JP2006521103A - パントラクトンヒドロラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T);
アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
アルギニン(R)、リシン(K);
イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び
フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)、(例えば、Creighton, Proteins(1984)参照)。
a)第1PCRで産生された一本鎖DNAにランダムにハイブリダイゼーションする第2PCRにおけるプライマーを使用し、第2PCRのためのテンプレートとして第1PCRの一本鎖DNAを使用すること;及び
b)それにより、やはり工程a)のランダムにハイブリダイゼーションするプライマーを使用して第2鎖のためのテンプレートとしてそれ自体役立つ対向鎖を発生させること、
を含むPCR増幅を含む方法を提供する。
ウマ肝臓エステラーゼアセトン粉末(Fluka Holding AG, Industriestrasse 25, P.O.Box260, CH-9471 Buchs, Switzerland)1gを、2M硫酸アンモニウム、1mM CaCl2、1mM MgCl2及び10μM EDTA(緩衝液A)を含有する40mlの50mMトリス/HCl、pH7.5に溶解させた。溶解しなかった物質を遠心及びその後、0.45μMフィルターを通す無菌ろ過により分離した。タンパク質溶液を、緩衝液Aと平衡化させたブチルセファロースカラムHR26/10(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)に適用した。カラムを緩衝液A100mlで洗浄した。この後、400mlの線状勾配0〜100%緩衝液B(硫酸アンモニウムなしの緩衝液A)を適用した。ラクトナーゼはこの勾配の中央で溶離した。パントラクトン加水分解活性を示す画分をプールし、緩衝液を20mMトリス/HCl、pH8.0、1mM CaCl2、1mM MgCl2及び10μM EDTAに交換した。プールした画分を、0〜350mM NaClからの線状勾配を使用して、MonoQを予め充填したカラムHR26/10(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)に適用した。タンパク質は勾配の始めに溶離した。再び活性画分をプールし、1mlに濃縮しそしてSUperdex200カラム(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)に適用した。溶離緩衝液として50mM トリス/HCl、pH8.0、1mM CaCl2、1mM MgCl2及び10μM EDTAを使用して、SDS−PAGEにより示されたサイズと一致している約31kDaの分子サイズを示す最後のピークとしてラクトナーゼが溶離した。
(a)分子サイズ、構造及び等電点:
SDS−PAGEによれば、変性されたタンパク質は、約35kDaの分子量を有する。較正されたゲルろ過カラムの溶離時間を使用して、ネイティブタンパク質の分子量は約31kDaであることが計算された。これは、ウマ肝臓からのラクトナーゼは30〜35kDaのモノマーであることを意味する。2Dゲルを使用して、等電点はpH5.5の範囲にあることが決定された。
2Dゲル電気泳動後の濃縮されたタンパク質をトリプシンにより消化した。発生したペプチドを質量分光法により分析した。ペプチドNo.66のN−末端配列は配列番号11として示される。
ウマ肝臓酵素のパントラクトナーゼ活性に対する種々の二価金属イオンの効果を試験するために、1.3、2.6、5.2若しくは10.4mMのCa2+、Mg2+又はMn2+
を200mMトリス/酢酸塩、pH9.0及び50mM(R,S)−パントラクトンからなる反応混合物に加えた。反応混合物を37℃で60分間インキュベーションしそして2mM EDTAを含有する等しい容積のメタノールで停止させた。(S)−パントラクトンの減少をHPLCにより決定した。カルシウムは酵素活性を減少させたが、マグネシウム及びマンガンは酵素の活性を増加させた。
精製した酵素を5.2mM MgCl2及び200mMトリス/酢酸塩、pH9.0中で30〜80℃の温度で15分間インキュベーションした。氷上で30分の後、標準アッセイ(60分、37℃)により活性を決定した。酵素は60℃まで安定であった。それは65℃で不活性化し始めそして70℃でその活性の50%より多くを失った。
すべての既知の哺乳動物遺伝子(下記参照)からの配列情報を使用して、Roche Molecular Biochemicals, Penzberg, Germanyによりここ快く提供された、Bavariaからの1年齢「Haflinger」からのウマ肝臓から作られたcDNAに対するPCRのためのプライマーをデザインした。QIAGEN RNeasy Max Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を使用して肝臓組織からトータルRNAを調製した。
