DE69928206T2

DE69928206T2 - Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen

Info

Publication number: DE69928206T2
Application number: DE69928206T
Authority: DE
Inventors: Hisashi Tsuchiura-shi Semba
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2019-12-23
Also published as: DE69928206D1; EP1016712B1; EP1016712A3; US6387659B1; EP1016712A2

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende betrifft ein Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyase unter Verwendung einer rekombinanten Hefezelle, in die das S-Hydroxynitrillyase codierende Gen, das von Cassava (Manihot esculenta) abgeleitet ist, eingebracht ist.
2. Beschreibung des Standes der Technik
S-Hydroxynitrillyase, die von Cassava (EC 4.1.2.37) abgeleitet ist, ist ein für die Synthese von optische aktiven S-Cyanhydrinen aus aromatischen und/oder aliphatischen Carbonylverbindungen und Cyanwasserstoffsäure geeignetes Enzym. Die Synthese von optisch aktiven Cyanhydrinen unter Verwendung des Enzyms ist sehr geeignet für die Synthese verschiedener optisch aktiver Zwischenprodukte.
Es war jedoch schwierig, das vorliegende Enzym industriell zu verwenden, da Cassava-Gewebe eine äußerst geringe Menge des Enzyms enthält. Ein Beispiel für ein Verfahren zur Herstellung des Enzyms ist herkömmlich bekannt, welches die Stufen des Züchtens von E. coli, die mit rekombinanter DNA transformiert sind, in welche das von Cassava abgeleitete S-Hydroxynitrillyase codierende Gen eingebracht wurde, umfaßt (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35. 437-439, 1996; Biotechnol. Bioeng. 53, 332-338, 1997). Jedoch hat solch ein Verfahren unter Verwendung von E. coli als einen Wirt mehrere Nachteile, einschließlich einer niedrigen Produktivität des Enzyms und dem Erfordernis, zur Herstellung einer großen Menge des Enzyms teure Antibiotika und/oder ein Induktorsubstrat zu dem Medium hinzuzugeben. Aufgrund dieser Probleme war es schwierig, ein Verfahren für eine effiziente Produktion des Enzyms bei geringen Kosten zu erhalten.
Die WO 97/03204, Hasslacher et al. (1997), Protein expression & Purfication 11, Seiten 61-71, und Hasslacher et al. (1996), Journal of Biological Chemistry 271, Seiten 5884-5891, lehren die Überexpression von aktiver S-Hydroxynitrillyase unter Verwendung von rekombinanter Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, in welche das S-Hydroxynitrillyase codierende Gen, das von Hevea brasiliensis abgeleitet ist, über einen integrierenden Hefeexpressionsvektor eingebracht wurde.
Trummler et al. (1998), Plant Science (1998) 139, Seiten 19-27, offenbaren Pichia pastoris als einen Expressionswirt für S-Hydroxynitrillyase, die von Linum usitatissimum abgeleitet ist.
Hughes et al. (1997), Biotechnology & Bioengineering 53, Seiten 332-338, beschreiben die Herstellung und Charakterisierung einer Pflanzen-Alpha-Hydroxynitrillyase in E.col.
Wajant & Pfizenmaier (1996), J. Biol. Chem. 271, Seiten 25830-25834, beschreiben die Identifizierung von Resten von potentiell aktiven Stellen in der Hydroxynitrillyase von Manihot esculenta durch ortsgerichtete Mutagenese.
Hughes et al. (1994), Archives of Biochemistry & Biphysics 31, Seiten 496-502, beschreiben die Reinigung, Charakterisierung und Klonierung von Alpha-Hydroxynitrillyase von Cassava (Manihot esculenta crantz).
Die EP-A-0 969 095 beschreibt (S)-Hydroxynitrillyasen von Havea brasiliensis und Manihot esculenta mit verbesserter Substrateignung.
Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung einer großen Menge von S-Hydroxynitrillyase durch gentechnische Verfahren bereitzustellen.
Nach intensiven Studien waren die vorliegenden Erfinder schließlich erfolgreich bei der Herstellung einer großen Menge von S-Hydroxynitrillyase unter Verwendung von Hefe anstelle der Verwendung von E. coli als einen Wirt für die Expression des von Cassava abgeleiteten S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens.
Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man Hefezellen, die mit rekombinanter DNA transformiert sind, welche aus einem Expressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen, das von Cassava (Manihot esculenta) abgeleitet ist, aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung folgendes:

(1) ein Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyase mit den Stufen, in denen man Hefezellen von Saccharomyces, die mit rekombinanter DNA transformiert sind, welche aus einem Hefeepisomexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen, das von Cassava (Manihot esculenta) abgeleitet ist, aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei die Saccharomyces ein diploider Stamm ist und wobei der Hefeepisomexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des GAP(Glycerol-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase)-Promotors aus der Hefe Saccharomyces besteht, oder DNA, die aus der GAP-Promotorsequenz besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält,
(2) ein Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man Hefezellen von Saccharomyces, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, welche aus einem Hefeintegrationsexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen, das von Cassava (Manihot esculenta) abgeleitet ist, aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei die Saccharomyces ein diploider Stamm ist und wobei der Hefeintegrationsexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des GAP(Glycerol-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase)-Promotors aus der Hefe Saccharomyces besteht, oder DNA, die aus der GAP-Promotorsequenz besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält, und
(3) ein Verfahren zum Herstellen von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man Hefezellen von Pichia, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, welche aus einem Hefeintegrationsexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen, das von Cassava (Manihot esculenfa) abgeleitet ist, aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei der Hefeintegrationsexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des AOX1 (Alkoholoxidase)-Promotors aus der Hefe Pichia besteht, oder DNA, die aus der Sequenz des AOX1-Promotors besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, währen die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält.

Diese Beschreibung umfaßt den gesamten Inhalt oder einen Teil des Inhalts, der in den Beschreibungen der japanischen Veröffentlichungen mit den Nummern 2000-189159, 2000-245486 und 2000-189160 offenbart ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend ausführlich beschrieben.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das S-Hydroxynitrillyase codierende interessierende Gen, das von Cassava abgeleitet ist, zuerst kloniert. Die DNA-Sequenz des Enzyms ist gut bekannt und wurde bereits veröffentlicht (Arch. Biochem, Biophys. 311. 496-502, 1994). Gesamt-mRNA, einschließlich mRNA des Enzymgens wird, aus Cassava-Blättern extrahiert, und cDNA davon wird nach einem herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Das das Enzym codierende Gen wird durch PCR unter Verwendung von Primern, die auf der Grundlage der gut bekannten Sequenzdaten von S-Hydroxynitrillyase-cDNA entworfen wurden, vervielfältigt.
Anschließend wurde eine Expressionskassette konstruiert, indem ein Transkriptionspromotor an einer aufstromig gelegenen Stelle und ein Transkriptionsterminator an einer abstromig gelegenen Stelle des Enzymgens eingesetzt wurde, so daß das Enzymgen, das wie oben beschrieben erhalten wurde, in den rekombinanten Hefezellen exprimiert werden kann, und die konstruierte Expressionskassette wird dann in einen Expressionsvektor eingebracht. Wenn ein Transkriptionspromotor und -terminator bereits in einem Expressionsvektor vorhanden sind, in den das Enzymgen eingebracht werden soll, können alternativ der Transkriptionspromotor und der -terminator verwendet und nur das Enzymgen dazwischen eingebracht werden, d.h. es ist nicht notwendig, eine Expressionskassette aufzubauen. In beiden Fällen können mehrere Expressionskassetten in einem Expressionsvektor vorhanden sein.
Da die Expressionsmenge des Enzyms stark von der Auswahl eines in einer Expressionskassette zu verwendenen Promtotors abhängt, sollte ein geeigneter Promotor ausgewählt werden. Beispiele für Hefepromotoren für eine effiziente Expression des eingebrachten Gens in einer Hefezelle umfassen native Promotoren, wie beispielsweise PGK, GAP, TPI, GAL1, GAL10, ADH2, PH05, CUP1 und MFα1, rekombinante Promotoren, wie beispielsweise den PGK/α2-Operator, GAP/GAL, PGK/GAL, GAP/ADH2, CYC/GRE und PGK/ARE, und mutierte Promotoren, wie beispielsweise Leu2-d. Insbesondere wird der GAP-Promotor bevorzugt.
Jeder der oben beschriebenen Promotoren kann DNA aufweisen, die aus der Nukleotidsequenz eines nativen Promotors besteht, oder DNA, die aus der nativen Promotorsequenz, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, besteht. Deletion, Substitution oder Hinzufügung von Base(n) kann durch Anwendung von irgendwelchen herkömmlichen Techniken, wie beispielsweise ortsgerichtete Mutagenese, erzeugt werden.
Andererseits kann ein Transkriptionsterminator auf der abstromig gelegenen Seite des Enzymgens vorhanden sein, um eine effiziente Beendigung der Transkription zum Erreichen einer maximalen Genexpression zu ermöglichen. Beispiele für solche Transkriptionsterminatoren umfassen ADH1, TDH1, TFF und TFP5.
