TW469293B - (S)-hydroxy-nitrile-lyase in isolated and purified form - Google Patents

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經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 年月g知:正I 4 6 9 2 Μ 8. Μ 補充 _______Β7 五、發明說明（i) 利用生物性催化劑來協助化學反應的進行已逐漸重要’ 特別是一些應用領域，通常是一些標記的酵素，強調其可在 反應中將二個鏡像物其中之一與非對稱或原非對稱的組成分 子相轉換之優良特性。 一種被利用的酵素爲源自於巴西橡樹抝 的（S)-羥基腈裂解酶(Hnl)，其不只可將醛或酮與HCN或HCN 供給者催化形成芳香族的氰醇亦可催化形成脂肪族氰醇(ΕΡ_ Α-0632130>»由於無法由其他的（S)-羥基腈裂解酶，諸如得 自栽培種高粱（办/^⑽WcWor)的該酵素（Tetrahedron Letters, 31: 1249-1252, 1990)來製備脂肪族（S)-氰醇，故此方法顯得 非常重要。 以往所熟知的Hnl是藉由Selmar之方法（Physiologia plantarum 75: 97-101，1989)由巴西橡樹的葉片中製備得到， 且其分子量爲46 kDa (J.E. Poulton in: Cyanide Compounds in Biology [Ciba Foundation Symposium 140], pp 67-91, 1988) 1 但利用此法所獲得的酵素不夠純質故無法製備專一性的抗一 Hnl抗體或決定Hnl蛋白質之胺基酸序列，其他常用的層析法 純化步驟亦無法成功的得到該純質的Hnl的酵素。而利用離 子交換法以氯化鈉梯度沖提所得到的純質酵素，在管柱沖提 液中卻無法測得Hnl之活性，只有在使用硫酸銨取代傳統上 所用之氯化鈉進行沖提，才能成功的分離到該酵素，本發明 即是關於一種純質且分離型式的（S)-羥基腈裂解酶。 利用本方法所得到的純質且分離的Hnl，其分子量爲30 ±lkDa，其比活性爲19 IU/每毫克蛋白質，並包含有 本紙張尺度適用ΐ國函家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------^-----r---訂---------線 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁》 46 92 9 3 五、發明説明（2 )

下列的部分胺基酸序列： 部分序列1 :白胺酸-甲基胺酸-麩胺酸-纈胺酸-苯丙胺酸 _脯胺酸 部分序列2 :白胺酸-絲胺酸-白肢酸-苯丙胺酸•麩胺醯酸 -天冬胺醢酸- 部分序列3 :麩胺酸-異白胺酸-丙胺酸-羝胺酸-異白胺酸 -白胺酸-麩胺醯酸-麩胺酸-纈肢酸-白胺酸- 當反轉錄巴西橡樹之J«RNA後卽可選殖一個hnl基因的 cDNA，其具有下列的核基酸序列，而具衍生的Hnl蛋白質 之胺基酸序列亦列於核苷序列之下，而由Hnl蛋白質所得 到的部分序列則以盡線部分表示。

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61/21 AAC CTC 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 rc Αλλ ccc lye l«u lye pro 121/41 ACC CCC GTT GhC eer gly «ap iai/61 TTC TTC ACG TTC l*u leu thr pht 241/81 TCT CGA CCA CTC eye gly gly l*u 301/101 CPT TTC CAC AAT val phe hi· aen 361/121 CTC ATG GAG CTC leu met οΐυ val 421/141 hAG CAC ΑΤΛ ACT lye 9IU 11* thr 461/1&1 TGC CGT OCT GAG eye gly pro glu 541/181 AAT ATT TTA CCT 11· leu 蠹i纛 31/11 CAT TTT CTT CTT ATT CAT ACC KTk TCC CAC COT GCA TCC ATT TCG CAC hi塞 ph* leu ile hi· thr ey· hi« $ly ftlA trp ίΛ« trp hi·· 91/31 CTC CTT GAG GCA CTT CCC CAC AAG GTT ACT CCA CTC GAC CTT GCA GCA i_u leu 9IU «1« leu gly hie lys v篡1 thr AlA leu ttdp leu &la «1« 1S1/51 CCA AGG CAA λΤΤ GAG CAC ATT CGC TCA TTT GAT GKG ΤΛΤ TCT GAA CCC pro trg ςΐπ il· gLu glu il· gly ser ph· ««p glu tyr ««r glu pro 211/71 TTC GM CCA CTC CCT CCA GGC GJJi AAO GTO ATT CTG GTT CCC CAG ACC i籲u αΙα λβιι pro pro gly 9I11 Xye val ile ieu v&l giy glu 9.r 271/91 ΛλΤ ΑΤΑ CCA ATT CCT CCT CAT ΛΑΧ TAC 7GT CAA AAC ATT GCA CCT GCT aan ile «1« il· 4!« Alft *ep ly« tyr cys 9IU lye ile »}.« aIa ala 331/111 TCA GTA TTG CCA CAC ACC GAG ChC T6C COi TCT ΤλΟ CTC GTG GAT AAG ••r val leu pro *sp thr glu hi· ey· pro a*r tyr val v»l ·βρ lye 391/131 TTT CCC CAC TCG AAA CAC ACC ACG TAT TTT ACG TAC ACT λΧλ GAT GCC phe 取夺 asp trp lye «βρ thr thr tyr phe thr tyr thr ly» Asp gly

451/151 ACG CTT C。、TTG AAA CTG GCC TTC ACC CTT CTG AG。CAA AAT 1TA TAT ACC CTT gly leu lye l«u gly phe thr leu l«u arg glu Αβα leu tyr thr leu 511/111 CAA TAT 0ΑΛ CTO CCC AAC ATG TTC ACA MO ΑΛβ ΰβλ TCA ΤΤΛ TTT CAA glu typ giu l«u 應 1龜 ly· met 1m tbr ly» qlv l^u phe gin 571/191 ^ AAC CCA CCA TTC TTC ACT AAG βλΛ GGT TAC GCh TCG ATT AAG AAA ATT lys «rg pfo phe ph« thr .ly» 9I1· gly tyr gly ·βΓ ίΛβ iy· ly« il· 601/^01 ΤλΤ QXG TCG ACC tyr vsl trp t.k\t 631/211 GAC CAA GAC GAA ATA TTT TTA CCT βλλ TTT CAA CTC TCC CAA ATA GhX ftsp 9I11 mep gXu il« ph· leu pro 9lg ph· gin i*u trp 9I0 9^u 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（210X297公嫠）

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齋萌親明（3 ) 6 92 9 3 A7 B7

661/221 691/231 ·. AAC TAT ΑΑΛ CCA CAC AAO CTT TAT fJiO CTC «ΛΛ COT GGS GAT GXT AM TTC CAC CTT ACX “n tyr ly· pro Mp ly· v*l tyi* ly· v·]» gU gly gly mj» hi· ly· 1_ia gin leu tbr 721/241 7Sl/2Si ΛΑδ ACT AAG CAC ATC CCT CM ATT CTC CAA CAC GTG CCT CAT ACC TAT ΑΛΤ TCA CTT CTT Xym thr lye Pin <IW ·1· olu Lla 1看u ΰίη olu val ala Α·ρ thr tyr a«n OPA TGACGCTTTTTGTTACXATTXACTATCCGACCAACTATGAirrrAATAATCTCACXTTTTCAAGTCCCAXtTAACTrGTC CTRAAATAAACXTGTirJITTCTCTTCTAATl 111 i i 11<-ΛΤΤΠίΑΙΚ；ΤΡ〇ΟΛ€Λ<#ΤϋΤ〇σΚΛ£ΡπΤΤ〇ΰΑ〇Α〇ΤπΤΤ ΛΓΤΤλΤΑΤΑΓΛΤΑΛΤ HTCTAAGt ΓΑΤΤΤ