(R)−パントラクトンを特異的に加水分解する活性を、A.niger発酵に由来する種々の商業的に入手可能な酵素製品において同定した。それぞれの酵素を精製するために、Amano Pharmaceuticala Co.Ltd., Nagoya, JapanからのLipase A “Amano”と呼ばれる商業的調製物を使用した。ラクトナーゼ活性と共に共精製された2つの酵素から得られた配列データに従えば、調製物は、A.tubigensisからのリパーゼを過発現するA.awamoriの凍結乾燥されそして破壊された(broken)細胞(発酵ブロスを含む)を表すと思われる。この物質を、20mMトリス/HCl、pH7.5、2.5mM MgCl2(標準緩衝液)に溶解した。5%エタノールを加えてこの物質の溶解度を増加させた。溶液にならなかった物質を、遠心(30分、15000rpm、4℃)により分離し、続いて0.45μmフィルターを通してろ過した。溶解した部分を、最初にAmiconセル(50kDaカットオフ)における限外ろ過により精製して、次のアニオン交換クロマトグラフィー段階を妨害することがありうるいかなる塩及び小さな分子サイズを有する化合物も除去した。次いで、タンパク質を、HR26/10を予備充填したQ−セファロースカラム(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)に適用した。カラムを200mM標準緩衝液で洗浄し、次いでタンパク質を0〜350mM NaClの線状勾配(400ml)により溶離した。活性を含有する画分をプールした。硫酸アンモニウムを加えて1.5Mの最終濃度とし、そのように処理したタンパク質溶液を、HR26/10ブチルセファロースを予備充填したカラム(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)に適用した。1.5M硫酸アンモニウムを含有する標準緩衝液で200mlの洗浄の後、タンパク質を、1.5〜0の減少していく硫酸アンモニウム勾配(400ml)により分離した。ここで、活性を2つのピークにおいて溶離し、これらを別々にプールした。両プールの容積を2ml未満に減少させた。2つの濃縮物を標準緩衝液を使用するSuperdex200カラムでのゲルろ過により分離した。各分離の活性画分をプールしそして濃縮した。プールIIの活性はプールIの活性よりも僅かに早く溶離する傾向があったが、これは対応するタンパク質の分子量が僅かにより高いことがありうることを示している。
(a)ネイティブ形態の構造及び分子量
実施例4に記載の条件を使用して72mlのSuperdex200(Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Deubendorf, Switzerland)で酵素を溶離した。標準曲線から推定されるとうり、これは75kDaの分子質量を反映している。SDS−PAGEは38kDaの分子質量を示した。データの組み合わせは、A.nigerからの(R)−パントラクトナーゼが、38kDaの2つの同一サブユニットからなるホモ二量体であることを示唆した。
50μlの希釈された酵素(0.1U)を、20mMトリス/HCl、pH7.5中で0、30、40、50、55、60、70℃で1時間インキュベーションした。氷上で15分の後、標準アッセイを使用して残留活性を決定した。酵素は50℃までは安定であった。より高い温度では、それはその活性を失い始めた。
商業的ソースからの濃く濃縮した(R)−パントラクトナーゼ(実施例5参照)を、下記の条件下に20、30、40、50、55及び60℃で30分間インキュベーションした:
100mM(R,S)−パントラクトン、
100mM MgCl2
200mM トリス/HCl、pH8.0
100μl最終容積中の0.05U(R)−パントラクトナーゼ。
A.nigerからの(R)−パントラクトナーゼは、その活性のためにMg2+又はMn2+イオンを必要とする。それは1mM EDTAの添加により完全に抑制された。
酵素は、pHが7.0から11.0まで変わるとき、「正常な」pH活性プロフィルを示さなかった。0.1%Span80及び酢酸マグネシウム20mMを含有する200mM TEA−酢酸塩緩衝液(pH7.0〜11)中のアミノリパーゼA10mgを40℃で20分間インキュベーションした。サンプルを、50mM EDTAを含有する等容積の500mM MES緩衝液、pH5.5でクエンチし、遠心し(10,000g、10分)、次いで、70:30水−メタノール、1ml/分、20℃で溶離した0.46×15cmCHIRADEXカラムを使用するHPLCにより分析した。最も高い活性はpH10付近で達成された。それからpH11.0まで、活性はあまり変化しなかった。最も高い選択性はpH9.0付近で達成された。
見出されたラクトナーゼ活性がAspergillus属に広範囲に広まっているかどうかを見出すために、5つのA.niger株を下記の条件下に培養した:
培地(量/リットル):1.23gNaNO3、0.5gKH2PO4、0.2gMgSO4x7H2O、0.5g酵母抽出物、5%グルコース及びVishniac and Santer, Bacteriol.Rev.21: 195-213(1957)により記載された微量金属溶液0.04ml。