Wenn die Hefe Pichia als ein zu transformierender Wirt verwendet wird, kann ein Promotor in solch einer Expressionskassette, wie sie oben beschrieben ist, ein solcher sein, der Enzymexpression in einem Methanol verwertenden Stamm in der Hefe Pichia in der Gegenwart einer Methanolkohlenstoffquelle fördert. Ein Terminator in solch einer Expressionskassette kann ein solcher sein, der eine effiziente Transkriptionsbeendigung unter Erhalt von maximaler Genexpression erlaubt. Insbesondere sind der AOX1-Promotor und der AOX1-Terminator bevorzugt.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Hefeepisomexpressionsvektor (autonom replizierendes Plasmid) als Expressionsvektor verwendet.
Ein Hefeepisomplasmidvektor enthält 2μ-Plasmidsequenz, welche nativ für Hefe ist. Der Vektor kann in einer Hefewirtszelle repliziert werden, indem er den Replikationsursprung der 2μ-Plasmidsequenz verwendet.
Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Hefeepisomexpressionsvektor muß nicht auf bestimmte Vektoren beschränkt sein, solange er wenigstens die ORI-Sequenz der Hefe-2μ-Plasmidsequenz umfaßt und in einer Hefewirtszelle autonom repliziert werden kann. Beispiele für solche Vektoren umfassen YEp51, pYES2, YEp351 und YEp352, sind aber darauf nicht beschränkt.
Vorzugsweise kann der oben beschriebene Hefeepisomexpressionsvektor ein Shuttle-Vektor sein, der für eine Subklonierung in die rekombinanten E. coli in E.coli replizieren kann. Besonders bevorzugt können solche Expressionsvektoren auch ein Selektionsmarkergen, wie beispielsweise eine Ampicillin-Resistenzgen, enthalten. Solche Expressionsvektoren enthalten auch ein Markergen, mit dem Hefeklone in Abhängigkeit von ihrer Auxotrophie und/oder Wirkstoffresistenz selektiert werden können, wenn rekombinante Hefe hergestellt wird. Beispiele für Markergene umfassen HIS3, TRP1, LEU2, URA3, LYS2 und Tn903 kan^r, Com^r, Hyg^r, CUP1 und DHFR, obwohl sie darauf nicht beschränkt sind. Vorzugsweise sollte ein Markergen auf der Grundlage des genomischen Typs der für eine Genaufnahme verwendeten Wirts-Saccharomyces ausgewählt werden.
Spezielle Beispiele für den oben beschriebenen Hefeepisomexpressionsvektor zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen einen Vektor, der durch Aufnahme des GAP-Promotors in die multiple Klonierungsstelle des Hefeexpressionsvektors YEp352 des S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens abstromig zu dem Promotor und eines Terminators weiter abstromig aufgebaut ist (bezeichnet als YEp352-GC), einen Vektor, der durch Aufnahme des S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens in die multiple Klonierungsstelle abstromig zu dem GAL10-Promotor in dem Hefeexpressionsvektor YEp51 aufgebaut ist (bezeichnet als YEp51-C), einen Vektor, der durch Aufnahme des GAP-Promotors in die multiple Klonierungsstelle des Hefeexpressionsvektors YE351, des S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens abstromig zu dem Promotor und eines Terminators weiter abstromig aufgebaut ist (bezeichnet als YEp351-GC), und einen Vektor, der durch Aufnahme des S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens in die multiple Klonierungsstelle abstromig zu dem GAL1-Promotor in dem Hefeexpressionsvektor pYES2 aufgebaut ist (bezeichnet als pYES2-C).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Hefeintegrationsexpressionsvektor (welcher in chromosomale DNA integriert werden kann) als Expressionsvektor verwendet.
Obwohl ein Hefeintegrationsplasmidvektor eine DNA-Sequenz (normalerweise eine Selektionsmarkergensequenz) homolog zu derjenigen des Hefechromosoms aufweist, kann er in einer Hefezelle nicht als ein Plasmid repliziert werden. Solch ein Hefeintegrationsplasmidvektor kann in Hefezellen nur verbleiben, wenn ein homologer Austausch zwischen der Sequenz auf dem Vektor, die zu dem Hefechromosom homolog ist, und dem Hefechromosomgen stattfindet, wobei der Plasmidvektor in das Chromosom integriert wird. Das integrierte Gen wird bekanntermaßen auch nicht unter Wachstumsbedingungen, bei denen eine Expression von Selektionsmarkergen wesentlich ist, stabil in der Hefezelle gehalten.
