JP4090076B2 - ヘベアブラシリエンシス（Ｈｅｖｅａｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）から得られる（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ - Google Patents
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Description
生物学的触媒によって化学反応を実施することは、特にキラル又はプロキラル成分との反応で２個の対掌体の１つを優先的に変換する性質――これは酵素類の中でしばしば際立つている――を利用することができる、その使用領域でますます重要になっている。
使用される酵素の１つはヘベア ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）から得られる（Ｓ）-ヒドロキシニトリルリアーゼ（Hnl）であり、このリアーゼはＨＣＮ又はＨＣＮ供与体と共に対応するアルデヒド類又はケトン類から芳香族だけでなく脂肪族の（Ｓ)-シアノヒドリンの生成も触媒する（ヨーロッパ特許第０６３２１３０号明細書）。脂肪族（Ｓ)-シアノヒドリンが他の（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ、たとえばソルグフム ビコラー（Sorghum bicolor）から得られたリアーゼを用いて調製され得ないことで重要である。（Tetrahedron Letters，31：1249-1252，1990）
以前から知られているHnlは、セルマ（Selmar）法によってHevea brasiliensisの葉から調製され（Physiologia plantarum 75：97-101，1989）、４６kＤａの分子量を有する（J．E．Poulton：Cyanide Compounds in Biology〔Ciba Foundation Symposium 140〕，pp 67-91，1988）。しかし、この方法で単離された酵素は、特異的抗-Hnl-抗体を得るのに又はHnlたん白質のアミノ酸配列を決定するのに十分に純粋ではない。他の通常のクロマトグラフィー精製工程を用いて純粋なＨＮＬ酵素を単離するためのすべての試みは、失敗している。塩化ナトリウム勾配溶離によるイオン交換クロマトグラフィーによって純粋な形で酵素を得るためのすべての試みで、Hnl活性はカラム溶離液中に全く検出されなかった。溶離のために、他の慣用である塩化ナトリウム勾配の代りに硫酸アンモニウムを使用して初めて成功した。したがって本発明は精製されかつ単離された形で（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに関する。この方法で単離されかつ精製されたHnlは、分子量３０±１kＤａ、たん白質に対して１９ＩＵ／ｍｇの比活性を有し、次のアミノ酸部分配列を有する。
これによってHevea brasiliensisからのｍＲＮＡの逆転写後、hnl遺伝子のｃＤＮＡコピーをクローン化することを可能にする。この遺伝子は次のヌクレオチド配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１、下記のHnlたん白質のためにこの配列から導かれるアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２及び下線が引かれたHnlたん白質から決定される部分-配列を有する。
ｃＤＮＡは、２５７アミノ酸のポリペプチドのための開放読み枠を有するhnl遺伝子の完全なコード域を含有する。この分子量は、コードするたん白質の、決定されるＤＮＡ配列から由来するアミノ酸配列から算出して、２９．２２７Ｄａである。
したがって、本発明は、ＤＮＡ配列にも関し、これは（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするか又はヒドロキシニトリルリアーゼをコードする領域中で８５％以上が上記ヒドロキシニトリルリアーゼ配列と同一である。ｍＲＮＡからこれは逆転写によって得られる。ｃＤＮＡは、種々の宿主生物体中で不均一な発現によって酵素産生を得るためのベースである。
また本発明は組換えたん白質にも関する。このたん白質は、適する微生物、好ましくは真核微生物中でHevea brasiliensisからhnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の不均一発現によって産生される。
真核微生物、たとえばサッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア パストリス（Pichia pastoris）の中でHevea brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の不均一発現によって調製される組換えHnlたん白質は、植物Hevea brasiliensisから単離された天然のHnlたん白質と明らかに異なっていることが特に明らかである。重要な特徴は、この様な組換えHnlたん白質の比活性がHevea brasiliensisからの精製された天然たん白質の比活性よりも明らかに高いことである。その違いは、たん白質の電気泳動挙動に現れる。等電点電気泳動でも、本来のポリアクリルアミドゲル中での分離でも、精製された組換え及び天然Hnlたん白質のたん白質バンドが異なる位置に見い出される。この異なる挙動は、植物中で及び微生物中で同様に行われない翻訳後修飾に起因すること及び組換えHnlたん白質のより高い比活性は真核微生物中で異なって修飾されたたん白質分子に起因することが考えられる。
例１
Hevea brasiliensisからの純粋なHnlたん白質の単離
Hevea brasiliensis（−２０℃で貯蔵）の葉８ｇづつを、氷中で冷却しながら、オンニミキサー（Omnimixer）（１０，０００rpm，１．５分）で２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５ ８０ｍｌ中で均質化する。得られた抽出物を４℃で１時間保ち、次いで婦人用ナイロンストッキングを通して濾過し、粗細胞成分を除去する。濃縮物をもう一度２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５で洗滌する。小粒子を遠心分離（１８，０００rpm，４０分）によって除去する。この方法で得られた粗たん白質抽出物を次の順序でクロマトグラフィーによって精製する。イオン交換クロマトグラフィー
ＱＡＥ-セファロースＦ．Ｆ．カラム（ＸＫ１６，２１ｃｍ，ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を、出発緩衝液Ｉ（１０ｍＭヒスチジン／硫酸ｐＨ６．５，１０％ソルビトール）で平衡化する。サンプル供給後、カラムを少なくとも５０ｍｌの出発緩衝液で洗滌する。出発緩衝液Ｉ中で０〜０．６Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の線状勾配を溶離に使用する。分画（１０ｍｌ）を集め、Hnl活性を検定し、Hnl活性を有する分画を貯める。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