実施例5の濃縮した調製物を2Dゲルで分析した。それぞれ、33及び40kDaの2つの主要スポット並びに4.7及び5.6のpIがトリプシンで消化された。発生したペプチドを、HPLC(機器:Hewlett Packard 1090, Column: Vydac C18(0.21×25cm)、210nmでの吸光度、流量:0.20ml/分、緩衝液A:0.075%TFA、緩衝液B:80%アセトニトリル中の0.065%TFA、勾配:2%B(0〜10分)、2〜75%B(10〜120分)により分離した。ペプチドの選択は、エドマン分解により配列決定された、スポットC[pI5.6、39kDa(Poll C)]:Fxn42(ペプチド1)(配列番号81)、Fxn57(ペプチド3)(配列番号82)、Fx3(ペプチド2)(配列番号83)、Fx74(配列番号84)及びFx81(配列番号85)、スポットC[pI4.7、33kDa(PollA/B]:N−末端(配列番号86)、Fx58(配列番号87)、Fx64(配列番号88)、Fx65(配列番号89)、Fx73(配列番号90)及びFx68(配列番号91)。Xは定義されていないアミノ酸を表し、括弧内のアミノ酸は明確に決定することができなかったアミノ酸である。
異なるAspergillus種からの12の異なるフィターゼ配列を使用するGCGプログラムパッケージバージョン10.2からのプログラムCODONFREQUENCYにより作られたAspergillusのコドン使用頻度(codon usage)を使用して、遺伝子コードの縮重のため可能な異なるDNA配列組み合わせの数を減少させた。プライマーの3’端部においてすべての可能な組み合わせが実現されたが、いくらかのまれなコドンは決定的因子としてAspergillusコドン使用頻度を使用してプライマーの5’端部において省かれた。ハイブリダイゼーション実験を意図したオリゴヌクレオチドの場合には、3’−及び5’−端部を同じ方法で処理した。その名前が「S(センス)」又は「AS(アンチセンス)」を含むオリゴヌクレオチドをPCRのために使用した。その名前がS又はASを含まないオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション実験で使用することを意図した。
YPD培地[Sherman et al., Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory、Cold Spring Harbor, New York(1986)]300mlに、1×106個の胞子/mlを接種した。培養物を激しい振とう(200rpm)下に30℃で一夜培養した。菌糸体をワットマンろ紙によるろ過により集め、PBS(等張性リン酸塩緩衝液)で洗浄しそして液体窒素中で凍結させた。菌糸体を粉砕して氷冷乳針中で微細な粉末とした。粉末を、1/3容積の50mMトリス/HCl、pH8.0、1.0%SDS、50mM EDTA中に再懸濁させそして頻繁に反転させながら65℃で15分間インキュベーションした。溶液を50℃に冷却した。Proteinase K(100μg/ml最終濃度)を加えた。溶液を50℃で1時間インキュベーションした。更に100mg/mlプロテイナーゼKを加えそして更に3時間インキュベーションを続けた。1/3容積のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(50/49/1)を加えた。完全なしかし穏やかな混合の後、エマルションを遠心した(12000g、20分、4℃)。水性相を除去しそして再び抽出した。更なる遠心段階(12000g、10分、4℃)の後、水性相をクロロホルムで抽出した。0.7容積のイソプロパノールを水性相に加えそして溶液を15分間穏やかに混合した。沈殿したDNAを遠心(10000g、30分、4℃)により集めた。1/10容積の3M KCl、pH5.2を残りの上澄液に加えそして穏やかな振とう下に15分間インキュベーションした。更なる遠心段階の後、2つのペレットを70%エタノールで2回洗浄し、空気上で乾燥し、そして水0.5mlに溶解した。最後に、DNAをRNアーゼで処理して残留RNAを除去した。
A.niger ATCC9142のゲノムDNA(gDNA)を実施例6に記載のようにして製造した。PCR機械としてStratagene (Stratagene、La Jolla, CA, USA)からのRobocycler Infinity及びRoche Molecular Biochemicals (Penzberg, Germany)からのTAQ polymerase KitをPCRsのために使用した:
gDNA(1/10希釈した)1μl 段階1:5分−95℃
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−50℃
プライマーS(100pM/μl)1μl 段階4:1分−72℃
プライマーAS(100pM/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのTAQポリメラーゼ1μl