Der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Hefeintegrationsexpressionsvektor ist nicht auf bestimmte beschränkt, solange er eine Integration des S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens, das von Cassava abgeleitet ist, durch den Vektor in das Hefechromosom erlaubt. Z. B. können, wenn sie in das Chromosom von Saccharomyces aufgenommen werden, Hefeintegrationsvektoren, wie beispielsweise pRS303 und pRS304, oder modifizierte Vektoren, die durch Ausschneiden der von Hefe-2μ-Plasmid abgeleiteten Sequenz aus Vektoren, die von Hefe-2μ abgeleitet sind, wie beispielsweise YEp51, pYES2, YEp351 und YEp352, und anschließendes Zyklisieren des Vektors aufgebaut sind, bevorzugt verwendet werden. Vektoren für eine Integration in das Chromosom eines Methanol verwertenden Stammes in der Hefe Pichia umfassen pPIC3.5K, pPIC9K und pAO815, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Hefeintegrationsexpressionsvektoren, wie sie oben beschrieben sind, können vorzugsweise Shuttle-Vektoren sein, die zum Subklonieren in den rekombinanten E. coli-Zellen in E.coli-Zellen replizieren können. Besonders bevorzugt enthalten solche Hefeexpressionsvektoren Selektionsmarkergene, wie beispielsweise Ampicillin-Resistenzgene. Alternativ enthalten solche Expressionsvektoren Markergene, durch welche Hefeklone in Abhängigkeit von Auxotrophie und Wirkstoffresistenz selektiert werden können, wenn rekombinante Hefe hergestellt wird. Beispiele für Markergene zum Einbringen in die Hefe Saccharomyces umfassen HIS3, TRP1, LEU2, URA3, LYS2, Tn903 kan^r, Cm^r, Hyg^r, CUP1 und DHFR, obwohl sie auf diese nicht beschränkt sind. Ein Markergen sollte abhängig von dem genomischen Typ des Wirts-Saccharomyces-Stammes, in welchen das Gen eingebracht werden soll, ausgewählt werden. Beispiele für Markergene für ein Einbringen in die Hefe Pichia umfassen HIS4 und kan^r, obwohl sie darauf nicht beschränkt sind. Ein Markergen sollte in Abhängigkeit von dem genomischen Typ des Wirts-Pichia-Stammes, in welchen das Gen eingebracht werden soll, ausgewählt werden.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Hefe Saccharomyces als ein Wirt verwendet, obwohl der in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Wirt darauf nicht beschränkt ist, solange er solch eine Expressionskassette nach dem Einbringen der Kassette stabil behalten kann. Beispiele für die Hefe Saccharomyces umfassen Saccharomyces cerevisiae der Stämme KK4, Y334, Inv-Sc1 und W303. Des weiteren können sowohl haploide als auch diploide Stämme dieser Wirtshefe verwendet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, obwohl in der Hefe Pichia ein Methanol verwertender Stamm als ein Wirt verwendet wird, die Hefe nicht auf bestimmte beschränkt, solange sie solch eine Expressionskassette nach dem Einbringen der Kassette beibehalten kann. Beispiele für Methanol verwertende Stämme in der Hefe Pichia umfassen Pichia pastoris der Stämme KM71 und GS115. Es können sowohl haploide als auch diploide dieser Wirtshefen verwendet werden.
Gemäß herkömmlicher Transformationstechnik kann rekombinante Hefe mit der Fähigkeit, eine interessierende S-Hydroxynitrillyase zu produzieren, durch Einbringen eines Hefeepisomexpressionsvektors, in den das S-Hydroxynitrillyase codierende Gen, das von Cassava abgeleitet ist, aufgenommen wurde, in irgendeinen der oben beschriebenen Wirte erhalten werden.
S-Hydroxynitrillyase kann durch Kultivieren der erhaltenen rekombinanten Hefe in einem Medium hergestellt werden.
Das Medium kann zweckmäßiger Weise mit Stickstoffquellen, wie beispielsweise Hefestickstoffbasisaminosäuren (Difco Laboratories), essentiellen Aminosäuren und Gasaminosäure, Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glucose, Galactose, Raffinose und andere Sacchariden, oder Alkohol, wie beispielsweise Glycerol und Ethanol, versetzt werden. Das Medium kann auf einen pH-Wert von 4 bis 7 eingestellt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung des Mediums zum Kultivieren von Hefe, die mit Hefeepisomexpressionsvektor transformiert ist, vorzugsweise in Abhängigkeit von dem Selektionsmarkergen auf dem zu verwendenden Vektor verändert werden, um eine Deletion des in der rekombinanten Hefezelle vorhandenen Enzymgens zu verhindern. Z. B. wird ein Medium, das im wesentlichen kein Uracil enthält, für rekombinante Hefen ausgewählt, die mit dem Hefeepisomexpressionsvektor YEp352-GC, bei dem das Selektionsmarkergen URA3 ist, transformiert sind. Alternativ wird ein Medium, das im wesentlichen kein L-Leucin enthält, für eine rekombinante Hefe ausgewählt, die mit dem Hefeepisomexpressionsvektor YEp351-GC, bei dem das Selektionsmarkergen LEU2 ist, ausgewählt.
