DE19952501A1

DE19952501A1 - L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton

Info

Publication number: DE19952501A1
Application number: DE19952501A
Authority: DE
Inventors: Maria Kesseler; Bernhard Hauer; Thomas Friedrich; Ralf Mattes
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2001-05-03

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für die Proteine codieren, Nuckleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymati sche Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Er findung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nucleinsäurekonstrukte, Vektoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Panto lacton.

D-Pantolacton ist eine Vorstufe in der chemischen Synthese bzw. Biosynthese von Pantothensäure, Panthenol und Pantethein und de ren Derivate. Diese werden als Vitaminzusätze in der menschlichen Ernährung, im Tierfutter, in der Medizin beispielsweise für die Wundheilung und in der Kosmetik beispielsweise in der Haarkosme tik eingesetzt werden. Wirtschaftliche Verfahren zur Synthese von enantiomerenreinem D-Pantolacton sind daher von großer Bedeutung. Neben den seit langem ausgeübten chemischen Verfahren zur Her stellung von D-Pantolacton wurden in jüngerer Zeit auch verschie dene biotechnologische Verfahren bearbeitet. Eine Übersicht über Pantolacton und seine chemische Synthese ist Ullmann's Encyclope dia of Industrial Chemistry (Vol. A27, 1996, VCH Verlagsgesell schaft mbH, 69451 Weinheim, Seite 559-566) zu entnehmen.

Für die biotechnologische Synthese von Pantolacton wurden ver schiedenen Synthesestrategien verfolgt.

Eine Racematspaltung durch selektive Hydrolyse von O-Acetyl-Pan tolacton mittels Lipasen oder Esterasen wird von Glänzer et al. (1988, Enzyme Microb. Technol. 10, 689-690) beschrieben. Eine derartige Racematspaltung wird in den Schutzrechten DE 40 05 150 und EP-A-0 507 278 beansprucht. Die erreichbare Enantiomerenrein heit ist für eine technische Nutzung bei diesem Verfahren ungenü gend.

Von Degussa wird die Herstellung von Pantolacton mit dem Enzym Oxinitrilase ausgehend von Hydroxypivalaldehyd und Blausäure über optisch reines Hydroxypivalaldehydcyanhydrin beschrieben (DE 41 26 580. EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). In dieser Reaktion sind theoretisch 100% Ausbeute zu erreichen. Nachteil dieser Re aktion ist der hohe Enzymbedarf (äquimolare Mengen Enzym : Sub strat) sowie die relativ geringe Enantiomerenreinheit des Pro dukts (max. 82% ee).

In JP 47019745 wird die Synthese von D-Pantolacton mit Hilfe von Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus oder Corynebacterium be schrieben. In der Reaktion setzen die genannten Organismen race misches Pantolacton zu D-Pantolacton um, in dem sie das L-Panto lacton verstoffwechseln. Nachteil dieses Verfahrens ist, daß die Hälfte des Edukts verstoffwechselt wird und damit verloren ist.

Mitsubishi Chemical Ind. und Ube Ind. haben Verfahren zur Her stellung von D-Pantolacton aus D,L-Pantolacton beansprucht (JP 6067320, JP 62294092, JP 62294096, JP 57152895). In diesen Verfahren werden L-Pantolacton-Hydrolasen aus den Hefen Rhodotho rula, Sporidiobolus und Sterigmatomyces beschrieben. Aus heutiger Sicht (siehe Yamada & Shimizu, Ann. N. Y. ACad.Sci. 672 [1992] in Enzyme Eng. XI, Clark et al., 372-386; Chimia, 47, 1993 : 5-10, JP 62187426; JP 61293384; JP 61293386; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1988 : 622-642, Chemical Aspects of Enzyme Biotechno logy, eds. T. O. Baldwin et al., Plenum Press, New York, 1990: 151 -163) bestätigt durch eigene Arbeiten scheint die direkte Hydro lyse des L-Pantolactons in diesen Hefen jedoch zweifelhaft. Die Reaktion verläuft vielmehr über das Ketopantolacton, das durch die Ketopantoat-Oxidoreduktasen zum L-Pantolacton umgesetzt wird. In eigenen Arbeiten konnte das Ketopantolacton als Zwischenstufe nachgewiesen werden, das heißt es erfolgt keine direkte Hydrolyse zum L-Pantolacton. Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Pantolacton-Konzentration, die im Verfahren umgesetzt werden kann.

Diese Reaktion über Ketopantolacton- und Ketopantoat-Oxidoreduk tasen wurde auch für Bakterien beschrieben (z. B. Yamada & Shi mizu, s. o.; Shimizu et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 12077-12084, Ka taoka et al. 1992, Eur. J. Biochem. 204, 799-806). Entsprechende Verfahren zur enantioselektiven Synthese von D-Pan tolacton aus D,L-Pantolacton via Ketopantolacton und Ketopantoat haben zwar den Vorteil einer hohen Ausbeute (theoretisch 100%, 90,5% erreicht mit Rhodococcus s. u.), sind jedoch wegen des Co faktorbedarfs (NADH oder NADPH), der Zufütterung eines Energie substrates (Glucose), der niedrigen Raum-Zeit-Ausbeute und der geringen Endkonzentrationen (18,2-72 g/l D-Pantolacton) nicht wirtschaftlich. Desweiteren ist ein solches Verfahren dadurch be nachteiligt, daß die beiden beteiligten Enzyme i. d. R. verschie dene Optima für die Umsatzbedingungen aufweisen, ein Problem, das bei Verwendung eines einzigen (hydrolytischen) Enzyms entfällt.

