WO2001032890A1 - L-pantolacton-hydrolase und ein verfahren zur herstellung von d-pantolacton - Google Patents

L-pantolacton-hydrolase und ein verfahren zur herstellung von d-pantolacton Download PDF

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WO2001032890A1
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nucleic acid
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microorganism
hydrolase
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PCT/EP2000/010320
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Maria Kesseler
Bernhard Hauer
Thomas Friedrich
Ralf Mattes
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction

Definitions

  • the present invention relates to proteins which have an enzymatic activity for the hydrolysis of L-pantolactone.
  • the invention further relates to nucleic acids that code for these proteins, nucleic acid constructs, vectors, genetically modified microorganisms and a method for producing D-pantolactone.
  • D-pantolactone is a precursor in the chemical synthesis or biosynthesis of pantothenic acid, panthenol and pantethein and their derivatives. These are used as vitamin additives in human nutrition, in animal feed, in medicine, for example for wound healing, and in cosmetics, for example in hair cosmetics. Economic processes for the synthesis of enantiomerically pure D-pantolactone are therefore of great importance
  • pantolactone In addition to the long-established chemical processes for the production of D-pantolactone, various biotechnological processes have also recently been worked on. An overview of pantolactone and its chemical synthesis can be found in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Vol. A27, 1996, VCH Verlagsgesellschaft mbH, 69451 Weinheim, pages 559-566).
  • pantolactone Various synthetic strategies were pursued for the biotechnological synthesis of pantolactone.
  • Degussa describes the production of pantolactone with the enzyme oxinitrilase starting from hydroxypivalaldehyde and hydrocyanic acid via optically pure hydroxypivalaldehyde cyanohydrin (DE 41 26 580, EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). Theoretically, 100% yield can be achieved in this reaction. The disadvantage of this reaction is the high enzyme requirement (equimolar amounts Enzyme: substrate) and the relatively low enantiomeric purity of the product (max. 82% ee).
  • JP 47019745 describes the synthesis of D-pantolactone using Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus or Corynebacterium.
  • the organisms mentioned convert racemic pantolactone to D-pantolactone by metabolizing the L-pantolactone.
  • the disadvantage of this process is that half of the starting material is metabolized and is therefore lost.
  • ketopantolactone and ketopantoate oxidoreductases have also been described for bacteria (e.g. Yamada & Shimizu, see above; Shimizu et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 12077-12084, Kataoka et al. 1992, Eur. J Biochem. 204, 799-806).
  • the Fuji company in cooperation with the Yamada working group at Kyoto University has developed a process for the enzymatic resolution using a fungal D-pantolactone hydrolase (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP- B-0 504 421, 5 EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5,275,949,
  • D-pantolactone hydrolase is a glycosylated enzyme that consists of a 125 kDa homodimer and
  • nucleic acid sequences which, as a result of the degenerate genetic code, are derived from the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1,
  • L-pantolactone hydrolases can advantageously be found in organisms, microorganisms such as bacteria.
  • the enzyme or the enzymes have a high enzymatic activity for the hydrolytic conversion of L-pantolactone into L-pantoic acid.
  • L-pantolactone hydrolases do not convert D-pantolactone, so that the organisms, extracts or purified enzymes as well as corresponding recombinant strains or proteins can be used to produce enantiomerically pure D-pantolactone.
  • Derivatives of the nucleic acid sequence according to the invention with the sequence SEQ ID NO: 1 are to be understood, for example, as allele variants which have at least 50% homology at the derived amino acid level, preferably at least 60% homology, particularly preferably 70%, very particularly preferably at least 80% homology. Homology was determined using either the method of Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970: 443-453) or Smith S Waterman (Adv. Appl. Math., 2, 1981: 482-489). The homologies can advantageously be higher over partial regions of the sequences.
  • the amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 1 can be found in SEQ ID NO: 2.
  • Allelic variants include in particular functional variants which can be obtained by deleting, inserting or substituting nucleotides from the sequence shown in SEQ ID NO: 1, the enzymatic Activity of the derived synthesized proteins should not be significantly reduced. Enzymes with a not significantly reduced enzymatic activity are to be understood as enzymes which have an enzymatic activity of at least 20%, preferably 50%, particularly preferably 75%, very particularly preferably 90%.
  • the invention thus also relates to amino acid sequences which are encoded by the group of nucleic acid sequences shown above.
  • the invention advantageously relates to amino acid sequences which are encoded by the sequence SEQ ID NO: 1.
  • Functional equivalents of the sequences mentioned under (a) to (c) are to be understood as nucleic acids which code for enzymes which hydrolyze L-pantolactone to the corresponding acid and which are at least 20%, preferably 50%, particularly preferably 75%, very particularly preferably Have 90% of the activity of the sequence mentioned under SEQ ID NO: 2, are not inhibited by EDTA (1 r ⁇ M solution) and are stable between pH 4 to 10.
  • These functional equivalents also advantageously have a pH optimum between pH 7 and 8 and a temperature optimum between 70 ° C and 80 ° C.
  • derivatives are also to be understood as homologs of SEQ ID NO: 1, for example fungal or bacterial homologs, shortened sequences, single-stranded DNA or RNA of the coding and non-coding DNA sequence.
  • Homologs of SEQ ID NO: 1 have a homology at the DNA level of at least 50%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 70%, very particularly preferably at least 80% over the entire DNA specified in SEQ ID NO: 1 -Area.
  • homologs of SEQ ID NO: 1 are to be understood as derivatives such as promoter variants.
  • the promoters which precede the specified nucleotide sequences can be changed by one or more nucleotide exchanges, by insertion (s) and / or deletion (s), but without the functionality or effectiveness of the promoters being impaired.
  • the effectiveness of the promoters can be increased by changing their sequence, or completely replaced by more effective promoters, including organisms of other species.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be identified and isolated from all organisms.
  • SEQ ID NO: 1 or its homologues can advantageously be isolated from fungi, yeasts or bacteria. Gram-negative and gram-positive bacteria are mentioned as bacteria.
  • the nucleic acid (s) according to the invention are preferred from gram-negative bacteria, advantageously from ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria or ⁇ -proteobacteria, particularly preferably from bacteria of the Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae or Rhizobiaceae families , very particularly preferably isolated from bacteria of the genus Agrobacterium, Pseudomonas or Burkholderia using methods known to the person skilled in the art.
  • the genera Beauveria or Psilocybe may be mentioned as advantageously suitable mushrooms.
  • Advantageous yeasts can be found, for example, in the Apiotrichum genus.
  • SEQ ID No: 1 or its derivatives, homologs or parts of these sequences can be isolated from other fungi or bacteria, for example, using conventional hybridization methods or the PCR technique.
  • These DNA sequences hybridize under standard conditions with the sequences according to the invention.
  • longer fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can also be used for the hybridization.
  • DNA hybrids are advantageously 2.0 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 70 ° C., preferably between approximately 50 ° C. to 70 ° C.
  • DNA: RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 2.0 ⁇ SSC and temperatures between approximately 20 ° C. to 60 ° C., preferably between approximately 35 ° C. to 60 ° C.
  • nucleic acid construct according to the invention are the nucleic acid construct according to the invention.
  • L-pantolactone hydrolase genes with sequence SEQ ID No: 1 and its derivatives and homologues which were advantageously functionally linked to one or more regulatory signals to increase gene expression.
  • these regulatory sequences are sequences to which inducers or repressors bind and thus regulate the expression of the nucleic acid.
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified so that the natural regulation has been switched off and the expression of the genes increased.
  • the nucleic acid construct can also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals have been inserted before the sequence SEQ ID No: 1 or its homologues and the natural promoter with its regulation has not been removed.
  • the nucleic acid construct can also advantageously contain one or more so-called “enhancer sequences” functionally linked to the promoter, which enable increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences, such as further regulatory elements or terminators, can also be inserted at the 3 'end of the DNA sequences.
  • the nucleic acids according to the invention can be contained in the construct in one or more copies.
  • the marker may also contain further markers such as antibiotic resistance or auxotrophy-complementing genes, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the method according to the invention are, for example, in promoters such as aphll (Tn5) -, tre-, cos-, tac-, trp-, lacPAI, rha, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp- lac-, lacl ⁇ 3-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, ⁇ -P R - or ⁇ -Pi, -promotor contain, which are advantageously in gram-negative bacteria Find application. Further advantageous regulatory sequences are found, for example, in the gram-positive promoters such as in the constitutive or inducible Streptomyces
  • the promoters of pyruvate decarboxylase and methanol oxidase from, for example, Hansenula are also advantageous. Artificial promoters for regulation can also be used.
  • the nucleic acid construct is advantageously inserted into a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as, for example, a plasmid, a phage or other DNA, which enables optimal expression of the genes in the host.
  • plasmids mentioned represent a small selection of the possible plasmids. Further plasmids are well known to the person skilled in the art and can be found, for example, in the book Cloning Vectors (Eds. Pouwels PH et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018 ) can be removed.
  • the nucleic acid construct for the expression of the further genes contained additionally contains 3 'and / or 5' terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected for optimal expression depending on the host organism selected and gene or genes.
  • regulatory sequences are intended to enable targeted expression of the genes and protein expression. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably influence the gene expression of the introduced genes positively and thereby increase.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong transcription signals such as promoters and / or "enhancers".
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • the vector containing the nucleic acid construct according to the invention or the nucleic acid according to the invention can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid according to the invention.
  • Another object of the invention is an L-pantolactone hydrolase, characterized by the following properties:
  • L-pantolactone hydrolase is stable in a pH range from 4 to 10
  • This L-pantolactone hydrolase can be used as a free or immobilized enzyme in the process according to the invention.
  • the expression of the genes according to the invention and of the proteins encoded by these genes in a host organism generally involves stress for these organisms.
  • the nucleic acids according to the invention can advantageously be expressed in the host organisms according to the invention.
  • Gouvernante are among the best preserved proteins in evolution in both pro- and eukaryotes and can be found universally in all organisms. They are divided according to the molecular weight in kilodaltons, e.g. HSP60, 70, 10 90 etc. These stress proteins owe their name to their ability to be induced by stress conditions such as low glucose levels, heat shock, alcohol, UV light, oxidative reagents etc.
  • a possible protein aggregation of the hydrolases can thus advantageously be prevented.
  • the stress proteins bind to hydrophobic parts of the proteins and thus prevent incorrect folding of the proteins or enable correct folding.
  • helper proteins cohort proteins
  • HSP17 35 the eukaryotic genes HSP17, 5, HSP22, HSP 25, HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, TRiC, UBI1,2,3,4 or their prokaryotic homologues such as HtpG, DnaK, DnaJ, GroES, GroEL, HtrC, ClpB, GrpE etc.
  • Preferred chaperones are GroES, GroEL, HtpG, DnaK, DnaJ, HSP70 or H ⁇ P27.
  • nucleic acids according to the invention are advantageously expressed in the presence of at least one stress protein; the genes can be under the joint control of a promoter or can be read by separate promoters. Accordingly, their
  • Expression can be induced by adding one or more inductor substances simultaneously or at separate times.
  • the nucleic acids can be on one vector or on separate ones Vectors. It is also possible to modify the host organism's stress proteins by genetic manipulation in such a way that they are overexpressed.