Vorzugsweise kann dem Medium ein Induktorsubstrat in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Promotor, wenn die Enzymproduktion induziert werden muß, hinzugefügt werden. Wenn z. B. die Promotorexpression durch eine bestimmte Kohlenstoffquelle gefördert oder gehemmt wird, sollte für jeden Fall eine geeignete Kohlenstoffquelle ausgewählt werden.
Wenn die Expression des Enzymgens durch den GAP-Promotor kontrolliert wird, der einer der für die vorliegende Erfindung zu bevorzugenden Promotoren ist, kann jede Kohlenstoffquelle, die von der Wirtshefezelle verwertet werden kann, verwendet werden, weil der Promotor konstitutiv exprimieren wird.
Auf der anderen Seite kann zur Kultivierung von Hefe, die mit Hefeintegrationsexpressionsvektor transformiert ist, ein Medium geeignet sein, das für ein Wachstum der zu verwendenden Wirtshefe ausgewählt ist. Es besteht keine Beschränkung hinsichtlich einer Nahrungsquelle, noch besteht eine Notwendigkeit, irgendwelche Antibiotika hinzuzufügen, da das Enzymgen stabil in den rekombinanten Hefezellen behalten werden kann. Vorzugsweise kann das Medium auf einen pH-Wert von 4 bis 7 eingestellt werden.
Vorzugsweise kann in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Promotor ein Induktorsubstrat zu dem Medium hinzugefügt werden, wenn es erforderlich ist, die Enzymproduktion zu induzieren. Wenn z. B. die Promotorexpression durch eine bestimmte Kohlenstoffquelle gefördert oder gehemmt wird, sollte für jeden Fall eine geeignete Kohlenstoffquelle ausgewählt werden.
Wenn die Expression des Enzymgens von dem GAP-Promotor, der einer der für die vorliegende Erfindung geeigneten Promotoren ist, kontrolliert wird, kann jede Kohlenstoffquelle, die von der Wirtshefezelle verwertet werden kann, verwendet werden, da der Promotor konstitutiv exprimieren wird.
Andererseits, wenn die Expression des Enzymgens von dem AOX1-Promotor, welcher einer der für die vorliegende Erfindung geeigneten Promotoren ist, kontrolliert wird, sollte Glucose vorzugsweise nicht hinzugefügt werden, da sie die Expression unterdrücken/hemmen kann, wogegen Glycerol und Raffinose die Enzymgenexpression nicht beeinflussen. Darüber hinaus kann Methanol vorzugsweise für eine effiziente Expression des Enzymgens und somit für eine Produktion einer großen Menge des Enzyms zu der Kultur hinzugefügt werden, weil er die Genexpression fördert.
Die Zellen werden bei 25 bis 35 °C für mehrere Stunden bis zu 3 Tagen kultiviert, z. B. bis das Wachstum seine stationäre Phase erreicht.
Die rekombinanten Hefezellen, die wie oben beschrieben kultiviert werden, können eine große Menge an S-Hydroxynitrillyase produzieren.
Anschließend kann die S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur gewonnen werden, indem man herkömmliche Enzymgewinnungsmethode verwendet, einschließlich Zelllyse unter Verwendung von zellwandverdauendem Enzym (Zymolyase), Ultraschallbehandlung, Zerstörung unter Verwendung von Glasperlen, Extraktion mit grenzflächenaktiven Stoffen, Selbstverdauung und dem Gefrier-Tau- Verfahren. Anschließend können ungelöste Materialien beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation unter Erhalt einer rohen Enzymlösung, die S-Hydroxynitrillyase enthält, entfernt werden.
S-Hydroxynitrillyase kann aus der rohen Enzymlösung weiter gereinigt werden, indem man irgendein herkömmliches Proteinreinigungsverfahren alleine oder in Kombination anwendet, einschließlich Ammoniumsulfattraktionierung, Präzipitation mit organischem Lösungsmittel, Adsorption an Ionenaustauscher, Ionenaustauscherchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie und Elektrophorese.
Wirkung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein effizientes Verfahren zur Herstellung einer großen Menge von S-Hydroxynitrillyase unter Verwendung von gentechnischen Verfahren bereitgestellt.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung ausführlich anhand von nicht beschränkenden Beispielen beschrieben.