H2O40μl
段階2〜4を35回繰り返した。
840bp断片(1/10に希釈した)1μl 段階1:5分−95℃
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
プライマーS10pMol/μl)1μl 段階4:30秒−72℃
プライマーAS10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのTAQポリメラーゼ1μl
H2O40μl
段階2〜4を30回繰り返した。
(a)3’−端部の単離
A.niger ATCC9142のgDNA 1μl 段階1:5分−95℃
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
プライマーOal2AS又はOal3S 段階4:30秒−72℃
(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのTAQポリメラーゼ1μl
H2O40μl
段階2〜4を30回繰り返した。
第2PCR
第1PCRからのDNA4μl 段階1:5分−95℃
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−58℃
プライマーOal4AS又はOal1AS 段階4:1分−72℃
(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular Biochemicalsからの
High Fidelity Mix 1μl
H2O 38μl
段階2〜4を35回繰り返した。
プローブとしてDIG標識されたオリゴヌクレオチドFxn42、Fxn57、Fx73及びFx74並びにX線フイルムでの化学発光検出(chemiluminescent detection)を伴うDIGシステム(Roche Molecular Biochemicals)を使用して、A.niger ATCC9142のゲノムDNAに関してハイブリダイゼーション実験を行った。ハイブリダイゼーション及び検出は供給者により推奨されるとおりに行われた。
染色体DNA 20μl
10×緩衝液20μl
HindIII(10U/μl)5μl
H2O 175μl
37℃で16時間インキュベーション
ライゲーション溶液5μl 段階1:5分−95℃
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+ を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
センスプライマー(10pMol/μl)1μl 段階4:3分−72℃
アンチセンスプライマー(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1μl
H2O 40μl
段階2〜4を32回繰り返した。
a)K−P−F−A−H−Q−V−K(配列番号43)及び
b)R−H−H−N−A−P−A−P−T−P−E−D−P−E−R−R(配列番号44)は、Fxn42であるK−P−F−A−H−Q−V−K−T−x−E−D(配列番号45)を与える。
実施例10に記載のすべての3つの方法により得られた配列を比較及びアセンブルして全ラクトナーゼ遺伝子を包含する2443bpの連続配列を発生させた。遺伝子の開始コドン及び停止コドン及び可能なイントロンを決定するために、市販の調製物からの精製された遺伝子から得られたペプチドの入手可能なアミノ酸配列を、GCGプログラムパッケージリリース10.2の2つのプログラムTESTCODE及びCODONPREFERENCEの結果と一緒に使用した。停止コドン及び1つのイントロンは同じ方法で両プログラムにより決定されたが、開始コドンは、特にペプチドFx74(配列番号84)のN−末端で利用可能な他の配列決定されたペプチドはなかったので、明らかではなかった。データベースサーチの期間中見出された相同性アミノ酸配列へのすべての可能な翻訳の比較も助けにならなかった。何故ならば、タンパク質のN−末端部分はまったく不均一であると思われるからである。ゆえに、ペプチドFx74の位置の上流にしかし同じリーディングフレームにおいて見出された2つのメチオニン残基が選ばれそして両者はそれぞれの発現カセットの構成のために使用された。CTに富んだ領域は、配列番号7の塩基対666〜742間に見出された。しかしながら、このCTに富んだ領域の位置は、開始コドンとして1つのMet他よりも実際に好まなかった。何故ならば、この領域と開始コドン間の距離は通常真菌において相当変動するである。また、可能なポリアデニル化部位は遺伝子の下流に同定された。
−E.coliにおける発現のためのoal(配列番号98)
−Saccharomyces cerevisiaeにおける発現のためのoalEco(配列番号94)
−S.cervisiaeにおける発現のためのoalEShort(配列番号95の位置32における第2の可能なMetを使用する31アミノ酸のより短いバージョン)
−E.coliにおける発現のためのoalS(アーティファクトとして最終的に同定されたペプチドFxn42のミスリーディング配列の故にoalSが作成された)