フエニルセファロース ロウ サブスティチューション（low substitution）（ファルマシア）が詰められたカラム（ＸＫ２６，１１ｃｍ）を、出発緩衝液Ｈ（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０中で０．６５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4）で平衡化する。イオン交換クロマトグラフィーからの一緒にされたHnl分画を２５％（ＮＨ4）2ＳＯ4飽和に調整し、供給する。次いでカラムを出発緩衝液２００ｍｌで洗滌し、降下する線状（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配（０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０中で）で溶離する。分画１０ｍｌを集め、Hnl活性を検定し、Hnl活性を有する分画を貯める。
排他クロマトグラフィー
バイオゲルＰ１５０カラム（２６×３４ｃｍ，Biorad，Hercules，カルファルニア）を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５で平衡化する。酵素溶液の容量を供給する前に限外濾過（排他限界１０，０００Da，Amicon Inc., Beverly,MA）によって減少させる。溶離を室温で１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で行い、分画を集める（６ｍｌ）。この方法で精製されたHnlたん白質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量３０±１kＤａで唯一のバンドを示し、比活性１９ＩＵ／ｍｇを有する。
Hnl活性の検定
Hnl酵素活性を、２５℃及びｐＨ５．０ラセミ性マンデロニトリルからベンズアルデヒドの生成を経て追跡する。酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０ ９００μｌと混合し、活性検定を基質溶液１００μｌ（毎日新たに調製される１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５中で３７．５ｍＭマンデロニトリル）を添加して開始する。２８０ｎｍでの吸収の増加（参考として酵素不含基質溶液で測定）を５分間追跡する。１ＩＵは上記条件下でマンデロニトリルから１分あたりベンズアルデヒド１μモルの変換を触媒する酵素量に相当する。
例２
Hevea brasiliensisから発現-ｃＤＮＡ遺伝子バンクの産生
ｍＲＮＡを、グラーツ大学の植物園から属Hevea brasiliensis（樹齢１０年）の若葉から標準法で調製する（Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience,ニューヨーク，1990）。ｃＤＮＡ遺伝子バンクをＺａｐ-ｃＤＮＡ合成キット及びGigapack IIゴールドパッキング抽出物を用いてこれに関する文献中の手引きに従って調製する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA．米国）。
例３
たん白質を発現する組換えプラスミドの単離は、Hevea brasiliensisヒドロキシニトリルリアーゼに対する抗血清と免疫学的に相互作用する。
ｃＤＮＡ遺伝子バンクからの約１００，０００個のファージは、ポリクロナール抗-Hnl抗血清（ウサギ）を用いる標準法によって免疫スクリーニングで調べる。特異的に結合する抗体をアルカリ性ホスファターゼ及びクロモゲン性基質ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）／Ｘホスファート（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルホスファート；４-トルイジン塩）を基礎とする検出システム（ベーリング−マンハイムバイオケミカ，マンハイム、ドイツ）を用いて視覚化する。ファージＤＮＡからの挿入断片を、得られたポジティブクローンから手引き書“Uni-Zap XRからｐブルースクリプトの生体内切出し”（Stratagene Cloning Systems，La Jolla,カルフォルニア、米国）に従って適切な組換えプラスミド（ｐＨＮＬ-１００）中に転移させる。ｃＤＮＡ挿入断片のサイズは１１００ｂｐである。ｐＨＮＬ-１００を大腸菌ＳＯＬＲ（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，カルフォルニア，米国）で形質転換する。１ｍＭ ＩＰＴＧで誘発して、抗-Hnl-抗血清との免疫反応性を示し、約３０−３２kＤａの分子量を有するLacZ-Hnl融合たん白質を検出すること及びサイトゾルたん白質分画中でたん白質に対して０．０３５ＩＵ／ｍｇのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を検出することができる。分子生物学技術のすべては、Ausubel等から引用される。
（Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク，1990）。
例４
Hevea brasiliensisからのｃＤＮＡフラグメントの配列決定及びＰＣＲ法を用いる全長ｃＤＮＡのクローン化
ＤＡＮ配列決定をSanger等の連鎖停止反応法（Sanger等，Ｐ ＮＡＳ，74：5463-5467，1977）によって“DyeDeoxy Terminator Cycle配列決定キット”（AppliedBiosystem Inc., ホスター市、カルホルニア、米国）及び”自動ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いて実施する。最初の配列データから、プラスミドｐＨＮＬ-１００は不完全なｃＤＮＡ挿入断片を含有することが明らかである。５’-域中の欠失部分を後述する様に補充する：ファージＤＮＡをHevea brasiliensis ｃＤＮＡ遺伝子バンクから単離し、２つの遺伝子-特異的プライマー（プライマー１：CCTCCAAGAACGTCAACAAG；プライマー２：CATCAAATGAGCCAATCTCC）及びベクター-特異的プライマー（Ｔ３：AATTAACCCTCACTAAAGGG）を２-工程ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。ＰＣＲサイクル１：プライマー１のみ及びｃＤＮＡ遺伝子バンク（Hevea brasiliensis）ＤＮＡ４０ｍｇ；ＰＣＲサイクル２：プライマー２及びＴ３及びＤＮＡテレプレートとしてＰＣＲサイクル１からの1/10容量。ＰＣＲサイクル２から得られるＤＮＡをＥCOＲＩ及びSty Iで切り取り、得られたフラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１００（ＥCOＲＩ及びSty Iで切り取られた）の適切な領域中に入れてクローン化する。ｐＨＮＬ-１０１と呼ばれる得られた構造体中の挿入断片は完全に配列決定される。
ＤＮＡ配列の分析は、位置１でＡＴGで開始し、位置７７２でＴＧＡ停止コドン――これは２９，２２７Ｄａのたん白質をコードする――で終了する開放読み枠を明らかにする。このたん白質の大きさは、H. brasiliensisの葉から単離されたヒドロキシニトリル-リアーゼ（Hnl）に対して測定された分子量と関連する。このたん白質をコードするＤＮＡ配列を、H. brasiliensisのhnl遺伝子（ｃＤＮＡ）として決める。
例５
大腸菌中でH. brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の過発現によるヒドロキシニトリルリアーゼ調製物の産生