r〇iTTtCAJU；TC»SGACACTCTCCCACCCTTTCC CCTACCCCTATICTCTACCTTATCATCCTTTTC 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 該cDNA包含有完整的hnl基因编碼匿域，並具有一個 2J5锢多胜呔的開放可讀框（open reading frame}，由DN A 序列所決定的胺基酸序列编碼之蛋白其計算結果其分子量 為）9,227 Da。 本發明亦關於一個可K编碼<S>-羥基睛裂解酶的DNA 序列*或在编碼羥基睛裂解酶之區域與此序列有高於85% 之相同性。其可自mRNA反轉錄而得到，而cDNA是藉因在各 種不同案主體内異源性表現來獲得該酵素的基礎。 本發明也關於一種重組蛋白質*其可藉由在適當的徹 生物，最好為真核撒生物*異源性表現來自巴西橡樹之hnl 基因（cDNA)而裂備。 Hnl蛋白質己可藉由在真核微生物中，諸如糖酵母菌. 或卩1(：111&?331〇1"丨3異源性表現巴西橡樹的11111基因而製備 ，此有別於自巴西橡樹中分離天然的Hnl蛋白質，最大的 特戡在於重組Hnl蛋白質之比话性明顯較自巴西橡樹分部 而得之天然蛋白質之比活性爲高*其差異亦可藉由蛋白質 的電泳結果加以區分，不論是等電焦電泳或原性聚丙烯醯. 胺膠體電泳，純化的重組Hnl蛋白質與天然Hnl蛋白質其條. 帶之位置均不相同，此被認爲是因植物髏與微生物中其轉 譯後之修飾作用不同所致，且重組Hnl蛋白質之比话性較 本紙張尺度逋用中國國家標率（CMS ) A4规格（210X297公釐） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 6 4 6 9 2 9 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) 高是由於真核撤生物中其蛋白質之修飾作用不同所致。 第1實例： 自巴西橡樹中分離純質的Hnl蛋白質》 將8克巴西橡樹之禁片（貯存於-20Ό)與80毫升之20 mM，磷酸鉀缓衝液pH 6.5, Μ均質機加Μ均質化（10,000 rpm, 1.5分鐘），並於冰中冷卻，將均質液置於41C 1小時 ，隨後Mladies尼龍油[網加以過逋粗磷片細胞，殘留物再 M20 mM之磷酸鉀緩衝液pH 6.5清洗一次，並Μ離心方式 (18,000 ,40分鐘）去除小分子，根據此法所得到的粗蛋白 再依下列層析步驟加Κ純化： 雜芊夺梅層析法 將 QAE-Sepharose F_F管柱（ΧΚ 16, 21 公分，Pharmacia, Uppsala,瑞典）Μ啟始緩衝液I <1〇 idM組織胺酸/硫酸pH 6.5, 10%山梨糖醇）加Μ平衡，當裝載樣後，該管柱至少 Μ 50 ml之啟始縷衝液清洗之，啟始緩衝液Μ〇至0.6 Μ的 <NH4>sS04之直線梯度沖提樣品，收集每一部分（1〇 mi>並 分析Hnl之栝性，將具有Hn丨活性之部分混合收集之。 葙水袢夺W作用画析法 將一填充有低取代物之苯基-Sepharose管柱（XK 26, 11公分）以啟始緩衝掖H(0.65 M (NHdiSCU溶於〇.1 Μ之磷 酸鉀缓衝液，pH 6.0中）平衡之，將由離子交換層析法所 得到之混合的Hnl部分調整到25¾ <NH4>2S04之飽和度並載 入管柱中，將此管柱Μ 200 ml之啟始緩衝液清洗之，而後 Μ遞減直線（NH4>2S04梯度（溶於〇.1 Μ磷酸鉀媛衝液pH 6.0> 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

7 469293 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（5 ) 沖提之，每10 ml為一部分收集並分析Hnl之栝性，捋具有 Hnl活性的部分混合收集之。 凝膠層 將一 Biogel P150之管柱（26X34公分，Biorad, Hercules ,加州）以10〇8^之磷酸鉀緩衝液9116.5平衡之，將含酵素 之溶液在載入管柱前Μ超濾法（凝膠極限為10,000 Da, Aeicon Inc., Beverly, ΜΑ)加Μ澳缩，随後在室溫下以 100 mM之磷酸鉀縷衝夜pH 6.5進行沖提，並收集每一部分 (6 al>，Μ此純化辦法所得到的Hnl蛋白質以SDS聚丙烯醯 胺膠體電泳可得一値條帶其分子童爲30 ± lkDa，且其 比活性為19 Hl/mg。 Η»丨活件^分析

Hnl之活性可藉由在，PH 5.0下自外消旋扁桃睛 形成苯甲醛而測得，將50 μΐ之酵素溶液與900 μΐ» 50 mM 之榑様酸鉀缓衝液，PH 5.0温合*而栝性分析可藉由加入 100 μΐ之基質溶液（37.5 mM扁桃睛溶於10 bM榉横酸鉀緩 衝液PH 3.5，每天新鮮配製 >而两始測定，且吸光度在280 na時會上升（M基質溶液未加酵素者之測定值為參考值）， 在此吸光度停留5分鐘，〗U表示在此情況下每分鐘自扁桃 腈催化轉換1 μ«ι〇ΐ的苯甲醛所需之酵素量。 第2實例 自巴西橡樹中製備一表現cDNA之基因庫 自Graz大學之植物圔取樣10年樹齡的巴西橡樹嫩蒱， 並 Μ 檫準方法製備 aRNA<Ausubel at al·，Current Protocols 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 8 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 16 9 2 9 3 A7 B7 五、發明説明（6 ) in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Inter- science, New York, 1990〉利用Zap-cDNA 合成組及 Gigapack II Gold Packaging Extract 製備 cDNA基因庫（Stratagene Cloning Systens, La Jolla, CA, U.S.A)，並依所附之操作手冊方法操作之。 第3實例 分雔一傾重組質體其所表現之蛋白質可與抗巴西橡樹 之羥基腈裂解酶抗血清產生免疫交互作用。 將來自cDNA基因庫中的約100,000個噬菌體，利用多 株抗-Hnl抗血素（兔子）之棟準方法進行免疫篩選採討，而 特定结合抗體可藉由碱性磷酸酶及呈色基質NBT(四唑硝基 藍）/X-磷酸鹽（5-溴-4氯-3-B5I哚磷酸鹽；4-甲苯胺鹽>測 定条統而偵測（Boehringer Mannheim Biochemica, Mannhein ,PRG)。將依據由’’Uni-Zap XR 栝體内切除 pBluescript" 之操作方法所得到的正反應的單株噬菌體揷入片段轉移到 適當的重組載體中（pHNL-100)。（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, U.S.A.)，其cDNA揷人片段爲 1100 bp。將pHNL-100轉型到S0LR糸大腸桿菌中（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, U.S.A)，其可藉由 1 mM IPTG之誘導而測得Lacz-Hul融合蛋白，該蛋白可表現抗-Hnl 抗血清之免疫活性，其分子量約30〜32 kDa，且在細胞質 蛋白質部分可測得羥基睛裂解酶之活性為0.035 Ϊϋ/mg蛋 白質。所有的分子生物技術均依據Ausubel等人之方法 (Current Protocols in Molecular Biology, Greene 本纸張尺度咖㈣跡縣（CNS )峨格（2Ι〇Χ297讀） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

)69293 A7 ' B7 五、發明説明（7 )

Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1990)。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 第4實例 定序來自巴西橡樹之cDNAH段並利用PCR方法選殖全 長之cDNA» 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 DNA定序是依據Sanger等人之鏈終止方法測定之（Sanger etal., PNAS, 74:5463-5467, 1977)並利用 DyeDeoxy Terninator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosysteas Inc., Foster City, CA, U.S.A.)及自動 DNA 定序儀 373A (Applied Biosystems)定其序列。由啟始序列之結果可知 pHNL-100質體含有一個不完整的cDNA揷入片段，而在5’匾 域缺少的部分可依下列描逑方法加K镇補：從巴西橡樹之 cDNA庫中分離噬菌體DNA，並Μ此為二步驟PCR方法之模版 ，且配合二條基因專一性之引子（引子1 : CCTCCAAGAACGT CAACAAG:引子 2 : CATCAAATGAGCCAATCTCC及一條載體專 一性引子（Τ3 : AATTAACCCTCACTAAAGGG)PCR第 1 循環：只 有引子1及40 oig cDNA基因庫（巴西橡樹）DNA ; PCR第2循 環：引子2及T3及1/10體積取自PCR第1循環之產物做爲 DNA模販。PCR第2循環所得到之DMA產物MEcoRI及Styl切 割，再將切割片段選殖到PHNL-100質體（MEcoHI及Styl切 割）之適當區域中*含有揷入片段之構築稱之為PHNL-101 並加以完全定序。 由DNA序列分析證明在第1位置上之AGT為開放可讀框 之啟姶點，而在第772位置具有TGA之中止密碼，該序列可 本紙張慮用中國國家標準⑽SU爾（2戲赚餐） — 經濟‘部中央標準局員工消費合作社印製 6 9 2 9 3 A7 B7 五、發明説明（8 ) 編碼一値29,227 Da之蛋白質，此蛋白質之大小與分離自 巴西橡樹葉片之羥基腈裂解酶（Hnl)之分子量相近*编碼 該蛋白質的DNA序列定義為巴西橡樹之hnl基因<cDNA>。 第5實例 藉由在大腸桿菌中過度表現巴西橡樹hnl基因<cDNA> 而製備羥基腈裂解酶。 因選殖技術之理由必須導入新的切割點*故在啟始密 碥位置（位置1 >及終止密碼（位置783)分別M PCR技術導人 Ncol及Hind III之切點（邸M PCR片段取代原來該區域之片 段），二者所使用之模版為PHNL-101質體的DNA。 在 3’-匾域：PCR具有 P51-HX 引子（CCGCTCGAGAAGCTTCAAAGA AGTCAATTATAG)及 P5 卜3, 1引子（CACGCTTCTGAGGGAAAAT)將 PCR所得到之DNA產物以Xhol及Celll切割，並將之選殖到 質體？11仏-101(具有\11〇1及（：6111切點）中所構築之質體稱 為PHNL-102。

5’-區域：PCR 之引子為 P5 卜 EN(GGAATTCCATGGCATTCGC 所得到之DNA產物K EcoRl及Sty I切割並將Η段選殖到質體 PHNL-102(具有EcoRI及Styl切點）中，所構築之質體稱爲 PHNL-103壶以定序方式檢定之。 將PHNL-103中Ncol-Hindlll片段遵殖到大腸捍面之表. 現載體 pSE 420中（Invitrogen Corp.·，San Diego, CA， U.S.A.)，所構築之質體pHNL-200H定序方式檢定之並轉 型到大腸桿菌ToplO·品条中（Invitrogen Corp., San 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐> ' -11 - (請先間讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

..S 6 9293 A7 B7 五、發明説明（9 )

Diego, CA, U.S.A.)0 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 選擇一個適當的轉型體培養於100 ml的2倍YT培養基 中（10克/升NaCl，10克/升酵.母抽出物，16克/升Bacto tryptone)並添加100 mg/1之氨苄青蚕素鈉鹽，將之置於 一振盪三角瓶中於37¾及160 rpni下搌盪培養至光學密度 0DB〇ll = 0.5*添加1 mM之IPTG(異丙基/3-D-硫代半乳糖苷> 以誘導蛋白質的產生，再添加1 %之蒱萄糖後同樣在此條 件下連嫌培養3小時*隨後Μ離心方式收集細胞並添加4 ml 之破壞緩衝液（50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.4，1 mM EDTA[乙 二胺四乙酸]，1 mM PMSF [苯基甲基硫醯氟化物]，5 %甘 油），於冰浴中冷卻，並K起音波振碎儀（Braun Labsonic 2000)於45瓦下搌籃3分鐘Μ破壊細胞，將破壊之溶液Μ Sorvall SS-34之離心迴轉軸及Sorvall RC-5型離心機於4 C，27,000 g下離心15分鐘Μ分離可溶與不可溶部分。可 溶解部分含有羥基睛裂解酶之栝性<0.15 U/ng蛋白質）， 利用SDS-聚丙烯酿胺膠體電泳及西方吸漬法分析可溶解與 不可溶之蛋白質，證明在有栝性之可溶解部分只產生1 % 的異質形免疫活性Hnl蛋白質而在不可溶的部分，其以不 活化之”包含體”形式存在，並具有99%的免疫活性Hnl蛋 白質。 不溶解部分的蛋白質可藉由添加20 ml之去原性緩衡 液（3.5 Μ尿素，0.1 M Tris, pH 8.0)而溶解之，再K離 心方式（27000 g4C 15分鐘）去除不溶物。溶解的蛋白質 Μ多重步驟進行透析，首先於4TC下以缓衝液1 (50 πιΜ磷 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Α4規格（210父297公焱） -12 - 12 A7 B7 469293 五、發明説明（ίο) 酸鉀pH 7.4, 1 raM EDTA)透析5次，以此法所製備之可溶 性且復原之蛋白質其HnUb活性為0.8至1.4 IU/mg蛋白質 Ο 第6實例 藉由在糖酵母菌中過度表現西巴橡樹hnl基因（cDNA) 而製備羥基睛裂解酶。 因選殖技術之理由，必須將已被Hindlll直線化的質 體與 B/E適合接頭（AGCTTGAATTCGGATCC; AGCTGGATCCGAATT CA>連接，因而在pHNL-103質體之Hindlll位置上形成二但 新切點（EcoRI.BamHI)該構築體稱為pHNL-104 *並Μ定序 方式檢定之。 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 將hnl基因包含BanHI片段，自質體pHNL-104上切割下 來並選殖到酵母菌表現載體P«A91中（Kingsman et al., Methods in Enzymology, 185:329-341，1990>，該載體 已被Bglll直線化。該構築質體稱為pHNL-300，並M定序 方式檢定之*隨後k進一步轉型至糖酵母菌試驗品条W303 MHill et·, Yeast, 2:163-167, 1986)，轉型體培養於 缺乏白胺酸的最少培養基中（6.7克/升酵母氧基w/o胺基 酸[Difco, U.S.A.]，20克/升葡萄糖，20毫升/升缺乏 白胺酸之疲基酸濃縮物[腺瞭呤1.0克/升，甲硫胺酸1.0 克/升，精胺酸1.0克/升，蘇胺酸15.0克/升，組胺酸. 1·〇克/升*色胺酸1.0克/升，尿噃啶2.0克/升*離胺 酸11.5克/升])，在蛋白質製備上是將細胞培養於含100 11缺乏白胺酸的最少培養其中並置於一有蓋三角瓶内於30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -13 - A7 B7 469293 五、發明説明（11) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) t：及150 rpm之條件下振盪培養至光學密度0D6DD=5.0,再 以離心方式收集細胞，將細胞以5 al之破壞鍰衝液（同第 5賁例）懸浮之 * 並在 Merckenschlager (Braun, Melsungen, FRG> 儀中 Μ 玻璃珠方法"（Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wi1ey-Interscience, New York, 1990) 破壞細胞。於可溶性細胞質部分可測得4.62 Ill/mg蛋白賁 之羥基睛裂解酶活性*具有PMA91之空白質體的酵母轉型 體做為對照組，在對照組中並未測得細胞質的羥基丨胃裂解 酶活性，將K此法所製得之蛋白質水溶液貯存於-20¾， 另一種較可能的長時間貯存法是將產物去除所有低分子量 物質（以蒸餾水於4¾下透析 >或Μ懸浮於水中方式破壊酵 母細胞後（Benchtop 3L，VIRTIS Co·，Inc·, Gardiner, NY, U.S.A.)再進行冷凍乾燥。該酵素樣品再溶於破壊鑀 衝液（同第5實例）時仍可維持100%之活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 此外，從製備的蛋白質水溶液亦能輕易製備高度純質 化的重組Hnl蛋白質，其可以樣品方式*利用如第1實例 所描述之方法而得到醉素製備產物，其在SDS-聚丙烯醯胺 膠體電泳上*只顯現一個30 土 1 kDa之條帶，利用在糖 酵母菌中過度表現以製備重組Hnl，其比活性為22至28 IIJ /mg蛋白質。 第7實例 藉由在Pichia pastoris中過度表現巴西橡樹hnl基因（cDNA> 而製備羥基睛裂解酶。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐） 14 469293 A7 B7 五、發明説明（12) 將PHNL-104質體中帶有EcoRI片段之hnl基因（cDNA)選 殖到己被EcoRI直線化之P. pastoris表現載髌pHIL-D2中 (Invitrogen Corp.，San Diego, CA, U.S.A·)，該構築 體稱為PHNL-400，並M定序方式檢定之。 案主品糸GS115(His4->t轉型體，組胺酸原質營養生 物之篩選及利用甲醇之營養缺殖體之選拔均依據Pi chi a表 現組合糸統（Invitrogen Corp·, San Diego, CA, U_S.A,> 之說明而操作，從20値正反應的轉型體中可偵測到2個產 生高濃度的羥基腈裂解酶之轉型體，製備蛋白質之細胞培 養法則依據Pi chi a表現組合之操作步驟進行，*利用離心方 式收集細胞，並將之懸浮於破壊緩衝液中（同第5實例）使 光學密度0DeDn=50.0並M”玻璃珠方法”（同第6實例）破壊 細胞。如此可在可溶性細胞質部分測得羥基睛裂解酶之活 性為16 IU/mg蛋白質，以此方法所製備之蛋白質可同第6 賁例之方法貯存之亦不會喪失其活性。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 亦可以同第1實例之方法得到高純質度之酵素製備產 物，且在SDS-聚丙烯豳胺膠體電泳上只顯示一條約30 土 1 kDa的條帶，刺用衣^. Pastoris中過度表現而製備Hnl重 組蛋白質其此活性範菌為41至46 IU/mg蛋白質。 第8實例 重組Hnl產物之比較 純質化的Hnl蛋白質製備物K PH 3〜9膠體之等電焦電 泳（Phast System，Pharmacia, Uppsala, Sweden〉或原性 聚丙烯醯胺膠體電泳（7.5¾聚丙烯醯胺，tris/甘胺酸鍰 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 15 469293 A7 B7 五、發明説明（b) 衝液pH 8.0)進行分祈。結果顯示不同製備法所得到之條 帶亦不相同，在等電焦結果顯示，來自巴西橡樹之Hnl具 有一個等電點爲4.1之條帶，而由耱薛母或P. pastoris製 備得到的重組蛋白質其具有2至3個相近的條帶且較靠近 碱性區域，而來自P. Pastoris之Hnl重組蛋白其位置偏移 的情況更為明顯。 在原性聚丙烯醢胺膠體電泳結果上，來自糖酵母菌及 P. pastoris^視重蛋白質表現相似的型式，二者均有二 個非常靠近的條帶，利用西方吸漬法（使用多株抗-Hnl抗 血清）證明二者對Hnl蛋白具專一性。相反的，分析來自巴 西橡樹之蛋白質則共有一個可辨識的擴散條帶。 第9實例 檢定與催化有關之羥基腈裂解酶的必須胺基酸 利用 BLAST 之捜尋模式（Altschul et al., J. Moi. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

