌、グラム陰性菌及びグラム不定菌の細胞、好ましくはグラム陰性菌の細胞が含まれる。

したがって、本発明において使用することができる原核微生物には、限定するものではないが、グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)、グルコノバクター・アサイイ(Gluconobacter asaii)、アクロモバクター・デルマルヴァエ(Achromobacter delmarvae)、アクロモバクター・ヴィスコサス(Achromobacter viscosus)、アクロモバクター・ラクチカム(Achromobacter lacticum)、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)、アグロバクテリウム・ラディオバクター(Agrobacterium radiobacter)、アルカリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)、アルスロバクター・シトレウス(Arthrobacter citreus)、アルスロバクター・ツメセンス(Arthrobacter tumescens)、アルスロバクター・パラフィネウス(Arthrobacter paraffineus)、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、アルスロバクター・オキシダンス(Arthrobacter oxydans)、アウレオバクテリウム・サペルダエ(Aureobacterium saperdae)、アゾトバクター・インディカス(Azotobacter indicus)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ディバリカタム(Brevibacterium divaricatum)、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、ブレビバクテリウム・グロボサム(Brevibacterium globosum)、ブレビバクテリウム・フスカム(Brevibacterium fuscum)、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム(Brevibacterium ketoglutamicum)、ブレビバクテリウム・ヘルコラム(Brevibacterium helcolum)、ブレビバクテリウム・プシラム(Brevibacterium pusillum)、ブレビバクテリウム・テスタセウム(Brevibacterium testaceum)、ブレビバクテリウム・ロセウム(Brevibacterium roseum)、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム(Brevibacterium immariophilium)、ブレビバクテリウム・リネンス(Brevibacterium linens)、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ(Brevibacterium protopharmiae)、コリネバクテリウム・アセトフィラム(Corynebacterium acetophilum)、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム(Corynebacterium acetoacidophilum)、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム(Corynebacterium acetoglutamicum)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エルウィニア・アミロボーラ(Erwinia amylovora)、エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)、エルウィニア・ヘルビコーラ(Erwinia herbicola)、エルウィニア・クリサンテミ(Erwinia chrysanthemi)、フラボバクテリウム・ペレグリナム(Flavobacterium peregrinum)、フラボバクテリウム・フカツム(Flavobacterium fucatum)、フラボバクテリウム・アウランティナム(Flavobacterium aurantinum)、フラボバクテリウム・レナナム(Flavobacterium rhenanum)、フラボバクテリウム・セワネンセ(Flavobacterium sewanense)、フラボバクテリウム・ブレーベ(Flavobacterium breve)、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム(Flavobacterium meningosepticum)、ミクロコッカス属の種(Micrococcus sp.)CCM825、モルガネラ・モルガニイ(Morganella morganii)、ノカルジア・オパカ(Nocardia opaca)、ノカルジア・ルゴサ(Nocardia rugosa)、プラノコッカス・ユーシナタス(Planococcus eucinatus)、プロテウス・レッゲリ(Proteus rettgeri)、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ(Propionibacterium shermanii)、シュードモナス・シンキサンタ(Pseudomonas synxantha)、シュードモナス・アゾトフォルマンス(Pseudomonas azotoformans)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas jluorescens)、シュードモナス・オバリス(Pseudomonas ovalis)、シュードモナス・スタッツェリ(Pseudomonas stutzeri)、シュードモナス・アシドボランス(Pseudomonas acidovolans)、シュードモナス・ムシドレンス(Pseudomonas mucidolens)、シュードモナス・テストステロニ(Pseudomonas testosteroni)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、ロドコッカス・ロドクラウス(Rhodococcus rhodochrous)、ロドコッカス属の種(Rhodococcus sp.)ATCC 15592、ロドコッカス属の種ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレエ(Sporosarcina ureae)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、ビブリオ・メチニコフィイ(Vibrio metschnikovii)、ビブリオ・チロゲネス(Vibrio tyrogenes)、アクチノマデュラ・マデュレ(Actinomadura madurae)、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス(Actinomyces violaceochromogenes)、キタサトスポリア・パルロサ(Kitasatosporia parulosa)、ストレプトマイセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトマイセス・コエリコロル(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・フラベラス(Streptomyces flavelus)、ストレプトマイセス・グリセオラス(Streptomyces griseolus)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・オリバセウス(Streptomyces olivaceus)、ストレプトマイセス・タナシエンシス(Streptomyces tanashiensis)、ストレプトマイセス・バージニエ(Streptomyces virginiae)、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス(Streptomyces antibioticus)、ストレプトマイセス・カカオイ(Streptomyces cacaoi)、ストレプトマイセス・ラベンデュレ(Streptomyces lavendulae)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、アエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・チアミノリティカス(Bacillus thiaminolyticus)、エシェリキア・フロインディイ(Escherichia freundii)、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム(Microbacterium ammoniaphilum)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・ショットムレリ(Salmonella schottmulleri)、ザントモナス・シトリ(Xanthomonas citri)、シネコシスティス属の種(Synechocystis sp.)、シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)、サーモシネコッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)、ミクロシスティス・アエルギノサ(Microcystis aeruginosa)、ネンジュモ属の種(Nostoc sp.)、N.コミュネ(N. commune)、N.スファエリカム(N.sphaericum)、ノストック・プンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)、スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)、リングビヤ・マジュスキュラ(Lyngbya majuscula)、L.ラゲルヘイミイ(L. lagerheimii)、フォルミディウム・テヌエ(Phormidium tenue)、アナバエナ属の種(Anabaena sp.)、レプトリングビヤ属の種(Leptolyngbya sp.)が含まれる。

本発明において使用することができる真核微生物には、限定するものではないが、サッカロミセス属(Saccharomyces)の種、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ハンセヌラ属(Hansenula)の種、例えばハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)の種、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)の種、例えばクルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)及びクルイベロミセス・マルキシアナス(Kluyveromyces marxianus)、ヤロウイア属(Yarrowia)の種、例えばヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、ピキア属(Pichia)の種、例えばピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・スティピテス(Pichia stipites)及びピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ジゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)の種、例えばジゴサッカロミセス・ルキシー(Zygosaccharomyces rouxii)及びジゴサッカロミセス・バイリイ(Zygosaccharomyces bailii)、カンジダ属(Candida)の種、例えばカンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)、カンジダ・ユティリス(Candida utilis)、カンジダ・フレイシュシイ(Candida freyschussii)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)及びカンジダ・ソノレンシス(Candida sonorensis)、シュワンニオミセス属(Schwanniomyces)の種、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)、アルクスラ属(Arxula)の種、例えばアルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、オガタエア属(Ogataea)の種、例えばオガタエア・ミヌータ(Ogataea minuta)、クレブシエラ属(Klebsiella)の種、例えばクレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)、アスペルギルス属(Aspergillus)の種、例えばアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)又はミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)が含まれる。

本発明の好ましい微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種(Aerococcus sp.)、アスペルギルス属の種(Aspergillus sp.)、バチルス・プミルス、枯草菌(Bacillus subtilis)、バクテロイデス・シータイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)、クロストリジウム・アルギディカーニス(Clostridium algidicarnis)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌(Escherichia coli)、ハロフェラックス・ボルカニ(Haloferax volcanii)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ(Methanocaldococcus jannaschii)、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス(Methanothermobacter thermautotrophicus)、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス(Pseudozyma tsukubaensis)、ラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド(Shigella boydii)、シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、ビブリオ・ナトリージェンス(Vibrio natrigens)又はヤロウイア・リポリティカを含む。

特に好ましい微生物は、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、緑膿菌、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウイア・リポリティカである。

本発明の更なる実施形態は、水、キナーゼ1、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェート並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む組成物であって、
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、組成物である。

本発明の更なる実施形態は、
i. 水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2並びにプレノール及び/又はイソプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体を用意するステップ、並びに
ii. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
iii. 必要に応じて、イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、水、キナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む水性媒体中での、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
1つ以上のキナーゼ2は、水、キナーゼ2並びにイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェート並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒することができ、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている、方法である。

好ましい実施形態では、37℃で10時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。より好ましい実施形態では、37℃で7時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。更により好ましい実施形態では、37℃で7時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも25%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。更により好ましい実施形態では、37℃で18時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも40%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。最も好ましい実施形態では、37℃で5時間のインキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも25%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。

イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する本発明の方法の一実施形態では、キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒しており、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。

イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する本発明の更なる方法では、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒しており、インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%、より好ましくは少なくとも20%、更により好ましくは少なくとも25%、更により好ましくは少なくとも30%、更により好ましくは少なくとも35%、更により好ましくは少なくとも40%、更により好ましくは少なくとも45%、更により好ましくは少なくとも50%、更により好ましくは少なくとも55%、更により好ましくは少なくとも60%、更により好ましくは少なくとも65%、更により好ましくは少なくとも70%、更により好ましくは少なくとも75%、更により好ましくは少なくとも80%、更により好ましくは少なくとも85%、更により好ましくは少なくとも90%、更により好ましくは少なくとも95%、更により好ましくは少なくとも96%、97%、98%、99%又は100%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている。

本発明の更なる実施形態は、
i. 水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2並びにイソプレノール及び/又はプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む水性媒体を用意するステップ、並びに
ii. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
iii. 必要に応じて、イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、方法である。

イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートを生成する本発明の更なる方法では、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している。

好ましい実施形態では、キナーゼ1は、配列番号37と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含み、
且つ
キナーゼ2は、配列番号85と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含む。

別の好ましい実施形態では、キナーゼ1は、配列番号1と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含み、
且つ
キナーゼ2は、配列番号486と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含む。

別の好ましい実施形態では、キナーゼ1は、配列番号291と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含み、
且つ
キナーゼ2は、配列番号103と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含む。

別の好ましい実施形態では、キナーゼ1は、配列番号46と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含み、
且つ
キナーゼ2は、配列番号88と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含む。

別の好ましい実施形態では、キナーゼ1は、配列番号49と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含み、
且つ
キナーゼ2は、配列番号88と、
少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超
の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はその機能的バリアントを含む。

本発明の更なる実施形態は、キナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物であって、
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、組換え構築物である。

キナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物の一実施形態では、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している。

キナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物の更なる実施形態では、キナーゼ1及びキナーゼ2はそれぞれ異種調節エレメント、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は他の任意の異種エレメントに機能的に連結されている。

本発明の別の実施形態は、キナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物を含む組換えベクターであり、キナーゼ1及びキナーゼ2はそれぞれ異種のもの、例えばプロモーター、ターミネーター、エンハンサー又は他の任意の異種エレメントに機能的に連結されている。

特に好ましい実施形態では、前記ベクターは配列番号109、110、又は491の配列を含む。

本発明の別の実施形態は、それぞれが異種調節エレメントに機能的に連結されているキナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物を含むか、又は、前記組換え構築物を含む組換えベクターを含む、組換え微生物である。