クローニング技術によって、新しい制限切断部位を挿入する。すなわちＮｃｏＩを開始コドン（位置１）の領域中に、Hind IIIを停止コドン（位置７８３）の後に標準ＰＣＲ法（ＰＣＲフラグメントによって対応する領域を置き代える）によって挿入する。両方の場合に使用されるテンプレートはプラスミドｐＨＮＬ-１０１からのＤＮＡである。
３’領域：プライマーＰ５１-ＨＸ（CCGCTCGAGAAGCTTCAAAGAAGTCAATTATAG）及びプライマーＰ５１-３．２（CACGCTTCTGAGGGAAAAT）を有するＰＣＲ；Xho I及びGel IIでＰＣＲからＤＮＡを切り取り、フラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１０１（Xho I及びCel IIで切り取る）中に入れクローン化する。得られたプラスミドをｐＨＮＬ-１０２と呼ぶ。
５’領域：プライマーＰ５１-ＥＮ（GGAATTCCATGGCATTCGCTCATTTT）及びプライマーＰ５１-３．１Ａ（CCTCCAAGAACGTCAACAAG）を有するＰＣＲ；ＥCOＲＩ及びSty IでＰＣＲからＤＮＡを切り取り、そのフラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１０２（ＥCOＲＩ及びSty Iで切り取る）中に入れ、クローン化する。得られたプラスミドを、ｐＨＮＬ-１０３と呼び、配列決定によって調べる。
ｐＨＮＬ-１０３からのＮCOＩ-Hind IIIフラグメントを、最終段階で大腸菌発現ベクターｐＳＥ４２０中でクローン化する（Invitrogen Corp.，サンディェゴ、カルホルニア、米国）。得られたプラスミドｐＨＮＬ-２００を、配列決定によって調べ、大腸菌株Top 10’で形質転換する（Invitrogen Corp.，サンディェゴ、カルホルニア、米国）。
適した形質転換物を、アンピシリン−Na塩１００ｍｇ／ｌが補給された２×YＴ培地（ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（Bactotryptone）１６ｇ／ｌ）１００ｍｌ中でじゃま板を有する振とうフラスコ中で３７℃、１６０ｒｐｍで培養し、光学濃度ＯＤ600＝０．５とする。たん白質産生を１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド）を加えて誘発し、培養を同一の条件下に３時間１％グルコースの添加後に続ける。次いで細胞を遠心分離して集め、崩壊緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ〔エチレンジアミンテトラアセテート〕、１ｍＭ ＰＭＳＦ〔フエニルメチルスルホニルフルオライド〕、５％グリセロール）４ｍｌ中に取る。細胞の崩壊を氷中で冷却しながら超音波破壊機（Braun社，Labsonic 2000）を用いて４５ワット３分間行う。崩壊溶液をSorvall ＳＳ−３４ローター及びSorvallＲＣ−５遠心分離機（デュポン社、ウィルミントン、デラウェアー、米国）中で２７，０００ｇ及び４℃で１５分間遠心分離して、可溶性及び不溶性構成成分に分画する。可溶性分画は、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性（たん白質０．１５Ｕ／ｍｇ）を有するたん白質を含有する。可溶性及び不溶性分画中のたん白質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティング法によって分析することによって、産生された不均質な免疫反応性Hnlたん白質の総量約１％しか活性な可溶性分画中に存在せず、一方免疫反応性Hnlたん白質９９％は不活性な“封入体”の形で不溶性分画中に見い出されることが明らかである。不溶性分画中のたん白質を、変性緩衝液（３．５Ｍ尿素、０．１Ｍトリス；ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて溶解し、不活性構成成分を遠心分離（２７，０００ｇ、４℃で１５分間）して除去する。得られたたん白質溶液を数回、すなわち先ず緩衝液１（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ尿素）に対して、５回緩衝液２（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して４℃で透析する。この様な方法で得られた、溶解されかつ復元されたたん白質調製物は、たん白質に対して比Hnl活性０．８〜１．４ＩＵ／ｍｇを示す。
例６
Saccharomyces cerevisiae中でH．brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を過発現することによってヒドロキシニトリルリアーゼ調製物を産生。
クローニング技術によって、２つの新しい切断部位（EcoRI，BamHI）を、Hind IIIで直鎖化されたプラスミドをアダプターＢ／Ｅ（AGCTTGAATTCGGATCC；AGCTGGATCCGAATTCA）に連結してプラスミドｐＨＮＬ-１０３のHind III制限切断の領域中に導入する。得られた構造体はｐＨＮＬ-１０４と呼ばれ、配列決定によって調べる。
hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）をBamHIフラグメントとしてプラスミドｐＨＮＬ-１０４から除き、Bgl IIで直鎖化された酵母発現ベクターｐＭＡ９１（Kingsman等、Methods in Enzymology，185:329-341，1990）中に入れ、クローン化する。得られたプラスミドはｐＨＮＬ-３００と呼ばれ、配列決定によって調べ、更にS.cerevisiae laborstamm株Ｗ３０３Ｄ（Hill等、Yeast，2:163-167，1986）中で形質転換する。形質転換体をロイシン不含最小培地（６．７ｇ／ｌ酵素窒素ベースｗ／ｏアミノ酸〔Difco社，米国〕、２０ｇ／ｌグルコース、２０ｍｌ／ｌロイシン不含アミノ酸濃縮物〔アデニン１．０ｇ／ｌ、メチオニン１．０ｇ／ｌ、アルギニン1.0g/l，トレオニン15.0g/l、ヒスチジン1.0g/l、トリプリファン１．０ｇ／ｌ、ウラシル２．０ｇ／ｌ、リジン１１．５ｇ／ｌ〕）上で培養する。たん白質産生のために、細胞を、じゃま板を有するエルレンマイヤーフラスコ中で３０℃、１５０ｒｐｍでロイシン不含最小培地１００ｍｌ中に培養し、光学密度ＯＤ600＝５．０とし、遠心分離して集める。細胞を崩壊緩衝液５ｍｌ中に懸濁し（例５に於ける様に）、Merckenschlager（ブラウン社、メルズンゲン、BRD）中で“ガラスビーズ法”（Ausubel等、Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、ニューヨーク、1990）によって崩壊する。たん白質に対するヒドロキシニトリルリアーゼ活性４．６２ＩＵ／ｍｇが、可溶性サイトゾル分画中に検出される。ブランクプラスミドｐＭＡ９１を有する酵母形質転換はコントロールとして供給し、この場合サイトゾルヒドロキシニトリルリアーゼ活性は検出されない。この様に調製された水性たん白質調製物を−２０℃で貯蔵する。タン白質調製物の長期間貯蔵に対する他の可能性は、すべての低分子量物質（蒸留水に対して４℃で透析）の除去後、生成物の凍結乾燥又は水中に懸濁後、酵母細胞の崩壊から成る（Benchtop ３Ｌ，ＶＩＲＴＩＳ Co., Inc.,ガージィナー、米国）。崩壊緩衝液中に再溶解された酵素サンプルの活性（例５に於ける様に）は、この場合ほぼ１００％を保つ。