Die Firma Fuji in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Yamada an der Kyoto-Universität hat ein Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung mit Hilfe einer pilzlichen D-Pantolacton-Hydro lase (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP-B-0 504 421, EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5, 275, 949, US 5,372,940) entwickelt. Das Enzym läßt sich beispielsweise aus den Pilzen Cylindrocarpon tonkinense, Gibberella fujikuroi und Fusarium oxysporum isolieren. Die D-Pantolacton-Hydrolase ist ein glycosyliertes Enzym, das aus einem 125 kDa Homodimer besteht und Ca2⁺-abhängig ist (Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996, 799: 650-658, En zyme Engineering). Das Enzym wird durch Cd2⁺, Hg2⁺, Cu2⁺ und EDTA inhibiert (US 5,372,940). Die Reinigung der D-Pantolacton-Hydro lase wurde von Shimizu et al. beschrieben. Das gereinigte Enzym zeigt gegenüber einer Reihe von Lactonen speziell gegenüber Zuc kerlactonen eine Hydrolaseaktivität (Eur. J. Biochem., 209, 1992: 383-390). Seine Sequenz zeigt schwache Homologien zur Glucono lactonase aus Zyrnomonas mobilis (28,9%), der humanen und Ratten- Paraoxonase (25,3%) und der Strictosidin Synthase aus Catha ranthus roseus (15,9%; EP-A-0 794 251, Kobayashi et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12787-12792). Von Kataoko et al. wird eine starke Abhängigkeit der erzielten Enantiomerenreinheit des Produkts vom Umsatz bei unterschiedlichen pH-Werten (Enzym. Microbiol. Technol. 19 : 307-310, 1996 und Appl. Microbiol. Bio technol. 1995, 44: 333-338) beschrieben. Bei pH-Werten, die nahe oder über pH 7 liegen, werden geringere Enantiomerenreinhei ten erzielt, da die spontane chemische Hydrolyse des L-Pantolac tons bei höheren pH-Werten immer stärker wird und so die Enantio merenreinheit des Produkts herabsetzt. Als optimaler pH-Wert für die Herstellung möglichst enantiomerenreinen D-Pantolactons wird pH 5 angegeben. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms ist bei diesem pH jedoch erheblich verlangsamt. Um optisch reines Produkt zu erhalten, ist nach Extraktion eine anschließende Kristallisa tion erforderlich (Yamada, H. Chimia 47, 1993: 5-10).

Von Nachteil bei den oben genannten Prozessen ist, daß sie häufig nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen. Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Nach wie vor besteht deshalb ein großer Bedarf nach einem einfachen, wirt schaftlichen biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist. Dieses Verfahren sollte ausgehend von der bestehenden chemischen Synthese einen einfachen Zugang zu D-Pantolacton in hohen Ausbeu ten und Enantiomerenreinheiten ermöglichen, so daß keine weitere Aufreinigung des Produkts mehr erforderlich ist.

Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches, wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäurese quenz gelöst, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrola seaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestell ten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäurese quenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 darge stellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens XX % Ho mologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymati sche Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter a) bis c) genannten Se quenzen.

Diese L-Pantolacton-Hydrolasen lassen sich in Organismen vorteil haft Mikroorganismen wie Bakterien finden. Das Enzym bzw. die En zyme besitzen eine hohe enzymatische Aktivität zur hydrolytischen Umwandlung von L-Pantolacton in L-Pantoinsäure.

Diese L-Pantolacton-Hydrolasen setzen D-Pantolacton nicht um, so daß die Organismen, Extrakte oder gereinigte Enzyme sowie ent sprechende rekombinante Stämme bzw. Proteine zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Pantolacton verwendet werden können.

Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu ver stehen, die mindestens 50% Homologie auf der abgeleiteten Amino säureebene, bevorzugt mindestens 60% Homologie, besonders bevor zugt 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80% Homologie auf weisen. Die Homologie wurde entweder nach der Methode von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970: 443-453) oder Smith & Waterman (Adv. Appl. Math., 2, 1981: 482-489) bestimmt. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft hö her liegen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen insbeson dere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestell ten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine nicht wesentlich reduziert sein sollte. Unter Enzymen mit einer nicht wesentlich reduzierten enzymatischen Aktivität sind Enzyme zu verstehen, die eine enzy matische Aktivität von mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% aufweisen. Die Er findung betrifft damit auch Aminosäuresequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nukleinsäuresequenzen kodiert wer den. Vorteilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert werden.

Unter funktionellen Äquivalenten der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Enzyme kodie ren, die L-Pantolacton zur entsprechenden Säure hydrolysieren und die mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% der Aktivität der unter SEQ ID NO: 2 genannten Sequenz aufweisen, nicht durch EDTA (1 mM-Lösung) ge hemmt werden und zwischen pH 4 bis 10 stabil sind. Diese funktio nellen Äquivalente weisen außerdem vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 7 und 8 auf und ein Temperaturoptimum zwischen 70°C und 80°C.