Biol. 215, 403-410, 1990)搜尋蛋白質之資料庫（Swissprot, PIR, Genpept}，並利用 GCG套裝軟體程式（Progran Manual for the Wisconsin Package, Version 8, Septeaber 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711)構築多種列排組合並進 行統計分析，所得到之說明如下：來自巴西橡樹之羥基腈 裂解酶可能屬於《//3水解酶摺疊形式結構之一大群（01 Us et al., Protein Engineering, Vol. 5, 197-211,1992) 除具有四级摺昼之特性外，該蛋白質亦具有催化三組體， 該組體為天冬胺酸或緣胺酸或半胱胺酸為三組體核心加上 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16 - ' ' 經濟部中央標準局男工消費合作社印製 6 9293 A7 __B7___ 五、發明説明（ Η) 天冬胺酸/麩胺酸與組胺酸所形成。為證明該電腦預測所 決定的胺基睃亦具有羥基睛裂解酶活性《麩胺酸79»絲胺 酸80 *半胱胺酸81 *天冬胺酸207及組肢酸235)，因而製 備羥基腈裂解酶之突變蛋白質，其在中，在79, 80, 207 及235之位置以白安酸取代而81之位置K絲胺酸取代，該 突變體MPCR方法誘導至pHNL-104質體之含量（參考第6實 例>，為改變突變體中79 , 80及81位置的胺基酸，必須利 用反訊息端引子，具亦包含將用於次選殖的基因專一性Muni 切割點，及載髏專一性引子<T3)(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1 & 2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1990)。利用一種特殊的PCR方法M改變207及235位 置的胺基酸，此必須在訊息方向使用一種磷酸化突變體之 引子，一種基因專一性引子其亦包含次選殖用的Ce III限 制切割點，及另一點載體專一性引子<T7) (Michael S.F., Biotechniques 16，410-412, 1994)，PCR產物之純化及 次選殖之程序均為標準方法，將質體PHNL-105〜pHNL-109 之hnl基因<cDNA>突變體選殖到表現質體pMA91(pHNL-302 〜PHNL-306)中，並依第6實例之方法於糖酵母菌中製備 突變蛋白，檢測可溶性細胞質部分羥基腈裂解酶之活性， 得知五種突變體完全不具酵素活性，由此可知這些胺基酸 直接與酵素活性有關，突變蛋白質之等電焦電泳電或原性 聚丙烯醯胺膠體電泳之移動行為與未突變蛋白質相較亦不 相同（Ausubel et al·, Current Protocols in Molecular 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2!〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 17 A7 469293 B7 五、發明説明（15)

Biology, Vo 1. 1 & 2, Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1990) ° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

Claims (1)