更に、水性たん白質調製物から出発して、高度に精製された組換え体Hnlたん白質を容易に調製することができる。簡単な方法で、例１に記載したのと同一の方法を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で３０±１kＤａで唯一のバンドを実際に示す酵素調製物を得ることができる。S．Cerevisiae中で過発現させることによって得られる組換えHnlのこの様な調製物は、たん白質に対して２２〜２８ＩＵ／ｍｇの比活性を示す。
例７
Pichia pastoris中でH．brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の過発現によるヒドロキシニトリルリアーゼ調製物。
hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を、ＥCOＲＩで直鎖化されたP．Pastoris発現ベクターｐＨＩＬ-Ｄ２（Invitrogen Corp.，サンディゴ；ＣＡ、米国）中に入れ、プラスミドｐＨＮＬＺ-104からＥCOＲＩフラグメントとしてクローン化し，配列決定によってpHNL-400と表示する構造体を調べる。
宿主株ＧＳ１１５（His 4-）の形質転換、ヒスチジン原栄養株及び同時にメタノールを利用する栄養要求株選択は“Pichia発現キット”システム用記録に従って行う（Invitrogen Corp.，サンディエゴ、ＣＡ、米国）。２０個の正の形質転換体から高い細胞内濃度でヒドロキシニトリルリアーゼを産生する２個を同定することができる、細胞を同時に“Pichia発現キット”の手引きに従ってたん白質産生のために培養する。遠心分離によって集められた細胞を崩壊緩衝液中に懸濁し（例５の様に）、光学密度ＯＤ600＝５０．０とし、“ガラスビーズ法”によって崩壊する（例６に於けると同様に）。たん白質に対して１６Ｕ／ｍｇのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が可溶性サイトゾル分画中に検出される。この様な方法で調製されたたん白質調製物を活性の無視できる損失と共に例６に記載した様に同一方法で貯蔵する。
例１に記載したのと同一方法によって簡単な方法で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で３０±１ｋＤａで〔Sic〕の実際に唯一のバンドを示す、高度に精製された酵素調製物を得ることができる。P．pastoris中で過発現して得られる組換えHnlのこの様な調製物は、たん白質に対して４１〜４６ＩＵ／ｍｇの範囲で比活性を示す。
例８
組換えHnl生成物の比較
精製されたHnlたん白質調製物をゲル３−９（Phast System，ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を用いる等電点分画電気泳動によって又は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ポリアクリルアミド、トリス／グリシン緩衝液ｐＨ８．８）によって分析する。これから、異なるバンドは異なる調製物によって見い出されることが分る。等電点分画電気泳動によればH．brasiliensisからのHnlは等電点４．１で１つのバンドを示す。S．cerevisiae及びP．pastorisからの組換えたん白質を用いて、２又は３つのバンドが接近して表われ、ベース域に対応する位置にいくつ分かれ離れてある。P．pastorisからの組換えHnlを用いて、この移動した位置での量がきわだって多いことが分る。
天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によればS．cerevisiae及びP．pastorisからの組換えたん白質は、むしろ類似の挙動を示す。夫々の場合、極めて接近する２つのバンドが同定され、これはウェスタンブロッティング（ポリクロナール抗-Hnl抗血清を用いる）によってHnlたん白質に特異的であるものとして同定される２つの弱いバンドによって両側が接している。これとは対照的にH．brasiliensisからのたん白質の分析によればいく分か遠くへ流出し、いく分かぼやけるバンドが同定される。
例９
触媒反応に関係するヒドロキシニトリルリアーゼの不可欠なアミノ酸の同定サーチモデュール（search module）ＢＬＡＳＴ（Altschul等、J．Mol．Biol．215，403-410，1990）を用いてたん白質データバンク（Swissport，PIR，Genpept）の研究、及びＧＣＧソフトウェアーパッケージのプログラムモデュール（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，9月1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，米国53711）を用いて“マルチプル アライメント”及びその統計解析の構築から次の解釈が導かれる：Hevea brasiliensisからのヒドロキシニトリルリアーゼは、“α／βヒドロラーゼ折りたたむ”タイプの、構造上類似するたん白質の大きいグループに属する（Ollis等、Protein Engineering，第５巻、197-211，1992）。特有の３次折りたたみの他に、これらのたん白質は三っ組元素、ならびにAsp/Glu及びHisの親核部分としてAsp又はSer又はCysを有する、いわゆる触媒三っ組元素を有する。コンピューター予測から決定されるこれらのアミノ酸もヒドロキシニトリルリアーゼ（Glu79，Ser80，Cys81，Aps207及びHis235）の触媒活性に関係することも証明するために、ヒドロキシニトリルリアーゼの突然変異たん白質を、夫々の場合位置７９，８０，２０７，２３５でアミノ酸アラニン及び位置８１でセリンを用いて調製する。突然変異をスタンダードＰＣＲ法によってプラスミドｐＨＮＬ-１０４のレベル（例６参照）で導入する。アミノ酸位置７９，８０及び８１の変更のために、夫々の場合サブクローニングに必要である遺伝子-特異的制限切断部位MunIとも重複する、突然変異アンチセンスエンドプライマー及びベクター 特異的プライマー（Ｔ３）を使用する（Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology，Vol．1 & 2，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク、1990）。特別のＰＣＲ法を、アミノ酸位置２０７及び２３５を変更するために使用する。これはセンスディレクション（sense direction）でホスホリレート化された突然変異プライマーはサブクローニングに必要である制限切断部位Gel IIとも重複する遺伝子-特異的プライマー及び他のベクター特異的プライマー（Ｔ７）の使用を伴う（Michael S．F.,BioTechniques 16，410-412，1994）。ＰＣＲ生成物の精製及びサブクローニングは標準法で行われる。プラスミドｐＨＮＬ-１０５-ｐＨＮＬ-１０９中に得られる突然変異hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を、発現プラスミドｐＭＡ９１（ｐＨＮＬ-３０２-ｐＨＮＬ-３０６）に入れ、クローン化し、突然変異たん白質を、例６に記載した様にSaccharomyces cerevisiae中で産生する。ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を、可溶性サイトゾル分画中で測定し、実施された５回の突然変異の夫々は酵素活性の完全な夫活性化を導く結果が得られる。このことから直接の酵素触媒作用でこれらのアミノ酸が関係していることが推測される。突然変異していないたん白質と比較して突然変異たん白質中のたん白質構造の全体的維持は、等電点電気泳動又は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で実際に同一の流出挙動によって確かめる（Ausubel等、Current Protocols inMolecular Biology，Vol．1 & 2，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク、1990）。