  • prokaryotic or eukaryotic organisms are suitable as recombinant host organisms for the nucleic acid according to the invention or the nucleic acid construct.
  • Microorganisms such as bacteria, fungi or yeasts are advantageously used as host organisms.
  • Gram-positive or gram-negative bacteria are advantageous, preferably bacteria from the Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaeeae or Noeardiaeeae families, yeasts such as Piehia, Saccharomyces or Hansenula or fungi such as Beauveria or Psilocybe, particularly preferably bacteria of the genus Escherichia monas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus are used.
  • the genus and type Escherichia coli is very particularly preferred.
  • Further advantageous bacteria can also be found in the group of oc-proteobacteria, ß-proteobacteria or ⁇ -proteobacteria.
  • nucleic acid sequences preferably contain at least one of the nucleic acid sequences, nucleic acid constructs or vectors described in this invention, which code for L-pantolactone hydrolases.
  • Microorganisms are usually in a • liquid medium, which is a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source mostly in the form of organic
  • Q Contains nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese, magnesium salts and optionally vitamins at temperatures between 0 ° C and 100 ° C, preferably between 10 ° C and 60 ° C with gassing with oxygen.
  • the pH of the nutrient liquid can be fixed
  • the cultivation can be batch-wise, semi-batch wise or continuous. Nutrients can start at Bfeeg Fermentation submitted or fed semi-continuously or continuously. The same applies to inducers such as isopropythiogalactoside, (IPTG), lactose, arabinose, rhamnose and antibiotics or temperature shifts, which switch on the expression of the gene according to the invention, depending on the promoter used.
  • inducers such as isopropythiogalactoside, (IPTG), lactose, arabinose, rhamnose and antibiotics or temperature shifts, which switch on the expression of the gene according to the invention, depending on the promoter used.
  • IPTG isopropythiogalactoside
  • lactose lactose
  • arabinose arabinose
  • rhamnose rhamnose
  • antibiotics or temperature shifts
  • the process according to the invention is advantageously carried out at a temperature between 0 ° C. to 95 ° C., preferably between 10 ° C. to 85 ° C., particularly preferably between 15 ° C. to 75 ° C.
  • the pH in the process of the invention is advantageously kept between pH 4 and 12, preferably between pH 6 and 9, particularly preferably between pH 6 and 8, very particularly preferably between pH 6, 5 and 1 7 is held; 5.
  • Racemic pantolactone in the process according to the invention is understood to mean pantolactone which consists of a 50:50 mixture of the two enantiomers or of any other mixture with an enrichment of one of the two enantiomers in the mixture.
  • enantiomerically pure or chiral pantolactone (D or L enantiomer) is to be understood as enantiomers which show an enantiomer enrichment.
  • Growing cells containing the nucleic acids, nucleic acid constructs or vectors according to the invention can be used for the method according to the invention.
  • Dormant or disrupted cells can also be used.
  • Disrupted cells are understood to mean, for example, cells which have been made permeable by treatment with, for example, solvents, or cells which have been broken up by means of enzyme treatment, by mechanical treatment (for example French press or ultrasound) or by some other method.
  • the crude extracts obtained in this way are advantageous for the process according to the invention. suitable.
  • Purified or purified enzymes can also be used for the process. Immobilized microorganisms or enzymes, which can advantageously be used in the reaction, are also suitable.
  • the D-pantolactone produced in the process according to the invention can advantageously be obtained from the aqueous reaction solution by extraction or crystallization or advantageously by extraction and crystallization.
  • the aqueous reaction solution is extracted with an organic solvent. The extraction can be repeated several times to increase the yield.
  • the solution is advantageously cooled to about 0 ° C. to 10 ° C. before extraction.
  • the aqueous solution is advantageously neutralized to about pH 6.0 to pH 7.0 in order to convert the free acid into the salt, so that it cannot be extracted under the reaction conditions.
  • bicarbonate or another base such as NaOH or KOH is used.
  • solvents can be used as organic solvents which show a phase boundary with water, if appropriate after addition of salts, and into which the lactone can pass from the aqueous phase.
  • Advantageous solvents are solvents which absorb only a little water, so that only a little acid passes into the solvent, such as toluene, methylene chloride, butyl acetate, diisopropyl ether, benzene, methyl tert-butyl ether, methyl isobutyl ketone, diethyl ketone or ethyl acetate.
  • the products can usually be obtained in good chemical purities, i.e. greater than 90% chemical purity.
  • the organic phase with the product can also be only partially concentrated and the product crystallized out.
  • the solution is advantageously cooled to a temperature of 0 ° C to 10 ° C. Crystallization can also take place directly from the organic solution or from an aqueous solution.
  • the product which has crystallized out can be taken up again in the same or in a different solvent for recrystallization and can be crystallized again.
  • the subsequent advantageous crystallization at least once can further increase the enantiomeric purity of the product if necessary.
  • the resulting D-pantolactone can advantageously be used directly as an organic solution without crystallization.
  • the L-enantiomer remaining in aqueous solution can be closed to form the lactone by acidic acids, for example with sulfuric acid, and then extracted as described above.
  • the solution is advantageously heated for lactonization.
  • the L-lactone obtained can be racemized and recycled with catalytic amounts (about 1 to 5% mol%) of a base such as NaOH, Na pantoate or Na methylate. Due to the advantageous racemization and recycling of the undesired enantiomer, a theoretical yield of 98% can be achieved in the process according to the invention.
  • the product of the process according to the invention can be isolated in yields of from 60 to 100%, preferably from 80 to 100%, particularly preferably from 90 to 100%, based on the racemic pantolactone used for the reaction.
  • the isolated product is characterized by a high chemical purity of> 90%, preferably> 95%, particularly preferably> 98%.
  • the products have a high enantiomeric purity, which can advantageously be further increased by crystallization if necessary.
  • the process according to the invention can be operated batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • panthenol, pantethein and their derivatives are suitable as starting materials for the synthesis of panthenol, pantethein and their derivatives.
  • These substances and the enantiomerically pure pantolactone obtained can be used in combination with one another or alone for the production of pharmaceuticals, foods, animal feed or cosmetics.
  • ketopantolactone, ketopantoic acid, D, L-pantolactone, D, L-, D- and L-pantoic acid were determined by HPLC analysis (Tab. La). All strains listed except Beauveria amorpha Lu7953 were able to reduce the ketopantoic acid formed from ketopantolactone by spontaneous hydrolysis to pantoic acid. However, since D-pantoic acid was formed in all strains instead of the L-pantoic acid described in Example 1, the conversion of pantolactone to L-pantoic acid cannot result from an oxidation reduction process (via ketopantolactone and ketopantoic acid).
  • GYP 1% D-glucose, 0.5% polypeptone, 0.5% yeast extract
  • HFP 1% peptone, 1% trypton, 0.5% yeast extract, 0.3% NaCl
  • HFP 1% peptone, 1% trypton, 0.5% yeast extract, 0.3% NaCl
  • the cells 1128 g wet weight
  • an Ultra-Turrax rod 1.8 1, 20 mM Tris / HCl, pH 7.4
  • Final volume 3 This solution was then freed from coarse particles on a glass suction filter through a bed of glass balls (0.1 to 0.2 mm, 200 ml).
  • This cell suspension (3.2 l) was homogenized twice at 1500 bar in a Z04 microfluidizer.
  • the device was rinsed with 500 ml of buffer.
  • the combined volumes (4 l) were subjected to a first precipitation with 200 ml of an IM manganese chloride solution (final concentration 50 mM).
  • the pH was kept at pH 7.0 by adding sodium hydroxide solution.
  • the precipitate was centrifuged off at 6000 rpm for 30 minutes.
  • 200 ml of a 0.2 M EDTA solution (pH 7.5) were added to the supernatant (3.1 l). With the addition, the pH dropped to 5.0.
  • a precipitate formed which was again centrifuged off at 6000 rpm (20 minutes, Sorvall).
  • the supernatant (3.4 l) was titrated back to pH 7.0.
  • the phenyl-Sepharose column (Pharmacia, diameter 5 cm, height 25 cm, volume 490 ml) was washed with 1 1 buffer A (20 M sodium phosphate buffer, pH 7.4, 40% ammonium sulfate) and in the gradient with buffer B ( 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4). At a flow of 10 ml / min, 100% buffer B was reached after 120 minutes and held for 40 minutes. Active fractions were collected and pooled (250 ml).
  • TBS buffer 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.4
  • 50 ml TBS + 50 ml ⁇ -naphthylacetate solution Sigma N-8505, 0.4 g / 1 in 10% acetone
  • the cells (400 g wet mass) of Agrobacterium radiobacter (Lu 5351) were first resuspended by treatment with an Ultra-Turrax rod in the buffer (1.8 1, 20 mM Tris / HCl, pH 7.4) (final volume 2, 2 1).
  • This solution was then freed from coarse particles on a glass suction filter through a bed of glass balls (0.1 to 0.2 mm, 200 ml).
  • This cell suspension was homogenized twice at 1500 bar in the Z04 microfluidizer.
  • the device was rinsed with 500 ml of buffer.
  • the combined volumes (2.7 l) were subjected to a first precipitation with 135 ml of a 1 M manganese chloride solution (final concentration 50 mM).
  • the pH was kept at pH 7.0 by adding sodium hydroxide solution and the precipitate was centrifuged off at 6000 rpm for 30 min.
  • the supernatant (2.6 l) was mixed with 575 ml of a 0.2 M EDTA solution and the pH checked again.
  • the phenyl-Sepharose column (Pharmacia, diameter 5 cm, height 25 cm, volume 490 ml) was washed with 1 1 buffer A (20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4, 40% ammonium sulfate) and in the gradient with buffer B ( 20 mM sodium phosphate buffer, pH 7.4). At a flow of 10 ml / min, 100% B was reached after 120 min and held for 40 min. Active fractions were collected and pooled (350 ml, 20.9 mS).
  • the Mono-P fractions were concentrated in 0.2 ml portions by acetone precipitation at -20 degrees Celsius.
  • the pellets were then taken up in 0.005 ml SDS sample buffer without DTT and placed on an SDS gel.
  • the L-pantolactone hydrolase was identified by an activity staining (see Example 4) and cut out. It was recognizable as a red-brown colored band with an apparent molecular weight of 36 kDa.
  • the protein in the cut gel pieces was digested by trypsin and the peptides were sequenced. The remaining gel was stained with Coomassie Blue. Two peptide sequences (SEQ ID NO: 5 and 6) were obtained. Sequencing of SEQ ID NO: 5 revealed ambiguity for the first amino acid in the sequence. The tyrosine shown in position 1 can also be a leucine, the sequence was not clear here. 6.
  • Lu5351 insensitive (> 85% residual activity) to chelating substances, SH reagents, protease inhibitors, detergents (exception: Lu5351 with 74% residual activity in 1% SDS) and various cations.
  • Genbank + screening cloning of L-pantolactone hydrolase from Burkholderia caryophylli Lu681
  • Genomic DNA from Burkholderia caryophylli Lu681 was isolated (Qiagen, Hilden), digested with EcoRI and ligated into pBluescriptKS + vector cut and dephosphorylated with EcoRI (Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989).