1. 469293 90 Λί4Η秦 ! 丨公 申專利範圍 口 Α8 Β8 C8 D8 第085108400號專利再審查案申請專利範圍修正本修正曰期：90年06月 1種純質之（S)-羥基腈裂解酶，其具有如下所示胺基酸 序列： (-43)^ AAG ACC ACX TAT CCA TAG TAA AGK Αΰλ CAT CAC A^C GCA TTC CCT CXT TTT CTT CTT ATT EAT XCC XTA TCC CftC CCT CCA TCC ATT TCC CAC Haft *1« ph· al·*. ph· v«L l«u 11· tri· thr 11· eye. hi,· 9ly trp' 11· ttp hi.* 61/21 91/31 AAC CTC ϋλλ GCC CXC CTT ΟλΟ OCh CTT CGC CftC JUMS CTT ACT OCK CTC aXC CTT GCA leu ly· pro- l«u l«〇 gXu； λΙλ Xma gly hi* lye vsl. thr Al*; 1·α «ip ϊ«α *ϊλ' αΧα n/ii ACC GCC GTt CAC CCA ACC CM ATT GK GA6 ATT CC6 TCft TTT CAT GAG ΤλΤ TCT GAA CGC gly v*；l cap prio grin 11· grlu glv H·： i^Iy ·；·ί； pih· 4*p glu ty.i" ^lu pro 181/fit 211/71 TTC TTG ACC TTC TTCf CAC CCA CTC CCT CCA CCC GAA AAC CTC ATT CTC CTT GCC GAG AGG 1*ΰ thr ph« ltfU： ^lu cila l«u pra pro gly glu iym v&i lie leu v«l ^iy glu ^41/81 271/91 TGT GCA GCA CTC AAT ATA CCA ΑΦΤ CCT CCT GAT ftAA TAC TCT <SKh AA& ATT CCA GCT GGT cy* gly gly L*u asn. 11# «1«； tie atl« *1& asp ly« tyr eye glu lya lie 丨 1* All al·* 301/101 331/111 CTt TTC CAO ΛΑΤ TCA： CTA ΤΤβ CCA G«C ACC GAa OlC TGC CCX TCT TAC CTC CTO CAT ΑΛβ ν·Λ ph· hi‘纛·η v«i l«u pro mep thr glu hi· dy# pko «*r tyr ν*1 ΐκβρ lyft 361/121 391/131 CTC ATC： GAC CTG TTT CCC GAC TCC AAA GAC ACC AOS TAT TTT AGG TAC ACT ΑΛλ CAT CCC leu met alu vul.jhg pro a«p ^Cp lys *8p thr thr tyr pH· thr tyxi the XyM Λΰρ qXy 421/141 · 4SX/m XAC： CAC ATA XCT CCA TTC ΑΛΛ CTG GCC TTC ACG CTT CTO MO GAA ΑΛΤ TTI^ TXT ACC CTT Xyn. glu 11· thr gly l*u ly« l«u gly pile thr l«u ：1«U' *rgr glu *«n xyr thr l*u 4A1/161 SIX/171 TGC C&T CCT GAG G9A TAT CMk CTC CC6 ΛΑΟ ATC- TtQ ACIV ACC KAG CCA TCA TTA TTT CXA eye ^.l-y prp. glu glu t>yr 9IU itu *1« ly«i im1s l«u thr erg* ly· qI^ nttr 1·γ. ohe alh 541/ldl S7X/19X AAT ΛΤΤ TTK CCT AftC CCft CCK TTC TTC ACT AXG CAA GGT TAC GCA TC& λΤΤ AAA. ftTT JE£S 11« 1·ν «1« Xyft «ref pro ph« thr .ays glu gly tyr giy 9*t £1·^ ly* lyi II·： 601/Ϊ01 63X/2H TKT CTG TCG ACC GKC CfX (SAP <SAA λΤλ TTT ΤΤΛ CCT Ολλ TTT CM CTC TOG CAA； ATA CAA tyr1 vi丨 trp the &·ρ 9lii 麗*七 9_Lu ii· ph* l_u pirci 9ΐύ ph· gin l*u trp gin： 11* glu 69X/21X _____ ......... 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IL-----------政--------訂 i ttf fl I n 1— t— I ,, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TGAGGCTTTTTCTTACTATTAAGTlmGCIMSCAACTATGACTTAATAIiTCTCXCATTTTCXACTeGGAJlTTMieTTGTe CTAAAATAAAGTTGTTTATTOTGTTCXAATTTTTTTlTCAlTTCAA&TCCCACACTCTCCCArtCnTCCACACCCtTT ATTTATATATATAXTCTAACTCTCTATTTAACGCAAACCTACCGCTATTGTCTACCTTATCAtGCTTTTCTTTCAATeA AATMATMAftCTTATTT 〇2. —種純質（S)羥基腈裂解酶，其具可自下述DNA序列衍 生的胺基酸序列：(a) —具有下述核苷酸序列的DNA : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 4 6 9 2 9 3 A8B8C8D8 六、申請專利範圍 1/1 ΑΤβ GCA M«t «1« 61/21 λΑ<ϊ CTC Αλλ CCC (-43}G ΑΑΟ ACC ACA TAT CGA TAG ΤΛΑ AGA ΟΤλ TAT CAT CAG ΑΛΛ 31/11 TTC GCT CAT TTT GTT CTT ATT CAT ACC ATA TOC CAC GGT GCX TCO ATT TCC CAC ph·扈l·* hiai ph* leu il· hi· thr il* cy« hi· .gly 秦1« trp ii* trp hi· 91/31 CCA OCX »1*' «la *AC CTC Αλλ CCC CTC CtT CAC GCA C« <SOC CfiC λΛβ GTT ACT CCA CXC CAC CTT ly· leu ly· pro» leu 1·ι> giu ·1 義 1·β gly his lye val. ttw «ia· l«u 龜-p l*u 121/41 isa/si AGC CCC GTT CAC CCA AGS ΟΛΛ ATT CMS GAG ATT CCC TCA TIT GAT GAC ΤΚΓ TCT ΟΑΛ CCC e«r gly v<l ；·ϋρ pco 4Γ9 9ln 11« ^lu- glu il· gly «*r pb« «vp glu tyr mmr glu pro 181/61 211/71 TTC TTG ACS5 TTC TTC GftC GCA CTC CCT CCA GGQ CAA AAC CTC ATT CTG QTT CCC? GJU； AGC leu i攀ϋ thi: ph· leu glu &i丨 pro pro giy glu lye vii ile L«u vftl gty glu 24X/S1 271/91 TCST CGA GG^ CTC ΑΛΤ ΑΤΑ GCJi ATT CCT GCT GAT AAA TAC TGT CXA AAG ΛΤΤ CCA GGT CCT cy丨 g]>夕 gly l«u ftsn 尊1邐[1* 暴1% 基 1墨 isftp ly· tyr eye lys iLe al« ·!&； «1« 301/101 331/111 GTT TTC CAC AAT TCA OTA TTG CCA GAG ACC GKQ CkQ TGC CCA TCT TAC CTC QTQ CAT AA6 vaI ph· hie Asn **r l«u pro *ep thr glu Hie eye pro ear tyr vaX v«l- *«p ly» 361/121 391/131 fere ΛΓσ 伽 CTC TTt CCC CAC 伽 AXX 义〇〇九《?你丨17? λ〇&· TAC ACT 畔 CAT GGC I^u οΐύ vaI chc. pro asp- trp lya asp th^- thr tyr ph· thr %yt^ ly« a·^ gly1 421/141 MO CAC ly« il« thr 451/151 AAO CAC ΛΤΛ ACT GGtk TTC AAA CTC CMC. WC AGO CTT CTO ACC CftA AAT ΤΓ^ ΤλΤ. *CC CTT gly l*u lys l«Kt gly thr 1·α Ima glu *»n lmi tyr thr l«u TGC CGT CCT CAC GhK TAT CMi~ CTO CCS AUG ATC TTG XCA AS« GCA TCA TTA cyA gly vpro glu CAA glu tyr glu l»u *Xa lyv iaasl ]：«u ^tir airg ly· olV. ϋ^Ρ l^u t>h« oln (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 541/ldl &7I/191 ΑΛΑ ATT ly* il· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ΛΑΤ ATT TTA CCT AAC CCA CCA TTC TTC ACT KAO GAA CGT TAC CGA TGC ATT HifiG n 12· l*u 4l« lye «?9 p<o ;ph« chr.ly* ^lu gly tyr gly mmr He ly* 601/201 631/211 TXT «3TC TCG Xcc CAC CAA GAC <5» ATIt TTT TTA CCT> GliA TTT CM CTC TGC CMt ΧΤΛ ΟΛΑ tyr ν·1 trp the 廛·ρ glzt 4βρ glu il_ ρτό glii ph· gin l-ti trp glit il翁 «61/221 69I/22X |AC TAT λλλ CCA ΧΛ〇 CTT TAT ΑΛ0 GT.C GAA 0<JT 08^ CAT CKT ΑΑΛ Tt<3 CAC CTT ACA «•n tyr ly« p^o »np iy· val tyr ly* v»l gt« gly gly hi* ly· Xe« tnr 721/541 7S1/351 ▲ XAO ACT AAC GAG XTC OttT ΟΛΑ ΛΤΤ CTC CAX GAO CTC CCT CAT ACC ΪΑΤ HAT ΤβΑ CTT CTT ly· t；hr iy勝 oln il_ al· αΐύ LI·· l«u aln olu vaL- *1· *»p the tyr a«n OFA· CTTACTXTTJttCtXTCCCAeCAACTATCflGtTAATAATCTCKCATTrTCAACTGGOXATTAAGTTGTC CtrTATTCTGTtCTAAli!,U：.T，TTn〇VtTTCAAaTGCCACACTCTCgCAC'G；CtT.TCCACACTCtTT ATATAATGlAXGTCTCTATTTAAiEiG〇AAACCTACCCCTATTCTCTAGCTTATCA*K3CTIXTCTTTCAATGA iCtTKTTT1 (b) —種與（a)中之DNA完全互補的DNA ;或 ^ (c) 一種為（a)或（b)中之DNA的簡#性核苔酸序列。3. —種用以編碼（S)-羥基腈裂解酶的DNA序列，其具有： (a)—如下所示之核苷酸序列：