それぞれが異種調節エレメントに機能的に連結されているキナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物を含むか、又は、前記組換え構築物を含む組換えベクターを含む、組換え微生物は、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・アサイイ、アクロモバクター・デルマルヴァエ、アクロモバクター・ヴィスコサス、アクロモバクター・ラクチカム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラディオバクター、アルカリゲネス・フェカリス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・ツメセンス、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス、アルスロバクター・オキシダンス、アウレオバクテリウム・サペルダエ、アゾトバクター・インディカス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・グロボサム、ブレビバクテリウム・フスカム、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム・ヘルコラム、ブレビバクテリウム・プシラム、ブレビバクテリウム・テスタセウム、ブレビバクテリウム・ロセウム、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム、ブレビバクテリウム・リネンス、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ、コリネバクテリウム・アセトフィラム、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、エンテロバクター・アエロゲネス、エルウィニア・アミロボーラ、エルウィニア・カロトボーラ、エルウィニア・ヘルビコーラ、エルウィニア・クリサンテミ、フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカツム、フラボバクテリウム・アウランティナム、フラボバクテリウム・レナナム、フラボバクテリウム・セワネンセ、フラボバクテリウム・ブレーベ、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム、ミクロコッカス属の種CCM825、モルガネラ・モルガニイ、ノカルジア・オパカ、ノカルジア・ルゴサ、プラノコッカス・ユーシナタス、プロテウス・レッゲリ、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ロドクラウス、ロドコッカス属の種ATCC 15592、ロドコッカス属の種ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ビブリオ・メチニコフィイ、ビブリオ・チロゲネス、アクチノマデュラ・マデュレ、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、キタサトスポリア・パルロサ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、アエロモナス・サルモニシダ、バチルス・プミルス、バチルス・サーキュランス、バチルス・チアミノリティカス、エシェリキア・フロインディイ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム、セラチア・マルセッセンス、サルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・ショットムレリ、ザントモナス・シトリ、シネコシスティス属の種、シネココッカス・エロンガタス、サーモシネコッカス・エロンガタス、ミクロシスティス・アエルギノサ、ネンジュモ属の種、N.コミュネ、N.スファエリカム、ノストック・プンクチフォルメ、スピルリナ・プラテンシス、リングビヤ・マジュスキュラ、L.ラゲルヘイミイ、フォルミディウム・テヌエ、アナバエナ属の種、レプトリングビヤ属の種、サッカロミセス属の種、例えばサッカロミセス・セレビシエ、ハンセヌラ属の種、例えばハンセヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス属の種、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス属の種、例えばクルイベロミセス・ラクチス及びクルイベロミセス・マルキシアナス、ヤロウイア属の種、例えばヤロウイア・リポリティカ、ピキア属の種、例えばピキア・メタノリカ、ピキア・スティピテス及びピキア・パストリス、ジゴサッカロミセス属の種、例えばジゴサッカロミセス・ルキシー及びジゴサッカロミセス・バイリイ、カンジダ属の種、例えばカンジダ・ボイジニイ、カンジダ・ユティリス、カンジダ・フレイシュシイ、カンジダ・グラブラータ及びカンジダ・ソノレンシス、シュワンニオミセス属の種、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス、アルクスラ属の種、例えばアルクスラ・アデニニボランス、オガタエア属の種、例えばオガタエア・ミヌータ、クレブシエラ属の種、例えばクレブシエラ・ニューモニア、アスペルギルス属の種、例えばアスペルギルス・ニガー又ミセリオフトラ・サーモフィラを含むリストから好ましくは選択される。

より好ましくは、組換え微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカである。特に好ましい微生物は、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、緑膿菌、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウイア・リポリティカである。

本発明の別の実施形態は、水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2、イソプレノール及び/又はプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む組成物であって、
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、組成物である。

水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2、イソプレノール及び/又はプレノール並びに必要に応じて三リン酸ヌクレオチド、好ましくはATP並びに二価カチオン、好ましくはMg²⁺を含む組成物の更なる実施形態では、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している。

本発明の別の実施形態は、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び場合により1つ以上のイソプレノイド、好ましくはネロリドール、ファルネソール又はファルネセンを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む組換え微生物であって、
1つ以上のキナーゼ1は、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
1つ以上のキナーゼ2は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルへの反応を触媒している、組換え微生物である。

1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び必要に応じて、1つ以上のイソプレノイド、好ましくはネロリドール、ファルネソール又はファルネセンを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む組換え微生物の更なる実施形態では、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449,若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している。

本発明の別の実施形態は、1つ以上のイソプレノイド、好ましくはネロリドール、ファルネソール若しくはファルネセン若しくはイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩の発酵生成の方法であって、
i. 1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び必要に応じて、1つ以上のイソプレノイドを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む組換え微生物を用意するステップ、
ii. 前記微生物を、プレノール及び/又はイソプレノールを含む培地中で、前記1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩の生成を可能にする条件下で培養するステップ、並びに必要に応じて、培地から、前記1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩を単離するステップを含む、方法である。

本発明の更なる実施形態は、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び必要に応じて1つ以上のイソプレノイドを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む1つ以上の組換え微生物を含む組成物である。

一実施形態では、前記組成物は、プレノール及び/又はイソプレノール、培地並びに炭素源を更に含んでいる。

本発明の更なる実施形態は、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び必要に応じて1つ以上のイソプレノイド、好ましくはネロリドール、ファルネソール又はファルネセンを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む組換え微生物を生成する方法であって、
(I) 前記微生物において、プレノール及び/又はイソプレノールのリン酸化活性を有するキナーゼ1酵素をコードするキナーゼ1遺伝子の活性及び/又は発現を導入する、向上させる又は増強させるステップ、並びに
(II) 前記微生物において、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートのリン酸化活性を有するキナーゼ2酵素をコードするキナーゼ2遺伝子の活性及び/又は発現を導入する、向上させる又は増強させるステップ、並びに必要に応じて
(III) 前記微生物においてイソプレノイド生成経路の活性及び/又は発現を更に導入する、向上させる又は増強させるステップ
を含む、方法である。

上で定義の方法により作出される、或いは、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩の発酵生成の方法で使用される、組換え微生物は、グルコノバクター・オキシダンス、グルコノバクター・アサイイ、アクロモバクター・デルマルヴァエ、アクロモバクター・ヴィスコサス、アクロモバクター・ラクチカム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・ラディオバクター、アルカリゲネス・フェカリス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・ツメセンス、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミカス、アルスロバクター・オキシダンス、アウレオバクテリウム・サペルダエ、アゾトバクター・インディカス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ディバリカタム、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテリウム・グロボサム、ブレビバクテリウム・フスカム、ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム、ブレビバクテリウム・ヘルコラム、ブレビバクテリウム・プシラム、ブレビバクテリウム・テスタセウム、ブレビバクテリウム・ロセウム、ブレビバクテリウム・イマリオフィラム、ブレビバクテリウム・リネンス、ブレビバクテリウム・プロトファルミエ、コリネバクテリウム・アセトフィラム、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・カルナエ、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム、エンテロバクター・アエロゲネス、エルウィニア・アミロボーラ、エルウィニア・カロトボーラ、エルウィニア・ヘルビコーラ、エルウィニア・クリサンテミ、フラボバクテリウム・ペレグリナム、フラボバクテリウム・フカツム、フラボバクテリウム・アウランティナム、フラボバクテリウム・レナナム、フラボバクテリウム・セワネンセ、フラボバクテリウム・ブレーベ、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム、ミクロコッカス属の種CCM825、モルガネラ・モルガニイ、ノカルジア・オパカ、ノカルジア・ルゴサ、プラノコッカス・ユーシナタス、プロテウス・レッゲリ、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、ロドコッカス・エリスロポリス、ロドコッカス・ロドクラウス、ロドコッカス属の種ATCC 15592、ロドコッカス属の種ATCC 19070、スポロサルシナ・ウレエ、スタフィロコッカス・アウレウス、ビブリオ・メチニコフィイ、ビブリオ・チロゲネス、アクチノマデュラ・マデュレ、アクチノマイセス・ビオラセオクロモゲネス、キタサトスポリア・パルロサ、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、アエロモナス・サルモニシダ、バチルス・プミルス、バチルス・サーキュランス、バチルス・チアミノリティカス、エシェリキア・フロインディイ、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム、セラチア・マルセッセンス、サルモネラ・チフィムリウム、サルモネラ・ショットムレリ、ザントモナス・シトリ、シネコシスティス属の種、シネココッカス・エロンガタス、サーモシネコッカス・エロンガタス、ミクロシスティス・アエルギノサ、ネンジュモ属の種、N.コミュネ、N.スファエリカム、ノストック・プンクチフォルメ、スピルリナ・プラテンシス、リングビヤ・マジュスキュラ、L.ラゲルヘイミイ、フォルミディウム・テヌエ、アナバエナ属の種、レプトリングビヤ属の種、サッカロミセス属の種、例えばサッカロミセス・セレビシエ、ハンセヌラ属の種、例えばハンセヌラ・ポリモルファ、シゾサッカロミセス属の種、例えばシゾサッカロミセス・ポンベ、クルイベロミセス属の種、例えばクルイベロミセス・ラクチス及びクルイベロミセス・マルキシアナス、ヤロウイア属の種、例えばヤロウイア・リポリティカ、ピキア属の種、例えばピキア・メタノリカ、ピキア・スティピテス及びピキア・パストリス、ジゴサッカロミセス属の種、例えばジゴサッカロミセス・ルキシー及びジゴサッカロミセス・バイリイ、カンジダ属の種、例えばカンジダ・ボイジニイ、カンジダ・ユティリス、カンジダ・フレイシュシイ、カンジダ・グラブラータ及びカンジダ・ソノレンシス、シュワンニオミセス属の種、例えばシュワンニオミセス・オクシデンタリス、アルクスラ属の種、例えばアルクスラ・アデニニボランス、オガタエア属の種、例えばオガタエア・ミヌータ、クレブシエラ属の種、例えばクレブシエラ・ニューモニア、アスペルギルス属の種、例えばアスペルギルス・ニガー又はミセリオフトラ・サーモフィラを含むリストから好ましくは選択される。

より好ましくは、組換え微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカである。

特に好ましい組換え微生物は、枯草菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、緑膿菌、シュードモナス・プチダ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ及びヤロウイア・リポリティカである。

本発明の更なる実施形態は、
i. キナーゼ1をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター、及び
ii. キナーゼ2をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター
を含む組換え発現構築物であって、
キナーゼ1又はキナーゼ2に機能的に連結されたプロモーターのうちの少なくとも1つは、キナーゼ1又はキナーゼ2に対して異種であり、
キナーゼ1は、
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
b. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
c. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
d. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
e. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルへの反応を触媒している、組換え発現構築物である。

一実施形態では、本発明は、
i. キナーゼ1をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター、及び
ii. キナーゼ2をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター
を含む組換え発現構築物であって、
キナーゼ1又はキナーゼ2に機能的に連結されたプロモーターのうちの少なくとも1つは、キナーゼ1又はキナーゼ2に対して異種であり、キナーゼ2は、
f. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、組換え発現構築物である。

キナーゼ1及びキナーゼ2は、それぞれ異種プロモーターの制御下にあってもよく、キナーゼ1、キナーゼ2又はその両方に対して異種である1つのプロモーターの制御下にあるオペロンに配置されていてもよい。オペロンは、IPP及び/又はDMAPPからの好ましいイソプレノイドの生成にとって必要な更なる遺伝子を含むことができる。

配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483又は486の配列のいずれかとある特定の同一性を有するアミノ酸分子は、配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483又は486のいずれかと、少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超の配列同一性を有するアミノ酸分子を含む。

配列番号2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、109、110、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268、271、274、277、280、283、286、289、292、295、298、301、304、307、310、313、316、319、322、325、349、358、361、367、379、388、394、397、412、430、442、445、448、463、478、481、484、487、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266、269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380、383、386、389、392、395、398、401、404、407、410、413、416、419、422、425、428、431、434、437、440、443、446、449、452、455、458、461、464、467、470、473、476、479、482、485又は488の配列のいずれかとある特定の同一性を有する核酸分子は、配列番号2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、32、33、35、36、38、39、41、42、44、45、47、48、50、51、53、54、56、57、59、60、62、63、65、66、68、69、71、72、74、75、77、78、80、81、83、84、86、87、89、90、92、93、95、96、98、99、101、102、104、105、107、108、109、110、112、115、118、121、124、127、130、133、136、139、142、145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、199、202、205、208、211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268、271、274、277、280、283、286、289、292、295、298、301、304、307、310、313、316、319、322、325、349、358、361、367、379、388、394、397、412、430、442、445、448、463、478、481、484、487、113、116、119、122、125、128、131、134、137、140、143、146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、200、203、206、209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266、269、272、275、278、281、284、287、290、293、296、299、302、305、308、311、314、317、320、323、326、329、332、335、338、341、344、347、350、353、356、359、362、365、368、371、374、377、380、383、386、389、392、395、398、401、404、407、410、413、416、419、422、425、428、431、434、437、440、443、446、449、452、455、458、461、464、467、470、473、476、479、482、485又は488のいずれかと、少なくとも50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%若しくはそれ超の配列同一性を有する核酸分子を含む。