  • the ligation mixture was transformed into E. coli XLlBlue according to the instructions from Stratagene (La Jolla, Calif.). The
  • the plasmid DNA was isolated from E. coli XLlBlue pKS + 681 in accordance with the instructions from Qiagen (Hilden) and cut individually or in a double digest with the restriction enzymes EcoRI, BamHI, PstI and HindIII. The fragmented DNA was cut through
  • SEQ ID NO: 2 in turn contains the peptides YGIEGLNNLEAL and AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO: 3 and 4), which were found after tryptic digestion of the purified and blotted L-pantolactone hydrolase from Burkholderia caryophylli Lu681 and Agrobacterium radiobacter Lu5351 (see Examples 4 and 5).
  • GACCAGGGCCAGAA (P2) derived as a primer for a PCR amplification of the L-pantolactone hydrolase gene under the following conditions: 20 mM Tris / HCl pH 8, 8, 2 mM MgSO 4 , 10 mM KC1, 10 mM ( NH 4 ) 2 S0 4 , 0.1% Triton X-100, 0.1 mg / ml BSA, 25 mM per dNTP, 0.96 ⁇ g / ml pKS + 681, 2.2 ⁇ g / ml Pl and P2, 25U / ml Pfu polymerase
  • E. coli XLlBlue pKK681 was grown in 30 ml LB medium with ampicillin (100 ⁇ g / ml) and IPTG (0.5 mM) overnight at 37 ° C., harvested and in Tris-HCl buffer (50 mM, pH 7 , 0) washed 0 and resuspended (3 ml 50 mM Tris / HCl pH 7.0). 0.25 ml of
  • Suspension was treated with 150 mM L-pantolactone, 150 mM pipes pH 7, 0 ad 0.5 ml A. dest. added and incubated at 30 ° C for 3 h.
  • 35 GACCAGGGCCAGAA (P2) derived as a primer for a PCR amplification of the L-pantolactone hydrolase gene under the following conditions: 20 mM Tris-HCl pH 8, 8, 2 mM MgSO, 10 mM KC1, 10 mM (NH 4 ) 2 S0, 0.1% Triton X-100, 0.1 mg / ml BSA, 25 mM per dNTP, 0.96 ⁇ g / ml pKS + 681, 2.2 ⁇ g / ml Pl and P2, 25U / ml Pfu polymerase
  • PCR 40 (Stratagene, LaJolla, Calif.); The PCR parameters were as follows: 1 min 95 ° C, 1 min 55 ° C, 2.5 min 72 ° C, 30 cycles.
  • the PCR product obtained (0.8 kB) was cut with Ndel and Hindlll and ligated into pDHEl9 (Prof. Mattes, Stuttgart) cut and dephosphorylated with Ndel and Hindlll.
  • E. coli XLl Blue or TG1 (Stratagene, LaJolla, Calif .; DSMZ, Braunschweig, DSMZ No. 6056, Inoue et al, 1990, Gene 96: 23-28).
  • E. coli TG1 pDHE681 was grown in 14 l minimal medium with 40 g / l glycine and 2.5 g / l rhamnose for 6 to 7 h at 37 ° C., harvested and washed with Tris / HCl buffer (50 mM, pH 7.0) and ad 1.4 1 buffer resuspended.
  • the activity of the single-concentrated cell suspension in the standard assay 150 mM pipes pH 7.0, 150 mM L-pantolactone, 1 h 30 ° C. was 680 to 2700 U / 1 or 60 to 160 g / BTM.
  • the aqueous phase (21 ml; Na-L-Pantoat) was adjusted to pH 1 with about 5 ml of 3 MH 2 S0 4 , heated at 80 ° C. for 15 minutes and mixed with 8 g of anhydrous Na 2 S0 4 .
  • the L-pantolactone obtained was extracted analogously 3 times with a volume of ethyl acetate, dried with Na 2 SO 4 and evaporated.
  • the L-pantolactone melt can be racemized by heating after adding NaOH in the presence of small amounts of Na-L-pantoate (3 h at 180 ° C.).
  • L-pantolactone hydrolase was obtained directly from fermentation broth from E. coli (TG1 pDHE681 or preferential strains which co-express chaperones such as GroEL) by cell disruption (2 x 1000 bar in a 0 microfluidizer), cell debris separation (20 min 9000 g at 10 ° C), 10-fold concentration via cross-flow filtration (Hämoflow F60, Fresenius, membrane with exclusion of approx. 10 kDa) and heat precipitation (20 min 60 ° C, 20 min RT-10 ° C, centrifugation) and a specific activity of about 3000 U / g protein
  • This 10 x homogenate had an activity of 63-100000 U / 1 and a protein concentration of 20-30 g / 1.
  • Racemate resolution batches were worked up with homogenate (50.8% conversion, 92.5% ee) by extraction with 5 x 1 45 vol. MTBE. 43% D-pantolactone with 91.4% ee and 98.2%
  • L-pantolactone hydrolase was isolated as in Example 16 and bound to various carrier materials such as the commercially available EupergitC (Röhm GmbH, Darmstadt) or Deloxan DAPIII (Degussa, Frankfurt).
  • Eupergit is a carrier material activated by epoxy groups. As a result, the protein is mainly covalently fixed to amino groups.
  • Homogenate was first subjected to precipitation by heat treatment. 1.11 homogenate was incubated in amounts of 550 ml each for 30 minutes at 60 ° C. and then placed on ice for 20 minutes to cool. This solution was centrifuged (1 hour 8000 rpm GS3 rotor) to separate denatured protein. The supernatant was then concentrated on a Hemoflow F40 cartridge and re-buffered in a 20 mM HEPES buffer, pH 7.5. The amount of protein per g of Eupergite can be chosen freely.
  • Deloxan is a silicate modified with amino groups. These amino groups can be activated with glutardialdehyde to form a Schiff base. The excess aldehyde is then washed away and the protein is added to the activated carrier. The free amino groups of the protein react with the formation of a second Schiff's base with the still free aldehyde of the bound glutardialdehyde. This protein immobilized in this way can already be used. However, the Schiff's base tends to hydrolize, so that the protein slowly bleeds from the carrier in aqueous solution. This can be avoided by reduction with sodium borohydride. The ship's base is converted into a secondary amine. The prerequisite for this is the stability of the enzyme against reduction with sodium borohydride.
  • activated deloxane were Given 10,000 U (approx.2.7 g protein) L-pantolactone hydrolase.
  • the protein was incubated with the activated carrier for 18 hours at room temperature.
  • the solution was separated from the support via a glass suction filter.
  • the support was washed several times with water and then with 1 1 0.1M phosphate buffer, pH 7, 2 and 1 M NaCl.
  • Half of the carrier was removed (without reduction). The other half was washed again with water and then placed in 0.1 M sodium borate buffer, pH 7.2.
  • Reduction with sodium borohydride :
  • pantoic acid ee values refer to the formation of (L) -pantoic acid ee, enantiomeric excess, corrected, corrected ee after deduction of those formed by chemical hydrolysis
  • ee values refer to the formation of (L) -pantoic acid
  • pCMBS p-chloromercurbiphenylsulfonic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • DIFP diisopropyl fluorophosphate
  • Table 5 Homologies of the L-pantolactone hydrolase amino acid sequence from Lu681 according to gap 4 or bestfit 5 search

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nucleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.

Description

L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nucleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.
D-Pantolacton ist eine Vorstufe in der chemischen Synthese bzw. Biosynthese von Pantothensäure, Panthenol und Pantethein und deren Derivate. Diese werden als Vitaminzusätze in der menschlichen Ernährung, im Tierfutter, in der Medizin beispielsweise für die Wundheilung und in der Kosmetik beispielsweise in der Haarkosmetik eingesetzt. Wirtschaftliche Verfahren zur Synthese von enantiomerenreinem D-Pantolacton sind daher von großer
Bedeutung. Neben den seit langem ausgeübten chemischen Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton wurden in jüngerer Zeit auch verschiedene biotechnologische Verfahren bearbeitet. Eine Übersicht über Pantolacton und seine chemische Synthese ist Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (Vol. A27, 1996, VCH Verlagsgesellschaft mbH, 69451 Weinheim, Seite 559-566) zu entnehmen.
Für die biotechnologische Synthese von Pantolacton wurden ver- schiedenen Synthesestrategien verfolgt.
Eine Racematspaltung durch selektive Hydrolyse von O-Acetyl- Pantolacton mittels Lipasen oder Esterasen wird von Glänzer et al. (1988, Enzyme Microb. Technol . 10, 689-690) beschrieben. Eine derartige Racematspaltung wird in den Schutzrechten
DE 40 05 150 und EP-A-0 507 278 beansprucht. Die erreichbare Enantiomerenreinheit ist für eine technische Nutzung bei diesem Verfahren ungenügend.
Von Degussa wird die Herstellung von Pantolacton mit dem Enzym Oxinitrilase ausgehend von Hydroxypivalaldehyd und Blausäure über optisch reines Hydroxypivalaldehydcyanhydrin beschrieben (DE 41 26 580, EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). In dieser Reaktion sind theoretisch 100 % Ausbeute zu erreichen. Nach- teil dieser Reaktion ist der hohe Enzymbedarf (äquimolare Mengen Enzym: Substrat) sowie die relativ geringe Enantiomerenreinheit des Produkts (max. 82 % ee) .
In JP 47019745 wird die Synthese von D-Pantolacton mit Hilfe von Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus oder Corynebacterium beschrieben. In der Reaktion setzen die genannten Organismen racemisches Pantolacton zu D-Pantolacton um, in dem sie das L-Pantolacton verstoffwechseln. Nachteil dieses Verfahren ist, daß die Hälfte des Edukts verstoffwechselt wird und damit ver- loren ist.
Mitsubishi Chemical Ind. und Übe Ind. haben Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton aus D, -Pantolacton beansprucht (JP 6067320, JP 62294092, JP 62294096, JP 57152895). In diesen Verfahren werden L-Pantolacton-Hydrolasen aus den Hefen Rhodothorula, Sporidiobolus und Sterigmatomyces beschrieben. Aus heutiger Sicht (siehe Yamada & Shimizu, Ann.N. Y.Acad. Sei . 672 [1992] in Enzyme Eng. XI, Clark et al., 372-386; Chimia, 47, 1993: 5-10, JP 62187426; JP 61293384; JP 61293386; Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 1988: 622-642, Chemical Aspects of Enzyme
Biotechnology, eds . T.O. Baldwin et al . , Plenum Press, New York, 1990: 151-163) bestätigt durch eigene Arbeiten scheint die direkte Hydrolyse des L-Pantolactons in diesen Hefen jedoch zweifelhaft. Die Reaktion verläuft vielmehr über das Ketopanto- lacton, das durch die Ketopantoat-Oxidoreduktasen zum L-Pantolacton umgesetzt wird. In eigenen Arbeiten konnte das Ketopanto- lacton als Zwischenstufe nachgewiesen werden, das heißt es erfolgt keine direkte Hydrolyse zum L-Pantolacton. Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Pantolacton-Konzentration, die im Ver- fahren umgesetzt werden kann.