Weiterhin sind unter Derivate auch Homologe der SEQ ID NO: 1 bei spielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Se quenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nichtco dierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 be sitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 50%, bevorzugt von mindestens 60%, besonders bevorzugt von mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80% über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.

Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschaltet sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promoto ren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo tidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startcodon oder 0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopcodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, be vorzugt erhöht wird.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzi piell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteil haft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram-nega tive und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) [der Plural und Singular sollen für die Anmeldung gleichbedeutend sein] aus gram-negativen Bakte rien vorteilhaft aus α-Proteobacterien, β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae, ganz be sonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, Pseu domonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert. Als vorteilhaft geeignete Pilze seien die Gattungen Be auveria oder Psilocybe genannt. Vorteilhafte Hefen sind bei spielsweise in der Gattung Apiotrichum zu finden.

SEQ ID NO: 1 oder seine Derivate, Homologen oder Teile dieser Se quenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridisierungs verfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedin gungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Berei che beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit der D-Pantolacton-Hydrolase in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können (ein solcher Bereich ist beispielsweise das sog. HTGT-Motiv), verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollstän digen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelz temperaturen für DNA:DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäu re Temperaturen zwischen 20 und 70°C in einer wäßrigen Pufferlö sung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Ge genwart von 50% Formamid. Vorteilhafterweise liegen die Hybridi sierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 2,0 × SSC und Tempe raturen zwischen etwa 20°C bis 70°C, bevorzugt zwischen etwa 50°C bis 70°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbe dingungen vorteilhaft bei 2,0 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 60°C, bevorzugt zwischen etwa 35°C bis 60°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind bei spielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäu re mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedin gungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbü chern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybri disierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Aus ubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nu cleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Ox ford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Mole cular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Univer sity Press, Oxford.

Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die L-Pantolacton-Hydrolasengene mit Sequenz SEQ ID NO: 1 und seine Derivate und Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genex pression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden, und so die Expression der Nu kleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationsse quenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nu kleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt, es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Se quenz SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen inseriert und der natür liche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Das Nukleinsäurekonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktio nell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Ex pression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Ko pien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch wei tere Marker wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komple mentierende Gene gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.

Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver fahren sind beispielsweise in Promotoren wie aphII (Tn5), trc, cos-, tac-, trp-, laCPAI, rha, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp lac-, lacI^q T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationsse quenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie in den konstitutiven oder induzierbaren Streptomyces-Promotoren aphI, ermE, melC, tipA, mcrAB, gylCAB, veg, SPO1, amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren AOX1, GAL1, ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxi dase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.

Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorga nismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise ei nem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pBluescript, pBAD, pQE (His-tag System), pICIC223-3, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pGEM7Z, pKK223-3, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI oder wie broad-host-range Plasmide wie pBBR1MCS oder pRK293 in Streptomy ces und anderen Actinomyceten pIJ101, pIJ364, pMVS301, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebac terium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plas mide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Wei tere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können bei spielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 ISBN 0 444 904018) entnommen werden.

Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expres sion der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtsorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.

Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugs weise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflus sen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatori schen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene er folgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/ oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Ver stärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabi lität der mRNA verbessert wird.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das er findungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine L-Pantolacton- Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA

Diese L-Pantolacton-Hydrolase kann im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.

Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen entsprechend der im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen ande rer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.

Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nu kleinsäure oder dem Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vor teilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram- positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, Hefen wie Pichia, Saccharo myces oder Hansenula oder Pilze wie Beauveria oder Psilocybe be sonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomo nas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacte rium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüberhinaus in der Gruppe der α-Proteobacterien, β-Proteo bacterien oder γ-Proteobacterien zu finden.

Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfin dung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäurekonstrukte oder Vektoren, die für L-Pantolacton-Hydrolasen kodieren.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenen falls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Luft- oder Sauerstoffbe gasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht regu liert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, fed batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder konti nuierlich nach gefüttert werden. Das racemische Pantolacton kann direkt zur Anzucht gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Ver fahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.

Die Wirtsorganismen enthalten vorteilhaft 0,5 U/g BTM ( = Biotroc kenmasse) L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität, bevorzugt 4 U/g BTM, besonders bevorzugt 20-150 U/g BTM, ganz besonders bevorzugt 40-150 U/g BTM.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Tempe ratur zwischen 0°C bis 95°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 85°C besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 75°C durchgeführt.

Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwi schen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 6 und 9, besonders be vorzugt zwischen pH 6 und 8, ganz besonders bevorzugt zwischen pH 6,5 und 7,5 gehalten.

Unter racemischen Pantolacton im erfindungsgemäßen Verfahren ist Pantolacton zu verstehen, das aus einem 50 : 50 Gemisch der beiden Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch besteht.

Unter enantiomerenreinem bzw. chiralem Pantolacton (D- oder L-Enantiomer) sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 70%ee, bevorzugt von min. 80%ee, besonders bevorzugt von min. 90%ee, ganz besonders bevorzugt min. 98%ee erreicht.

Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen ver wendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein säurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufge schlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Be handlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z. B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobili sierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reak tion Anwendung finden können.

Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßi gerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zen trifugation. Dies ist bei Verwendung von immobilisierten Organis men oder Enzymen vorteilhaft nicht notwendig, kann aber auch er folgen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten D-Pantolacton läßt sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über Ex traktion oder Kristallisation oder vorteilhaft über Extraktion und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktions lösung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Ex traktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt wer den. Vorteilhaft wird die Lösung vor Extraktion auf ca. 0°C bis 10°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wird vor dem Herunterkühlen oder danach vorteilhaft auf ca. pH 6,0 bis pH 7,0 neutralisiert, um die freie Säure in das Salz zu überführen, so daß sie unter den Reaktionsbedingungen nicht extrahiert werden kann. Für die Neu tralisation wird beispielsweise Bicarbonat oder eine andere Base wie NaOH oder KOH genommen. Als organische Lösungsmittel können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze zeigen und in die das Lacton aus der wäßrigen Phase übergehen kann. Vor teilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die nur wenig Wasser aufnehmen, so daß nur wenig Säure in das Lösungsmittel übergeht wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diisopropylether, Ben zol, Methyltertiärbutylether, Methylisobutylketon oder Essig ester.

Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90% che mische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die orga nische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abge kühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wäßrigen Lösung erfolgen. Das auskristalli sierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und nochmals kristallisiert werden. Durch die anschließende vorteil hafte mindestens einmalige Kristallisation kann die Enantiomeren reinheit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert wer den. Vorteilhaft kann jedoch das entstandene L-Pantolacton direkt als organische Lösung ohne Kristallisation verwendet werden.

Das in wäßriger Lösung verbliebene L-Enantiomer kann durch Ansäu ren beispielsweise mit Schwefelsäure zum Lacton geschlossen wer den und anschließend wie oben beschrieben extrahiert werden. Zur Lactonisierung wird die Lösung vorteilhaft erwärmt. Das gewonnene L-Lacton kann nach Abziehen des Lösungsmittels in der Schmelze mit katalytischen Mengen (ca. 1-5% Mol%) einer Base wie NaOH oder NaMethylat racemisiert und rückgeführt werden. Durch die vorteilhafte Racemisierung und Rückführung des unerwünschten Enantiomers kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine theoretische Ausbeute von 98% erreicht werden.

Bei den genannten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100%, be vorzugt von 80 bis 100%, besonders bevorzugt von 90 bis 100% bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte racemische Pantolac ton isolieren. Das isolierte Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von < 90%, bevorzugt < 95% besonders bevor zugt von < 98% aus. Weiterhin haben die Produkte eine hohe Enan tiomerenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.

Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für die Synthese von Panthenol, Pantethein und deren Derivate. Diese Stoffe und das erhaltene enantiomerenreine Pantolacton können in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.

Die nachstehenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung.

Beispiele 1. L-Pantolacton-Hydrolyse mit Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere der in Tabelle 1a, 1b angegebenen Stämme) wurden 1-3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen, geerntet, in Puffer gewaschen und resuspendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7.0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM D,L-Pan tolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Kon zentrationen an D,L-Pantolacton, D,L-, D- und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt (Tab. 1a). Alternativ wurde die Um setzung über Nacht unter Titration mit 4 M NaOH durchgeführt (4 ml Zellsuspension, 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris/HCl pH 7.0 ad 20 ml dest. Aqua; Tab. 1b). Alle Stämme der Tabelle 1 hydroly sierten das racemische Pantolacton zu L-Pantoinsäure. Der ee-Wert bei hohem Umsatz (< 45%) und damit die Enantioselektivität E des Enzyms wurde nach Straathof und Jongejan, Enzyme & Microbiol. Technology 21: 559-571, 1997 bestimmt.

2. Verifizierung der hydrolytischen Aktivität

Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere Stämme aus Tab. 1) wurden 1-3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen, geerntet, in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7.0) gewaschen und resuspendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7.0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM Ketopantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Konzentrationen an Ketopantolacton, Ketopantoinsäure, D,L-Pantolacton, D,L-, D und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt (Tab. 1a). Alle aufgeführten Stämme außer Beauveria amorpha Lu7953 vermochten die aus Ketopantolacton durch spontane Hydrolyse entstehende Ketopan toinsäure zu Pantoinsäure zu reduzieren. Da bei allen Stämmen je doch D-Pantoinsäure anstelle der unter Beispiel 1 beschriebenen L-Pantoinsäure gebildet wurde, kann die Umsetzung von Pantolacton zu L-Pantoinsäure nicht durch einen Oxidations-Reduktionsprozeß (über Ketopantolacton und Ketopantoinsäure) entstehen. Es wurde auch im dialysierten Rohextrakt von Lu681 oder Lu5351 und bei Einsatz der gereinigten Enzyme aus Lu681 und Lu5351 keine Abhän gigkeit der L-Pantolacton-Hydrolyse von Cofaktoren festgestellt. Die enzymatische Aktivität läßt sich damit auf ein hydrolytisches Enzym zurückführen.

3. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit verschiede nen Wildtypstämmen a. Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt) an gezogen (OD600 = 6,7, BTM = 2,97 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Panto lacton in 50 mM Tris/HCl pH 7.0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,5 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse be stimmt (3 h: c = 45%, ee = 95%; 19,5 h: c = 59%, ee = 89% bzgl. L- Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 73% bzw. 100%.

b. Agrobacterium radiobacter Lu5351

Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen (OD600 = 11,5, BTM = 2,90 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Pan tolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7.0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse be stimmt (3 h: c = 20%, ee = 93%; 19,4 h: c = 53%, ee = 94% bzgl. L- Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 21% bzw. 100%.

c. Pseudomonas dimunuta Lu683

Pseudomonas dimunuta Lu683 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt) angezogen (OD600 = 7,3, BTM = 3,78 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7.0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Ti tration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,3 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 48%, ee = 97%; 19,4 h: c = 69%, ee = 79% bzgl. L-Panto insäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 82 % bzw. 100%.

d. Apiotrichum humicola Lu3215

Apiotrichum humicola Lu3215 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) ange zogen (OD600 = 18,5, BTM = 7,34 g/l), geerntet und gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-Panto lacton in 50 mM Tris/HCl p117.0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse be stimmt (3 h: c = 55%, ee = 79% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84%.

4. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681

Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 14 l Komplexmedium (HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 200 U) aus dem Rohextrakt gerei nigt (Tab. 2). Dazu wurden die Zellen (1128 g Feuchtmasse) zu nächst durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puf fer (1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert. Endvolumen 3 l. Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1-0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension (3,2 l) wurde 2mal bei 1500 bar im Z04 Microfluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (4 l) wurden einer er sten Fällung mit 200 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natron lauge auf pH 7,0 gehalten. Der Niederschlag wurde 30 Minuten bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (3,1 l) wurde mit 200 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung (pH 7,5) versetzt. Durch die Zugabe sank der pH auf 5,0 ab. Es bildete sich ein Niederschlag, der wiederum bei 6000 U/min (20 Minuten, Sorvall) abzentrifugiert wurde. Der Überstand (3,4 l) wurde auf pH 7,0 zurücktitriert.

Anschließend wurden 989 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 50%igen Sättigung) zugegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung wurde 20 Minuten bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand (3,7 l) wurde geteilt: 1,2 l wurden in einer Phenyl sepharose Chromatographie eingesetzt.

Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphos phatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradien ten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% Puffer-B nach 120 Minu ten erreicht und für 40 Minuten gehalten. Aktive Fraktionen wur den gesammelt und vereinigt (250 ml).

Nach Verdünnung auf < 7 mS/cm wurden diese 3 l durch Chromatogra phie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml, Fast Flow, Pharmacia) gereinigt. Die Säule wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min). Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde auf 100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei linear 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und ver einigt (118 ml). Dieses Volumen wurde konzentriert (10 kD Omega- Membran) und gegen 5 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert; Endvolu men 21 ml. 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 auf getragen. Die Säule wurde zuvor äquilibriert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und dann entwickelt mit einem Gradienten (1% pro Mi nute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive Frak tionen wurden vereinigt (3,7 ml) und zweimal gegen 2 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert (4 ml).

Dieses Material wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharmacia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt. Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Aceton fällung bei -20 Grad Celsius konzentriert.

Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben (Tris/Glycin Gel 12%, Fa. Novex ca. 2,5 h 125 V, 50 mA, Laemmli, U. K., 1970, Nature, 227: 680-685). Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert und ausgeschnitten. Hierzu wurde das Gel kurz in TBS-Puffer ( = 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) geschwenkt und dann mit 50 ml TBS + 50 ml α-Naph thylacetat-Lösung (Sigma N-8505, 0,4 g/l in 10% Aceton) 10 min. vorinkubiert. Anschließend wurden 50 ml Fast Red TR-Lösung (Sigma F-8764, 1 g/l) zugegeben und das Gel weiter bei RT ( = ca. 23°C) geschwenkt. Die L-Pantolacton-Hydrolase war als rot-braun ge färbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequen zen (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten.

5. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Agrobacterium ra diobacter Lu5351

Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 14 l Komplexmedium (z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 60 U) aus dem Rohextrakt gerei nigt (Tab. 2). Dazu wurden die Zellen (400 g Feuchtmasse) von Agrobacterium radiobacter (Lu 5351) zunächst durch eine Behand lung mit einem. Ultra-Turrax Stab im Puffer (1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert (Endvolumen 2,2 l). Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1-0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension wurde 2mal bei 1500 bar im Z04 Microfluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (2,7 l) wurden einer ersten Fällung mit 135 ml einer 1 M Mangan chlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natronlauge auf pH 7,0 gehalten und der Nieder schlag 30 min bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (2,6 1) wurde mit 575 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung versetzt und der pH erneut kontrolliert. Zu diesen 3,15 l wurden 711 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 40%igen Sättigung) gegeben und 10 Minuten ge rührt. Die Trübung wurde 30 min bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand (3/3 l) wurde in einer Phenylsepharose Chro matographie eingesetzt.

Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphos phatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradien ten mit Puffer 8 (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% 8 nach 120 min erreicht und für 40 min gehalten. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (350 ml, 20,9 mS).

Nach Verdünnung auf 7 mS/cm (3,1 l Endvolumen) wurde eine Chroma tographie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml, Fast Flow, Pharmacia) durchgeführt. Die Säule wurde mit 1 l Puf fer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min). Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde auf 100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten linear bei 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und ver einigt (134 ml). Dieses Volumen wurde konzentriert (10 kD Omega- Membran) und gegen 3 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert (Endvolu men 19 ml). 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquilibriert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und entwickelt mit einem Gradienten (1% pro Mi nute) nach Puffer 8 (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive Frak tionen wurden vereinigt (12,5 ml) und gegen 5 l 10 mM Natriumace tatpuffer pH 5.0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert.