本発明のアミノ酸分子の機能的断片は、配列番号1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64、67、70、73、76、79、82、85、88、91、94、97、100、103、106、111、114、117、120、123、126、129、132、135、138、141、144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、198、201、204、207、210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267、270、273、276、279、282、285、288、291、294、297、300、303、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、342、345、348、351、354、357、360、363、366、369、372、375、378、381、384、387、390、393、396、399、402、405、408、411、414、417、420、423、426、429、432、435、438、441、444、447、450、453、456、459、462、465、468、471、474、477、480、483又は486の配列のいずれかの少なくとも50個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも75個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも100個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも125個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも150個の連続したアミノ酸、更により好ましくは少なくとも175個の連続したアミノ酸、更により好ましくは少なくとも200個の連続したアミノ酸、更により好ましくは少なくとも225個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも250個の連続したアミノ酸、を含む。

本発明の更なる実施形態は、
i. キナーゼ1をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター、及び
ii. キナーゼ2をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター
を含む組換え発現構築物を含む組換えベクターであって、
キナーゼ1又はキナーゼ2に機能的に連結されたプロモーターのうちの少なくとも1つは、キナーゼ1又はキナーゼ2に対して異種である、組換えベクターである。キナーゼ1及びキナーゼ2は、それぞれ異種プロモーターの制御下にあってもよく、キナーゼ1、キナーゼ2又はその両方に対して異種である1つのプロモーターの制御下にあるオペロンに配置されていてもよい。オペロンは、IPP及び/又はDMAPPからの好ましいイソプレノイドの生成にとって必要な更なる遺伝子を含むことができる。

本発明の更なる実施形態は、a)キナーゼ1をコードする核酸分子に機能的に連結された微生物において機能的なプロモーター及びキナーゼ2をコードする核酸分子に機能的に連結された微生物において機能的なプロモーターを含む組換え発現構築物であり、キナーゼ1又はキナーゼ2に機能的に連結されたプロモーターのうちの少なくとも1つは、キナーゼ1又はキナーゼ2に対して異種である組換え発現構築物か、又は、b)前記組換え発現構築物を含む組換えベクターを含む、組換え微生物である。

好ましくは、組換え微生物は、ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカである。

本発明の別の実施形態は、上で定義の組換え微生物を培養する又は増殖する方法であって、培養培地に前記組換え微生物のうちの1つ以上を接種するステップ、並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む培養培地中で前記組換え微生物を培養するステップ又は増殖するステップを含む、方法である。

本発明の別の実施形態は、プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩に、全細胞生物変換するための、上で定義の組換え微生物又は上で定義の組成物の使用である。

本発明の別の実施形態は、プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はIPP若しくはその塩及び/又はDMAPP若しくはその塩に、全細胞生物変換する方法であって、
I) 上で定義の組換え微生物を、イソプレノール及び/又はプレノール、前記組換え微生物を増殖するのに適した培地並びにC源を含む発酵槽で増殖するステップ、並びに
II) I)で得られた発酵ブロスから、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はIPP若しくはその塩及び/又はDMAPP若しくはその塩を回収するステップ
を含む、方法である。

本発明の別の実施形態は、プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はIPP若しくはその塩及び/又はDMAPP若しくはその塩に、全細胞生物変換する方法であって、
i) 上で定義の組換え微生物を、前記組換え微生物を増殖するのに適した培地及びC源を含む発酵槽で増殖するステップ、並びに
ii) 発酵槽から組換え微生物を回収するステップ、並びに
iii) イソプレノール/プレノールを補充することによって、培地中で全細胞生物変換を実施するステップ、並びに
iv) iii)で得られた媒体から1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はIPP及び/若しくはDMAPPを回収するステップ
を含む、方法である。

定義
理解すべきこととして、本発明は特定の手法又はプロトコルに限定されるものでない。理解すべきこととしてまた、本明細書で使用される用語法は特定の実施形態を説明することだけを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するのもではない。留意しなければならないこととして、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の言及を含むものである。したがって、例えば、「ベクター(a vector)」への言及は1つ以上のベクターへの言及であり、当業者であれば知られているその等価物等を含むものである。本明細書で使用される「約」という用語は、概、およそ、あたり、又はほぼを意味する。「約」という用語を数字の範囲と併せて使用される場合、この用語は記載した数値の上下の境界を拡大することによってその範囲を加減する。全体として、本明細書では「約」という用語を使用して、表記された数値の上下に、20%、好ましくは10%の相違分だけ上下に(より高く又はより低く)数値を加減する。本明細書で使用される場合、「又は(若しくは)」という語は特定の列記の任意の1つのメンバを意味し、その列記のメンバの任意の組合せも含むものである。本明細書及び以下の特許請求の範囲で使用される場合、「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」、「含む(include)」、「含めて(including)」及び「含む(includes)」という語は、1つ以上の記載した特性、整数、成分、又はステップの存在を明示することを意図するが、それらの語は1つ以上のその他の特性、整数、成分、ステップ、又はそれらの群の存在又は付加を排除するものではない。明確にするために、本明細書で使用されるある特定の用語を以下のように定義し且つ使用する。

アンチパラレル:「アンチパラレル」とは本明細書では、リン酸ジエステル結合が一方のヌクレオチド配列では5'-3'方向に進行しもう一方のヌクレオチド配列では3'-5'方向に進行している、相補性の塩基残基の間の水素結合をとおして対合した2つのヌクレオチド配列を指す。

アンチセンス:「アンチセンス」という用語は、ヌクレオチド配列であって、転写又は機能向けのその通常の配向に対して逆位であり、したがって、宿主細胞内で発現される標的遺伝子mRNA分子と相補的であるRNA転写物(例えば、これは、標的遺伝子mRNA分子又は一本鎖ゲノムDNAとワトソン-クリック塩基対合をとおしてハイブリダイズすることができる)を発現するヌクレオチド配列、又は標的DNA分子、例えば宿主細胞に存在するゲノムDNAと相補的であるヌクレオチド配列を指す。

コード領域:本明細書で使用される場合、「コード領域」という用語は、構造遺伝子に関連して使用される場合、mRNA分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドに見いだされるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物においては、5'側に、イニシエーターのメチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ATG」が結合しており、3'側に、終止コドンを規定する3つのトリプレット(すなわち、TAA、TAG、TGA)のうちの1つが結合している。イントロンを含有することに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、RNA転写物に存在する配列の5'末端と3'末端の両方に位置する配列も含むことができる。これらの配列は、「隣接(flanking)」配列又は領域と呼ばれる(これらの隣接配列はmRNA転写物に存在する非翻訳配列に対して5'若しくは3'に位置する)。5'隣接領域は、調節配列、例えば、遺伝子の転写を制御する又はそれに影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサーを含有することができる。3'隣接領域は、転写の終結、転写後の切断及びポリアデニル化を方向づける配列を含有することができる。

相補的:「相補的」又は「相補性」とは、アンチパラレルなヌクレオチド配列の相補的塩基残基間で水素結合を形成すると(塩基対律によって)互いに対合することができるアンチパラレルなヌクレオチド配列を含む、2つのヌクレオチド配列を指す。例えば、配列5'-AGT-3'は、配列5'-ACT-3'と相補的である。相補性は「部分的」であっても「全体」であってもよい。「部分的」相補性とは、1つ以上の核酸塩基が塩基対律に準じてマッチしていない場合である。2つの核酸分子間の「全体」又は「完全」相補性とは、それぞれ及び全ての核酸塩基が他の塩基と、塩基対律のもとでマッチしている場合である。核酸分子鎖間の相補性の程度は、核酸分子鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しい影響を及ぼす。本明細書で使用される核酸配列の「相補体」とは、ヌクレオチド配列であって、これの核酸分子が核酸配列の核酸分子に対して全体相補性を示すヌクレオチド配列を指す。

ドナーDNA分子:本明細書で使用される場合、「ドナーDNA分子」、「修復DNA分子」又は「鋳型DNA分子」という用語は全て、本明細書で交換可能に使用され、細胞のゲノムに導入される配列を有するDNA分子を意味する。ドナーDNA分子は、前記細胞のゲノムの標的領域中の配列と相同又は同一の配列が5'末端及び/又は3'末端に隣接することができる（に挟まれうる）。ドナーDNA分子は、それぞれの細胞において天然には存在しない配列、例えば標的領域に導入されることになるORF、非コードRNA又は調節エレメントを含むことができ、又は、ドナーDNA分子は、少なくとも1つの突然変異、遺伝子編集を除いて標的領域と相同である配列を含むことができる。ドナーDNA分子の配列はゲノムに付加されてもよく、又は、ドナーDNA分子の配列はドナーDNA配列の長さのゲノム中の配列に置きかわってもよい。

二本鎖RNA:「二本鎖RNA」分子又は「dsRNA」分子は、ヌクレオチド配列のセンスRNA断片及び当該ヌクレオチド配列のアンチセンスRNA断片を含むが、両方のRNA断片が互いに相補的なヌクレオチド配列を含み、それによって、センスとアンチセンスのRNA断片が対合し且つ二本鎖RNA分子を形成することが可能となる。

内因性:「内因性」ヌクレオチド配列とは、非形質転換細胞のゲノム中に存在するヌクレオチド配列を指す。

発現:「発現」とは、細胞における、遺伝子産物の生合成、好ましくは、ヌクレオチド配列、例えば、内因性遺伝子又は異種遺伝子の転写及び/又は翻訳を指す。例えば、構造遺伝子の場合には、発現は構造遺伝子のmRNAへの転写及び - 必要に応じて - mRNAの1つ以上のポリペプチドへの続いて行われる翻訳を伴う。他の場合では、発現とはRNA分子を宿すDNAの転写のみを指す場合がある。

発現構築物:本明細書で使用される「発現構築物」とは、細胞中の特定のヌクレオチド配列の発現を方向づけることができるDNA配列であって、それが導入されることになる前記細胞中で機能的なプロモーターを含むDNA配列を意味するが、これは - 必要に応じて - 終結シグナルに動作可能に連結されている目的のヌクレオチド配列に動作可能に連結されている。翻訳が必要である場合、発現構築物はまた通常には、ヌクレオチド配列の適当な翻訳に必要な配列も含む。コード領域は目的のタンパク質をコードすることができるがまた、目的の機能的RNA、例えばRNAa、siRNA、snoRNA、snRNA、マイクロRNA、ta-siRNA又は他の任意の非コード調節性RNAをセンス方向又はアンチセンス方向にコードすることもできる。目的のヌクレオチド配列を含む発現構築物はキメラであってもよく、これは、その成分のうちの1つ以上がその他の成分のうちの1つ以上に対して異種であることを意味する。発現構築物はまた、天然に存在するが、異種発現にとって有用な組換え形態で得られたものであってもよい。しかし通常には、発現構築物は宿主に対して異種である、すなわち、発現構築物の特定のDNA配列は宿主細胞で天然に生じるものでなく、形質転換事象によって宿主細胞中に又は宿主細胞の祖先中に導入されていることが必要である。発現構築物中のヌクレオチド配列の発現は、構成型プロモーターの制御下にあってもよく、宿主細胞を特定のいくつかの外界刺激に暴露した場合にだけ転写を開始する誘導型プロモーターの制御下にあってもよい。

外来:「外来」という用語は、細胞のゲノム中に実験操作によって導入された任意の核酸分子(例えば、遺伝子配列)を指し、導入された配列がいくつかの改変(例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等)を含有し且つそれ故に天然に存在する配列と比較して異なる限り、上記細胞中に見いだされる配列を含むことができる。