使用される酵素の１つはヘベア ブラシリエンシス（Hevea brasiliensis）から得られる（Ｓ）-ヒドロキシニトリルリアーゼ（Hnl）であり、このリアーゼはＨＣＮ又はＨＣＮ供与体と共に対応するアルデヒド類又はケトン類から芳香族だけでなく脂肪族の（Ｓ)-シアノヒドリンの生成も触媒する（ヨーロッパ特許第０６３２１３０号明細書）。脂肪族（Ｓ)-シアノヒドリンが他の（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ、たとえばソルグフム ビコラー（Sorghum bicolor）から得られたリアーゼを用いて調製され得ないことで重要である。（Tetrahedron Letters，31：1249-1252，1990）
以前から知られているHnlは、セルマ（Selmar）法によってHevea brasiliensisの葉から調製され（Physiologia plantarum 75：97-101，1989）、４６kＤａの分子量を有する（J．E．Poulton：Cyanide Compounds in Biology〔Ciba Foundation Symposium 140〕，pp 67-91，1988）。しかし、この方法で単離された酵素は、特異的抗-Hnl-抗体を得るのに又はHnlたん白質のアミノ酸配列を決定するのに十分に純粋ではない。他の通常のクロマトグラフィー精製工程を用いて純粋なＨＮＬ酵素を単離するためのすべての試みは、失敗している。塩化ナトリウム勾配溶離によるイオン交換クロマトグラフィーによって純粋な形で酵素を得るためのすべての試みで、Hnl活性はカラム溶離液中に全く検出されなかった。溶離のために、他の慣用である塩化ナトリウム勾配の代りに硫酸アンモニウムを使用して初めて成功した。したがって本発明は精製されかつ単離された形で（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼに関する。この方法で単離されかつ精製されたHnlは、分子量３０±１kＤａ、たん白質に対して１９ＩＵ／ｍｇの比活性を有し、次のアミノ酸部分配列を有する。
したがって、本発明は、ＤＮＡ配列にも関し、これは（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするか又はヒドロキシニトリルリアーゼをコードする領域中で８５％以上が上記ヒドロキシニトリルリアーゼ配列と同一である。ｍＲＮＡからこれは逆転写によって得られる。ｃＤＮＡは、種々の宿主生物体中で不均一な発現によって酵素産生を得るためのベースである。
また本発明は組換えたん白質にも関する。このたん白質は、適する微生物、好ましくは真核微生物中でHevea brasiliensisからhnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の不均一発現によって産生される。
真核微生物、たとえばサッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア パストリス（Pichia pastoris）の中でHevea brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の不均一発現によって調製される組換えHnlたん白質は、植物Hevea brasiliensisから単離された天然のHnlたん白質と明らかに異なっていることが特に明らかである。重要な特徴は、この様な組換えHnlたん白質の比活性がHevea brasiliensisからの精製された天然たん白質の比活性よりも明らかに高いことである。その違いは、たん白質の電気泳動挙動に現れる。等電点電気泳動でも、本来のポリアクリルアミドゲル中での分離でも、精製された組換え及び天然Hnlたん白質のたん白質バンドが異なる位置に見い出される。この異なる挙動は、植物中で及び微生物中で同様に行われない翻訳後修飾に起因すること及び組換えHnlたん白質のより高い比活性は真核微生物中で異なって修飾されたたん白質分子に起因することが考えられる。
例１
Hevea brasiliensisからの純粋なHnlたん白質の単離
Hevea brasiliensis（−２０℃で貯蔵）の葉８ｇづつを、氷中で冷却しながら、オンニミキサー（Omnimixer）（１０，０００rpm，１．５分）で２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５ ８０ｍｌ中で均質化する。得られた抽出物を４℃で１時間保ち、次いで婦人用ナイロンストッキングを通して濾過し、粗細胞成分を除去する。濃縮物をもう一度２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５で洗滌する。小粒子を遠心分離（１８，０００rpm，４０分）によって除去する。この方法で得られた粗たん白質抽出物を次の順序でクロマトグラフィーによって精製する。イオン交換クロマトグラフィー
ＱＡＥ-セファロースＦ．Ｆ．カラム（ＸＫ１６，２１ｃｍ，ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を、出発緩衝液Ｉ（１０ｍＭヒスチジン／硫酸ｐＨ６．５，１０％ソルビトール）で平衡化する。サンプル供給後、カラムを少なくとも５０ｍｌの出発緩衝液で洗滌する。出発緩衝液Ｉ中で０〜０．６Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4の線状勾配を溶離に使用する。分画（１０ｍｌ）を集め、Hnl活性を検定し、Hnl活性を有する分画を貯める。
疎水性相互作用クロマトグラフィー
フエニルセファロース ロウ サブスティチューション（low substitution）（ファルマシア）が詰められたカラム（ＸＫ２６，１１ｃｍ）を、出発緩衝液Ｈ（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０中で０．６５Ｍ（ＮＨ4）2ＳＯ4）で平衡化する。イオン交換クロマトグラフィーからの一緒にされたHnl分画を２５％（ＮＨ4）2ＳＯ4飽和に調整し、供給する。次いでカラムを出発緩衝液２００ｍｌで洗滌し、降下する線状（ＮＨ4）2ＳＯ4勾配（０．１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．０中で）で溶離する。分画１０ｍｌを集め、Hnl活性を検定し、Hnl活性を有する分画を貯める。
排他クロマトグラフィー
バイオゲルＰ１５０カラム（２６×３４ｃｍ，Biorad，Hercules，カルファルニア）を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５で平衡化する。酵素溶液の容量を供給する前に限外濾過（排他限界１０，０００Da，Amicon Inc., Beverly,MA）によって減少させる。溶離を室温で１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液で行い、分画を集める（６ｍｌ）。この方法で精製されたHnlたん白質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分子量３０±１kＤａで唯一のバンドを示し、比活性１９ＩＵ／ｍｇを有する。
Hnl活性の検定