Diese Reaktion über Ketopantolacton- und Ketopantoat-Oxidoreduktasen wurde auch für Bakterien beschrieben (z.B. Yamada & Shimizu, s.o.; Shimizu et al . , 1988, J. Biol . Chem. 263, 12077-12084, Kataoka et al . 1992, Eur. J. Biochem. 204, 799-806). Entsprechende Verfahren zur enantioselektiven Synthese von D-Pantolacton aus D, L-Pantolacton via Ketopantolacton und Keto- pantoat haben zwar den Vorteil einer hohen Ausbeute (theoretisch 100 %, 90,5 % erreicht mit Rhodococcus s.u.), sind jedoch wegen des Cofaktorbedarfs (NADH oder NADPH) , der Zufütterung eines Energiesubstrates (Glucose) , der niedrigen Raum-Zeit-Ausbeute und der geringen Endkonzentrationen (18,2-72 g/1 D-Pantolacton) nicht wirtschaftlich. Desweiteren ist ein solches Verfahren dadurch benachteiligt, daß die beiden beteiligten Enzyme i.d.R. verschiedene Opti a für die Umsatzbedingungen aufweisen, ein Problem, das bei Verwendung eines einzigen (hydrolytischen) Enzyms entfällt. Die Firma Fuji in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Yamada an der Kyoto Universität hat ein Verfahren zur enzymatischen Racematspaltung mit Hilfe einer pilzlichen D-Pantolacton-Hydro- lase (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP-B-0 504 421, 5 EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5,275,949,
US 5,372,940) entwickelt. Das Enzym läßt sich beispielsweise aus den Pilzen Cylindrocarpon tonkinense, Gibberella fujikuroi und Fusarium oxysporum isolieren. Die D-Pantolacton-Hydrolase ist ein glycosyliertes Enzym, das aus einem 125 kDa Homodimer besteht und
10 Ca2+-abhängig ist (Ann. N.Y. Acad. Sei. 1996, 799: 650-658, Enzyme Engineering) . Das Enzym wird durch Cd2+, Hg2+, Cu2+ und EDTA inhibiert (US 5,372,940). Die Reinigung der D-Pantolacton- Hydrolase wurde von Shimizu et al . beschrieben. Das gereinigte Enzym zeigt gegenüber einer Reihe von Lactonen speziell gegenüber
15 Zuckerlactonen eine Hydrolaseaktivität (Eur. J. Biochem., 209, 1992: 383-390). Seine Sequenz zeigt schwache Homologien zur Gluconolactonase aus Zymomonas mobilis (28,9 %), der humanen und Ratten-Paraoxonase (25,3 %) und der Strictosidin Synthase aus Catharanthus roseus (15,9 %; EP-A-0 794 251, Kobayashi et al .
20 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 12787-12792). Von Kataoko et al . wird eine starke Abhängigkeit der erzielten Enantiomeren- reinheit des Produkts vom Umsatz bei unterschiedlichen pH-Werten (Enzym. Microbiol. Technol . 19: 307-310, 1996 und Appl . Micro- biol. Biotechnol. 1995, 44: 333-338) beschrieben. Bei pH-Werten,
25 die nahe oder über pH 7 liegen, werden geringere Enantiomeren- reinheiten erzielt, da die spontane chemische Hydrolyse des L-Pantolactons bei höheren pH-Werten immer stärker wird und so die Enantiomerenreinheit des Produkts herabsetzt. Als optimaler pH-Wert für die Herstellung möglichst enantiomerenreinen D-Panto-
30 lactons wird pH 5 angegeben. Die Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms ist bei diesem pH jedoch erheblich verlangsamt. Um optisch reines Produkt zu erhalten, ist nach Extraktion eine anschließende Kristallisation erforderlich (Yamada, H. Chimia 47, 1993: 5-10) .
35
Von Nachteil bei den oben genannten Prozessen ist, daß sie häufig nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen. Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Nach wie
40 vor besteht deshalb ein großer Bedarf nach einem einfachen, wirtschaftlichen biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist. Dieses Verfahren sollte ausgehend von der bestehenden chemischen Synthese einen einfachen Zugang zu D-Pantolacton in hohen Aus- 5 beuten und Enantiomerenreinheiten ermöglichen, so daß keine weitere Aufreinigung des Produkts mehr erforderlich ist. Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches, wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäure- sequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrola- seaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäurese- quenz , die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.
Diese L-Pantolacton-Hydrolasen lassen sich in Organismen vorteil- haft Mikroorganismen wie Bakterien finden. Das Enzym bzw. die Enzyme besitzen eine hohe enzymatische Aktivität zur hydrolytischen Umwandlung von L-Pantolacton in L-Pantoinsäure .
Diese L-Pantolacton-Hydrolasen setzen D-Pantolacton nicht um, so daß die Organismen, Extrakte oder gereinigte Enzyme sowie entsprechende rekombinante Stämme bzw. Proteine zur Herstellung von enantiomerenreinem D-Pantolacton verwendet werden können.
Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die mindestens 50 % Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, bevorzugt mindestens 60 % Homologie, besonders bevorzugt 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 % Homologie aufweisen. Die Homologie wurde entweder nach der Methode von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970: 443-453) oder Smith S Waterman (Adv. Appl . Math., 2, 1981: 482-489) bestimmt. Über Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft höher liegen. Die von SEQ ID NO : 1 abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen ins- besondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine nicht wesentlich reduziert sein sollte. Unter Enzymen mit einer nicht wesentlich reduzierten enzymatischen Aktivität sind Enzyme zu verstehen, die eine enzymatische Aktivität von mindestens 20 %, be- vorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % aufweisen. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäuresequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nuklein- säuresequenzen kodiert werden. Vorteilhaft betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert werden .
Unter funktionellen Äquivalenten der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für Enzyme kodieren, die L-Pantolacton zur entsprechenden Säure hydrolysieren und die mindestens 20 %, bevorzugt 50 %, besonders bevorzugt 75 %, ganz besonders bevorzugt 90 % der Aktivität der unter SEQ ID NO: 2 genannten Sequenz aufweisen, nicht durch EDTA (1 rαM-Lösung) gehemmt werden und zwischen pH 4 bis 10 stabil sind. Diese funktioneilen Äquivalente weisen außerdem vorteilhaft ein pH-Optimum zwischen pH 7 und 8 auf und ein TemperaturOptimum zwischen 70°C und 80°C.
Weiterhin sind unter Derivate auch Homologe der SEQ ID NO: 1 beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und nicht- codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1 besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 50 %, bevorzugt von mindestens 60 %, besonders bevorzugt von mindestens 70 %, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80 % über den gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.
Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion (en) und/oder Deletion (en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo- tidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startcodon oder 0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopcodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert, bevorzugt erhöht wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren. Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien gram- negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure (n) [der Plural und Singular sollen für die Anmeldung gleichbedeutend sein] aus gram-negativen Bakterien vorteilhaft aus α-Proteobacterien, ß-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae, ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, Pseudomonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden isoliert. Als vorteilhaft geeignete Pilze seien die Gattungen Beauveria oder Psilocybe genannt. Vorteilhafte Hefen sind bei- spielsweise in der Gattung Apiotrichum zu finden.
SEQ ID No: 1 oder seine Derivate, Homologen oder Teile dieser Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridi- sierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder 0 Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum, die über Vergleiche mit der D-Pantolacton-Hydrolase in dem Fach- 5 mann bekannter Weise ermittelt werden können (ein solcher Bereich ist beispielsweise das sog. HTGT-Motiv) , verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid, Q längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA: DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. 5
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 20 und 70°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid. Vorteilhafterweise liegen die 0 Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA-Hybride bei 2,0 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 70°C, bevorzugt zwischen etwa 50°C bis 70°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 2 , 0 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 60°C, bevorzugt zwischen etwa 35°C bis 60°C. Diese 5 angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 1000 Nukleotiden und einem G- + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Cloning" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C- Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al . (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Heimes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni- verεity Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die
L-Pantolacton-Hydrolasegene mit Sequenz SEQ ID No: 1 und seine Derivate und Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Genexpression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die Induktoren oder Repressoren binden, und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Sequenz SEQ ID No : 1 oder seine Homologen inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert wird. Das Nukleinsäurekonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktioneil verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3 ' -Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker wie Antibiotikaresistenzen oder Auxotrophien komplementierende Gene gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie aphll (Tn5)-, tre-, cos-, tac-, trp-, lacPAI, rha, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp- lac-, lacl<3-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder λ-Pi,-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren wie in den konstitutiven oder induzierbaren Streptomyces-
Promotoren aphl , ermE, melC, tipA, mcrAB, gylCAB, veg, SPOl, amy und SP02, in den Hefe- oder Pilzpromotoren A0X1, GAL1, ADC1, MFα , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammenhang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden .
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirts- Organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pBluescript, pBAD, pQE (His-tag System), pICIC223-3, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pGEM7Z, pKK223-3, pUC19 , pKC30, pRep4 , pHSl , pHS2 , pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-Bl, λgtll oder pBdCI oder broad-host-range Plasmide wie pBBRIMCS oder pRK293, in Streptomyces und anderen Actinomyceten pIJlOl, pIJ364, pMVS301, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUBHO, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALSl, pIL2 oder pBB116, in Hefen 2μM, pAG-1, YE 6 , YEpl3 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P.H. et al . Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985 , ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3 ' und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Genen für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird. Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bestehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine L-Pantolacton- Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA
Diese L-Pantolacton-Hydrolase kann im erfindungsgemäßen Verfahren als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend der im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Expression der erfindungsgemäßen Gene und der von diesen Genen kodierten Proteine in einem Wirtsorganismus beinhaltet in der Regel einen Streß für diese Organismen. Durch gleichzeitige Expression dieser Gene in Gegenwart mindestens eines Gens, das für ein sogenanntes Streßprotein kodiert oder in Gegenwart einer Kombination dieser Gene, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren vorteilhaft in den erfindungsgemäßen Wirtsorganismen exprimiert werden. Streßproteine, auch Hitzeschockproteine 5 (= HSP) oder molekulare Chaperone (engl. Anstandsdame oder
Gouvernante) genannt, gehören zu den in der Evolution sowohl in Pro- als auch in Eukaryonten am besten konservierten Proteine und sind universell bei allen Organismen zu finden. Ihre Unterteilung erfolgt nach dem Molekulargewicht in Kilodalton, z.B. HSP60, 70, 10 90 usw. Diese Streßproteine verdanken ihre Bezeichnung ihrer Eigenschaft durch Streßbedingungen wie zu niedriger Glukosespiegel, Hitzeschock, Alkohol, UV-Licht, oxidative Reagenzien etc. induzierbar zu sein.