機能的リンケージ:「機能的リンケージ」又は「機能的に連結した」という用語は、例えば、調節エレメント(例えばプロモーター)の発現される核酸配列との、及び、適宜、更なる調節エレメント(例えばターミネーター)との連鎖配列であって、それぞれの調節エレメントがその目的の機能を完遂して前記核酸配列の発現を可能にし、改変し、容易にし又はさもなくばそれに影響を与えることができるような形での連鎖配列を意味すると理解されたい。同義語として、「作動可能なリンケージ」又は「作動可能に連結された」という表現を使用してもよい。発現は、センスRNA又はアンチセンスRNAとの関連で核酸配列の配置に応じてもたらされ得る。この目的のため、化学的意味の直接リンケージは必ずしも必要でない。例えば、遺伝子制御配列、例えばエンハンサー配列も、更に離れた位置から、又は実際に、他のDNA分子からでも、標的配列に対するその機能を働かせることができる。好ましい配置とは、発現させる核酸配列がプロモーターとして作用する配列の後方に組換えで位置され、その結果、2つの配列がお互いに共有結合で連結されている、配置である。プロモーター配列と発現される核酸配列の間の距離は、組換え的に200塩基対未満であることが好ましく、特に好ましくは100塩基対未満、非常に特に好ましくは50塩基対未満である。好ましい実施形態では、転写開始が本発明のキメラRNAの所望の始まりと同一であるような形で、転写される核酸配列をプロモーターの後方に位置させる。機能的リンケージ、及び発現構築物は、(例えば、Maniatis T, Fritsch EF and Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY); Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscienceに)記載の慣用の組換え及びクローニング技法の手段によって作製することができる。しかし、例えば、制限酵素に対する特異的切断部位をもつリンカーとして又はシグナルペプチドとして作用する、更なる配列も2つの配列の間に位置させることができる。配列の挿入はまた、融合タンパク質の発現をもたらすことができる。好ましくは、調節領域、例えばプロモーター及び発現させる核酸配列のリンケージからなる発現構築物を、ベクターに統合された形態で存在させることができ、例えば、形質転換によってゲノムへと挿入することができる。

遺伝子:「遺伝子」という用語は、遺伝子産物(例えば、ポリペプチド又は機能的RNA)の発現をいくつかの方式で調節することができる適当な調節配列に作動可能に接続された領域を指す。遺伝子は、コード領域(オープンリーディングフレーム、ORF)に先行する(上流の)及び後続する(下流の)DNAの非翻訳調節領域(例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー等)並びに、適用可能であれば、個々のコード領域(すなわちエクソン)の間に介在配列(すなわちイントロン)を含む。本明細書で使用される「構造遺伝子」という用語は、特定のポリペプチドにとって特徴であるアミノ酸の配列に次いで翻訳されるmRNAに転写される、DNA配列を意味することを意図している。

本明細書で使用される場合「遺伝子編集」とは、細胞のゲノムの特定の位置に特定の突然変異を導入することを意味する。遺伝子編集は、より高度な技術を適用して、例えば、CRISPR Casシステム及びドナーDNA、又は変異原性活性、例えばデアミナーゼに連結されたCRISPR Casシステムを使用して、正確な編集によって導入することができる(国際公開第15133554号、国際公開第17070632号)。

ゲノム及びゲノムDNA:「ゲノム」又は「ゲノムDNA」という用語は、宿主生物体の遺伝性の遺伝子情報を指している。前記ゲノムDNAには核のDNA(染色体DNAとも呼ばれる)が含まれるがまた、色素体(例えば葉緑体)及びその他の細胞小器官(例えばミトコンドリア)のDNAも含まれる。好ましくは「ゲノム」又は「ゲノムDNA」という用語は、核の染色体DNAを指している。

異種:核酸分子又はDNAに関する「異種」という用語は、核酸分子であって、例えばWT細胞のゲノムにおいて、天然ではそれが作動可能に連結されてない、或いは、例えばWT細胞のゲノムにおいて、天然では異なる場所又は位置でそれが作動可能に連結されている第2の核酸分子、例えばプロモーターに、作動可能に連結されている、又は作動可能に連結されるように操作されている、核酸分子を指す。

好ましくは、核酸分子又はDNAに関する「異種」という用語は、核酸分子であって、天然ではそれが作動可能に連結されてない第2の核酸分子、例えばプロモーター又はオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、又は作動可能に連結されるように操作されている、核酸分子を指す。

核酸分子及びそれに連結された1つ以上の調節核酸分子(例えばプロモーター又は転写終結シグナル)を含む異種発現構築物とは、例えば、実験操作によって生じている構築物であって、a)前記核酸分子又はb)前記調節核酸分子のいずれか又はc)両方(すなわち(a)と(b))がその天然(ネイティブ)の遺伝環境に存在しないか、又は、実験遺伝子操作によって改変されている構築物であり、改変の例とは1個以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、逆位又は挿入である。天然の遺伝環境とは、起源の生物体における天然の染色体遺伝子座を、又はゲノムライブラリー中の存在を指す。ゲノムライブラリーの場合、核酸分子の配列の天然の遺伝環境は、少なくとも部分的に保持されているのが好ましい。環境は、核酸配列に少なくとも片側で隣接し、少なくとも50bp、好ましくは少なくとも500bp、特に好ましくは少なくとも1,000bp、非常に特に好ましくは少なくとも5,000bpの長さの配列を有する。天然に存在する発現構築物が - 例えば、プロモーターと対応する遺伝子との天然に存在する組合せが - 非天然の合成の「人工的」方法、例えば突然変異誘発によって改変される場合、トランスジェニック発現構築物になる。そのような方法が記載されている(米国特許第5,565,350号;国際公開第00/15815号)。例えば、プロモーターに作動可能に連結されたタンパク質をコードする核酸分子は、上記プロモーターはこの分子のネイティブのプロモーターではないが、プロモーターについて異種であるとされる。好ましくは、異種DNAとは、これが導入される細胞にとって内因性ではないか又はそれと天然では関連していないが、別の細胞から得られたものであるか又は合成されたものである。異種DNAにはまた、いくつかの改変を含有する内因性DNA配列、内因性DNA配列の天然には存在しない多重のコピー、又はそれに物理的に連結された別のDNA配列と天然では関連していないDNA配列も含まれる。一般に、必ずではないが、異種DNAはそれが発現される細胞によって通常産生されないRNA又はタンパク質をコードする。

ハイブリダイゼーション:本明細書で定義の「ハイブリダイゼーション」という用語は、実質的に相補的なヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションのプロセスは完全に溶液中で行うことができる、すなわち、相補的核酸の両方が溶液中に存在する。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、マトリクスに、例えば磁性ビーズ、セファロースビーズ又は他の任意のレジンに固定化される相補的な核酸のうちの1つを用いて行うことができる。ハイブリダイゼーションのプロセスは、固体支持体に、例えばニトロセルロース又はナイロン膜に固定化された、或いは例えばフォトリソグラフィーによって、例えば石英質ガラス支持体に固定化された相補的な核酸(後者は核酸アレイ若しくはマイクロアレイとして、又は核酸チップとして知られる)のうちの1つを使用して更に行うことができる。ハイブリダイゼーションを行うため、一般には核酸分子を、熱的に又は化学的に変性して、二本鎖を2つの一本鎖に融解し及び/又はヘアピン又は他の2次構造を一本鎖の核酸から取り除く。

「ストリンジェンシー」という用語は、その下でハイブリダイゼーションが行われる条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、条件、例えば温度、塩濃度、イオン強度及びハイブリダイゼーション緩衝剤組成によって影響を受ける。一般に、低ストリンジェンシー条件は、規定のイオン強度及びpHにての特定の配列に対する熱融点(Tm)よりも約30℃低いように選択される。中ストリンジェンシー条件とは、温度がTmより20℃下にある場合であり、高ストリンジェンシー条件とは、温度がTmより10℃下にある場合である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は通常には、標的核酸配列に対して高い配列類似性を有するハイブリダイズする配列を単離するために使用される。しかし、核酸は、遺伝コードの縮重に起因して、配列において逸脱するが、依然として実質的に同一のポリペプチドをコードすることがある。したがって、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は時として、そのような核酸分子を特定するのに必要とされることがある。

「Tm」とは、規定のイオン強度及びpHの下の温度であり、この温度で標的配列の50%が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする。Tmは、溶液状態及び塩基組成及びプローブ長に依存する。例えば、より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションの最大速度は、Tmより約16℃から最大32℃下で得られる。ハイブリダイゼーション溶液中の一価カチオンの存在は、2本の核酸鎖の間の静電反発力を減少させ、それによってハイブリッド形成を促進する。この効果は、最大0.4Mのナトリウム濃度に対して認められる(より高い濃度については、この効果は無視することができる)。ホルムアミドは、ホルムアミドのパーセントごとに0.6～0.7℃でDNA-DNA及びDNA-RNA二重鎖の融点温度を減少させ、50%ホルムアミドの添加によって、ハイブリダイゼーションを30～45℃で実施することが可能となるが、ハイブリダイゼーション速度は低下することになる。塩基対ミスマッチではハイブリダイゼーション速度及び二重鎖の熱安定性が減少する。平均して及び長いプローブの場合、Tmは塩基ミスマッチ1%あたり約1℃低下する。Tmは、ハイブリッドのタイプに応じて、以下の方程式を使用して算出することができる:
DNA-DNAハイブリッド(Meinkoth and Wahl, Anal. Biochem., 138: 267-284, 1984):
Tm = 81.5℃ + 16.6×log[Na+]a + 0.41×%[G/Cb] - 500×[Lc]-1 - 0.61×%ホルムアミド
DNA-RNA又はRNA-RNAハイブリッド:
Tm = 79.8 + 18.5 (log10[Na+]a) + 0.58 (%G/Cb) + 11.8 (%G/Cb)2 - 820/Lc
オリゴ-DNA又はオリゴ-RNAdハイブリッド:
<20ヌクレオチドの場合: Tm = 2 (ln)
20～35ヌクレオチドの場合: Tm = 22 + 1.46 (ln)
a 又は他の一価カチオンの場合、しかし0.01～0.4M範囲においてのみ正しい。
b 30%～75%範囲における%GCについてのみ正しい。
c L = 塩基対における二重鎖の長さ。
d オリゴ、オリゴヌクレオチド; ln = プライマーの有効長 = 2×(G/Cの数)+(A/Tの数)。

非特異的結合は、いくつかの既知の技法、例えばタンパク質含有溶液によるメンブレンのブロッキング、ハイブリダイゼーション緩衝剤への異種RNA、DNA及びSDSの添加、並びにRnaseによる処理のいずれか1つを使用して制御することができる。非関連プローブの場合、一連のハイブリダイゼーションは、(i)アニーリング温度を徐々に低下させること(例えば68℃から42℃へ)、又は(ii)ホルムアミド濃度を徐々に低下させること(例えば50%から0%へ)のうちの1つに変化を与えることによって実施することができる。当業者であれば、ハイブリダイゼーション過程で変更することができ、且つ、ストリンジェンシー条件を維持するか又は変化させることになる種々のパラメーターについて知っている。

ハイブリダイゼーション条件の他に、ハイブリダイゼーションの特異性はまた通常には、ポストハイブリダイゼーション洗浄の機能にも依存する。非特異的ハイブリダイゼーションから生じるバックグラウンドを除去するために、試料を希釈塩溶液で洗浄する。そのような洗浄の極めて重要な因子には、最終洗浄溶液のイオン強度及び温度が含まれる。塩濃度が低いほどそして洗浄温度が高いほど、洗浄のストリンジェンシーは高くなる。洗浄条件は通常には、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー以下で実施される。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍であるシグナルを与える。一般に、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は遺伝子増幅検出法に適したストリンジェント条件は、上に記載のとおりである。より高い又は低いストリンジェント条件を選択することもできる。当業者であれば、洗浄過程で変更することができ、且つ、ストリンジェンシー条件を維持するか又は変化させることになる種々のパラメーターについて知っている。

例えば、50ヌクレオチドよりも長いDNAハイブリッドについての通常の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、1×SSC中65℃にての、又は1×SSC及び50%ホルムアミド中42℃にてのハイブリダイゼーション、これに続く0.3×SSC中65℃にての洗浄を包含する。50ヌクレオチドよりも長いDNAハイブリッドについての中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、4×SSC中50℃にての、又は6×SSC及び50%ホルムアミド中40℃にてのハイブリダイゼーション、これに続く2×SSC中50℃にての洗浄を包含する。ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズする核酸について想定される長さである。知られている配列の核酸がハイブリダイズされる場合、ハイブリッドの長さは、配列をアラインメントすること及び本明細書に記載の保存領域を特定することによって決定することができる。1×SSCとは、0.15M NaCl及び15mMクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーション溶液及び洗浄溶液は、5×デンハルト試薬、0.5～1.0%SDS、変性の断片化したサケ精子DNA 100μg/ml、0.5%ピロホスフェートナトリウムを付加的に含んでもよい。高ストリンジェンシーの別の例とは、0.1SDS及び必要に応じて5×デンハルト試薬、変性の断片化したサケ精子DNA 100μg/ml、0.5%ピロホスフェートナトリウムを含む0.1×SSC中65℃にてのハイブリダイゼーション、これに続く0.3×SSC中65℃にての洗浄である。

ストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, New Yorkを又はCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 and yearly updates)を参照することができる。

「同一性」:「同一性」とは、2つ以上の核酸分子又はアミノ酸分子の比較について使用される場合、前記分子の配列がある特定の程度の配列類似性を共有し、配列が部分的に同一であることを意味する。

酵素バリアントは、親酵素と比較した場合のその配列同一性によって定義することができる。配列同一性は通常、「%配列同一性」又は「%同一性」として提供される。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を決定するために、第1の段階で、これら2つの配列間でペアワイズ配列アラインメントを作成するが、この場合、それらの完全長にわたって2つの配列のアラインメントを取る(すなわちペアワイズグローバルアラインメント)。アラインメントは、Needleman及びWunschのアルゴリズム(J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)を実装するプログラムを用いて、好ましくは、プログラムデフォルトパラメータ(ギャップオープン=10.0、ギャップ伸長=0.5及びマトリクス=EBLOSUM62)でプログラム「NEEDLE」(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))を使用することによって、作成される。本発明の目的のための好ましいアラインメントとは、最も高い配列同一性を決定することができる、そういったアラインメントである。

以下の例は、2つのヌクレオチド配列を例示するためのものであるが、同じ計算がタンパク質配列に適用される:
Seq A: AAGATACTG 長さ: 9塩基
Seq B: GATCTGA 長さ: 7塩基
したがって、より短い配列は配列Bである。

それらの完全長にわたって両配列を示しているペアワイズグローバルアラインメントを作成すると、

が得られる。

アラインメントの「|」という符号は、同一の残基を指示する(これは、DNAについては塩基又はタンパク質についてはアミノ酸を意味する)。同一残基の数は6である。
アラインメントの「-」という符号はギャップを指示する。Seq B内のアラインメントによって導入されるギャップの数は1である。Seq Bの境界でアラインメントによって導入されるギャップの数は2であり、Seq Aの境界でギャップの数は1である。
それらの完全長にわたってアラインメントを取った配列を示すアラインメントの長さは10である。

本発明によるその完全長にわたってより短い配列を示しているペアワイズアラインメントを作成すると:

が結果として得られる。

本発明によるその完全長にわたって配列Aを示しているペアワイズアラインメントを作成すると:

が結果として得られる。

本発明によるその完全長にわたって配列Bを示しているペアワイズアラインメントを作成すると:

が結果として得られる。

その完全長にわたってより短い配列を示しているアラインメントの長さは8である(より短い配列のアラインメントの長さに含められる1つのギャップが存在する)。
したがって、その完全長にわたってSeq Aを示すアラインメントの長さは9となる(Seq Aが本発明の配列であることを意味する)。
したがって、その完全長にわたってSeq Bを示すアラインメントの長さは8となる(Seq Bが本発明の配列であることを意味する)。
2つの配列のアラインメントを取った後、第2の段階において、同一性値を作成したアラインメントから決定する。本明細書の目的のため、パーセント同一性を、%同一性=(同一残基/その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列を示しているアラインメント領域の長さ)×100によって算出する。したがって、本実施形態による2つのアミノ酸配列の比較に関連した配列同一性は、同一残基の数を、その完全長にわたって本発明のそれぞれの配列を示しているアラインメント領域の長さで割ることによって算出される。この値に100を掛け、「%同一性」が得られる。上に提供の例によれば、%同一性は:本発明の配列であるSeq Aについては(6 / 9)×100 = 66.7%であり、本発明の配列であるSeq Bについては(6 / 8)×100 = 75%である。

InDelとは、NHEJによるDSBの修復に関連する、生物体のゲノムにおける塩基のランダムな挿入又は欠失についての用語である。これは、長さが1～10000塩基対で評価して、小さな遺伝的変異のうちに分類される。本明細書で使用される場合、InDelは、標的部位中の又は標的部位にすぐ近くの(例えば1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、25bp、20bp、15bp、10bp又は5bp未満で上流及び/又は下流に)塩基のランダム挿入又は欠失を指す。

標的DNAの標的部位へのドナーDNA分子の導入に関する「導入する」、「導入」等という用語は、例えば、標的領域へのドナーDNA分子若しくはそれの部分の物理的統合又は標的領域へのドナーDNA分子の配列若しくはそれの部分の導入によって、標的領域へのドナーDNA分子の配列の任意の導入を意味し、この場合、ドナーDNAをポリメラーゼの鋳型として使用する。

イントロン:イントロンとは遺伝子内のDNAのセクション(介在配列)を指し、これは、当該遺伝子が産生するタンパク質の部分をコードせず、且つ、当該遺伝子から転写されるmRNAよりスプライシングで切り出されるのであるが、これの後に、mRNAは細胞核から輸送される。イントロン配列とはイントロンの核酸配列を指す。したがって、イントロンは、コード配列(エクソン)と共に転写されるが、成熟mRNAの形成過程で取り除かれるDNA配列のそういった領域である。イントロンは実コード領域内に位置することがあり又はプレmRNA(未スプライシングmRNA)の5'若しくは3'非翻訳リーダーのいずれかの内に位置することがある。一次転写物中のイントロンは切除され、コード配列は同時に且つ正確にライゲートされて成熟RNAを形成する。イントロンとエクソンの接合部（ジャンクション）がスプライス部位を形成する。イントロンの配列はGUで始まりそしてAGで終わる。更に、植物においては、2例のAU-ACイントロンが記載されている:シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来のRecA様タンパク質遺伝子の第14イントロン及びG5遺伝子の第7イントロンはAT-ACイントロンである。イントロンを含有するプレmRNAは短い3つの配列を有する、これらの配列は - 他の配列と比べて - イントロンが正しくスプライシングされるのに必須である。これらの配列は5'スプライス部位、3'スプライス部位及び分岐点である。mRNAスプライシングとは、一次mRNA転写物中に存在する介在配列(イントロン)の除去及びエクソン配列の接続又はライゲーションである。これはまた、介在配列(イントロン)の除去と共に同じmRNA上の2つのエクソンを接続するシススプライシングとしても知られる。イントロンの機能的エレメントは、スプライセオソーム(例えば、イントロンの端部にてのスプライシングコンセンサス配列)の特定のタンパク質成分によって認識及び結合される配列を含んでいる。機能的エレメントのスプライセオソームとの相互作用によって、成熟前mRNAからのイントロン配列の除去及びエクソン配列の再接続がもたらされる。イントロンは短い3つの配列を有し、これらは、イントロンが正しくスプライシングされるのに - 十分ではないが - 必須である。これらの配列は、5'スプライス部位、3'スプライス部位及び分岐点である。分岐点配列はスプライシング及びスプライス部位選択において重要である。分岐点配列は通常、3'スプライス部位の10～60ヌクレオチド上流に存在する。

同質遺伝子的である:異種DNA配列の存在又は非存在によって異なり得ることを除いて、遺伝的に同一である生物体。

単離された:本明細書で使用される「単離された」という用語は、材料は、人手によって取り出されており、その元来のネイティブの環境から離れて存在し、それ故に天然の産物でないことを意味する。単離された材料又は分子(例えばDNA分子又は酵素)は、精製された形態で存在してもよく、非ネイティブの環境、例えばトランスジェニック宿主細胞で存在してもよい。例えば、生細胞中に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、天然の系で共存する材料の一部又は全てから隔てられた同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であることもあり、及び/又は、そのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは、組成物の一部である可能性もあり、そのようなベクター若しくは組成物はその元来の環境の部分でないという点において単離されていることになる。好ましくは、「単離された」という用語は、「単離された核酸配列」のように核酸分子に関係して使用される場合、その天然源で元来関連している少なくとも1つの夾雑核酸分子から特定され且つ隔てられた、核酸配列を指す。単離された核酸分子とは、天然で見いだされるものとは異なる形態又は設定で存在する核酸分子である。対照的に、単離されていない核酸分子とは、天然で存在する状態で見いだされる核酸分子、例えばDNA及びRNAである。例えば、所与のDNA配列(例えば遺伝子)が、宿主細胞染色体上に隣接する遺伝子の近位に見いだされる。RNA配列、例えば、特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列が細胞において、多数のタンパク質をコードする数多くの他のmRNAとの混合物として見いだされる。しかしながら、例えば配列番号2を含む単離された核酸配列には、例として挙げれば、配列番号2を通常含有する細胞中のそのような核酸配列が含まれるが、この場合、上記核酸配列は、天然の細胞のそれとは異なる染色体の若しくは染色体外の位置にあるか、又は、さもなくば、天然に見いだされるのとは異なる核酸配列が隣接する（に挟まれている）。単離された核酸配列は一本鎖の形態で存在しても、二本鎖の形態で存在してもよい。タンパク質を発現させるために単離された核酸配列を利用する場合、核酸配列は、少なくともセンス鎖又はコード鎖の一部分を最小限には含有することになる(すなわち、核酸配列は一本鎖であってもよい)。代替的に、核酸配列はセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含有してもよい(すなわち、核酸配列は二本鎖であってもよい)。

最小プロモーター:不活性であるか又は上流活性化の非存在下では大幅に減少したプロモーター活性を有する、プロモーターエレメント、特にTATAエレメント。適切な転写因子の存在では、最小プロモーターは転写を可能とするように機能を果たす。

非コード:「非コード」という用語は、発現されるタンパク質の一部又は全てをコードしない核酸分子の配列を指す。非コード配列には、限定するものでないが、イントロン、エンハンサー、プロモーター領域、3'非翻訳領域及び5'非翻訳領域が含まれる。

核酸及びヌクレオチド:「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在する若しくは合成若しくは人工の核酸又はヌクレオチドを指す。「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド又は任意のヌクレオチドアナログ及びポリマー又はそれらのハイブリッドを、一本鎖若しくは二本鎖のセンス型又はアンチセンス型のいずれかで含む。特に指示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらのバリアント(例えば、縮重コドン置換)及び相補配列、並びに明確に指示された配列を暗に包含する。「核酸」という用語は、「遺伝子」、「cDNA」、「mRNA」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と本明細書では互換的に使用される。ヌクレオチドアナログには、塩基、糖及び/又はホスフェートの化学構造に改変を有するヌクレオチドが含まれ、改変には、限定するものでないが、5位ピリミジン改変、8位プリン改変、シトシン環外アミン類にての改変、5-ブロモ-ウラシルの置換等が含まれる、並びに、改変には、限定するものでないが、糖改変リボヌクレオチドを始めとした2'位糖改変が含まれるが、この場合、2'-OHは、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2又はCNから選択される基によって置き換えられている。ショートヘアピンRNA(shRNA)はまた、非天然エレメント、例えば、非天然塩基、例えばイオノシン(ionosin)及びキサンチン、非天然糖、例えば2'-メトキシリボース、又は非天然リン酸ジエステルリンケージ、例えばメチルホスホネート、ホスホロチオエート及びペプチドも含むことができる。

核酸配列:「核酸配列」という表現は、5'末端から3'末端へ読まれたデオキシリボヌクレオチド塩基又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖のポリマーを指す。核酸配列には、染色体DNA、自己複製プラスミド、DNA又はRNAの感染性ポリマー及び主に構造的役割を果たすDNA又はRNAが含まれる。「核酸配列」とはまた、ヌクレオチドを表す略語、文字、記号又は単語の連続した表示を指す。一実施形態では、核酸は、長さが通常100ヌクレオチド未満の比較的短い核酸である「プローブ」であってもよい。核酸プローブは長さが約50ヌクレオチドから長さが約10ヌクレオチドであることが多い。核酸の「標的領域」は目的のものであると特定されている核酸の一部分である。核酸の「コード領域」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、配列特異的な方式で転写され且つ翻訳されて、特定のポリペプチド又はタンパク質を生成する、核酸の一部分である。コード領域はそのようなポリペプチド又はタンパク質をコードすると言われる。