[Beispiel I]
Herstellung von cDNA aus Cassava-Gewebe und dem von Cassava abgeleiteten S-Hydroxynitrillyase-Gen
Gesamt mRNA wurde aus Cassava-Blättern extrahiert. Die extrahierte mRNA wurde als Matrize zum Synthetisieren von cDNA verwendet. So wurde eine cDNA-Bibliothek von Cassava hergestellt. Die folgenden PCR-Primer wurden auf der Grundlage der Sequenzdaten des von Cassava abgeleiteten S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens synthetisiert (siehe Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994).
Sense-Primer: GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT TTT GTT CTG ATT C (SEQ ID Nr. 1)
Antisense-Primer: GGG GTC GAC CTC ACG GAT TAG AAG CCG CCG (SEQ ID Nr. 2)
Durchführung von PCR mit der cDNA, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, unter Verwendung dieser Primer (bei 95 °C für 0,5 Minuten, bei 55 °C für 0,5 Minuten und bei 72 °C für 1 Minute: 35 Zyklen insgesamt) lieferte ein Gen, das dem S-Hydroxynitrillyase codierenden Gen entsprach. Eine Analyse der DNA-Sequenz zeigte, daß es das gleiche war, wie dasjenige, das in der Veröffentlichung (oben) offenbart ist.
[Beispiel II]
Expression des Enzymgens in rekombinanten Hefezellen (1)
Der YEp352-GAP-Vektor, bestehend aus dem YEp352-Plasmidvektor, in welchen der GAP-Promotor und der -terminator in dessen multiple Klonierungsstelle aufgenommen worden waren, wurde zur Konstruktion des Hefeepisomexpressionsvektors YEp352-GC verwendet, indem die cDNA von S-Hydroxynitrillyase, die in Beispiel I oben erhalten wurde, zwischen den GAP-Promotor und den -terminator des YEp352-GAP-Vektors eingefügt wurde. Der YEp352-GC war ein E. coli-Hefe-Shuttle-Vektor, der ein Ampicillin-Resistenzgen, eine von dem Hefe-2μ-Plasmid abgeleitete Sequenz und die URA3-Sequenz, die ein Selektionsmarkergen für die rekombinante Hefe ist, enthielt.
Der Expressionsvektor YEp352-GC wurde zum Transformieren der Wirtshefe Saccharomyces cerevisiae des Stammes Inv-Sc1 verwendet. Ein rekombinanter Klon wurde in minimalem Selektionsmedium ohne Uracil mit der folgenden Zusammensetzung selektiert: Tabelle 1
Die rekombinanten Hefezellen (YEp352-GC-S2), die wie oben beschrieben erhalten wurden, wurden in YNBDCas-Flüssigmedium mit der nachfolgenden Zusammensetzung für 24 Stunden inkubiert, und die Enzymaktivität wurde bestimmt, wie es beschrieben werden wird. Tabelle 2
Zuerst wurde 1 ml der Kulturlösung, welche die rekombinanten Zellen enthielt, zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Anschließend wurden 0,1 ml 0,5 mm Glasperlen zu den gesammelten Zellen hinzugefügt, die anschließend mit flüssigem Stickstoff eingefroren wurden. Danach wurden die Zellen, nachdem 0,2 ml 0,15 M Natriumcitratpuffer (pH 5) hinzugefügt worden waren, durch Rühren zerstört. Die Lösung, die die zerstörten Zellen enthielt, wurde zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, der für einen Enzymaktivitätstest verwendet wurde. Eine Veränderung der Absorption des Überstandes wurde bei 249,6 nm überwacht, während das Enzym ein Substrat (DL-Mendelonitoril) unter Herstellung von Benzaldehyd abbaute. Anschließend wurde die Enzymaktivität anhand der bestimmten Absorption berechnet und in Einheiten ausgedrückt (eine Einheit entspricht der Aktivität des Enzyms, bei der 1 μMol Substrat pro Minute abgebaut werden).
Die S-Hydroxynitrillyase-Aktivität pro ml Kulturlösung, welche die rekombinanten Zellen (Stamm YEp352-GC-S2) enthielt, wurde mit 1,126 Einheiten/ml bestimmt (spezifische Aktivität: 1,33 Einheiten/mg Protein).
[Beispiel III]
Enzymgenexpression in rekombinanten Hefezellen (2)
Eine Expressionskassette wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI aus dem Plasmid YEp352-GC, das wie in Beispiel II hergestellt wurde, isoliert. Auf der anderen Seite wurde die von dem Hefe-2μ-Plasmid abgeleitete Sequenz in YEp351 mit AatII und HpaI daraus ausgeschnitten, und anschließend wurde das gespaltene Produkt unter Erhalt von YIp351 rezyklisiert. Anschließend wurde der YIp351 mit BamHI an seiner Klonierungsstelle gespalten. Der mit BamHI gespaltene YIp351 wurde mit der oben beschriebenen Expressionskassette unter Erhalt des Plasmides YIp351-2XGC (Hefeintegrationsexpressionsvektor), das aufeinanderfolgend zwei Expressionskassetten hintereinander enthielt, legiert.