15 Viele Streßproteine und konstitutiv gebildete verwandte Proteine sind für die korrekte Faltung, Zusammenlagerung, Stabilisierung und den Transport von Proteinen essentiell. Durch die Koex- pression der erfindungsgemäßen Proteine in Gegenwart mindestens eines Streßproteins können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
20 vorteilhaft exprimiert werden. Eine gegebenenfalls vorkommende Proteinaggregation der Hydrolasen kann so vorteilhaft verhindert werden. Dabei binden die Streßproteine an hydrophobe Teile der Proteine und verhindern so eine falsche Faltung der Proteine bzw. ermöglichen die korrekte Faltung. Bereits aggregierte oder dena-
25 turierte Proteine werden wieder dissoziiert und richtig gefaltet. Häufig treten diese Streßproteine bei der Ausübung ihrer Funktion in Kooperation mit anderen Proteinen sogenannten Helferproteinen (= cohort-Proteinen) man spricht deshalb von sogenannten Chaperon-Maschienen, die die vorteilhafte Wirkung bei der
30 Expression der erfindungsgemäßen Gene haben (Frydaman et al . , Nature, 370, 1994: 111-117). Die Wirkung dieser Chaperon- Maschinen kann unter ATP-Verbrauch erfolgen (= "Hauptchaperon- Maschinen" ) oder ohne ATP-Verbrauch (= "Junior-Chaperone" ) . Vorteilhafte Chaperone oder Hitzeschockproteine sind beispielsweise
35 die eukaryontisehen Gene HSP17 , 5 , HSP22, HSP 25, HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, TRiC, UBI1,2,3,4 oder ihre prokaryontisehen Homologen wie HtpG, DnaK, DnaJ, GroES, GroEL, HtrC, ClpB, GrpE etc. Bevorzugte Chaperone sind GroES, GroEL, HtpG, DnaK, DnaJ, HSP70 oder HΞP27.
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Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Gegenwart mindestens eines Streßproteins exprimiert, dabei können die Gene unter gemeinsamer Kontrolle eines Promoters liegen oder von getrennten Promotoren gelesen werden. Dementsprechend kann ihre
45 Expression durch Zugabe einer oder mehrerer Induktorsubstanzen gleichzeitig oder zu getrennten Zeitpunkten induziert werden. Die Nukleinsäuren können auf einem Vektor liegen oder auf getrennten Vektoren. Es ist auch möglich die Streßproteine des Wirtsorganismus über eine genetische Manipulation so zu verändern, daß sie überexprimiert werden.
5 Auch alternative Methoden zur Erhöhung des nativen Enzymanteils wie die Anzucht der Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Protein synthetisieren, bei niedrigen Temperaturen oder die Renaturierung durch Anwendung hoher Drücke (vorteilhaft 1 bis 2 kbar) auf Suspensionen des erfindungsgemäßen Proteins (mit oder 0 ohne Zusatz denaturierender Agenzien, beispielsweise Guanidin- Hydrochlorid) können vorteilhaft sein.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder das Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell 5 alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, 0 Streptomycetaeeae oder Noeardiaeeae, Hefen wie Piehia, Saccharo- myces oder Hansenula oder Pilze wie Beauveria oder Psilocybe besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudo- monas, Streptomyces , Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agro- bacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt 5 ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte Bakterien sind darüberhinaus in der Gruppe der oc-Proteobacterien, ß-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien zu finden.
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung
30 enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäu- rekonstrukte oder Vektoren, die für L-Pantolacton-Hydrolasen kodieren.
_5 Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem •flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen
. Q Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen
45 Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Bfeeginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nach gefüttert werden. Gleiches gilt für Induktoren wie beispielsweise Isopropythiogalactosid, (IPTG) , Lactose, Arabinose, Rhamnose und Antibiotika bzw. Temperatur-Shifts, die je nach verwendetem Promotor die Expression des erfindungsgemäßen Gens anschalten. Das racemische Pantolacton kann direkt zur Anzucht gegebenwerden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Die Wirtsorganismen enthalten vorteilhaft 0,5 U/g BTM (= Biotrockenmasse) L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität , bevorzugt 4 U/g BTM, besonders bevorzugt 20 bis 150 U/g BTM, ganz besonders bevorzugt 40 bis 600 U/g BTM.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer Temperatur zwischen 0°C bis 95°C, bevorzugt zwischen 10°C bis 85°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 75°C durchgeführt.
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft zwischen pH 4 und 12 , bevorzugt zwischen pH 6 und 9 , besonders bevorzugt zwischen pH 6 und 8, ganz besonders bevorzugt zwischen pH 6 , 5 und17 , 5 gehalten.
Unter racemischen Pantolacton im erfindungsgemäßen Verfahren ist Pantolacton zu verstehen, das aus einem 50:50 Gemisch der beiden Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch besteht.
Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Pantolacton (D- oder L-Enantiomer) sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 70 %ee, bevorzugt von min. 80 %ee, besonders bevorzugt von min. 90 %ee, ganz besonders bevorzugt min. 98 %ee erreicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein- säurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufgeschlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine mechanische Behandlung (z.B. French Press oder Ultraschall) oder über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteil- haft geeignet . Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in der Reaktion Anwendung finden können.
Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweckmäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration oder Zentrifugation. Dies ist bei Verwendung von immobilisierten Organismen oder Enzymen vorteilhaft nicht notwendig, kann aber auch erfolgen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten D-Pantolacton läßt sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über Extraktion oder Kristallisation oder vorteilhaft über Extraktion und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktionslösung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt werden. Vorteilhaft wird die Lösung vor Extraktion auf ca. 0°C bis 10°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wird vor dem Herunterkühlen oder danach vorteilhaft auf ca. pH 6,0 bis pH 7 , 0 neutralisiert, um die freie Säure in das Salz zu überführen, so daß sie unter den Reaktionsbedingungen nicht extrahiert werden kann. Für die Neutralisation wird beispielsweise Bicarbonat oder eine andere Base wie NaOH oder KOH genommen. Als organische Lösungsmittel können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze zeigen und in die das Lacton aus der wäßrigen Phase übergehen kann. Vorteilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die nur wenig Wasser aufnehmen, so daß nur wenig Säure in das Lösungsmittel übergeht wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diiso- propylether, Benzol, Methyltertiärbutylether, Methylisobutyl- keton, Diethylketon oder Essigester.
Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90 % chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt. Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung oder aus einer wäßrigen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungsmittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und noch- mals kristallisiert werden. Durch die anschließende vorteilhafte mindestens einmalige Kristallisation kann die Enantiomerenrein- heit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden. Vorteilhaft kann jedoch das entstandene D-Pantolacton direkt als organische Lösung ohne Kristallisation verwendet werden.
Das in wäßriger Lösung verbliebene L-Enantiomer kann durch An- säuren beispielsweise mit Schwefelsäure zum Lacton geschlossen werden und anschließend wie oben beschrieben extrahiert werden. Zur Lactonisierung wird die Lösung vorteilhaft erwärmt. Das gewonnene L-Lacton kann nach Abziehen des Lösungsmittels in der Schmelze mit katalytischen Mengen (ca. 1 bis 5 % Mol%) einer Base wie NaOH, Na-Pantoat oder Na-Methylat racemisiert und rückgeführt werden. Durch die vorteilhafte Racemisierung und Rückführung des unerwünschten Enantiomers kann im erfindungsgemäßen Verfahren eine theoretische Ausbeute von 98 % erreicht werden.
Bei den genannten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100 %, bevorzugt von 80 bis 100 %, besonders bevorzugt von 90 bis 100 % bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte racemische Pantolacton isolieren. Das isoliert Produkt zeichnet sich durch eine hohe chemische Reinheit von > 90 %, bevorzugt > 95 % besonders bevorzugt von > 98 % aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe Enantiomerenreinheit , die vorteilhaft falls erforderlich durch die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise oder kontinuierlich betrieben werden.
Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für die Synthese von Panthenol, Pantethein und deren Derivate. Diese Stoffe und das erhaltene enantiomerenreine Pantolacton können in Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka, Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.
Die nachstehenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung.
Beispiele :
1. L-Pantolacton-Hydrolyse mit Burkholderia caryophylli Lu681
Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere der in Tabelle la, lb angegebenen Stämme) wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z.B. HFP = 1 % Pepton, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) angezogen, geerntet, in Puffer gewaschen und resuspendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM D, L-Pantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Konzentrationen an D, L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch GC- bzw. HPLC-Analyse bestimmt (Tab. la) . Alternativ wurde die Umsetzung über Nacht unter Titration mit 4 M NaOH durchgeführt (4 ml Zellsuspension, 50 mM D, L-Pantolacton, 50 mM Tris/HCl pH 7,0 ad 20 ml dest. Aqua; Tab. lb) . Alle Stämme der Tabelle 1 hydrolysierten das racemische Pantolacton zu L-Pantoinsäure. Der ee-Wert bei hohem Umsatz (>45 %) und damit die Enantio- selektivität E des Enzyms wurde nach Straathof und Jongejan, Enzyme & Microbiol. Technology 21: 559-571, 1997 bestimmt.
Verifizierung der hydrolytischen Aktivität
Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere Stämme aus Tab. 1) wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z.B. HFP = 1 % Pepton, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) angezogen, geerntet, in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und resus- pendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM Ketopantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die Konzentrationen an Ketopantolacton, Ketopantoinsäure, D, L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt (Tab. la) . Alle aufgeführten Stämme außer Beauveria amorpha Lu7953 vermochten die aus Ketopantolacton durch spontane Hydrolyse entstehende Ketopantoinsäure zu Pantoinsäure zu reduzieren. Da bei allen Stämmen jedoch D- Pantoinsäure anstelle des unter Beispiel 1 beschriebenen L-Pantoinsäure gebildet wurde, kann die Umsetzung von Pantolacton zu L-Pantoinsäure nicht durch einen Oxidations-Reduktionsprozeß (über Ketopantolacton und Ketopantoinsäure) entstehen. Es wurde auch im dialysierten Rohextrakt von Lu681 oder Lu5351 und bei Einsatz der gereinigten Enzyme aus Lu681 und Lu5351 keine Abhängigkeit der L-Pantolacton-Hydrolyse von Cofaktoren festgestellt. Die enzymatische Aktivität läßt sich damit auf ein hydrolytisches Enzym zurückführen.
3. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit verschiedenen WildtypStämmen
a. Burkholderia caryophylli Lu681
Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 200 ml Komplexmedium (z.B. GYP = 1 % D-Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt) angezogen (OD600 = 6,7, BTM = 2,97 g/1) , geerntet und gewaschen. 10 ml der lOfach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7 , 0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,5 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 45 %, ee = 95 % ; 19,5 h: c = 59 %, ee = 89 % bzgl . L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 73 % bzw. 100 %. b. Agrobacterium radiobacter Lu5351
Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 200 ml Komplexmedium (z.B. HFP = 1 % Pepton, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) angezogen (OD600 = 11,5, BTM = 2,90 g/1) , geerntet und gewaschen. 10 ml der lOfach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D, -Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7 , 0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7 , 0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 20 %, ee = 93 %; 19,4 h: c = 53 %, ee = 94 % bzgl . L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 21 % bzw. 100 %.
c. Pseudomonas diminuta Lu683
Pseudomonas dimunuta Lu683 wurde in 200 ml Komplexmedium (z.B. GYP = 1 % D-Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,5 % Hefeextrakt) angezogen (OD600 = 7,3, BTM = 3,78 g/1), geerntet und gewaschen. 10 ml der lOfach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L- Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7 , 0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h und 19,3 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 48 %, ee = 97 %; 19,4 h: c = 69 %, ee = 79 % bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 82 % bzw. 100 %.
d. Apiotrichum humicola Lu3215
Apiotrichum humicola Lu3215 wurde in 200 ml Komplexmedium (z.B. HFP = 1 % Pepton, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) angezogen (OD600 = 18,5, BTM = 7,34 g/1), geerntet und gewaschen.