   -2- ^紙張尺度適β中國國家標準仰⑽4規格（21〇 χ 297公釐） 469293 A8 B3 C8 D8 六、申請專利範圍 (，43>G AMS ACC TAT CCK TAG TAX AGA Αβλ TAT CAT CAC TTC. CCT CAT TTT CTT CTT ATT CAT RC^ATA ph_ 巍1 巍 hi* ph·· vkl l饞u hi· ttir ii· 91/31. AAA cec CIC CTTCCA CTT <SGC CAC λλβ ly鼸 pra l«u i鲁u glu 暑 1猶 1 翁u giy )^· ly霉 — 1S1/51 GTt GAC CCA AG6 CAA ATT GAG GAG ATT GGG v»l Α·ρ pro 4Γ9 glh il* ^lu qlu II· gly , aii/71 ACG TTC TTG GAC CCA CTC CCT CCX GCC QAA ttir lau glu 暴l丨 leu pro pro gly 9^u GGX CTC XAT ATA GCA ATT CCT GCT GRT^wIk 9ly l«u «sn lie «1«. i.1· «la Mlk asp lys 331/111 CAC AAT XCA GTA Τ7ΰ CCK GAC ACC GXG CAC hi« ash *«r val l«u pro i邐p thr giu iti· CAti CTC TTT CCC CXC TGG KAH CAC xcc^ila alu vai^ phc pro 丨丨p; trpi ly· a»p thr thr： TCC CAC GGT CCA TCC ΛΤΤ TGG CAC cy« gly 麄丄鑫 trpi il* trp βΤΤ ACT CCX CTG CAC CTT CCA GCX vkI thr «1« l«u A*p l«u al& Ala TCA TTT CKT QAG TAT TCX GAA CCC «•r. ph· asp $Iu ty.r ,**r glu pro AAO GTG ATT CTG GT7 GGC GAG AGC lys val 11« L«.u v«l ^ly glu sar TAC TCT CXX KKQ ATX OCX CCT GCX tyr eye ,9lu ly廉 ile lie :巍mi* TCC CCA TCT TAC CTC CTC OAT AAC eyw pro a«r tyr val v«L 廉廉p ly· TAT TTT *C^ TAC ACT ΛΛΛ CAT CCC tyx ph· thr tyr the lyv asp gly 421/141 AAC. CAC AAG. 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AAr ATT ΤΤλ QCT AftQ CGA cat tie TTC ACT XAG GAA ear TAC GCA TCG ATT XAG ΑΛΚ ATT Λ·η 11» L*tf 義1γ* «rg p丨o 笮h· thr .办《 gill gly tyr 窄iy **r ile 肅 ly* il*. 631/211 ^一 cct pco glu p1t« 9I11 <:r|> .fin £1« 9XU 691/231 601/201 ΤΛΤ OTG TOG ACC GAC CKX CAC CAA ΑΤΑ TT® tTA CCt QM, TXT Ott CTC TCC CAR ΑΤΑ ΟΧΛ tyr v*l trp thr *ep asp ^lu： ii« ph· 1·α 6S1/221 9JiC tht ΑΑΛ ffCX <3lkC XKG GTT ΤΛΤ KAG OTQ «ΚΑ <K8T CC^ CKT CXT fUUI TTC CAC CTt AC» asn tyr lye «κρ ly* v«l tyr ly« V*1 glu gly gly hi* ly» l«u glitt Ι^βμ thr 721/241 ΧλΟ ACT ly·. thr ------------..,.表--------訂---------線.../ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) λλΰ GAS ATC GCT CAA ATT CTC CAX GAO^G ly· oln tl* ala <alu Π· lmti tiln nlu y σΓΤΓττι ΛΤλΑΑΰ： •TAATCTM •CTTATTT SI； ΟΤβ GOT CAT ACC TM* AAT ΤβΑ CTT .CTT val ala ««pi thr tyr »«ri raTTXCTATTfcXCXXWCCAGCAACTATOXCtTAATAATCTCACATTlTCaACTGGCAXnfAAGTTGTO 3ΤΤβΤΤΤΑΤΤ0ΤβΤίσΤΑΑ.ΤΓΓΤΤΪ'i i TCATTTGAAaTCGCACAcrCTCCCACCCTT.TCGACACXCtrr ATTTATATAtXTAXTCtXACTCTCTXrrTAACGCAAAOiTAeCGCXATTCTCTAiCTTATCATCCTXTTCTTTGRAtCA TCA<3G< 5. —種重組型蛋白質，其係以如申請專利範圍第3項之 DNA序列藉由異源性奉現來製備。6. 如申請專利範圍第4或5項之重組型蛋白質，其係用以 製備（S)-氰醇。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格<210 X 297公釐） 丨修正 —、统 申請曰期 丨丨 案 號 類 別 b (以上各櫊由本局填柱) ：：Λ. c A4 C4r f ____ ___ j第8麵。。號專利説明書= 呈分離且純質形式之（s)-羥基腈裂解酶 469293 期：87年4月 中 文 發明# wgmr IfflialH 稱 英 文 (S)-HYDROXY-NITRILE-LYASE IN ISOLATED AND PURIFIED FORM 姓 名 國 籍 Ο)曼哈德*哈布拉奇爾 (2)麥克♦史卡爾 ©海爾姆特♦史奇瓦伯 ⑷艾爾弗列德M.海恩 ©賽普·可爾溫 奥地利 钧赫弗列德•葛蘭格爾 裝 發明 住、居所 ⑴奧地利葛拉Η ®奥地利葛拉玆 (3)奧地利葛拉Η ④奧地利葛拉玆 (5)奥地利葛拉玆 钧奧地利葛拉玆 慕格拉本街45號 富爾貝奇街19號 瑪瑞古倫爾街93號 史特勞酋街24號 卡内里街12/42號 阿格諾特街23號 訂 姓 名 (名稱） 奥地利商·精密化學奥地利股份有限公司 經濟部中央梯準局貝工消費合作社印裝 國 藉 奧地利 線 ==、申請人住、居所 (事務所） 奧地利林Η ·聖彼得街25號 代表人 姓 名 ⑴波雷克⑵賀德曼 本紙張尺渡逋用中國國家榇準（CNS) Α4規格（2丨0X297公釐） 1 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 年月g知:正I 4 6 9 2 Μ 8. Μ 補充 _______Β7 五、發明說明（i) 利用生物性催化劑來協助化學反應的進行已逐漸重要’ 特別是一些應用領域，通常是一些標記的酵素，強調其可在 反應中將二個鏡像物其中之一與非對稱或原非對稱的組成分 子相轉換之優良特性。 一種被利用的酵素爲源自於巴西橡樹抝 的（S)-羥基腈裂解酶(Hnl)，其不只可將醛或酮與HCN或HCN 供給者催化形成芳香族的氰醇亦可催化形成脂肪族氰醇(ΕΡ_ Α-0632130>»由於無法由其他的（S)-羥基腈裂解酶，諸如得 自栽培種高粱（办/^⑽WcWor)的該酵素（Tetrahedron Letters, 31: 1249-1252, 1990)來製備脂肪族（S)-氰醇，故此方法顯得 非常重要。 以往所熟知的Hnl是藉由Selmar之方法（Physiologia plantarum 75: 97-101，1989)由巴西橡樹的葉片中製備得到， 且其分子量爲46 kDa (J.E. Poulton in: Cyanide Compounds in Biology [Ciba Foundation Symposium 140], pp 67-91, 1988) 1 但利用此法所獲得的酵素不夠純質故無法製備專一性的抗一 Hnl抗體或決定Hnl蛋白質之胺基酸序列，其他常用的層析法 純化步驟亦無法成功的得到該純質的Hnl的酵素。而利用離 子交換法以氯化鈉梯度沖提所得到的純質酵素，在管柱沖提 液中卻無法測得Hnl之活性，只有在使用硫酸銨取代傳統上 所用之氯化鈉進行沖提，才能成功的分離到該酵素，本發明 即是關於一種純質且分離型式的（S)-羥基腈裂解酶。 利用本方法所得到的純質且分離的Hnl，其分子量爲30 ±lkDa，其比活性爲19 IU/每毫克蛋白質，並包含有 本紙張尺度適用ΐ國函家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------------^-----r---訂---------線 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁》 46 92 9 3 五、發明説明（2 )