−S.cervisiaeにおける発現のためのoalSEco
−E.coliにおける発現のためのC−末端his−タグを含有するoalhis
−S.cervisiaeにおける発現のためのoalEhis
−E.coliにおける発現のためのN−末端his−タグを含有するoalNhis(配列番号92)
−S.cervisiaeにおける発現のためのoalENhis(配列番号96)(S.cervisiaeにおける発現及び分泌のためのA.terreus cbsのフィターゼのシグナルペプチドを含有する構築物oalsec)
最初に、oal遺伝子の推測されたコード配列(cDNA)を2つのPCRsにおいて単離した。2つのPCR産物を第3PCRによりアセンブルした。下記のプライマーを使用した:
Oal1AS(配列番号46)、Oal2AS(配列番号47)、Oal3S(配列番号48)、Oal4S(配列番号49)、Oal5S(配列番号50)、Oal6AS(配列番号51)、Oal7AS(配列番号52)、Oal8AS(配列番号53)、Oal9AS(配列番号54)、Oal10S(配列番号55)、Oal10SEco(配列番号56)、OalENhis(配列番号57)、Oal10SShis(配列番号58)、Oal11S(配列番号59)、Oal12AS(配列番号60)、Oal12ASEco(配列番号61)、 Oal12AShis(配列番号62)、Oal2ASHisEco(配列番号63)、Oal13S(配列番号64)、Oal13AS(配列番号65)、Oal14S(配列番号66)、Oal14AS(配列番号67)、Oal15S(配列番号68)、Oal15AS(配列番号69)、Oal16S(配列番号70)(第2Met)、OalsecS(配列番号71)、OalsecAS(配列番号72)、pQE80EcoS(配列番号73)、pQE80EcoNhisS(配列番号74)、pQE80BamAS(配列番号75)、pQE80BamhisAS(配列番号76)、pQE80EcoSshort(配列番号77)及びCP−a(配列番号78)。
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+ を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
Oal11S(10pMol/μl)1μl 段階4:1分−72℃
Oal14AS(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物1μl
H2O 40μl
段階2〜4を35回繰り返した。
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+ を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
Oal14S(10pMol/μl)1μl 段階4:1分−72℃
Oal9AS(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1μl
H2O 40μl
段階2〜4を35回繰り返した。
ヌクレオチド混合物1μl 段階2:30秒−95℃
Mg2+ を有するPCR標準緩衝液5μl 段階3:30秒−55℃
Oal12S(10pMol/μl)1μl 段階4:1分−72℃
Oal10AS(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1μl
H2O 40μl
段階2〜4を30回繰り返した。
oal1に関してプライマーpQE80EcoS及びpQE80BamASを使用するPCRを行って下記のプロトコールを使用して構築物Eco−oal−Bamを発生させた:
ヌクレオチド混合物1μl
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5μl
pQE80EcoS(10pMol/μl)1μl
pQE80BamAS(10pMol/μl)1μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1μl
H2O 40μl
段階1:5分−95℃
段階2:30秒−95℃
段階3:30秒−55℃
段階4:1分−72℃
段階2〜4を30回繰り返した。
上記したのと同じPCRプロトコールを使用して、プライマーpQE80EcoSshort及びpQE80BamASを同じテンプレートに対して使用した。完了したPCR反応を(a)に記載のように行った。
プライマーOal16S及びOal12ASEcoを使用した。他のすべては(a)に記載のように処理した。
プライマーpQE80EcoS及びpQE80BamhisASをPCRのために使用した。(a)参照。
プライマーOal10Seco及びOal12ASHisEcoをPCRのために使用した。(a)参照。
プライマーpQE80EcoNhisS及びpQE80BamASをPCRのために使用した(a参照)
プライマーOalENhis及びOal12ASEcoをPCRのために使用した(a参照)。
3つの独立のPCRsを使用して構築物を調製した。最初に、コンセンサスフィターゼの遺伝子に対するPCRによりシグナル配列を単離した[Lehmann et al., Protein Eng.13: 49-57(2000)]