10 ml der lOfach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-
Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7 , 0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei
30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7 , 0 inkubiert. Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 55 %, ee = 79 % bzgl. L-Pantoinsäure).
Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84 %.
4. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681
Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 14 1 Komplexmedium (HFP = 1 % Pepton, 1% Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/1 BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 200 U) aus dem Rohextrakt gereinigt. Dazu wurden die Zellen (1128 g Feuchtmasse) zunächst durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer (1,8 1, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert. Endvolumen 3 1. Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension (3,2 1) wurde 2 mal bei 1500 bar im Z04 Microfluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (4 1) wurden einer ersten Fällung mit 200 ml einer IM Manganchlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM) . Der pH wurde durch Zugabe von Natronlauge auf pH 7 , 0 gehalten. Der Niederschlag wurde 30 Minuten bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (3,1 1) wurde mit 200 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung (pH 7,5) versetzt. Durch die Zugabe sank der pH auf 5,0 ab. Es bildete sich ein Niederschlag, der wiederum bei 6000 U/min (20 Minuten, Sorvall) abzentrifugiert wurde. Der Überstand (3,4 1) wurde auf pH 7 , 0 zurücktitriert.
Anschließend wurden 989 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 50%igen Sättigung) zugegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung wurde 20 Minuten bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand (3,7 1) wurde geteilt: 1,2 1 wurden in einer Phenyl- sepharose Chromatographie eingesetzt.
Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 1 Puffer A (20 M Natrium- phosphatpuffer , pH 7,4, 40 % Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100 % Puffer-B nach 120 Minuten erreicht und für 40 Minuten gehalten. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (250 ml) .
Nach Verdünnung auf < 7 mS/cm wurden diese 3 1 durch Chromato- graphie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml,
Fast Flow, Pharmacia) gereinigt. Die Säule wurde mit 1 1 Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min) . Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde linear auf 100 % B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei linear 100 % gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (118 ml) . Dieses Volumen wurde konzentriert (10 kD Omega-Membran) und gegen 5 1 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert; Endvolumen 21 ml. 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquilibriert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und dann entwickelt mit einem Gradienten (1 % pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl) . Aktive Fraktionen wurden vereinigt (3,7 ml) und zwei mal gegen 2 1 10 mM Tris/HCl pH 7 , 0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert (4 ml) . Dieses Material wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharmacia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt. Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Aceton- fällung bei -20 Grad Celsius konzentriert.
Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben (Tris/Glycin Gel 12 %, Fa. Novex ca. 2,5 h 125 V, 50 mA, Laemmli, U.K., 1970, Nature, 227:680-685). Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert und ausgeschnitten. Hierzu wurde das Gel kurz in TBS-Puffer (= 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,4) geschwenkt und dann mit 50 ml TBS + 50 ml α-Naphthylacetat-Lösung (Sigma N-8505, 0,4 g/1 in 10 % Aceton) 10 min. vorinkubiert . Anschließend wurden 50 ml Fast Red TR- Lösung (Sigma F-8764, 1 g/1) zugegeben und das Gel weiter bei RT (= ca. 23°C) geschwenkt. Die L-Pantolacton-Hydrolase war als rotbraun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten.
5. Isolierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Agrobacterium radiobacter Lu5351
Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 14 1 Komplexmedium (z.B. HFP = 1 % Pepton, 1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,3 % NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/1 BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 60 U) aus dem Rohextrakt gereinigt (Tab. 2). Dazu wurden die Zellen (400 g Feuchtmasse) von Agrobacterium radiobacter (Lu 5351) zunächst durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer (1,8 1, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert (Endvolumen 2,2 1). Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit. Diese Zellsuspension wurde 2 mal bei 1500 bar im Z04 Micro- fluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (2,7 1) wurden einer ersten Fällung mit 135 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen (Endkonzentration 50 mM) . Der pH wurde durch Zugabe von Natronlauge auf pH 7 , 0 gehalten und der Niederschlag 30 min bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (2,6 1) wurde mit 575 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung versetzt und der pH erneut kontrolliert. Zu diesen 3,15 1 wurden 711 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer 40%igen Sättigung) gegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung wurde 30 min bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene Überstand (3,3 1) wurde in einer Phenylsepharose Chromatographie eingesetzt.
Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 1 Puffer A (20 mM Natrium- phosphatpuffer , pH 7,4, 40 % Ammoniumsulfat) gewaschen und im Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100 % B nach 120 min erreicht und für 40 min gehalten. Aktive Fraktionen wurden ge- sammelt und vereinigt (350 ml, 20,9 mS) .
Nach Verdünnung auf 7 mS/cm (3,1 1 Endvolumen) wurde eine Chromatographie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml, Fast Flow, Pharmacia) durchgeführt. Die Säule wurde mit 1 1 Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml /min) . Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde auf 100 % B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei 100 % gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (134 ml) . Dieses Volumen wurde konzen- triert (10 kD Omega-Membran) und gegen 3 1 10 mM Tris/HCl pH 7 , 0 dialysiert (Endvolumen 19 ml) . 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquili- briert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und entwickelt mit einem Gradienten (1 % pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive Fraktionen wurden vereinigt (12,5 ml) und gegen 5 1 10 mM Natriumacetatpuffer pH 5 , 0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und wurde daher abzentrifugiert.
Der Überstand wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Phar a- cia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt.
Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Acetonfällung bei -20 Grad Celsius konzentriert. Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben. Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert (siehe Beispiel 4) und ausgeschnitten. Sie war als rot-braun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide wurden sequenziert. Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 5 und 6) erhalten. Die Sequenzierung von SEQ ID NO: 5 ergab eine Unklarheit bei der ersten Aminosäure der Sequenz. Das in Position 1 wiedergegebene Tyrosin kann auch ein Leucin sein die Sequenz war hier nicht eindeutig. 6. Substratspezifität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolasen aus Lu681 und Lu5351
0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten 5 Enzyme aus Lu681 oder Lu5351 wurden in 150 mM Pipes pH 6 , 8 mit verschiedenen Estern und Lactonen inkubiert. Nach 0, 1 und 20 h wurden Proben gezogen, die Reaktion durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt und die Konzentration des Substrates sowie der korrespondierenden Säure durch HPLC-Analyse 0 bestimmt. Die Aktivität ist in den Tabellen 3a und 3b im Vergleich zur Aktivität mit L-Pantolacton angegeben.
Für das Lipasesubstrat 1 , 2-0-Dilauryl-rac-glycero-3-glutar- säure-resorufinester wurde für das Lu681-Enzym ein optischer 5 Test in der Mikrotiterplatte durchgeführt (Boehringer Mannheim, modifiziert) . 60 bis 482 U/1 Enzym wurden in 45 mM KH2P0 pH 6 , 8 mit 0,18 g/1 Resorufinester (2 g/1 in Dioxan + 2 % SDS + 10 % H 0) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion E wurde nach 2 min und 82 min bei 572 nm gemessen. Tab. 3c- zeigt die Extinktions- 0 differenz und die daraus berechnete Lipase-Aktivität , die ca. 0,05 % von der L-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität beträgt.
7. Inhibition und Aktivierung der gereinigten L-Pantolacton- Hydrolasen aus Lu681 und Lu5351
25
0 , 1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten Proteine aus Lu681 oder Lu5351 wurden 5 min mit verschiedenen Effektorsubstanzen in 150 mM Pipes (pH 7.0) vorinkubiert . Der Assay wurde durch Zugabe von 150 mM L-Pantolacton gestartet (1 h
30 30°C) und durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt. Anschließend wurden die Konzentrationen an D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Die Tabellen 4a und 4b zeigen die Aktivität im Vergleich zur Probe ohne Zusatz einer Effektorsubstanz . Insgesamt sind die gereinigten Enzyme
35 aus Lu681 und Lu5351 unempfindlich (> 85 % Restaktivität) gegen chelatisierende Substanzen, SH-Reagenzien, Protease-Inhibitoren, Detergenzien (Ausnahme: Lu5351 mit 74 %-Restaktivität in 1 % SDS) und verschiedene Kationen.
40 Eine signifikante Aktivierung (+ 20 %) ist allenfalls mit HgCl2 festzustellen (133 / 170 %) . Desweiteren wurde für die rekombinante 681-Lactonase (E. coli-Zellen, s. Bsp. 8ff.) eine kompetitive Hemmung durch D-Pantolacton nachgewiesen.
45 8. Genbank+Screening: Klonierung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681
Genomische DNA aus Burkholderia caryophylli Lu681 wurde iso- 5 liert (Qiagen, Hilden) , mit EcoRI verdaut und in mit EcoRI geschnittenen und dephosphorylierten pBluescriptKS+-Vektor ligiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual , 1989). Das Ligationsgemisch wurde gemäß Instruktion der Fa. Stratagene (La Jolla, Calif.) in E. coli XLlBlue transformiert. Die
10 Tansformanten wurden auf LB-Platten mit Ampicillin (100 μg/ml) , IPTG (= Isopropyl-ß-thiogalactosid, 0,2 mM) und X-Gal (80 mg/1) ausplattiert und über Nacht bei 30 oder 37°C inkubiert. Die weißen Kolonien wurden gepickt auf LB-Platten mit Ampicillin (100 μg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/1) und wiederum über
15 Nacht inkubiert. Anschließend wurde durch Filterabklatsch mit sterilen Nitrocellulosefiltern eine Kopie dieser Masterplatte auf LB-Ampicillin- (100 mg/ml) IPTG-Platten angelegt. Der Filter wurde nach Inkubation über Nacht auf dieser Platte (s.o.) einem Aktivitätstest mit 150 mM L-Pantolacton, 0,1 % Nitrazingelb und
20 10 mM Tris/HCL pH 7 , 0 unterzogen (3 h-ÜN 30°C) . Ein Klon mit Gelbfärbung (XLlBlue pKS+681) wurde isoliert.
9. Restriktionskartierung und Sequenzierung des EcoRI-Inserts aus E. coli XLlBlue pKS+681
25
Aus E. coli XLlBlue pKS+681 wurde die Plasmid-DNA gemäß Instruktion der Fa. Qiagen (Hilden) isoliert und mit den Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, PstI und Hindlll einzeln bzw. im Doppelverdau geschnitten. Die fragmentierte DNA wurde durch
30 Agarose-Gelelektrophorese im 0,8%igen Agarosegel analysiert. Aus den erhaltenen Fragmentgrößen resultiert die in Fig. 3 abgebildete Restriktionskarte des 7,5 kB-Insert. Es wurde vollständig sequenziert (Sanger et al . 1977) und enthält u.a. die Nukleotidsequenz ID NO: 1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz
35 (SEQ ID NO: 2) wiederum enthält die Peptide YGIEGLNNLEAL und AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO : 3 und 4) , die nach tryptischem Verdau der gereinigten und geblotteten L-Pantolacton-Hydrolase aus Burkholderia caryophylli Lu681 und Agrobacterium radiobacter Lu5351 gefunden wurden (siehe Beispiel 4 und 5) .