   下列的部分胺基酸序列： 部分序列1 :白胺酸-甲基胺酸-麩胺酸-纈胺酸-苯丙胺酸 _脯胺酸 部分序列2 :白胺酸-絲胺酸-白肢酸-苯丙胺酸•麩胺醯酸 -天冬胺醢酸- 部分序列3 :麩胺酸-異白胺酸-丙胺酸-羝胺酸-異白胺酸 -白胺酸-麩胺醯酸-麩胺酸-纈肢酸-白胺酸- 當反轉錄巴西橡樹之J«RNA後卽可選殖一個hnl基因的 cDNA，其具有下列的核基酸序列，而具衍生的Hnl蛋白質 之胺基酸序列亦列於核苷序列之下，而由Hnl蛋白質所得 到的部分序列則以盡線部分表示。 (-43)G AOC ACA TAT CGA TAG Τλλ AGA CTA ΤΛΤ CAT CAG (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1/1 ATG CCA TTC CCT Het 矗1& phft 瓤 61/21 AAC CTC 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 rc Αλλ ccc lye l«u lye pro 121/41 ACC CCC GTT GhC eer gly «ap iai/61 TTC TTC ACG TTC l*u leu thr pht 241/81 TCT CGA CCA CTC eye gly gly l*u 301/101 CPT TTC CAC AAT val phe hi· aen 361/121 CTC ATG GAG CTC leu met οΐυ val 421/141 hAG CAC ΑΤΛ ACT lye 9IU 11* thr 461/1&1 TGC CGT OCT GAG eye gly pro glu 541/181 AAT ATT TTA CCT 11· leu 蠹i纛 31/11 CAT TTT CTT CTT ATT CAT ACC KTk TCC CAC COT GCA TCC ATT TCG CAC hi塞 ph* leu ile hi· thr ey· hi« $ly ftlA trp ίΛ« trp hi·· 91/31 CTC CTT GAG GCA CTT CCC CAC AAG GTT ACT CCA CTC GAC CTT GCA GCA i_u leu 9IU «1« leu gly hie lys v篡1 thr AlA leu ttdp leu &la «1« 1S1/51 CCA AGG CAA λΤΤ GAG CAC ATT CGC TCA TTT GAT GKG ΤΛΤ TCT GAA CCC pro trg ςΐπ il· gLu glu il· gly ser ph· ««p glu tyr ««r glu pro 211/71 TTC GM CCA CTC CCT CCA GGC GJJi AAO GTO ATT CTG GTT CCC CAG ACC i籲u αΙα λβιι pro pro gly 9I11 Xye val ile ieu v&l giy glu 9.r 271/91 ΛλΤ ΑΤΑ CCA ATT CCT CCT CAT ΛΑΧ TAC 7GT CAA AAC ATT GCA CCT GCT aan ile «1« il· 4!« Alft *ep ly« tyr cys 9IU lye ile »}.« aIa ala 331/111 TCA GTA TTG CCA CAC ACC GAG ChC T6C COi TCT ΤλΟ CTC GTG GAT AAG ••r val leu pro *sp thr glu hi· ey· pro a*r tyr val v»l ·βρ lye 391/131 TTT CCC CAC TCG AAA CAC ACC ACG TAT TTT ACG TAC ACT λΧλ GAT GCC phe 取夺 asp trp lye «βρ thr thr tyr phe thr tyr thr ly» Asp gly 451/151 ACG CTT C。、TTG AAA CTG GCC TTC ACC CTT CTG AG。CAA AAT 1TA TAT ACC CTT gly leu lye l«u gly phe thr leu l«u arg glu Αβα leu tyr thr leu 511/111 CAA TAT 0ΑΛ CTO CCC AAC ATG TTC ACA MO ΑΛβ ΰβλ TCA ΤΤΛ TTT CAA glu typ giu l«u 應 1龜 ly· met 1m tbr ly» qlv l^u phe gin 571/191 ^ AAC CCA CCA TTC TTC ACT AAG βλΛ GGT TAC GCh TCG ATT AAG AAA ATT lys «rg pfo phe ph« thr .ly» 9I1· gly tyr gly ·βΓ ίΛβ iy· ly« il· 601/^01 ΤλΤ QXG TCG ACC tyr vsl trp t.k\t 631/211 GAC CAA GAC GAA ATA TTT TTA CCT βλλ TTT CAA CTC TCC CAA ATA GhX ftsp 9I11 mep gXu il« ph· leu pro 9lg ph· gin i*u trp 9I0 9^u 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4规格（210X297公嫠）