ヌクレオチド混合物1.0μl
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5.0μl
CP−a(10pMol/μl)1.0μl
pOalsecAS(10pMol/μl)1.0μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1.0μl
H2O 40μl
段階1:5分−95℃
段階2:30秒−95℃
段階3:30秒−55℃
段階4:1分−72℃
段階2〜4を30回繰り返した。
ヌクレオチド混合物1.0μl
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5.0μl
OalsecS(10pMol/μl)1.0μl
Oal12ASEco(10pMol/μl)1.0μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物 1.0μl
H2O 40μl
段階1:5分−95℃
段階2:30秒−95℃
段階3:30秒−55℃
段階4:45秒−72℃
段階2〜4を30回繰り返した。
PCR1の産物0.5μl
PCR2の産物0.5μl
ヌクレオチド混合物1.0μl
Mg2+を有するPCR標準緩衝液5.0μl
CP−a(10pMol/μl)1.0μl
Oal12ASEco(10pMol/μl)1.0μl
Roche Molecular BiochemicalsからのHigh Fidelityポリメラーゼ混合物1.0μl
H2O40μl
段階1:5分−95℃
段階2:30秒−95℃
段階3:30秒−55℃
段階4:1分−72℃
段階2〜4を30回繰り返した。
(a)E.coliにおける
構築物pQE80oal、pQE80oalS、pQE80oalhis及びpQE80oalNhisを、lacプロモーターのリプレッサーを含むpREP4を含有するE.coliM15において発現した(Qiagen, Hilden, Germanyの発現マニュアル参照)一夜の培養物を600nmにおける0.1のODに希釈しそして30℃で1.5のOD600nmに増殖させた。次いで培養物を0.5mM IPTGで誘導しそして30℃で更に6時間培養した。細胞を遠心(5000g、20分)により回収しそして−80℃で凍結した。製造者のロトコールに従ってB−PER(Pierce, Rockford, IL, USA)を使用してそれらを溶解した。更なる遠心段階の後、上澄液を(R)−パントラクトンの加水分解のために使用した。
構築物oalEco、oalES、oalEhis、oalENhis及びoalsecをS.cervisiaeINVScl又は匹敵する株において発現した。形質転換及びSDura-培地([Sherman et al., Laboratory course manual for methods in yeast genetics, Cold Spring Harbor laboratory、Cold Spring Harbor, New York(1986)で平板培養の後、平板を30℃で3〜4日インキュベーションし、成長したコロニーを突き砕きそしてSDura-液体培地2mlに移し、そして30℃で3日間激しく振とうしながら培養した。これらの培養物をSDura-培地25mlのための予備培養物として使用した。激しく振とうしながら30℃で更に3日の培養の後、YPD培地500mlに2リットルフラスコ中で上記調製された培養物(Sherman et al., 上記)を接種した。同一条件下に更に3日間培養した後、細胞を遠心により培地から分離しそしてY−PER(Pierce, Rockford, IL)を使用して溶解した。
バイオリアクターにおける多重の使用のために、A.nigerからの(R)−パントラクトナーゼを固定化した。E.coli又はS.cervisiae中で発現の後、細胞をB−PER(E.coli)若しくはY−PER(S.cervisiae)(Pierce, Rockford, IL, USA)のような化学的手段又は音波処理若しくは高圧のような機械的手段により破壊した(disrupted)。溶解物を遠心により清澄化した。この調製物を固定化のために直接使用した。別法として、固定化の前に、硫酸アンモニウム沈殿のような更なる精製段階を含ませて、更に特異的Oal活性を増加させた。
(1)シリカ−ゾル−ゲルにおけるOalの固定化
ポリ(グリセリルシリケート)−1.0(PGS−1.0)を文献[Gill and Ballesteros, J.Am.Chem.Soc.120: 8587-8598(1998)]に従って調製し、そしてその重量の半分の氷冷水に溶解した。これの100若しくは200mg部分を、2ml又は5mlのバイアル中で50mMリン酸塩、pH7.0中で生体触媒ストック(種々の調製物からの可溶性酵素)の氷冷調製物50若しくは100mgと完全に混合し、そしてバイアルを2分間穏やかに回転させてバイアルの壁にヒドロゲルの薄いコーティングを形成した。次いで、バイアルを20分間氷上に放置し、次いで冷蔵庫に移した(開放した)。ヒドロゲルを5℃で48〜72時間エージングさせてキセロゲルを形成させた。キセロゲルコーテッドバイアルを、100rpm、5℃で振とうすることにより、2×1若しくは2×4mlの50mMリン酸塩緩衝液、pH7で洗浄し、続いて10mMの酢酸マグネシムを含有する2×1若しくは2×4mlの50mM TEA−酢酸塩、pH7によって洗浄した。