Dieses Plasmid wurde mit BstXI an seiner Leu 2-Sequenz gespalten unter Erhalt einer linearen rekombinanten DNA, die zum Transformieren der Wirtshefe Saccharomyces cerevisiae vom Stamm Inv-Sc1 unter Erhalt einer Transformande verwendet wurde. Diese Transformande (Stamm YIp351-2XGC-70-55) wurde im YPD-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Glucose) gezüchtet und gleichzeitig hinsichtlich Enzymaktivität getestet, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
Es wurde bestimmt, daß die S-Hydroxynitrillyaseaktivität pro ml der Kulturlösung, die die rekombinanten Zellen (Stamm YIp351-2XGC-70-55) enthielt, 2,15 Einheiten/ml betrug (spezifische Aktivität 1,09 Einheiten/mg Protein).
[Beispiel IV]
Enzymgenexpression in rekombinanten Hefezellen (3)
Der in Beispiel III hergestellte YIp351-2XGC wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und SalI verdaut, um seinen Expressionskassettenbereich auszuschneiden, welcher dann in pRS303 an der Klonierungsstelle aufgenommen wurde, um den Hefeintegrationsexpressionsvektor pRS303-2XGC aufzubauen. Dieses Vektorplasmid wurde mit einem Restriktionsenzym bei ungefähr der Mitte seiner HIS3-Sequenz unter Erhalt einer linearen DNA gespalten, welche dann dazu verwendet wurde, die Wirtszellen, die in Beispiel III erhaltenen rekombinanten Hefezellen (YIp351-2XGC-70-55), zu transformieren. Eine selektierte Transformande (Stamm YIp351-2XGC-S1) wurde in YPD-Medium gezüchtet, wie es oben beschrieben ist, und es wurde auf ähnliche Weise bestimmt, daß die S-Hydroxynitrillyaseaktivität pro ml der Lösung 3,157 Einheiten/ml Lösung betrug (spezifische Aktivität: 1,24 Einheiten/mg Protein).
[Beispiel V]
Enzymgenexpression in rekombinanten Hefezellen (4)
Wie es in Beispiel IV beschrieben ist, wurde eine Expressionskassettenregion, in welcher zwei Expressionskassetten hintereinander eingefügt worden waren, aus dem in Beispiel III hergestellten YIp351-2XGC mit den Restriktionsenzymen SacI und PstI ausgeschnitten und in die Klonierungsstelle von pRS304 integriert, um einen Hefeintegrationsvektor pRS304-2XGC aufzubauen. Dieses Vektorplasmid wurde mit einem Restriktionsenzym bei ungefähr der Mitte seiner TRP1-Sequenz unter Erhalt einer linearen DNA gespalten, welche dann zum Transformieren der Wirtszellen, den in Beispiel IV erhaltenen rekombinanten Hefezellen (YIp351-2XGC-S1), verwendet. Eine ausgewählte Transformande (Stamm pRS304-2XGC-33) wurde in YPD-Medium gezüchtet, wie es oben beschrieben ist, und es wurde bestimmt, daß die S-Hydroxylnitrillyaseaktivität pro ml der Lösung 1,51 Einheiten/ml Lösung betrug (spezifische Aktivität).
[Beispiel VI]
Enzymgenexpression in rekombinanten Hefezellen (5)
Wie es in Beispiel V beschrieben ist, wurde eine Expressionskassettenregion, in der zwei Expressionskassetten hintereinander eingefügt worden waren, aus dem in Beispiel III hergestellten YIp351-2XGC mit den Restriktionsenzymen XbaI und SaI ausgeschnitten. Andererseits wurde die von dem Hefe-2μ-Plasmid erhaltene Sequenz in YEp352 daraus ausgeschnitten, und anschließend wurde das gespaltene Produkt unter Erhalt von YIp352 rezyklisiert. Die Expressionskassettenregion, wie sie oben hergestellt wurde, wurde in den YIp352 eingefügt, um das Plasmid YIp352-2XGC (Hefeintegrationsplasmid), in das zwei Expressionskassetten eingefügt waren, aufzubauen.
Dieses Vektorplasmid wurde mit einem Restriktionsenzym bei ungefähr der Mitte seiner URA3-Sequenz unter Erhalt einer linearen DNA gespalten, welche dann zum Transformieren der Wirtszellen, den in Beispiel V erhaltenen rekombinanten Hefezellen (pRS304-2XGC-33), verwendet.