オリゴヌクレオチド:「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸(RNA)若しくはデオキシリボ核酸(DNA)若しくはそれらの擬似体のオリゴマー又はポリマー、並びに同様に機能する天然には存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。そのような改変された又は置換されたオリゴヌクレオチドはネイティブ形態にまさって好ましい場合が多いが、なぜなら、例えば、細胞取込みが増強し、核酸標的に対する親和性が増強し且つヌクレアーゼの存在のもとで安定性が向上するなどの、所望の特性のためである。オリゴヌクレオチドはリンケージ(例えばリン酸ジエステル)又は置換リンケージ（連結）によって互いに共有結合された2つ以上のヌクレオモノマーを含むことが好ましい。

オーバーハング:「オーバーハング」とは、二本鎖のオリゴヌクレオチド分子の5'-又は3'-ヒドロキシル末端の比較的短い一本鎖ヌクレオチド配列である(「伸長」、「突出末端」又は「粘着性末端」とも呼ばれる)。

ポリペプチド:「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」及び「タンパク質」という用語は、連続するアミノ酸残基のポリマー又はオリゴマーを指して、本明細書では交換可能に使用される。

プレタンパク質:細胞小器官、例えば葉緑体を通常には標的化し、その輸送ペプチドをなおも含んでいるタンパク質。

標的領域でのドナーDNA分子の導入に関して「正確」とは、ドナーDNA分子配列には含まれていない標的領域の未変更のDNA配列と比較して、ドナーDNA分子の配列が、InDel、重複又は他の突然変異なしに標的領域に導入されることを意味する。

一次転写物:本明細書で使用される「一次転写物」という用語は遺伝子の未成熟RNA転写物を指す。「一次転写物」は例えば、イントロンをなおも含み、及び/又はポリAテール又はキャップ構造をまだ含んでおらず、及び/又は転写物としてのその正しい機能、例えばトリミング又は編集に必要な他の改変が欠損している。

プロモーター:「プロモーター」又は「プロモーター配列」という用語は等価であり、本明細書で使用される場合、目的のヌクレオチド配列にライゲートされる場合に目的のヌクレオチド配列のRNAへの転写を制御することができるDNA配列を指す。プロモーターは、mRNAへのその転写をプロモーターが制御している目的のヌクレオチド配列の転写開始点の近位、5'(すなわち上流)に存在し、転写開始のためにRNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。前記プロモーターは、例えば、転写開始点の近位、例えば少なくとも10kb、例えば5kb又は2kbを含む。プロモーターはまた、転写開始点の近位、少なくとも1500bp、好ましくは少なくとも1000bp、より好ましくは少なくとも500bp、更により好ましくは少なくとも400bp、少なくとも300bp、少なくとも200bp又は少なくとも100bpを含むことができる。更なる好ましい実施形態では、プロモーターは転写開始点の近位、少なくとも50bp、例えば少なくとも25bpを含む。プロモーターはエクソン領域及び/又はイントロン領域又は5'非翻訳領域を含まない。プロモーターは例えば、それぞれの細胞に対して異種であっても同種であってもよい。ポリヌクレオチド配列は、外来種から生じている場合、又は同じ種由来でありその元来の形態から改変されている場合、生物体又は第2のポリヌクレオチド配列「に対して異種」である。例えば、異種コード配列に作動可能に連結されたプロモーターとは、当該プロモーターが由来したものとは異なる種由来のコード配列を指し、或いは、同じ種由来であった場合、当該プロモーターに天然では関連していないコード配列(例えば、遺伝子操作のコード配列又は異なる生態型若しくは品種由来の対立遺伝子)を指す。適切なプロモーターは、発現が起こるべき宿主細胞の遺伝子に由来してもよく、この宿主細胞に対する病原体(例えばウイルス)に由来してもよい。プロモーターが誘導プロモーターである場合、次いで誘導剤に応答して転写速度が上昇する。プロモーター又はプロモーターから誘導される発現に言及する場合、「構成的」という用語は、細胞において、前記細胞の実質的に全生存期間をとおして、刺激(例えば、熱ショック、化学品、光等)の非存在のもとで、プロモーターが、作動可能に連結された核酸分子の転写を方向づけることができることを意味する。

プロモーター特異性:プロモーターに言及する場合、「特異性」という用語は、それぞれのプロモーターが付与する発現のパターンを意味する。特異性とは細胞の発生状況を説明するものであるが、この場合、プロモーターが、それぞれのプロモーターの制御下で核酸分子の発現を付与している。プロモーターの特異性はまた環境条件を含む場合もあり、当該環境条件下では、プロモーターが活性化されることもあり又は下方調節されこともあり、例えば、生物学的又は環境ストレス、例えば寒冷、乾燥又は感染による誘導又は抑圧である。

精製された:本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、その天然環境から取り出され、単離されるか又は隔てられた分子、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかを指す。「実質的に精製された」分子は、それが天然では関連する他成分を、少なくとも60%含まない状態である、好ましくは少なくとも75%含まない状態である、より好ましくは少なくとも90%含まない状態である。精製された核酸配列は単離された核酸配列とし得る。

組換え体:核酸分子に関する「組換え体」という用語は、組換えDNA技法によって生成された核酸分子を指す。組換え核酸分子はまた、それ自体天然には存在しないが、改変、変更、突然変異又はそうでなければ人為的に操作されている分子を含む。好ましくは、「組換え核酸分子」とは、天然に存在する核酸分子とは配列において少なくとも1つの核酸が異なる天然には存在しない核酸分子である。「組換え核酸分子」はまた、好ましくは作動可能に連結された天然にはその順で存在しない核酸分子の配列を含む「組換え構築物」も含むことができる。前記組換え核酸分子を生成する好ましい方法は、クローニング技法、部位特異的又は部位非特異的な突然変異誘発、合成又は組換え技法を含むことができる。

センス:「センス」という用語は、標的配列と、例えば、タンパク質転写因子に結合する及び所与の遺伝子の発現に関与する配列と、相補的又は同一である配列を有する核酸分子を意味すると理解される。好ましい実施形態によれば、核酸分子は目的の遺伝子及び目的の前記遺伝子の発現を可能にするエレメントを含む。

有意な上昇(向上)(increase)又は低下(decrease):測定技法に固有の誤差限界よりも大きい、例えば酵素活性の又は遺伝子発現の上昇(向上)又は低下、好ましくは、対照酵素の活性又は対照細胞の発現の約2倍以上の上昇(向上)又は低下、より好ましくは5倍以上の上昇(向上)又は低下、最も好ましくは約10倍以上の上昇(向上)又は低下。

小核酸分子:「小核酸分子」とは、核酸又はその誘導体からなる分子、例えばRNA又はDNAと理解される。これらは二本鎖であっても一本鎖であってもよく、且つ、約15bpと約30bpの間、例えば15bpと30bpの間、より好ましくは約19bpと約26bpの間、例えば19bpと26bpの間、更により好ましくは約20bpと約25bpの間、例えば20bpと25bpの間である。特に好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは約21bpと約24bpの間、例えば21bpと24bpの間である。最も好ましい実施形態では、小核酸分子は約21bp及び約24bp、例えば21bp及び24bpである。

実質的に相補的な:その最も広い意味で、「実質的に相補的な」という用語は、参照又は標的のヌクレオチド配列に関連してヌクレオチド配列について本明細書で使用される場合、前記参照又は標的のヌクレオチド配列の実質的に相補的なヌクレオチド配列と正確な相補的な配列との間の同一性に関して、以下のパーセンテージを有するヌクレオチド配列を意味する:少なくとも60%、より望ましくは少なくとも70%、より望ましくは少なくとも80%又は85%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも93%、更により好ましくは少なくとも95%又は96%、なお更により好ましくは少なくとも97%又は98%、また更により好ましくは少なくとも99%又は最も好ましくは100%(この文脈では後者は「同一」という用語に等しい)。好ましくは、(下で別に特定されなければ)、核酸配列の少なくとも19ヌクレオチド、好ましくは少なくとも50ヌクレオチドの長さ、より好ましくは全長にわたって、前記参照配列に対して、同一性について評価する。配列比較を、デフォルトGAP解析を使用して、GAPのUniversity of Wisconsin GCG, SEQWEBアプリケーションによって、Needleman及びWunsch(Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48: 443-453;上に定義のとおり)のアルゴリズムに基づいて実施する。参照ヌクレオチド配列に「実質的に相補的な」ヌクレオチド配列は、低度ストリンジェンシー条件、好ましくは中程度ストリンジェンシー条件、最も好ましくは高度ストリンジェンシー条件(上で定義のとおり)のもとで、参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。

本明細書で使用される「標的領域」とは、例えば、標的部位から離れて、又はドナーDNA分子の配列が細胞のゲノムに導入されている標的部位を含めて、10塩基、20塩基、30塩基、40塩基、50塩基、60塩基、70塩基、80塩基、90塩基、100塩基、125塩基、150塩基、200塩基又は500塩基以上近い領域を意味する。

本明細書で使用される「標的部位」とは、二本鎖切断又は一本鎖切断の1つ又は対(ニック)が、組換え技法、例えば、Znフィンガー、TALEN、制限酵素、ホーミングエンドヌクレアーゼ、RNAガイドヌクレアーゼ、RNAガイドニッカーゼ、例えばCRISPR/Casヌクレアーゼ又はニッカーゼ等を使用して誘導される、ゲノム内の位置を意味する。

トランスジーン:本明細書で使用される「トランスジーン」という用語は、実験操作によって細胞のゲノムへと導入される任意の核酸配列を指す。トランスジーンは「内因性DNA配列」であっても「異種DNA配列」(すなわち「外来のDNA」)であってもよい。「内因性DNA配列」という用語は、天然に存在する配列に関係して何らかの改変(例えば、点突然変異、選択マーカー遺伝子の存在等)を含有しないという条件で、それが導入される細胞において天然で見いだされるヌクレオチド配列を指す。

トランスジェニック:生物体に言及する場合、トランスジェニックという用語は、目的のDNA配列に動作可能に連結された適切なプロモーターを好ましくは含む組換えDNA分子によって、形質転換された、好ましくは安定して形質転換されたことを意味する。

ベクター:本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸分子であって、これが連結されている別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一タイプはゲノム統合型ベクター、すなわち「統合型ベクター」であり、これは宿主細胞の染色体DNAへと統合され得る。ベクターの別のタイプはエピソームベクター、すなわち、染色体外複製が可能である核酸分子である。ベクターが動作可能に連結された遺伝子の発現を誘導する能力のあるベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。本明細書では、文脈からそうでないことが明らかでない限り、「プラスミド」と「ベクター」は交換可能に使用される。in vitro又はin vivoで本明細書に記載のRNAを生成するように設計された発現ベクターは、ミトコンドリアRNAポリメラーゼ、RNA pol I、RNA pol II及びRNA pol IIIを含めて、任意のRNAポリメラーゼによって認識される配列を含有することができる。これらのベクターを、本発明による細胞における所望のRNA分子を転写するために使用することができる。

野生型:「野生型」、「天然の」又は「天然起源」という用語は、生物体、ポリペプチド又は核酸配列に関連して、前記生物体は天然に存在するものであること、又は、人為的に変更されていない、突然変異されていない又はさもなくば操作されていない少なくとも1つの天然に存在する生物体において入手可能なものであることを意味する。