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   齋萌親明（3 ) 6 92 9 3 A7 B7 661/221 691/231 ·. AAC TAT ΑΑΛ CCA CAC AAO CTT TAT fJiO CTC «ΛΛ COT GGS GAT GXT AM TTC CAC CTT ACX “n tyr ly· pro Mp ly· v*l tyi* ly· v·]» gU gly gly mj» hi· ly· 1_ia gin leu tbr 721/241 7Sl/2Si ΛΑδ ACT AAG CAC ATC CCT CM ATT CTC CAA CAC GTG CCT CAT ACC TAT ΑΛΤ TCA CTT CTT Xym thr lye Pin <IW ·1· olu Lla 1看u ΰίη olu val ala Α·ρ thr tyr a«n OPA TGACGCTTTTTGTTACXATTXACTATCCGACCAACTATGAirrrAATAATCTCACXTTTTCAAGTCCCAXtTAACTrGTC CTRAAATAAACXTGTirJITTCTCTTCTAATl 111 i i 11<-ΛΤΤΠίΑΙΚ；ΤΡ〇ΟΛ€Λ<#ΤϋΤ〇σΚΛ£ΡπΤΤ〇ΰΑ〇Α〇ΤπΤΤ ΛΓΤΤλΤΑΤΑΓΛΤΑΛΤ HTCTAAGt ΓΑΤΤΤ r〇iTTtCAJU；TC»SGACACTCTCCCACCCTTTCC CCTACCCCTATICTCTACCTTATCATCCTTTTC 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 該cDNA包含有完整的hnl基因编碼匿域，並具有一個 2J5锢多胜呔的開放可讀框（open reading frame}，由DN A 序列所決定的胺基酸序列编碼之蛋白其計算結果其分子量 為）9,227 Da。 本發明亦關於一個可K编碼<S>-羥基睛裂解酶的DNA 序列*或在编碼羥基睛裂解酶之區域與此序列有高於85% 之相同性。其可自mRNA反轉錄而得到，而cDNA是藉因在各 種不同案主體内異源性表現來獲得該酵素的基礎。 本發明也關於一種重組蛋白質*其可藉由在適當的徹 生物，最好為真核撒生物*異源性表現來自巴西橡樹之hnl 基因（cDNA)而裂備。 Hnl蛋白質己可藉由在真核微生物中，諸如糖酵母菌. 或卩1(：111&?331〇1"丨3異源性表現巴西橡樹的11111基因而製備 ，此有別於自巴西橡樹中分離天然的Hnl蛋白質，最大的 特戡在於重組Hnl蛋白質之比话性明顯較自巴西橡樹分部 而得之天然蛋白質之比活性爲高*其差異亦可藉由蛋白質 的電泳結果加以區分，不論是等電焦電泳或原性聚丙烯醯. 胺膠體電泳，純化的重組Hnl蛋白質與天然Hnl蛋白質其條. 帶之位置均不相同，此被認爲是因植物髏與微生物中其轉 譯後之修飾作用不同所致，且重組Hnl蛋白質之比话性較 本紙張尺度逋用中國國家標率（CMS ) A4规格（210X297公釐） {請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· 6 ;q 2 9 1ί 修正929和署補充 Α5Β5 四、中文發明摘要（發明之名稱··呈分離且純質形式之（S)-羥基腈裂解酶本發明是關於源自於巴西橡樹之呈分離且純質式之（S) -羥基腈裂解酶，論碼該酵素的DNA序列，且其胺基酸序列 與製備具有S-羥基腈裂解酶活性之蛋白質的方法。 (請先聞讀背面之注項再填寫本頁各欄) •裝· 英文發明摘要（發明之名稱 r (S)-HYiDROX^i>nTRlL：E:Li/^l AND PURIFIED FORM -訂 (S) -hydroxy-nitrile-lyase fromifevea brasll±Gnsd.3 in purified and isolated form, DN& sequence which codes for this enzyme/ and its amino-acid sequence and process for the production of a protein with (S) -hydroxyrnitrile-lyase activity· i線 經濟部中央嫖準局員工消費合作社印製 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） 469293 90 Λί4Η秦 ! 丨公 申專利範圍 口 Α8 Β8 C8 D8 第085108400號專利再審查案申請專利範圍修正本修正曰期：90年06月 1種純質之（S)-羥基腈裂解酶，其具有如下所示胺基酸 序列： (-43)^ AAG ACC ACX TAT CCA TAG TAA AGK Αΰλ CAT CAC A^C GCA TTC CCT CXT TTT CTT CTT ATT EAT XCC XTA TCC CftC CCT CCA TCC ATT TCC CAC Haft *1« ph· al·*. ph· v«L l«u 11· tri· thr 11· eye. hi,· 9ly trp' 11· ttp hi.* 61/21 91/31 AAC CTC ϋλλ GCC CXC CTT ΟλΟ OCh CTT CGC CftC JUMS CTT ACT OCK CTC aXC CTT GCA leu ly· pro- l«u l«〇 gXu； λΙλ Xma gly hi* lye vsl. thr Al*; 1·α «ip ϊ«α *ϊλ' αΧα n/ii ACC GCC GTt CAC CCA ACC CM ATT GK GA6 ATT CC6 TCft TTT CAT GAG ΤλΤ TCT GAA CGC gly v*；l cap prio grin 11· grlu glv H·： i^Iy ·；·ί； pih· 4*p glu ty.i" ^lu pro 181/fit 211/71 TTC TTG ACC TTC TTCf CAC CCA CTC CCT CCA CCC GAA AAC CTC ATT CTC CTT GCC GAG AGG 1*ΰ thr ph« ltfU： ^lu cila l«u pra pro gly glu iym v&i lie leu v«l ^iy glu ^41/81 271/91 TGT GCA GCA CTC AAT ATA CCA ΑΦΤ CCT CCT GAT ftAA TAC TCT <SKh AA& ATT CCA GCT GGT cy* gly gly L*u asn. 11# «1«； tie atl« *1& asp ly« tyr eye glu lya lie 丨 1* All al·* 301/101 331/111 CTt TTC CAO ΛΑΤ TCA： CTA ΤΤβ CCA G«C ACC GAa OlC TGC CCX TCT TAC CTC CTO CAT ΑΛβ ν·Λ ph· hi‘纛·η v«i l«u pro mep thr glu hi· dy# pko «*r tyr ν*1 ΐκβρ lyft 361/121 391/131 CTC ATC： GAC CTG TTT CCC GAC TCC AAA GAC ACC AOS TAT TTT AGG TAC ACT ΑΛλ CAT CCC leu met alu vul.jhg pro a«p ^Cp lys *8p thr thr tyr pH· thr tyxi the XyM Λΰρ qXy 421/141 · 4SX/m XAC： CAC ATA XCT CCA TTC ΑΛΛ CTG GCC TTC ACG CTT CTO MO GAA ΑΛΤ TTI^ TXT ACC CTT Xyn. glu 11· thr gly l*u ly« l«u gly pile thr l«u ：1«U' *rgr glu *«n xyr thr l*u 4A1/161 SIX/171 TGC C&T CCT GAG G9A TAT CMk CTC CC6 ΛΑΟ ATC- TtQ ACIV ACC KAG CCA TCA TTA TTT CXA eye ^.l-y prp. glu glu t>yr 9IU itu *1« ly«i im1s l«u thr erg* ly· qI^ nttr 1·γ. ohe alh 541/ldl S7X/19X AAT ΛΤΤ TTK CCT AftC CCft CCK TTC TTC ACT AXG CAA GGT TAC GCA TC& λΤΤ AAA. ftTT JE£S 11« 1·ν «1« Xyft «ref pro ph« thr .ays glu gly tyr giy 9*t £1·^ ly* lyi II·： 601/Ϊ01 63X/2H TKT CTG TCG ACC GKC CfX (SAP <SAA λΤλ TTT ΤΤΛ CCT Ολλ TTT CM CTC TOG CAA； ATA CAA tyr1 vi丨 trp the &·ρ 9lii 麗*七 9_Lu ii· ph* l_u pirci 9ΐύ ph· gin l*u trp gin： 11* glu 69X/21X _____ ......... TIG CAG CTT ACA tyr iy讎 v墨 1 ^iu gly giy 褰麄於 hl_ ly· l*u gin ]；Ί·λΐ thr 6&1/22I USC TAT Αλλ CCA GhC XAC GTT TAT AAO QTC GOT ΟΟλ HAT CAT asn tyr lys pro iy« v«l 721/241 751/251 λλβ λΰτ AAG GAC ATC GCT 似 ATT CTC CM C3AG 0TC GCT GAT ACC ΤλΤ λλΤ TCA err CTT ly· thr Xya elu 11¾ λ\λ alu LI·- Ita oln alu val ala Mvp thr tyr Α*ή ΟΡλ. IL-----------政--------訂 i ttf fl I n 1— t— I ,, (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TGAGGCTTTTTCTTACTATTAAGTlmGCIMSCAACTATGACTTAATAIiTCTCXCATTTTCXACTeGGAJlTTMieTTGTe CTAAAATAAAGTTGTTTATTOTGTTCXAATTTTTTTlTCAlTTCAA&TCCCACACTCTCCCArtCnTCCACACCCtTT ATTTATATATATAXTCTAACTCTCTATTTAACGCAAACCTACCGCTATTGTCTACCTTATCAtGCTTTTCTTTCAATeA AATMATMAftCTTATTT 〇2. —種純質（S)羥基腈裂解酶，其具可自下述DNA序列衍 生的胺基酸序列：(a) —具有下述核苷酸序列的DNA : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）