処置は、DGS溶液をラクトナーゼ酵素ストックと組み合わせる前にポリビニルアルコール(AldrichからのPVA、水中の85K13%w/w)の適当な量と混合したことを除いて(1)における処置と同様であった。更なる処理は(1)の場合と同じであった。
ポリエチレンイミン(Aldrichからの無水の高分子量の分岐状ポリマー1g)、CA(0.2g、36%Ac)及びセルロースアセテートブチレート(0.2g、Aldrichからの48%アセテート及びブチレート含有率)をジクロロメタン5mLに溶解し、そして溶液を使用してフラーズアース(Fullers Earth)(30〜60メッシュ、Aldrichから)7gをコーティングした。湿潤コーティングされた物質を室温で0.5時間空気下に乾燥してコーティングされたフラーズアース約9gを得た。次いでこれをグルタルアルデヒド(50%w/w、8mL、Aldrichから)及びリン酸塩緩衝液(50mM、pH8、50mL)の氷冷混合物中に、200rpmで2時間攪拌しながら懸濁させた。活性化された支持体を水(4×10mL)で洗浄し、次いでリン酸緩衝液(20mM、pH8、4×10mL)で洗浄し、次いで排出した(drained)。湿潤支持体をラクトナーゼ酵素ストックの氷冷した溶液(リン酸塩、50mM、pH8中の)と混合し、そして懸濁液を200rpmで20〜30時間攪拌した。液体を固定化された酵素からデカンテーションしそして湿潤した固定化物をリン酸塩(3×5mL)で洗浄し、エタノールアミン(20mM、pH8、20mL)で処理し、そして再びリン酸塩(20mM、pH7、2×5mL)で洗浄し、次いで排出した。
生体触媒50若しくは100mg及び0.5ラセミラクトン(20mM酢酸マグネシウムを含有する0.75Mトリエチルアミン酢酸塩、pH8.5中の)1若しくは2mLを使用して2若しくは4mLのバイアル中で反応を行った。バイアルを必要な時間40℃、200rpmでインキュベーションし、溶液を排出し、キラルHPLCにより分析し、触媒を次のサイクルを始める前に新鮮な基質溶液(2×1又は2mL)で洗浄した。分析のためのサンプルを50mM EDTAを含有する等容積の500mM MES緩衝液、pH5.5によりクエンチし、遠心し(10,000g、10分)、次いで0.46×15cmのCHIRADEXカラムを使用して、70:30水−エタノール、1mL/分、20℃で溶離するHPLCにより分析した。最初の速度(initial rates)を15分に測定しそしてE値を各サイクルの終わりに決定した。
実施例14(2)で上記したように調製された、ゾル−ゲル−PVA固定化された組換えラクトナーゼ生体触媒(E.coliで発現された)を使用して、充填床反応器においてラセミラクトンの連続的分割を行った:固定化された生体触媒(1.1g、0.21kUg−1、総計0.231kU)を、テフロン(登録商標)端部片を取り付けた0.46×15cmのOmnifitジャケット付きガラスカラムに乾式で詰め込んだ。これを、50mLガラス/テフロン(登録商標)注射器を備えた2つの注射器ポンプにより供給された1〜2mmのセルロースビーズを充填された1×10cmOmniftジャケット付きガラスカラムに接続した。カラムを、循環水浴に接続しそして分割実験期間中40℃に維持した。5ml/分の速度、室温で30分間トリス−酢酸塩緩衝液(ステアリン酸マグネシウム100mM、を含有する100mM、pH7)を供給し、次いでラセミラクトン(水中1.5M)及びトリス−酢酸塩緩衝液(50mM酢酸マクネシウムを含有する2.5M、pH8.25)の溶液を1:1の容積比及び2mL/分の全流速、室温で30分間一緒に供給することにより、反応器を状態調節した。次いで流速を1.2mL/分に降下させ、カラムを40℃に加熱し、システムを15分間平衡化させた。このようにして反応器を約45分間操作し、溶離物を氷浴中に集め、その条件下に総計52.7mLの供給物(5.14gのRSPLに相当する)を46〜48%の持続した転化率で処理した。溶離物のpHを硫酸(10%v/v/水性)によりpH6.5に調節し、溶液をジクロロメタン(10×75mL)で抽出しそして有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥しそしてロータリーエバボレーションして、10%RPL及び90%SPL(キラルHPLCにより分析して)からなる濃縮した(S)−パントラクトン(2.67g、理論の98%)を得た。水性相を硫酸(40%w/w)でpH1.5に酸性化し、1時間70℃に加熱し、氷中で冷却し、塩化ナトリウムで飽和させ、次いでジクロロメタン(10×75mL)で抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、ロータリーエバポレーションして93%のエナンチオマー純度を有する濃縮した(R)−パントラクトン(2.23g、理論知り収率の92%)を得た。(R)−/(S)−ラクトンの合わせた回収率は95%であった。