40
Datenbankabgleiche (Genbank, EMBL, ΞwissProt Stand 7.5.99, [Sptrembel] bzw. 5.1.99 [PIR] ) der Nukleotid- und der abgeleiteten Aminosäuresequenz ergaben lediglich eine geringe Homologie zu einer Gruppe hypothetischer Proteine und zu bestimmten
45 Tetracyclin-Cyclasen aus Streptomyceten (Tab. 5) . Insbesondere das Motiv mit der Consensus-Sequenz HTGTHVDAP ist in allen Proteinen hochkonserviert. Außerdem wurde eine Homologie von 48 S (38% identische Aminosäuren) zur Isatin-Hydrolase aus Pseudomonas putida WW2 gefunden (WO 94/09175) , die ebenfalls das genannte Sequenzmotiv enthält. Da keine Homologie zu anderen Lactonasen, Esterasen oder Lipasen gefunden wurde, handelt es sich bei den 5 gefundenen L-Pantolacton-Hydrolasen um eine neue Klasse von Enzymen. Die Sequenzvergleiche lassen eine entfernt verwandte phylogenetische Familie vermuten, zu der auch die benannten hypothetischen Proteine und Tetracyclin-Cyclasen sowie die Isatin-Hydrolase gehören. 10
10. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XLlBlue pKS+681
Eine volle Impföse E. coli XLlBlue pKS+681 wurde nach Wachstum (ÜN = über Nacht, 37°C) auf einer LB-Platte mit Ampicillin
15 (100 μg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/1) in 0,5 ml Tris-HCl pH 7,0 und 50 mM D, L-Pantolacton resuspendiert (OD600 = 2,5). Als Vergleich diente eine entsprechende E. coli XLlBlue pBlue- scriptKS+-Probe (OD600 = 2,5). Nach 1 h wurden die Zellen abzentrifugiert und D, L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure
20 durch HPLC-Analyse bestimmt. Tab. 6a zeigt Aktivitäten und ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Suspension besaß eine Aktivität von >90 U/L. In Flüssigkultur-Ansätzen (vgl. Beispiel 12) war jedoch keine signifikante Aktivität zu erkennen.
25 11. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli XLlBlue pKK223-3
Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 wurden die Oligo- nukleotide 5V- CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (Pl) und 5'- CCCAAGCTTCA-
30 GACCAGGGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli- fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedingungen: 20 mM Tris/HCl pH 8 , 8 , 2 mM MgS04, 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S04 , 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 μg/ml pKS+681, je 2,2 μg/ml Pl und P2 , 25U/ml Pfu-Polymerase
35 (Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit EcoRI und Hindlll geschnitten und in mit EcoRI und Hindlll geschnittenen und dephosphorylierten pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg) ligiert. Das Ligationsgemisch
40 wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al , 1990, Gene 96:23-28). Die Tansformanten wurden auf LB-Amp-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformationsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filterabklatsch und ein
45 anschließender Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktionsverdau (EcoRI-Hindlll, EcoRI- Hindlll-BamHI) der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Molecular Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 4 abgebildete Plasmid pKK681.
5 12. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli XLlBlue pKK681
E. coli XLlBlue pKK681 wurde in 30 ml LB-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) und IPTG (0,5 mM) über Nacht bei 37°C angezogen, geerntet und in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen 0 und resuspendiert (3 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0). 0,25 ml der
Suspension wurden mit 150 mM L-Pantolacton, 150 mM Pipes pH 7 , 0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h bei 30°C inkubiert. Daneben wurden 0,25 ml der Suspension mit 50 mM D, L-Pantolacton, 50 mM Tris pH 7,0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h inkubiert. 5 Weiterhin wurden 2 ml der Suspension mit 300 mM D, -Pantolacton, 50 mM Tris pH 6,8 ad 20 ml Aqua dest. versetzt und unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 6,8 3 h inkubiert. Nach 1 h und nach 3 h wurden Proben entnommen, die Zellen abgetrennt und der Überstand auf D, -Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure 0 untersucht. Tab. 6b zeigt Aktivitäten und ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Über-Nacht-Kultur (lx konzentriert) besitzt somit eine Aktivität von 90 bis 150 U/1.
Bei Induktion von E. coli XLlBlue pKK681 in der früh- 25 exponentiellen Wachstumsphase (OD600 = 0,6, + 0,5 mM IPTG) besitzen die entsprechenden Zellen nach 5 h Inkubation bei 37°C in der spätexponentiellen Phase (OD600 = 4,1) eine Aktivität von ca. 480 U/1.
30 13. Expressionsklonierung der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli TG1 pDHE19
Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr.l wurden die Oligo- nukleotide 5 -CAGGATGCCATATGTGCAACAACTGC (Pl) und 5 v -CCCAAGCTTCA-
35 GACCAGGGCCAGAA (P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli- fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden Bedingungen: 20 mM Tris-HCl pH 8 , 8 , 2 mM MgS0 , 10 mM KC1, 10 mM (NH4)2S0 , 0,1 % Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP, 0,96 μg/ml pKS+681, je 2,2 μg/ml Pl und P2 , 25U/ml Pfu-Polymerase
40 (Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt: 1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit Ndel und Hindlll geschnitten und in mit Ndel und Hindlll geschnittenen und dephosphorylierten pDHEl9 (Prof. Mattes, Stuttgart) ligiert. Das Ligationsgemisch
45 wurde in E. coli XLl Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene, LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al, 1990, Gene 96:23-28). Die Transformanten wurden auf LB-Ampi- cillm-Platten ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformationsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filte- rabklatsch auf LB-Ampicillm- (100 μg/ml) Rhamnose- (2 g/1) Platten (LB = Luria Broth) und ein anschließender Aktivitatstest durch- geführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch Minipraparation und Restriktionsverdau (Ndel-Hmdlll, NdeI-HindiII-BamHI) sowie Sequenzanalyse der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T. , Molecular Cloning: A labaratory manual, 1989) . Sie enthielten das in Fig. 5 abgebildete Plasmid pDHE681.
14. L-Pantolacton-Hydrolyse durch E. coli TG1 pDHE681
E coli TG1 pDHE681 wurde in 14 1 Minimalmedium mit 40 g/1 Glyceπn und 2,5 g/1 Rhamnose 6 bis 7 h bei 37°C angezogen, geerntet und Tris/HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und ad 1,4 1 Puffer resuspendiert Die Aktivität der einfach konzentrierten Zellsuspension betrug im Standardassay (150 mM Pipes pH 7,0, 150 mM L-Pantolacton, 1 h 30°C) 680 bis 2700 U/1 bzw. 60 bis 160 g/BTM.
10 ml der lOfach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D, L-Pantolacton m 50 mM Tris/HCl pH 7 , 0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7 , 0 mkubiert. Nach 0,4 h und 3 h wurden der Umsatz und der ee-Wert durch HPLC- Analyse bestimmt (0,4 h: c = 48 %, ee = 92 % ; 3 h: c = 58 %, ee = 72 % bzgl. L-Pantomsaure) . Dies entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84 % bzw. 100 %.
15 Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit E. coli TG1 pDHE681
3 g D, L-Pantolacton wurden in 10 ml H20 gelost und mit 4 M NaOH auf pH 6 , 5 titriert. Nach Zugabe von 5 bis 10 ml Zellsuspension E. coli TG1 pDHE681 (Beispiel 14) und Auffüllen ad 20 ml mit H20 wurde die Reaktion bei 30°C unter Titration auf pH 6 , 8 15 bis 22 h inkubiert . Wahlweise wurden nochmals 0 bis 2 ml Zellsuspension zugesetzt und weitere 3 h mkubiert bzw. 3 x 5 ml Zellsuspension zugesetzt und weitere 90 h kubiert. Figur 6 zeigt den Verlauf anhand des NaOH-Verbrauches. Je nach Umsatz und Inkubationszeit wurden ee-Werte für D-Pantolacton von 71 bis 97 % erzielt. /Anschließend wurden die Zellen aus den 22 ml-Ansatzen abzentrifugiert und mit 5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7 , 0 gewaschen und die Überstände vereinigt (20 bis 25 ml) und 3x mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert . Die organische Phase wurde nach Zugabe von 10 g Na S0 (wasserfrei) 1 h bei Raumtemperatur getrocknet. Der Niederschlag wurde abfiltriert, lx mit Ethylacetat gewaschen und das Filtrat 3 h bei 40°C einrotiert. Der viskose Ruckstand wurde ausgewogen und durch HPLC, GC, GC-MS sowie H-NMR analysiert (Tab. 7) . Er enthielt reines D-Pantolacton (ee 71 bis 87 % nach 50 bis 52 % Umsatz) .
5 Die wäßrige Phase (21 ml; Na-L-Pantoat) wurde mit ca. 5 ml 3 M H2S04 auf pH 1 gestellt, 15 min bei 80°C erhitzt und mit 8 g wasserfreiem Na2S04 versetzt. Das erhaltene L-Pantolacton wurde analog 3x mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, mit Na2S04 getrocknet und einrotiert. Zur Rückführung in die Hydrolyse kann 0 die L-Pantolacton-Schmelze durch Erhitzen nach NaOH-Zugabe in Gegenwart von geringen Mengen Na-L-Pantoat racemisiert werden (3 h 180°C) .
16. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit L-Panto- 5 lacton-Hydrolase aus E. coli-Stämmen
L-Pantolacton-Hydrolase wurde direkt aus Fermenterbrühe von E. coli (TG1 pDHE681 bzw. bevorzungt Stämme, die Chaperone wie z.B. GroEL co-exprimieren) durch Zellaufschluß (2 x 1000 bar im 0 Microfluidizer) , Zelltrümmerabtrennung (20 min 9000 g bei 10°C) , 10-fache Konzentration über eine Cross-Flow-Filtration (Hämoflow F60, Fresenius, Membran mit Ausschluß von ca. 10 kDa) und Hitzefällung (20 min 60°C, 20 min RT-10°C, Zentrifugation) gewonnen und auf eine spezifische Aktivität von ca. 3000 U/g Protein
25 angereichert. Dieses 10 x Homogenat besaß eine Aktivität von 63-100000 U/1 und eine Proteinkonzentration von 20-30 g/1.