Der Überstand wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharma cia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt.

Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Ace tonfällung bei -20 Grad Celsius konzentriert. Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben: Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert (siehe Bei spiel 4) und ausgeschnitten. Sie war als rot-braun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide wurden sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 5 und 6) erhalten. Die Sequenzierung von SEQ ID NO: 5 ergab eine Unklarheit bei der ersten Aminosäure der Sequenz. Das in Po sition 1 wiedergegebene Tyrosin kann auch ein Leucin sein; die Se quenz war hier nicht eindeutig.

6. Substratspezifität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolasen aus Lu681 und Lu5351

0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten Enzyme aus Lu681 oder Lu5351 wurden in 150 mM Pipes pH 6,8 mit verschiedenen Estern und Lactonen inkubiert. Nach 0,1 und 20 h wurden Proben gezogen, die Reaktion durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt und die Konzentration des Sub strates sowie der korrespondierenden Säure durch HPLC-Analyse be stimmt. Die Aktivität ist in den Tabellen 3a und 3b im Vergleich zur Aktivität mit L-Pantolacton angegeben.

Für das Lipasesubstrat 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutarsäure resorufinester wurde für das Lu681-Enzym ein optischer Test in der Mikrotiterplatte durchgeführt (Boehringer Mannheim, modifi ziert). 60-482 U/l Enzym wurden in 45 mM KH₂PO₄ pH 6,8 mit 0,18 g/l Resorufinester (2 g/l in Dioxan + 2% SDS + 10% H₂O) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion E wurde nach 2 min und 82 min bei 572 nm gemessen. Tab. 3c zeigt die Extinktionsdiffe renz und die daraus berechnete Lipase-Aktivität, die ca. 0,5% von der L-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität beträgt.

7. Inhibition und Aktivierung der gereinigten L-Pantolacton-Hy drolasen aus Lu681 und Lu5351

0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten Proteine aus Lu.681 oder Lu5351 wurden 5 min mit verschiedenen Effektorsubstanzen in 150 mM Pipes (pH 7.0) vorinkubiert. Der Assay wurde durch Zugabe von 150 mM L-Pantolacton gestartet (1 h 30°C) und durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt. Anschließend wurden die Konzentrationen an D,L-Panto lacton, D,L-, D- und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Die Tabellen 4a und 4b zeigen die Aktivität im Vergleich zur Probe ohne Zusatz einer Effektorsubstanz. Insgesamt sind die ge reinigten Enzyme aus Lu681 und Lu5351 unempfindlich (< 85% Rest aktivität) gegen chelatisierende Substanzen, SH-Reagenzien, Pro tease-Inhibitoren, Detergenzien (Ausnahme: Lu5351 mit 74%-Restaktivität in 1% SDS) und verschiedene Kationen.

Eine signifikante Aktivierung (+ 20%) ist allenfalls mit HgCl₂ festzustellen (133/170%). Desweiteren wurde für die rekombinante 681-Lactonase (E. coli-Zellen, s. 3.8 ff.) eine kom petitive Hemmung durch D-Pantolacton nachgewiesen.

8. Genbank + Screening: Klonierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681

Genomische DNA aus Burkholderia caryophylli Lu681 wurde isoliert (Qiagen, Hilden), mit EcoRI verdaut und in mit EcoRI geschnitte nen und dephosphorylierten pBluescriptKS+-Vektor ligiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989). Das Ligationsgemisch wurde gemäß Instruktion der Fa. Stratagene (La Jolla, Calif.) in E. coli XL1Blue transformiert. Die Tansfor manten wurden auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg/ml), IPTG ( = Isopropyl-(3-thiogalactosid, 0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) ausplat tiert und über Nacht bei 30 oder 37°C inkubiert. Die weißen Kolo nien wurden gepickt auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) und wiederum über Nacht inku biert. Anschließend wurde durch Filterabklatsch mit sterilen Ni trocellulosefiltern eine Kopie dieser Masterplatte auf LB-Ampi cillin-(100 mg/ml)IPTG-Platten angelegt. Der Filter wurde nach Inkubation über Nacht auf dieser Platte (s. o.) einem Aktivität stest mit 150 mM L-Pantolacton, 0,1% Nitrazingelb und 10 mM Tris/HCL pH 7,0 unterzogen (3 h-ÜN 30°C). Ein Klon mit Gelbfär bung (XL1Blue pKS + 681) wurde isoliert.

9. Restriktionskartierung und Sequenzierung des EcoRI-Inserts aus E. coli XL1Blue pKS + 681

Aus E. coli XL1Blue pKS + 681 wurde die Plasmid-DNA gemäß Instruk tion der Fa. Qiagen (Hilden) isoliert und mit den Restriktionsen zymen EcoRI, BamHI, PstI und HindIII einzeln bzw. im Doppelverdau geschnitten. Die fragmentierte DNA wurde durch Agarose-Gelelek trophorese im 0,8%igen Agarosegel analysiert. Aus den erhaltenen Fragmentgrößen resultiert die in Fig. 3 abgebildete Restriktions karte des 7,5 kB-Insert. Es wurde vollständig sequenziert (Sanger et al. 1977) und enthält u. a. die Nukleotidsequenz ID NO : 1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) wiederum enthält die Peptide YGIEGLNNLEAL und AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO: 3 und 4), die nach tryptischem Verdau der gereinigten und geblotteten L-Panto lacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681 und Agrobac terium radiobaca er Lu5351 gefunden wurden (siehe Beispiel 4 und 5).