ウシ及びウマ肝臓からのラクトナーゼのアミノ酸配列を使用して、我々は、これらの配列に対する限定された相同性を示したいくつかの他の配列を見出した。これらの中でも、B.subtilisからのyvre遺伝子(SMP−30/CGR1 FAMILY/仮想的33.2kDaタンパク質のメンバーとして注釈されたYVRE BACSU)を、発現ベクターへの後者のクローニングのための必要な制限部位(EcoRI及びPstI)も含むその5’−端部及び3’−端部のプライマーを使用するゲノムDNAからのPCRによりクローニングした。PCR条件は、A.nigerのゲノムDNAからのoal遺伝子の単離のために使用されたPCR条件と同じであった(実施例8参照)。PCR産物及びベクター(Stratagene (La Jolla, CA, USA)からのPET41a))をEcoRI及びPstIにより消化し、アガロースゲル電気泳動により清浄化し、ライゲーションしそしてE.coliTop10細胞(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に形質転換した。このストラテジーを使用して、遺伝子を、E.coliからのGSTタンパク質の遺伝子にフレーム内で融合した。
を含有する標準アッセイを使用して精製されたタンパク質の活性を40℃で決定した。酵素は(S)−パントラクトンの非常に高い選択性を示した。調製は1〜2U/mgの濃縮した融合タンパク質の特異的活性を有していた。酵素はMg2+又はCa2+イオンの存在下にのみ活性であった。
Claims (10)
- ウマの肝臓、A.niger ATCC9142、A.niger awamori ATCC38854又はA.niger MacRae ATCC46951に由来する、パントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列。
- ウマの肝臓に由来する場合には配列番号1に示されるようなヌクレオチド配列、A.niger MacRae ATCC46951に由来する場合には配列番号5に示されたヌクレオチド配列、A.niger ATCC9142に由来する場合には配列番号7に示されるようなヌクレオチド配列、A.niger awamori ATCC38854に由来する場合には配列番号9に示されるようなヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載のヌクレオチド配列。
- ウマの肝臓、Bacillus subtilis、A.niger ATCC9142、A.niger awamori ATCC38854又はA.niger MacRae ATCC46951に由来するパントラクトンヒドロラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- 請求項3に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- ウマの肝臓、A.niger ATCC9142、A.niger awamori ATCC38854又はA.niger MacRae ATCC46951に由来するパントラクトンヒドロラーゼ。
- パントラクトンヒドロラーゼのアミノ酸配列が、ウマの肝臓に由来する場合には配列番号2により示されるアミノ酸配列、A.niger MacRae ATCC46951に由来する場合には配列番号6により示されるアミノ酸配列、A.niger ATCC9142に由来するには配列番号8により示されるアミノ酸配列及びA.niger awamori ATCC38854に由来する場合には配列番号10により示されるアミノ酸配列を含む、パントラクトンヒドロラーゼ。
- パントラクトンヒドロラーゼが固定化されている、請求項5又は6に記載のパントラクトンヒドロラーゼ。
- R−又はS−パントラクトンの選択的加水分解のための、請求項6に記載のパントラクトンヒドロラーゼ又は配列番号4により示されるようなBacillus subtilisに由来するパントラクトンヒドロラーゼの使用。
- 請求項6に記載のパントラクトンヒドロラーゼ又は配列番号4により示されるようなBacillus subtilisに由来するパントラクトンヒドロラーゼの存在下に R−又はS−パントラクトンを選択的に加水分解する工程を含む、R−パントテン酸若しくはその塩又はR−パンテノールの製造方法。
- 既知の配列に直接隣接したヌクレオチド配列をクローニングする方法であって、
a)第1PCRで産生された一本鎖DNAにランダムにハイブリダイゼーションする第2PCRにおけるプライマーを使用して、該第2PCRのためのテンプレートとして第1PCRの一本鎖DNAを使用すること;及び
b)それにより、やはり工程a)のランダムにハイブリダイゼーションするプライマーを使用して第2鎖のためのテンプレートとしてそれ自体役立つ対向鎖を生成させること、
を含むPCR増幅を含む方法。
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