キナーゼ1によって触媒される反応を示す図である。(A)イソプレノールからのイソペンテニルホスフェート(IP)の合成、及び(B)プレノールからのジメチルアリルホスフェート(DMAP)の合成。キナーゼ1のスクリーニング結果を示す図である。酵素活性を、ATP及びMgCl₂の存在下で、イソプレノールを補充した清澄な大腸菌細胞溶解物中のIP形成を測定することによってモニタリングした。キナーゼ2によって触媒される反応を示す図である。(A)IPからのイソペンテニルジホスフェート(IPP)の合成、及び(B)DMAPからのジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)の合成。キナーゼ2のスクリーニング結果を示す図である。酵素活性を、ATP及びMgCl₂の存在下で、IPを補充した清澄な大腸菌細胞溶解物中のIPP形成を測定することによってモニタリングした。キナーゼ1及び2のカスケード反応を示す図である。(A)イソプレノールからのIPPの合成、及び(B)プレノールからのDMAPPの合成。イソプレノールをIPPに変換するキナーゼ1(配列番号43)及びキナーゼ2のカスケード反応の例を示す図である。酵素活性を、ATP及びMgCl₂の存在下でイソプレノールを補充した清澄な大腸菌細胞溶解物中のIPP形成を測定することによってモニタリングした。キナーゼ1のスクリーニング結果を示す図である。酵素活性を、ATP及びMgCl₂の存在下で、イソプレノールを補充した清澄な大腸菌細胞溶解物中のIP形成を測定することによってモニタリングした。キナーゼ2のスクリーニング結果を示す図である。酵素活性を、ATP及びMgCl₂の存在下で、IPを補充した清澄な大腸菌細胞溶解物中のIPP形成を測定することによってモニタリングした。経時的なIPの細胞(in vivo)産生を示す図である。培養物のOD600に正規化されたIPの濃度を図示する。値は独立した3回の測定の結果であり、エラーバーは標準偏差を指示する。経時的なIPPの細胞(in vivo)産生を示す図である。培養物のOD600に正規化されたIPPの濃度を図示する。値は独立した3回の測定の結果であり、エラーバーは標準偏差を指示する。

[実施例]
化学薬品及び共通の方法
別段に指示されない限り、本発明の目的で行ったクローニング手順については、これには制限消化、アガロースゲル電気泳動、核酸の精製、核酸のライゲーション、細菌細胞の形質転換、選択及び育成が含まれるが、記載のとおり実施した(Sambrook et al., 1989)。組換えDNAの配列解析は、レーザー蛍光DNAシーケンサー(Applied Biosystems、Foster City、CA、米国)によって、Sangerの技法(Sanger et al., 1977)を使用して実施した。別段に記載されない限り、化学薬品及び試薬はSigma Aldrich(Sigma Aldrich、St. Louis、米国)から、Promega(Madison、WI、米国)、Duchefa(Haarlem、オランダ)又はInvitrogen(Carlsbad、CA、米国)から入手した。制限エンドヌクレアーゼはNew England Biolabs(Ipswich、MA、米国)製又はRoche Diagnostics GmbH(Penzberg、ドイツ)製であった。オリゴヌクレオチドはEurofins Eurofins Genomics(Ebersberg、ドイツ)又はIntegrated DNA Technologies(Coralville、IA、米国)が合成した。

[実施例1]
キナーゼのクローニング
キナーゼのアミノ酸配列は公共データベースから特定した。それぞれのDNA配列を、大腸菌の標準コドン使用法を使用してこれから導いた。DNA配列を合成し(BioCat GmbH)、プラスミドpDHE19.2へとクローニングした(Ress-Loeschke, M. et al., DE 19848129, 1998, (BASF AG))。生成するプラスミドを使用して、大腸菌株TG10、pAgro、pHSG575(大腸菌TG10(Kesseler, M. et al., 国際公開第2004050877号A1, 2004, (BASF AG))のコンピテントセル(Chung, C.T. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1989, 86, 2172):pHSG575(Takeshita, S. et al., Gene, 1987, 61, 63)及びpAgro4(pBB541 in Tomoyasu, T. et al., Mol. Microbiol., 2001, 40, 397)で形質転換した大腸菌TG1(DSMZ 6056)のrhaA^-派生株を形質転換した。

[実施例2]
キナーゼの組換え産生
キナーゼの組換えプラスミドを有する大腸菌TG10を使用して100mlバッフル付き三角フラスコ中の、アンピシリン100μg/ml、スペクチノマイシン100μg/ml、クロラムフェニコール20μg/ml、0.1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド及びラムノース0.5g/mlを補充したLB培地(Bertani, G., J Bacteriol, 1951, 62, 293)25mlに接種した。培養物を振とう条件下で、37℃で18時間インキュベートした。続いて、バイオマスを5000×gで10分間遠心分離することによって回収した。細胞を緩衝剤(pH7.0にての50mM TRIS-HCl、1mM MgCl₂)で洗浄した後、同じ緩衝剤1mlに再懸濁した。

ホモジナイザー(Peqlab Precellys24、VWR)中で2回の30秒サイクルの間、石英ビーズ(φ0.1mm)0.7mlでバイオマス300mgを破壊することによって、細胞を含まない清澄な生溶解物を調製した。サイクルの合間に、試料を氷上で冷却した。生成する無細胞溶解物を、10℃で20817×gの遠心分離によって清澄化した。上清(=清澄化細胞溶解物)を単離したが、これは一般にタンパク質10～15mg/mlを含有した。

[実施例3]
酵素スクリーニング
キナーゼ1、イソプレノールのイソペンテニルホスフェート(IP)への変換
酵素活性をスクリーニングアッセイで評価した。それに関連して、緩衝剤(pH7.5にての50mM NH₄HCO₃)に、5mMイソプレノール(BASF製造)、15mM ATP、20mM MgCl₂を補充した。清澄化細胞溶解物を20容量%(最終)添加することによって、反応を開始した。続いて、反応物をサーモミキサー(Eppendorf)で37℃、300rpmで24時間インキュベートした後、アセトニトリルで1:5までに希釈することによってクエンチし、激しく混合した。クエンチした反応物を、室温で14,100×gで5分間遠心分離することによって清澄化し、生成する上清を使用して、質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィー(LC-MS)によってIP及びイソペンテニルピロホスフェート(IPP)のレベルを定量化した。

キナーゼ2、IPのイソペンテニルピロホスフェート(IPP)への変換
ここでも、pH7.5にての50mM NH₄HCO₃緩衝剤に、5mM IP二リチウム塩(Sigma-Aldrich)、15mM ATP、20mM MgCl₂を補充した。清澄化細胞溶解物を20容量%(最終)添加することによって、反応を開始した。前のパラグラフで記載したように、反応物を処理し、分析した。

[実施例4]
in vitroカスケード反応キナーゼ1及びキナーゼ2、イソプレノールのIPPへの変換
キナーゼ1とキナーゼ2の組合せでイソプレノールをIPPに変換する可能性について評価するために、カスケード反応をin vitroで実施した。それに関連して、pH7.5にての50mM NH₄HCO₃緩衝剤に、5mMイソプレノール、30mM ATP及び20mM MgCl₂を補充した。キナーゼ1及びキナーゼ2のタンパク質産生の清澄化細胞溶解物20容量%(合計40容量%)を添加することによって、反応を開始した。上記のように、反応物を処理し、分析した。LC-MS定量化によってIPP及び/又はDMAPPの首尾よい合成が示された。

[実施例5]
in vivoカスケード反応キナーゼ1及びキナーゼ2、イソプレノールのIPPへの変換
in vitroスクリーニングでヒットとして特定されたキナーゼの遺伝子を、ロジックpCDFDuet1_Kinase2_Kinase1(例えば配列番号486)に続いて、市販のpCDFDuet1プラスミドシステム(Novagen)へと再クローニングした(BioCat GmbH)。生成するプラスミドを使用して、大腸菌BL21-Gold(DE3)(Agilent)を形質転換した。形質転換体の単一コロニーを、スペクチノマイシン二塩酸塩(Sigma Aldrich)100μg/mlを補充したLB培地4mlを含有する12mlの反応チューブに移し、200rpmの攪拌で、37℃で一晩インキュベートした。一晩の培養物を使用して、500mlのバッフル付き三角フラスコへと満たされた、スペクチノマイシン二塩酸塩100μg/mlを含有するNeidhardt補充培地に(Clomburg, J.M. et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2019, 116(26)), 12810 100mlに、600nmにての最終光学密度(OD600)が0.1となるまで、接種した。続いて、培養物を37℃、200rpmで3時間インキュベートした後、温度を30℃に下げ、1mM IPTGの添加によって遺伝子発現を誘導した。イソプレノールを最終濃度26.9mMで添加し、0(イソプレノール添加前)、1、2.5、5、22及び28時間のインキュベーションの後に5mlの試料を採取した。試料のOD600を測定し、試料を高速ろ過によって直接に更に処理した(Castano-Cerezo, S. et al., Metabolomics, 2019, 15, 115)。手短に言えば、1lフィルター装置(Sartorius)に取り付けた直径5cmの0.45μmポリアミドフィルター膜(Sartorius)をとおして減圧下で、試料をろ過した。フィルターケーキ及びフィルターを15mlコニカルチューブに移し、液体窒素中で即座に凍結させた。フィルターを、更に処理するまで-80℃で保存した。それに関連して、70℃に予熱したpH7.5にての、イソプロパノールと50mM NH₄HCO₃水性液の1:1混合物に、フィルターを浸した。続いて、懸濁液を、70℃及びThermomixerでの1000rpmの攪拌で20分間インキュベートした後、氷上に置き、3分間超音波処理した(Branson Sonifier 250、70%、出力7)。4℃にての遠心分離によって全てのデブリを除去し、生成する上清1mlを新しい1.5ml反応チューブに移した。SpeedVac真空濃縮器(Thermo Fisher、Savant、SPD131DDA)を45℃で一晩使用して、全ての溶媒を試料から完全に除去した。pH7.5にてのメタノールと50mM NH₄HCO₃水性液の1:1混合物200μlに残留物を溶解した。IP/DMAP及びIPP/DMAPPを、質量分析法と組み合わせた液体クロマトグラフィーによって定量化した。IP/DMAP及びIPP/DMAPPの濃度に関する報告結果は、試料のそれぞれのOD600に対して正規化されている。遺伝子発現は誘導されず、イソプレノールを添加されてない培養物を陰性対照とした。報告値は、独立した3回の測定値の平均を示す。

[実施例6]
LC-MS定量化
in vitroアッセイ
反応物を、エレクトロンスプレーイオン化を備えた単一四重極質量分析計(ISQ-EC、Thermo-Fisher)と組み合わせた超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)システム(Vanquish、Thermo-Fisher)で定量化した。UPLCシステムを、イオン対クロマトグラフィーモードでランした。本システムは、ペプチドC-18カラム(Waters、ACQUITY peptide BEH、ポアサイズ130Å、粒子サイズ1.7μm、内径×長さ2.1×50mm)を装備し、本カラムは、25容量%の溶離液A(10mMトリブチルアミンと15mM酢酸を含有する緩衝剤)及び75容量%の溶離液B(アセトニトリル)を用いてアイソクラティック条件下で溶離した。この方法を0.5ml/分の流量で2.5分間ランし、カラムを40℃に加熱した。質量分析法を介して分析物を検出及び定量化した。それに関連して、装置を負イオン化モードに設定し、衝突誘起解離電圧を40Vに設定し、気化器の温度を282℃に設定し、イオントランスファーチューブの温度を300℃に設定した。スイープ、シース及び補助ガスの圧力を、それぞれ、0.5psig、49.9psig及び57psigに設定した。IPは0.6分で溶出し、その出現は質量電荷比(m/z)165でフォローできたが、一方、IPPは1.3分で溶出し、その出現はm/z245でフォローできた。定量化は、IP二リチウム塩とIPP三アンモニウム塩(Sigma-Aldrich)の基準標準物の分析によって作成された標準曲線に基づいた。反応収率を、反応に使用されているそれぞれの基質の量に対して報告する。

in vivoアッセイ
全ての測定を、Acquity PREMIER BEH C18、50×2.1mm、1.7μm dpカラム(Waters、ドイツ)を使用して、Thermo Vanquish Flex UHPLCシステムで実行した。試料2.5μLの分離を、流速600μl/分及び45℃で、(A)H₂O中の10mM AmFo(ギ酸アンモニウム) + 10mM DBA(ジブチルアミン)からの(B)H₂O/ACN(1:9)中の10mM AmFo + 10mM DBAへの多段階勾配によって行った。勾配については、2%Bで0.5分間のイソクラティック段階によって開始し、これに続いて、5.5分で60%Bまで上昇し、これに続いて0.5分で100%Bまで上昇し、100%Bで1分間の段階で終了し、その後、初期条件で再平衡化した。UVスペクトルを、200から600nmの範囲でDAD(ダイオードアレイ検出器)によって記録した。LCフローを、Apollo ESIソースをネガティブモードで使用して、maXis II hr-ToF質量分析計(Bruker Daltonics、ドイツ)に侵入する前に、概75μL/分にスプリットさせた。ソース領域で、温度を200℃に設定し、キャピラリー電圧を3200Vとし、乾燥ガス流量を5.0L/分とし、ネブライザーを1.0barに設定した。生成したイオンをファンネル1に転送するために、RFを400Vppに、多重極RFを350Vppに設定した。次いで、イオンは110m/zにての低カットオフ及びイオンエネルギー3.0eVで四重極を通過し、ステッピングモードで作動する衝突セルに転送され(衝突エネルギー = 8.0eV、プレパルスストレージ = 5.0μ秒、衝突RF = 200～800Vpp、転送時間 = 75～120μ秒、タイミング = 30～70%)、その後に、ToFチューブへと侵入した。質量スペクトルを、2.5Hzのスキャン速度で50～650m/zの範囲のフォーカスモードで取得した。定量化は、IP二リチウム塩及びIPP三アンモニウム塩の基準標準物の分析によって作成された標準曲線に基づいた。