Hnl酵素活性を、２５℃及びｐＨ５．０ラセミ性マンデロニトリルからベンズアルデヒドの生成を経て追跡する。酵素溶液５０μｌを、５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０ ９００μｌと混合し、活性検定を基質溶液１００μｌ（毎日新たに調製される１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．５中で３７．５ｍＭマンデロニトリル）を添加して開始する。２８０ｎｍでの吸収の増加（参考として酵素不含基質溶液で測定）を５分間追跡する。１ＩＵは上記条件下でマンデロニトリルから１分あたりベンズアルデヒド１μモルの変換を触媒する酵素量に相当する。
例２
Hevea brasiliensisから発現-ｃＤＮＡ遺伝子バンクの産生
ｍＲＮＡを、グラーツ大学の植物園から属Hevea brasiliensis（樹齢１０年）の若葉から標準法で調製する（Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience,ニューヨーク，1990）。ｃＤＮＡ遺伝子バンクをＺａｐ-ｃＤＮＡ合成キット及びGigapack IIゴールドパッキング抽出物を用いてこれに関する文献中の手引きに従って調製する（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA．米国）。
例３
たん白質を発現する組換えプラスミドの単離は、Hevea brasiliensisヒドロキシニトリルリアーゼに対する抗血清と免疫学的に相互作用する。
ｃＤＮＡ遺伝子バンクからの約１００，０００個のファージは、ポリクロナール抗-Hnl抗血清（ウサギ）を用いる標準法によって免疫スクリーニングで調べる。特異的に結合する抗体をアルカリ性ホスファターゼ及びクロモゲン性基質ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）／Ｘホスファート（５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルホスファート；４-トルイジン塩）を基礎とする検出システム（ベーリング−マンハイムバイオケミカ，マンハイム、ドイツ）を用いて視覚化する。ファージＤＮＡからの挿入断片を、得られたポジティブクローンから手引き書“Uni-Zap XRからｐブルースクリプトの生体内切出し”（Stratagene Cloning Systems，La Jolla,カルフォルニア、米国）に従って適切な組換えプラスミド（ｐＨＮＬ-１００）中に転移させる。ｃＤＮＡ挿入断片のサイズは１１００ｂｐである。ｐＨＮＬ-１００を大腸菌ＳＯＬＲ（Stratagene Cloning Systems，La Jolla，カルフォルニア，米国）で形質転換する。１ｍＭ ＩＰＴＧで誘発して、抗-Hnl-抗血清との免疫反応性を示し、約３０−３２kＤａの分子量を有するLacZ-Hnl融合たん白質を検出すること及びサイトゾルたん白質分画中でたん白質に対して０．０３５ＩＵ／ｍｇのヒドロキシニトリルリアーゼ活性を検出することができる。分子生物学技術のすべては、Ausubel等から引用される。
（Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク，1990）。
例４
Hevea brasiliensisからのｃＤＮＡフラグメントの配列決定及びＰＣＲ法を用いる全長ｃＤＮＡのクローン化
ＤＡＮ配列決定をSanger等の連鎖停止反応法（Sanger等，Ｐ ＮＡＳ，74：5463-5467，1977）によって“DyeDeoxy Terminator Cycle配列決定キット”（AppliedBiosystem Inc., ホスター市、カルホルニア、米国）及び”自動ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Applied Biosystem）を用いて実施する。最初の配列データから、プラスミドｐＨＮＬ-１００は不完全なｃＤＮＡ挿入断片を含有することが明らかである。５’-域中の欠失部分を後述する様に補充する：ファージＤＮＡをHevea brasiliensis ｃＤＮＡ遺伝子バンクから単離し、２つの遺伝子-特異的プライマー（プライマー１：CCTCCAAGAACGTCAACAAG；プライマー２：CATCAAATGAGCCAATCTCC）及びベクター-特異的プライマー（Ｔ３：AATTAACCCTCACTAAAGGG）を２-工程ＰＣＲのためのテンプレートとして使用する。ＰＣＲサイクル１：プライマー１のみ及びｃＤＮＡ遺伝子バンク（Hevea brasiliensis）ＤＮＡ４０ｍｇ；ＰＣＲサイクル２：プライマー２及びＴ３及びＤＮＡテレプレートとしてＰＣＲサイクル１からの1/10容量。ＰＣＲサイクル２から得られるＤＮＡをＥCOＲＩ及びSty Iで切り取り、得られたフラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１００（ＥCOＲＩ及びSty Iで切り取られた）の適切な領域中に入れてクローン化する。ｐＨＮＬ-１０１と呼ばれる得られた構造体中の挿入断片は完全に配列決定される。
ＤＮＡ配列の分析は、位置１でＡＴGで開始し、位置７７２でＴＧＡ停止コドン――これは２９，２２７Ｄａのたん白質をコードする――で終了する開放読み枠を明らかにする。このたん白質の大きさは、H. brasiliensisの葉から単離されたヒドロキシニトリル-リアーゼ（Hnl）に対して測定された分子量と関連する。このたん白質をコードするＤＮＡ配列を、H. brasiliensisのhnl遺伝子（ｃＤＮＡ）として決める。
例５
大腸菌中でH. brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の過発現によるヒドロキシニトリルリアーゼ調製物の産生
クローニング技術によって、新しい制限切断部位を挿入する。すなわちＮｃｏＩを開始コドン（位置１）の領域中に、Hind IIIを停止コドン（位置７８３）の後に標準ＰＣＲ法（ＰＣＲフラグメントによって対応する領域を置き代える）によって挿入する。両方の場合に使用されるテンプレートはプラスミドｐＨＮＬ-１０１からのＤＮＡである。
３’領域：プライマーＰ５１-ＨＸ（CCGCTCGAGAAGCTTCAAAGAAGTCAATTATAG）及びプライマーＰ５１-３．２（CACGCTTCTGAGGGAAAAT）を有するＰＣＲ；Xho I及びGel IIでＰＣＲからＤＮＡを切り取り、フラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１０１（Xho I及びCel IIで切り取る）中に入れクローン化する。得られたプラスミドをｐＨＮＬ-１０２と呼ぶ。
５’領域：プライマーＰ５１-ＥＮ（GGAATTCCATGGCATTCGCTCATTTT）及びプライマーＰ５１-３．１Ａ（CCTCCAAGAACGTCAACAAG）を有するＰＣＲ；ＥCOＲＩ及びSty IでＰＣＲからＤＮＡを切り取り、そのフラグメントをプラスミドｐＨＮＬ-１０２（ＥCOＲＩ及びSty Iで切り取る）中に入れ、クローン化する。得られたプラスミドを、ｐＨＮＬ-１０３と呼び、配列決定によって調べる。
ｐＨＮＬ-１０３からのＮCOＩ-Hind IIIフラグメントを、最終段階で大腸菌発現ベクターｐＳＥ４２０中でクローン化する（Invitrogen Corp.，サンディェゴ、カルホルニア、米国）。得られたプラスミドｐＨＮＬ-２００を、配列決定によって調べ、大腸菌株Top 10’で形質転換する（Invitrogen Corp.，サンディェゴ、カルホルニア、米国）。