Datenbankabgleiche (Genbank, EMBL, SwissProt Stand 7.5.99, [Sptrembel] bzw. 5.1.99 [PIR]) der Nukleotid- und der abgeleite ten Aminosäuresequenz ergaben lediglich eine geringe Homologie zu einer Gruppe hypothetischer Proteine und zu bestimmten Tetracy clin-Cyclasen aus Streptomyceten (Tab. 5). Insbesondere das Motiv mit der Consensus-Sequenz HTGTHVDAP ist in allen Proteinen hoch konserviert. Außerdem wurde eine Homologie von 48% (38% identi sche Aminosäuren) zur Isatin-Hydrolase aus Pseudomonas putida WW2 gefunden (WO 94/09175), die ebenfalls das genannte Sequenzmotiv enthält. Da keine Homologie zu anderen Lactonasen, Esterasen oder Lipasen gefunden wurde, handelt es sich bei den gefundenen L-Pan tolacton-Hydrolasen um eine neue Klasse von Enzymen. Die Sequenz vergleiche lassen eine entfernt verwandte phylogenetische Familie vermuten, zu der auch die benannten hypothetischen Proteine und Tetracyclin-Cyclasen sowie die Isatin-Hydrolase gehören.

10. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XL1Blue pKS + 681

Eine volle Impföse E. coli XL1Blue pKS + 681 wurde nach Wachstum (ÜN = über Nacht, 37°C) auf einer LB-Platte mit Ampicillin (100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) in 0,5 ml Tris-HCl pH 7.0 und 50 mM D,L-Pantolacton resuspendiert (OD600 = 2,5). Als Vergleich diente eine entsprechende E. coli XL1Blue pBlues criptKS + -Probe (OD600 = 2,5). Nach 1 h wurden die Zellen abzentri fugiert und D,L-Pantolacton, D,L-, D- und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Tab. 6a zeigt Aktivitäten und ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Suspension besaß eine Aktivität von ≧ 90 U/L. In Flüssigkultur-Ansätzen (vgl. Beispiel 12) war jedoch keine signifikante Aktivität zu erkennen.

11. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli XL1Blue pKK223-3

Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 wurden die Oligonukleo tide 5'-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCAGACCAG GGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Amplifikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedingungen: 20 mM Tris/HCl pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 µg/ml pKS + 681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25U/ml Pfu-Polymerase (Strata gene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR- Produkt (0,8 kB) wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten und in mit EcoRI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg) ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, La Jolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al. 1990, Gene 96: 23-28). Die Tansformanten wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformati onsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filterabklatsch und ein anschließender Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktionsverdau (EcoRI-HindIII, EcoRI- HindIII-BamHI) der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Molecu lar Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 4 abgebildete Plasmid pKK681.

12. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XL1Blue pKK681

E. coli XL1Blue pKK681 wurde in 30 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/ml) und IPTG (0,5 mM) über Nacht bei 37°C angezogen, ge erntet und in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7.0) gewaschen und re suspendiert (3 ml 50 mM Tris/HCl pH 7.0). 0,25 ml der Suspension wurden mit 150 mM L-Pantolacton, 150 mM Pipes pH 7.0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h bei 30°C inkubiert. Daneben wurden 0,25 ml der Suspension mit 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris pH 7.0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h inkubiert. Weiterhin wurden 2 ml der Suspension mit 300 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris pH 6.8 ad 20 ml Aqua dest. versetzt und unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 6.8 3 h inkubiert. Nach 1 h und nach 3 h wurden Proben entnom men, die Zellen abgetrennt und der Überstand auf D,L-Pantolacton, D,L-, D- und L-Pantoinsäure untersucht. Tab. 6b zeigt Aktivitä ten und ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Über-Nacht-Kultur (1 × konzentriert) besitzt somit eine Aktivität von 90-150 U/l.

Bei Induktion von E. coli XL1Blue pKK681 in der frühexponentiel len Wachstumsphase (OD600 = 0,6, + 0,5 mM IPTG) besitzen die ent sprechenden Zellen nach 5 h Inkubation bei 37°C in der spätexpo nentiellen Phase (OD600 = 4,1) eine Aktivität von ca. 480 U/l.

13. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli TG1 pDHE19

Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID NO. 1 wurden die Oligo nukleotide 5'-C'AGGATGCCATATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCA GACCAGGGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Amplifika tion des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedin gungen: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 2 mM MgSO₄, 10 mM KCl, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 µg/ml pKS + 681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25U/ml Pfu-Polymerase (Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit NdeI und HindIII geschnitten und in mit NdeI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten pDHE19 (***Nitrilase-Plasmid aus Stuttgart, Prof. Mattes***) li giert. Das Ligationsgemisch wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al. 1990, Gene 96: 23-28). Die Tansforman ten wurden auf LB-Ampicillin-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformationsplatte wurden analog zu 3.6 ein Filterabklatsch auf LB-Ampicillin-(100 µg/ml)Rhamnose-(2 g/l) Platten (LB = Luria Broth) und ein anschließender Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifi ziert wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktions verdau (NdeI-HindIII, NdeI-HindIII-BamHI) sowie Sequenzanalyse der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 5 abgebil dete Plasmid pDHE681.

14. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli TG1 pDHE681

E. coli TG1 pDHE681 wurde in 14 l Minimalmedium mit 40 g/l Glyce rin und 3 g/l Rhamnose 6-7 h bei 37°C angezogen, geerntet und in Tris/HC₁-Puffer (50 mM, pH 7.0) gewaschen und ad 1,4 l Puffer resuspendiert. Die Aktivität der einfach konzentrierten Zell suspension betrug im im Standardassay (150 mM Pipes pH 7,0, 150 mM L-Pantolacton, 1 h 30°C) 680-2700 U/l bzw. 60-160 g/BTM.

10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30 W unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach 0.4 h und 3 h wurden der Umsatz und der ee-Wert durch HPLC-Analyse be stimmt (0,4 h: c = 48%, ee = 92%; 3 h: c = 58%, ee = 72% bzgl. L-Pan toinsäure). Dies entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84% bzw. 100%.

15. Hv D-Pantolacton durch Hydrolyse mit E. coli TG1 pDHE681

3 g D,L-Pantolacton wurden in 10 ml H₂O gelöst und mit 4 M NaOH auf pH 6,5 titriert. Nach Zugabe von 5-10 ml Zellsuspension E. coli TG1 pDHE681 (Beispiel 14) und Auffüllen ad 20 ml mit H₂O wurde die Reaktion bei 30°C unter Titration auf pH 6,8 15-22 h inkubiert. Wahlweise wurden nochmals 0-2 ml Zellsuspension zuge setzt und weitere 3 h inkubiert bzw. 3 × 5 ml Zellsuspension zugesetzt und weitere 90 h inkubiert. Fig. 6 zeigt den Verlauf anhand des NaOH-Verbrauches. Je nach Umsatz und Inkubationszeit wurden ee-Werte für D-Pantolacton von 71 bis 97% erzielt. An schließend wurden die Zellen aus den 22 ml-Ansätzen abzentri fugiert und mit 5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,0 gewaschen und die Über stände vereinigt (20-25 ml) und 3 × mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde nach Zugabe von 10 g Na₂SO₄ (wasserfrei) 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Der Niederschlag wurde abfiltriert, 1 × mit Ethylacetat gewaschen und das Filtrat 3 h bei 40°C einrotiert. Der viskose Rückstand wurde ausgewogen und durch HPLC, GC, GC-MS sowie H-NMR analysiert (Tab. 7). Er ent hielt reines D-Pantolacton (ee 71-87% nach 50-52% Umsatz).

Die wäßrige Phase (21 ml; Na-L-Pantoat) wurde mit ca. 5 ml 3 M H₂SO₄ auf pH 1 gestellt, 15 min bei 80°C erhitzt und mit 8 g wasserfreiem Na₂SO₄ versetzt. Das erhaltene L-Pantolacton wurde analog 3 × mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, mit Na₂SO₄ ge trocknet und einrotiert. Zur Rückführung in die Hydrolyse kann die L-Pantolacton-Schmelze durch Erhitzen nach NaOH-Zugabe in Gegenwart von geringen Mengen Na-L-Pantoat racemisiert werden (3 h 180°C).

Tab. 3a Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681

Tab. 3b Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu5351

Tab. 3c Lipaseaktivität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681

Tab. 4a Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Burkholderia caryophylli Lu681 im Standardassay

Tab. 4b Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Agrobacterium radiobacter Lu5351 im Standardassay

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 darge stellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degene rierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 darge stellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter a) bis c) genannten Sequenzen.

2. Aminosäuresequenz, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz ge mäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.

4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz ge mäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.

6. Mikroorganismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäurese quenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4 oder einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-negatives Bakte rium handelt.

8. Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich net, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium aus der Gruppe der α-Proteobacterien, β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien handelt.

9. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakte rium aus der Familie der Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae handelt.

10. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakte rium der Gattungen Agrobacterium, Pseudomonas, Burkholderia, Salmonella oder Escherichia handelt.

11. L-Pantolacton-Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in ei nem pH-Bereich von 4 bis 10
c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA

12. Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, dadurch gekenn zeichnet, daß das Verfahren folgende Reaktionsschritte um faßt:

a) Umsetzung racemischen Pantolactons in Gegenwart einer L- Pantolactonhydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer L-Pan tolactonhydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß An spruch 2 oder einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 zu D-Pantolacton und L-Pantoinsäure
b) Abtrennung des D-Pantolactons.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die unter Reaktionsschritt b) erhaltene L-Pantoinsäure racemi siert und in Reaktionsschritt a) rückgeführt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart einer immobilisierten L-Pantolactonhydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer immobilisierten L-Pantolactonhydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart eines wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikroorga nismus gemäß Anspruch 6 durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus immobilisiert ist.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekennzeich net, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei einem pH zwischen 4 bis 12 durchgeführt wird.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17, dadurch gekennzeich net, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 95°C durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Pantolacton über Extraktion abgetrennt wird.

20. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeich net, daß das D-Pantolacton eine optische Reinheit von minde stens 90% ee besitzt.