Claims

水、キナーゼ1並びにイソプレノール及び/又はプレノールを含む水性媒体中で、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩への反応を触媒することができる単離されたキナーゼ1であって、
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、
単離されたキナーゼ1。
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、請求項1に記載の単離されたキナーゼ1。
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでいる、
単離されたキナーゼ1であって、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
請求項1又は2に記載の単離されたキナーゼ1。
a. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
g. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含む、単離されたキナーゼ1であって、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
単離されたキナーゼ1。
iv. 水、1つ以上のキナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む水性媒体を用意するステップ、
v. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
vi. 必要に応じて、イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、水、キナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む水性媒体中での、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、
方法。
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルホスフェート若しくはその塩に変換されている、請求項5に記載の方法。
キナーゼ1が、
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
請求項5又は6に記載の方法。
iv. 水、1つ以上のキナーゼ1並びにイソプレノール及び/又はプレノールを含む水性媒体を用意するステップ、
v. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
vi. 必要に応じて、イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルホスフェート及び/若しくはジメチルアリルホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
方法。
キナーゼ1を含む組換え構築物であって、
キナーゼ1は、
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
組換え構築物。
キナーゼ1が異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項9に記載の組換え構築物。
請求項9又は10に記載の組換え構築物を含む組換えベクター。
請求項9若しくは10に記載の組換え構築物又は請求項11に記載の組換えベクターを含む組換え微生物。
ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカ
である、請求項12に記載の組換え微生物。
水、キナーゼ1、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートを含む組成物であって、
キナーゼ1は、
f. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
g. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
h. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
i. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
j. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
組成物。
iv. 水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む水性媒体を用意するステップ、
v. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
vi. 必要に応じて、イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、水、キナーゼ1並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む水性媒体中での、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
1つ以上のキナーゼ2は、水、キナーゼ2並びにイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートを含む水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒することができ、
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも10%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている、
方法。
インキュベーション後に、イソプレノール及び/又はプレノールの少なくとも20%が、イソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートに変換されている、請求項15に記載の方法。
キナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
請求項15又は16に記載の方法。
キナーゼ2は、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
請求項17に記載の方法。
vii. 水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2並びにイソプレノール及び/又はプレノールを含む水性媒体を用意するステップ、
viii. 該水性媒体をインキュベートするステップ、並びに
ix. 必要に応じて、イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を反応混合物から単離するステップを含む、
イソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート又はその塩を生成する方法であって、
1つ以上のキナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
方法。
キナーゼ2は、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
請求項19に記載の方法。
キナーゼ1及びキナーゼ2を含む組換え構築物であって、
キナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒しており、且つ
キナーゼ2は、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
組換え構築物。
キナーゼ1及びキナーゼ2がそれぞれ異種プロモーターに機能的に連結されている、請求項21に記載の組換え構築物。
請求項21又は22に記載の組換え構築物を含む組換えベクター。
請求項21若しくは22に記載の組換え構築物又は請求項23に記載の組換えベクターを含む組換え微生物。
ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカ
である、請求項24に記載の組換え微生物。
水、1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2、イソプレノール及び/又はプレノールを含む組成物であって、
キナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒している、
組成物。
キナーゼ2が、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択され、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、水性媒体中での、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
請求項26に記載の組成物。
1つ以上のキナーゼ1、1つ以上のキナーゼ2及び必要に応じて1つ以上のイソプレノイドを生成することができる1つ以上の経路に関し導入された、向上した又は増強した活性及び/又は発現を含む組換え微生物であって、
1つ以上のキナーゼ1は、プレノール及び/又はイソプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
1つ以上のキナーゼ2は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒することができ、且つ
キナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルへの反応を触媒している、
組換え微生物。
キナーゼ2が、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
請求項28に記載の組成物。
1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩の発酵生成の方法であって、
iii. 請求項28又は29に記載の組換え微生物を用意するステップ、
iv. 前記微生物を、プレノール及び/又はイソプレノールを含む培地中で、前記1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩の生成を可能にする条件下で培養するステップ、並びに必要に応じて、培地から、前記1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩を単離するステップを含む、
方法。
請求項28又は29に記載の1つ以上の組換え微生物を含む組成物。
プレノール及び/又はイソプレノール、培地並びに炭素源を更に含んでいる、請求項31に記載の組成物。
(IV) 前記微生物において、プレノール及び/又はイソプレノールのリン酸化活性を有するキナーゼ1酵素をコードするキナーゼ1遺伝子の活性及び/又は発現を導入する、向上させる又は増強させるステップ、並びに
(V) 前記微生物において、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートのリン酸化活性を有するキナーゼ2酵素をコードするキナーゼ2遺伝子の活性及び/又は発現を導入する、向上させる又は増強させるステップ、並びに必要に応じて、
(VI) 前記微生物においてイソプレノイド生成経路の活性及び/又は発現を更に導入する、向上させる又は増強させるステップ
を含む、請求項28又は29に記載の組換え微生物を生成する方法。
微生物が、ロドコッカス・ロドクラウス、アエロコッカス属の種、アスペルギルス属の種、バチルス・プミルス、枯草菌、バクテロイデス・シータイオタオミクロン、クロストリジウム・アルギディカーニス、コリネバクテリウム・エフィシエンス、コリネバクテリウム・グルタミカム、大腸菌、ハロフェラックス・ボルカニ、ラクトバチルス・カゼイ、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ、メタノサーモバクター・サーモトトロフィカス、ミセリオフトラ・サーモフィラ、ピキア・パストリス、シュードモナス・シンキサンタ、シュードモナス・アゾトフォルマンス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・オバリス、シュードモナス・スタッツェリ、シュードモナス・アシドボランス、シュードモナス・ムシドレンス、シュードモナス・テストステロニ、緑膿菌、シュードザイマ・ツクバエンシス、ラルストニア・ユートロファ、ロドバクター・スフェロイデス、ロドコッカス・オパクス、サッカロミセス・セレビシエ、シゲラ・ボイド、シノリゾビウム・メリロティ、ストレプトマイセス・アンチバイオチクス、ストレプトマイセス・アベルミティリス、ストレプトマイセス・カカオイ、ストレプトマイセス・コエリコロル、ストレプトマイセス・フラベラス、ストレプトマイセス・グリセオラス、ストレプトマイセス・ラベンデュレ、ストレプトマイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・オリバセウス、ストレプトマイセス・タナシエンシス、ストレプトマイセス・バージニエ、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、テルモプラズマ・アシドフィラム、ビブリオ・ナトリージェンス又はヤロウイア・リポリティカ
から選択される、
請求項28若しくは29に記載の微生物又は請求項33に記載の方法。
iii. キナーゼ1をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター、及び
iv. キナーゼ2をコードする核酸分子に機能的に連結された、微生物において機能的なプロモーター
を含む組換え発現構築物であって、
キナーゼ1又はキナーゼ2に機能的に連結されたプロモーターのうちの少なくとも1つは、キナーゼ1又はキナーゼ2に対して異種であり、
キナーゼ1は、
k. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子、及び
l. 配列番号43、46、49、52、123、126、135、138、144、150、153、324、351、357、375、378、390若しくは393のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
m. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
n. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
o. 配列番号44、45、47、48、50、51、53、54、124、127、136、139、145、151、154、325、358、379、394、125、128、137、140、146、152、155、326、353、359、377、380、392若しくは395と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択されるアミノ酸分子をコードする配列を含んでおり、
b.、c.、d.及びe.で定義のアミノ酸分子は、イソプレノール及び/又はプレノールからイソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルへの反応を触媒している、
組換え発現構築物。
キナーゼ2が、
p. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子、及び
q. 配列番号76、85、88、103、138、171、174、177、180、183、189、192、195、198、201、204、207、210、216、219、222、225、228、231、234、237、240、246、249、252、255、258、261、270、273、279、282、288、426、429、435、447若しくは483のアミノ酸分子と少なくとも50%の同一性を有するアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
r. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485の核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
s. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と少なくとも50%の同一性を有する核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片、及び
t. 配列番号77、78、86、87、89、90、104、105、139、172、175、178、181、184、190、193、196、199、202、205、208、211、217、220、223、226、229、232、235、238、241、247、250、253、256、259、262、271、274、280、283、289、430、448、484、140、173、176、179、182、185、191、194、197、200、203、206、209、212、218、221、224、227、230、233、236、239、242、248、251、254、257、260、263、272、275、281、284、290、428、431、437、449若しくは485と相補的である少なくとも250塩基の断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるアミノ酸分子、又はその機能的断片
からなる群から選択される配列を含んでおり、
g.、h.、i.及びj.で定義のアミノ酸分子は、イソペンテニルホスフェート及び/又はジメチルアリルホスフェートからイソペンテニルピロホスフェート及び/又はジメチルアリルピロホスフェートへの反応を触媒している、
請求項35に記載の組換え発現構築物。
請求項35又は36に記載の組換え発現構築物を含む組換えベクター。
請求項35若しくは36に記載の組換え発現構築物又は請求項37に記載の組換えベクターを含む組換え微生物。
請求項28、29又は38に記載の組換え微生物を培養する又は増殖する方法であって、
培養培地に前記組換え微生物のうちの1つ以上を接種するステップ、並びにプレノール及び/又はイソプレノールを含む培養培地中で前記組換え微生物を培養するステップ又は増殖するステップ
を含む方法。
プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート若しくはその塩及び/又はジメチルアリルピロホスフェート若しくはその塩に、全細胞生物変換するための、請求項28、29若しくは38に記載の組換え微生物又は請求項31若しくは32に記載の組成物の使用。
プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェートに、全細胞生物変換する方法であって、
I) 請求項28、29又は38に記載の組換え微生物を、イソプレノール及び/又はプレノール、前記組換え微生物を増殖するのに適した培地並びにC源を含む発酵槽で増殖するステップ、並びに
II) I)で得られた発酵ブロスから、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はそれらのイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェートを回収するステップ
を含む、方法。
プレノール及び/又はイソプレノールを、1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はイソペンテニルピロホスフェート及び/若しくはジメチルアリルピロホスフェートに、全細胞生物変換する方法であって、
i) 請求項28、29又は38に記載の組換え微生物を、前記組換え微生物を増殖するのに適した培地及びC源を含む発酵槽で増殖するステップ、並びに
ii) 発酵槽から組換え微生物を回収するステップ、並びに
iii) イソプレノール/プレノールを補充することによって、水性培地中で全細胞生物変換を実施するステップ、並びに
iv) iii)で得られた水性媒体から1つ以上のイソプレノイド若しくはその塩又はIPP及び/若しくはDMAPPを回収するステップ
を含む、方法。