適した形質転換物を、アンピシリン−Na塩１００ｍｇ／ｌが補給された２×YＴ培地（ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、バクトトリプトン（Bactotryptone）１６ｇ／ｌ）１００ｍｌ中でじゃま板を有する振とうフラスコ中で３７℃、１６０ｒｐｍで培養し、光学濃度ＯＤ600＝０．５とする。たん白質産生を１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ-Ｄ-チオガラクトピラノシド）を加えて誘発し、培養を同一の条件下に３時間１％グルコースの添加後に続ける。次いで細胞を遠心分離して集め、崩壊緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ〔エチレンジアミンテトラアセテート〕、１ｍＭ ＰＭＳＦ〔フエニルメチルスルホニルフルオライド〕、５％グリセロール）４ｍｌ中に取る。細胞の崩壊を氷中で冷却しながら超音波破壊機（Braun社，Labsonic 2000）を用いて４５ワット３分間行う。崩壊溶液をSorvall ＳＳ−３４ローター及びSorvallＲＣ−５遠心分離機（デュポン社、ウィルミントン、デラウェアー、米国）中で２７，０００ｇ及び４℃で１５分間遠心分離して、可溶性及び不溶性構成成分に分画する。可溶性分画は、ヒドロキシニトリルリアーゼ活性（たん白質０．１５Ｕ／ｍｇ）を有するたん白質を含有する。可溶性及び不溶性分画中のたん白質を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティング法によって分析することによって、産生された不均質な免疫反応性Hnlたん白質の総量約１％しか活性な可溶性分画中に存在せず、一方免疫反応性Hnlたん白質９９％は不活性な“封入体”の形で不溶性分画中に見い出されることが明らかである。不溶性分画中のたん白質を、変性緩衝液（３．５Ｍ尿素、０．１Ｍトリス；ｐＨ８．０）２０ｍｌを加えて溶解し、不活性構成成分を遠心分離（２７，０００ｇ、４℃で１５分間）して除去する。得られたたん白質溶液を数回、すなわち先ず緩衝液１（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ尿素）に対して、５回緩衝液２（５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して４℃で透析する。この様な方法で得られた、溶解されかつ復元されたたん白質調製物は、たん白質に対して比Hnl活性０．８〜１．４ＩＵ／ｍｇを示す。
例６
Saccharomyces cerevisiae中でH．brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を過発現することによってヒドロキシニトリルリアーゼ調製物を産生。
クローニング技術によって、２つの新しい切断部位（EcoRI，BamHI）を、Hind IIIで直鎖化されたプラスミドをアダプターＢ／Ｅ（AGCTTGAATTCGGATCC；AGCTGGATCCGAATTCA）に連結してプラスミドｐＨＮＬ-１０３のHind III制限切断の領域中に導入する。得られた構造体はｐＨＮＬ-１０４と呼ばれ、配列決定によって調べる。
hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）をBamHIフラグメントとしてプラスミドｐＨＮＬ-１０４から除き、Bgl IIで直鎖化された酵母発現ベクターｐＭＡ９１（Kingsman等、Methods in Enzymology，185:329-341，1990）中に入れ、クローン化する。得られたプラスミドはｐＨＮＬ-３００と呼ばれ、配列決定によって調べ、更にS.cerevisiae laborstamm株Ｗ３０３Ｄ（Hill等、Yeast，2:163-167，1986）中で形質転換する。形質転換体をロイシン不含最小培地（６．７ｇ／ｌ酵素窒素ベースｗ／ｏアミノ酸〔Difco社，米国〕、２０ｇ／ｌグルコース、２０ｍｌ／ｌロイシン不含アミノ酸濃縮物〔アデニン１．０ｇ／ｌ、メチオニン１．０ｇ／ｌ、アルギニン1.0g/l，トレオニン15.0g/l、ヒスチジン1.0g/l、トリプリファン１．０ｇ／ｌ、ウラシル２．０ｇ／ｌ、リジン１１．５ｇ／ｌ〕）上で培養する。たん白質産生のために、細胞を、じゃま板を有するエルレンマイヤーフラスコ中で３０℃、１５０ｒｐｍでロイシン不含最小培地１００ｍｌ中に培養し、光学密度ＯＤ600＝５．０とし、遠心分離して集める。細胞を崩壊緩衝液５ｍｌ中に懸濁し（例５に於ける様に）、Merckenschlager（ブラウン社、メルズンゲン、BRD）中で“ガラスビーズ法”（Ausubel等、Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、ニューヨーク、1990）によって崩壊する。たん白質に対するヒドロキシニトリルリアーゼ活性４．６２ＩＵ／ｍｇが、可溶性サイトゾル分画中に検出される。ブランクプラスミドｐＭＡ９１を有する酵母形質転換はコントロールとして供給し、この場合サイトゾルヒドロキシニトリルリアーゼ活性は検出されない。この様に調製された水性たん白質調製物を−２０℃で貯蔵する。タン白質調製物の長期間貯蔵に対する他の可能性は、すべての低分子量物質（蒸留水に対して４℃で透析）の除去後、生成物の凍結乾燥又は水中に懸濁後、酵母細胞の崩壊から成る（Benchtop ３Ｌ，ＶＩＲＴＩＳ Co., Inc.,ガージィナー、米国）。崩壊緩衝液中に再溶解された酵素サンプルの活性（例５に於ける様に）は、この場合ほぼ１００％を保つ。
更に、水性たん白質調製物から出発して、高度に精製された組換え体Hnlたん白質を容易に調製することができる。簡単な方法で、例１に記載したのと同一の方法を用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で３０±１kＤａで唯一のバンドを実際に示す酵素調製物を得ることができる。S．Cerevisiae中で過発現させることによって得られる組換えHnlのこの様な調製物は、たん白質に対して２２〜２８ＩＵ／ｍｇの比活性を示す。
例７
Pichia pastoris中でH．brasiliensis hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）の過発現によるヒドロキシニトリルリアーゼ調製物。
hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を、ＥCOＲＩで直鎖化されたP．Pastoris発現ベクターｐＨＩＬ-Ｄ２（Invitrogen Corp.，サンディゴ；ＣＡ、米国）中に入れ、プラスミドｐＨＮＬＺ-104からＥCOＲＩフラグメントとしてクローン化し，配列決定によってpHNL-400と表示する構造体を調べる。
宿主株ＧＳ１１５（His 4-）の形質転換、ヒスチジン原栄養株及び同時にメタノールを利用する栄養要求株選択は“Pichia発現キット”システム用記録に従って行う（Invitrogen Corp.，サンディエゴ、ＣＡ、米国）。２０個の正の形質転換体から高い細胞内濃度でヒドロキシニトリルリアーゼを産生する２個を同定することができる、細胞を同時に“Pichia発現キット”の手引きに従ってたん白質産生のために培養する。遠心分離によって集められた細胞を崩壊緩衝液中に懸濁し（例５の様に）、光学密度ＯＤ600＝５０．０とし、“ガラスビーズ法”によって崩壊する（例６に於けると同様に）。たん白質に対して１６Ｕ／ｍｇのヒドロキシニトリルリアーゼ活性が可溶性サイトゾル分画中に検出される。この様な方法で調製されたたん白質調製物を活性の無視できる損失と共に例６に記載した様に同一方法で貯蔵する。