Die Racematspaltungen von 2,3 M D, L-Pantolacton (30 %w/v) mit hitzegefälltem Homogenat (16000 U/1, 6 g/1 Protein) wurden bei
30 30°C unter Titration mit 4 bis 10 M NaOH (pH7,5) mit leichter Pufferung (6 bis 20 mM NaHC03 ) im 0,75 bis 1,0 1 batch-Ansatz durchgeführt . Nach Inkubation über Nacht wurde das Enzym durch Cross-Flow-Filtration (Hämoflow F40, Fresenius, Membran mit Ausschluß von ca. 10 kDa) des Ansatzes von der Produkt-haltigen
35 Lösung getrennt, 1 bis 2 x mit VE-Wasser gewaschen und konzentriert. Anschließend wurde das Enzym erneut unter den obigen Bedingungen eingesetzt. Der Standzeitversuch zeigte eine Verdopplung der für einen ee-Wert von >90 % (D-PL) notwendigen Verweilzeit von 12 auf 24 h nach 6 d (Figur 7) . Die Aktivitäts-
40 Verluste sollten sich durch Verwendung größerer Volumina (z.B. 10-1-Ansatz für die F40-Kartusche) reduzieren lassen.
Die Aufarbeitung von Racematspaltungsansätzen mit Homogenat (50,8 % Umsatz, 92,5% ee) erfolgte durch Extraktion mit 5 x 1 45 Vol. MTBE. Es wurden 43 % D-Pantolacton mit 91,4 % ee und 98,2 %
Reinheit (GCint.St. bezogen auf 100 % Racemat) . Nach Erhitzen (65°C/15 min) mit Schwefelsäure (konz., 25 ml) und abermaliger Extraktion mit MTBE (5 x 1 Vol) wurden 53 % L-Pantolacton mit 62,3 % ee und 98,2 % Reinheit (GCint.st. ) erhalten. Verunreinigungen durch Protein oder DNA waren mit Standardverfahren nicht erkennbar .
* NaOH-Daten vom 6. Tag nicht verfügbar. 50,4 % Umsatz, 89,8 % ee bei 1390 min (23,17 h) .
Proben vom 7. Tag nicht verfügbar, daher keine analytischen Daten
17. Herstellung von D-Pantolacton durch Hydrolyse mit immobilisierter L-Pantolacton-Hydrolase
L-Pantolacton-Hydrolase wurde wie in Beispiel 16 isoliert und an verschiedene Trägermaterialien wie das kommerziell erhältliche EupergitC (Röhm GmbH, Darmstadt) oder Deloxan DAPIII (Degussa, Frankfurt) gebunden.
EupergitC
Eupergit ist ein durch Epoxidgruppen aktiviertes Trägermaterial. Das Protein wird dadurch hauptsächlich an Aminogruppen kovalent fixiert .
Homogenat wurde zunächst durch Hitzebehandlung einer Fällung unterzogen. 1,11 Homogenat wurden zu Mengen von je 550 ml für 30 Minuten bei 60°C inkubiert und dann für 20 Minuten auf Eis zur Abkühlung gestellt. Diese Lösung wurde zentrifugiert (1 Stunde 8000 U/min GS3 Rotor) , um denaturiertes Protein abzutrennen. Der Überstand wurde dann auf einer Hämoflow F40 Kartusche konzentriert und in einen 20 mM HEPES-Puffer , pH 7,5, umgepuffert. Die Menge Protein pro g Eupergit kann frei gewählt werden. In dem folgenden Beispiel wurden 7,2 g Protein in 270 ml Puffer mit 30 ml IM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 verdünnt und mit 17,5 g festem NaCl eingesalzt. Die hohe Salzmenge fördert die Bindung des Proteins an den Träger . Der pH wurde auf genau pH 6 , 8 eingestellt und zu dieser Lösung wurden dann 15 g trockenes Eupergit gegeben. Die Lösung wurde für 17 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf einer Glasnutsche abgesaugt und der Träger mit Wasser gewaschen. Das feuchte
Material wog ca. 60 g. Die Aufbewahrung erfolgte in einem 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5. Deloxan DAPIII, mit und ohne Reduktion
Deloxan ist ein mit Aminogruppen modifiziertes Silikat. Diese Aminogruppen können mit Glutardialdehyd unter Bildung einer Schiff 'sehen Base aktiviert werden. Der überschüssige Aldehyd wird dann weggewaschen und das Protein zum aktivierten Träger hinzugegeben. Die freien Aminogruppen des Proteins reagieren unter Bildung einer zweiten Schiff 'sehen Base mit dem noch freien Aldehyd des gebundenen Glutardialdehyds . Dieses so immobilisierte Protein ist bereits einsetzbar. Die Schiff 'sehe Base neigt jedoch zur Hydrolyse, so daß das Protein langsam vom Träger in wäßriger Lösung abblutet. Dies kann durch Reduktion mit Natriumborhydrid vermieden werden. Dabei wird die Schiff 'sehe Base in ein sekundäres Amin umgewandelt. Vorraussetzung dafür ist die Stabilität des Enzyms gegen eine Reduktion mit Natriumborhydrid.
Hitzefällung des Homogenats wie bei der Immobilisierung auf EupergitC.
Aktivierung:
140 g Deloxan DAPIII wurde mit Wasser, dann mit 1,5 1 0 , IM Natriumphosphatpuffer, pH 6, und 1,5 1 0 , IM Natriumphosphat- puffer, pH 7,5, gewaschen und resuspendiert . Dazu wurden 560 ml einer 2,5%igen Glutardialdehydlösung (pH 7,5 korrigiert im gleichen Puffer) gegeben und für 3 bis 4 Stunden reagiert. Der Träger wurde orangerot. Danach wurde der aktivierte Träger mit 6 1 Wasser gewaschen und in 1 1 Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) resuspendiert .
Zu 40 g aktiviertem Deloxan wurden z.B. 10000 U (ca. 2,7 g Protein) L-Pantolacton-Hydrolase gegeben. Das Protein wurde mit dem aktivierten Träger für 18 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert . Die Lösung wurde über eine Glasnutsche vom Träger getrennt. Der Träger wurde mehrfach mit Wasser und dann mit 1 1 0,1M Phosphatpuffer, pH 7 , 2 und 1 M NaCl gewaschen. Die Hälfte des Trägers wurde entnommen (ohne Reduktion) . Die andere Hälfte wurde wieder mit Wasser gewaschen und dann in 0,1 M Natriumboratpuffer, pH 7,2, gegeben. Reduktion durch Natriumborhydrid:
Zu dem in 80 ml Boratpuffer resuspendierten Träger wurden 0,4 g Natriumborhydrid gegeben (0,5 % ) und 3 Stunden bei Raumtemperatur bewegt. Dabei wurde das Trägermaterial wieder hellgelb. Der Träger wurde über eine Glasnutsche abgesaugt und mit 400 ml Boratpuffer gewaschen. Danach wurde der Träger mit 1 1 Wasser gewaschen und dann in 20 mM Phosphatpuffer aufgenommen. Racematspaltung
Zur Racematspaltung von 2,3 M D, L-Pantolacton (30 % w/v) mit Immobilisaten wurden diese unter Titration mit 10 M NaOH (pH 7,5) in 10 mM NaHC03 in 40-ml-Ansätzen bei 30°C gerührt, bis der ee-Wert für D-Pantolacton bei ca. 90 % lag (25 bis 60 h) . Der Biokatalysator wurde nach jedem Batch durch Filtration (Absaugen des Reaktionsansatzes durch einen HPLC-Laufmittel-Filter) vom Produkt getrennt und ggf. 3 x Waschen (VE-Wasser) zurückgewonnen. Die nachfolgenden Abbildungen zeigen die NaOH-Kurven der Standzeit-Versuche im gerührten Ansatz.
Tabelle la
Figure imgf000030_0001
PS, Pantoinsäure ee-Werte beziehen sich auf die Bildung von (L) -Pantoinsäure ee, enantiomerer Überschuß, korr., korrigierter ee bei Abzug der durch chemische Hydrolyse gebildeten
Pantoinsäure (Blank)
Figure imgf000031_0001
Tabelle lb
Figure imgf000031_0003
ee-Werte beziehen sich auf die Bildung von (L) -Pantoinsäure
ee, enantiomerer Überschuß; E, Enantioselektivität; korr., korrigierter ee oder E bei Abzug der durch chemische Hydrolyse gebildeten Pantoinsäure (Blank)
Figure imgf000031_0002
Tabelle 2: Reinigung der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu5351
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000032_0002
Tab. 3a Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681
Figure imgf000033_0001
++: > 50 U/1
+ : > 5 U/1
( + ) > 0,5 U/1 < 0,5 U/1
Tab. 3b Substratspezifität der L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu5351
Figure imgf000034_0001
> 50 u/i
> 5 U/1
: + ) > 0,5 U/1 < 0,5 U/1
Tab. 3c Lipaseaktivität der gereinigten L-Pantolacton-Hydrolase aus Lu681
Figure imgf000034_0002
Tab. 4a Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Burkholderia caryophylli Lu681 im Standardassay
Figure imgf000035_0001
Tab. 4b Effekte verschiedener Substanzzusätze auf die Aktivität der L-Pantolacton-Hydrolase von Agrobacterium radiobacter Lu5351 im Standardassay
Figure imgf000036_0001
pCMBS = p-Chlormercurbiphenylsulfonsäure
DTT = Dithiothreitol
SDS = Sodiumdodecylsulfat
EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure
DIFP = Diisopropylfluorophosphat
CHAPS = ( [3-Cholamidopropyl] -dimethylammonio) -1-propane- sulfonate
Figure imgf000037_0001
Tabelle 5: Homologien der L-Pantolacton-Hydrolase-Aminosäuresequenz aus Lu681 gemäß gap4- bzw. bestfit5-Recherche
Figure imgf000037_0002
Needleman & Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 Smith & Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2, 482-489
Figure imgf000038_0001
Tabelle 6: Expression der L-Pantolacton-Hydrolase in E. coli XLl Blue
a) XLl Blue pKS+681 und pKS+ (Negativkontrolle)
Figure imgf000038_0002
b) XLl Blue pKK681
Figure imgf000038_0003
n.b., nicht bestimmt
Tab. 7a
Figure imgf000039_0001
Tab . 7b
Figure imgf000039_0002

Claims

Patentansprüche
1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe :
a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50 % Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.
2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.
3. Aminoεäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.
4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.
6. Mikroorganismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäure- konstrukt gemäß Anspruch 4 oder einen Vector gemäß Anspruch 5.
7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-negatives Bakterium handelt .
5 8. Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 7 , dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium aus der Gruppe der α-Proteobacterien, ß-Proteo- bacterien oder γ-Proteobacterien handelt.
10 9. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae handelt.
15 10. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein Bakterium der Gattungen Agrobacterium, Pseudomonas, Burkholderia, Salmonella oder Escherichia handelt.
20 11. L-Pantolacton-Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften :
a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
25 b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
30 d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA
12. Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, dadurch 35 gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Reaktionsschritte umfaßt :
a) Umsetzung racemischen Pantolactons in Gegenwart einer L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer 40 L-Pantolacton-Hydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß
Anspruch 2 oder einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 zu D-Pantolacton und L-Pantoinsäure
b) Abtrennung des D-Pantolactons .
45
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die unter Reaktionsschritt (b) erhaltene L-Pantoinsäure racemisiert und in Reaktionsschritt (a) rückgeführt wird.
5 14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart einer immobilisierten L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer immobilisierten L-Pantolactonhydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 durchgeführt wird. 0
15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart eines wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 durchgeführt wird. 5
16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus immobilisiert ist.
17. Verfahren nach den /Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekenn- 0 zeichnet, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei einem pH zwischen 4 bis 12 durchgeführt wird.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C
25 bis 95°C durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Pantolacton über Extraktion abgetrennt wird.
30 20. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das D-Pantolacton eine optische Reinheit von mindestens 90 % ee besitzt.
35
40
45
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