例１に記載したのと同一方法によって簡単な方法で、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で３０±１ｋＤａで〔Sic〕の実際に唯一のバンドを示す、高度に精製された酵素調製物を得ることができる。P．pastoris中で過発現して得られる組換えHnlのこの様な調製物は、たん白質に対して４１〜４６ＩＵ／ｍｇの範囲で比活性を示す。
例８
組換えHnl生成物の比較
精製されたHnlたん白質調製物をゲル３−９（Phast System，ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を用いる等電点分画電気泳動によって又は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％ポリアクリルアミド、トリス／グリシン緩衝液ｐＨ８．８）によって分析する。これから、異なるバンドは異なる調製物によって見い出されることが分る。等電点分画電気泳動によればH．brasiliensisからのHnlは等電点４．１で１つのバンドを示す。S．cerevisiae及びP．pastorisからの組換えたん白質を用いて、２又は３つのバンドが接近して表われ、ベース域に対応する位置にいくつ分かれ離れてある。P．pastorisからの組換えHnlを用いて、この移動した位置での量がきわだって多いことが分る。
天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動によればS．cerevisiae及びP．pastorisからの組換えたん白質は、むしろ類似の挙動を示す。夫々の場合、極めて接近する２つのバンドが同定され、これはウェスタンブロッティング（ポリクロナール抗-Hnl抗血清を用いる）によってHnlたん白質に特異的であるものとして同定される２つの弱いバンドによって両側が接している。これとは対照的にH．brasiliensisからのたん白質の分析によればいく分か遠くへ流出し、いく分かぼやけるバンドが同定される。
例９
触媒反応に関係するヒドロキシニトリルリアーゼの不可欠なアミノ酸の同定サーチモデュール（search module）ＢＬＡＳＴ（Altschul等、J．Mol．Biol．215，403-410，1990）を用いてたん白質データバンク（Swissport，PIR，Genpept）の研究、及びＧＣＧソフトウェアーパッケージのプログラムモデュール（Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，9月1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，米国53711）を用いて“マルチプル アライメント”及びその統計解析の構築から次の解釈が導かれる：Hevea brasiliensisからのヒドロキシニトリルリアーゼは、“α／βヒドロラーゼ折りたたむ”タイプの、構造上類似するたん白質の大きいグループに属する（Ollis等、Protein Engineering，第５巻、197-211，1992）。特有の３次折りたたみの他に、これらのたん白質は三っ組元素、ならびにAsp/Glu及びHisの親核部分としてAsp又はSer又はCysを有する、いわゆる触媒三っ組元素を有する。コンピューター予測から決定されるこれらのアミノ酸もヒドロキシニトリルリアーゼ（Glu79，Ser80，Cys81，Aps207及びHis235）の触媒活性に関係することも証明するために、ヒドロキシニトリルリアーゼの突然変異たん白質を、夫々の場合位置７９，８０，２０７，２３５でアミノ酸アラニン及び位置８１でセリンを用いて調製する。突然変異をスタンダードＰＣＲ法によってプラスミドｐＨＮＬ-１０４のレベル（例６参照）で導入する。アミノ酸位置７９，８０及び８１の変更のために、夫々の場合サブクローニングに必要である遺伝子-特異的制限切断部位MunIとも重複する、突然変異アンチセンスエンドプライマー及びベクター 特異的プライマー（Ｔ３）を使用する（Ausubel等、Current Protocols in Molecular Biology，Vol．1 & 2，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク、1990）。特別のＰＣＲ法を、アミノ酸位置２０７及び２３５を変更するために使用する。これはセンスディレクション（sense direction）でホスホリレート化された突然変異プライマーはサブクローニングに必要である制限切断部位Gel IIとも重複する遺伝子-特異的プライマー及び他のベクター特異的プライマー（Ｔ７）の使用を伴う（Michael S．F.,BioTechniques 16，410-412，1994）。ＰＣＲ生成物の精製及びサブクローニングは標準法で行われる。プラスミドｐＨＮＬ-１０５-ｐＨＮＬ-１０９中に得られる突然変異hnl遺伝子（ｃＤＮＡ）を、発現プラスミドｐＭＡ９１（ｐＨＮＬ-３０２-ｐＨＮＬ-３０６）に入れ、クローン化し、突然変異たん白質を、例６に記載した様にSaccharomyces cerevisiae中で産生する。ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を、可溶性サイトゾル分画中で測定し、実施された５回の突然変異の夫々は酵素活性の完全な夫活性化を導く結果が得られる。このことから直接の酵素触媒作用でこれらのアミノ酸が関係していることが推測される。突然変異していないたん白質と比較して突然変異たん白質中のたん白質構造の全体的維持は、等電点電気泳動又は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動で実際に同一の流出挙動によって確かめる（Ausubel等、Current Protocols inMolecular Biology，Vol．1 & 2，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，ニューヨーク、1990）。
Claims (9)
- ＤＮＡ配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１に由来するアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２から成る（Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ。
- （Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする、請求項１記載のＤＮＡ配列。
- 請求項２記載のＤＮＡ配列を有するベクター。
- ベクターによって導入される、請求項２記載のＤＮＡ配列を有する宿主細胞。
- 微生物の細胞である、請求項４記載の宿主細胞。
- サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア パストリス（Pichia pastoris）に由来する、請求項４又は５記載の宿主細胞。
- 請求項４ないし６のいずれか１つに記載の宿主細胞中での請求項３記載のＤＮＡ配列の不均一な発現によって産生される組換えたん白質。
- （Ｓ)-ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するたん白質を産生する方法に於て、請求項４ないし６のいずれか１つに記載の宿主細胞を培養し、産生したたん白質を単離することを特徴とする、上記方法。
- （Ｓ)-シアノヒドリンを製造するために、請求項７記載の組換えたん白質を使用する方法。
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