Eine selektierte Transformande (Stamm YIp352-2XGC-194) wurde in YPD-Medium gezüchtet, wie es oben beschrieben ist, und es wurde in gleicher Weise bestimmt, daß die S-Hydroxynitrillyaseaktivität pro ml der Lösung 3,47 Einheiten/ml Lösung betrug (spezifische Aktivität).
[Beispiel VII]
Enzymgenexpression in rekombinanten Hefezellen (6)
Wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden die folgenden PCR-Primer auf der Grundlage der Sequenzdaten des von Cassava abgeleiteten S-Hydroxynitrillyase codierenden Gens synthetisiert.
Sense-Primer: GGG GGA TCC ACC ATG GTA ACT GCA CAT TTT GTT CTG ATT (SEQ ID Nr. 3)
Antisense-Primer: GGG TAC GTA TCA AGC ATA TGC ATC AGC C (SEQ ID Nr. 4)
Die Durchführung von PCR mit der cDNA von S-Hydroxynitrillyase, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war, unter Verwendung dieser Primer (bei 95 °C für 0,5 Minuten, bei 55 °C für 0,5 Minuten und bei 72 °C für 1 Minute: 35 Zyklen insgesamt) lieferte ein Gen, das dem S-Hydroxynitrillyase codierenden Gen entsprach. Eine Analyse der DNA-Sequenz zeigte, daß es das gleiche war, wie das in der Veröffentlichung (oben) offenbarte.
Die in Beispiel 1 erhaltende cDNA von S-Hydroxynitrillyase wurde in die multiple Klonierungsstelle eines Expressionsvektors für Pichia (pPIC3.5K, Invitrogen) unter Aufbau des pPIC3.5K-cas-Plasmides (Hefeintegrationsexpressionsvektor) eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym bei ungefähr dem mittleren Bereich seiner His4-Sequenz unter Erhalt einer linearen rekombinanten DNA gespalten, welche dann zum Transformieren von Wirtshefezellen Pichia pastoris KM71 bzw. GS115 verwendet wurde. Eine Selektion der erhaltenen Transformanden wurde hinsichtlich ihrer Resistenz gegen das Antibiotikum G418 unter Erhalt von Klonen mit höherer Resistenz durchgeführt.
Die wie oben beschrieben erhaltenen Transformanden wurden in BMMY-Medium (1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton, 10 % 1 M Phosphatpuffer (pH 6,0), 1,34 % Hefestickstoffbasis, 4 × 10^-5% Biotin, 1 % Methanol) gezüchtet und ihre Enzymaktivität in gleicher Weise bestimmt.
Es wurde bestimmt, daß die S-Hydroxynitrillyaseaktivität pro ml der Kulturlösungen für die von dem Stamm KM-71 abgeleiteten rekombinanten Zellen 6,25 Einheiten/ml (spezifische Aktivität: 2,77 Einheiten/mg Protein) und für diejenigen vom Stamm GS-115 4,96 Einheiten/ml (spezifische Aktivität: 1,23 Einheiten/mg Protein) betrug.
[Vergleichsbeispiel I]
Enzymgenexpression in rekombinanten E. coli-Zellen
Das Verfahren aus Beispiel I wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die folgenden Primer zum Erhalt eines Gens, das dem S-Hydroxynitrillyase codierenden Gen entsprach, verwendet wurden.
Sense-Primer: GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT TTT G (SEQ ID Nr. 5)
Antisense-Primer: TAG GAG CTG CAG GCT TCA AGC ATA TGC ATC (SEQ ID Nr. 6)
Das oben beschriebene Gen wurde zwischen die BamHI- und PstI-Stellen in der multiplen Klonierungsstelle eines Vektors für E. coli (pKK223-3, Pharmacia Biotech) unter Erhalt eines rekombinanten Vektors eingefügt. Dieses Vektorplasmid wurde in E. coli unter Erhalt rekombinanter E. coli-Zellen eingebracht. Die rekombinanten E. coli-Zellen wurden in LB-Medium kultiviert, welches 1 mM IPTG als Induktorsubstrat und 0,1 g/l Ampicillin als Antibiotikum enthielt. Es wurde bestimmt, daß die Enzymaktivität in der Kulturlösung 0,964 Einheiten/ml betrug (spezifische Aktivität: 0,545 Einheiten/mg Protein).

Claims

Verfahren zum Herstellen von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man: (a) Hefezellen von Saccharomyces, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, welche aus einem Hefeepisomexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen aus Cassava (Manihot esculenta) aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und (b) die S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei Saccharomyces ein diploider Stamm ist und wobei der Hefeepisomexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des GAP- (Glycerol-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase) Promotors aus der Hefe Saccharomyces besteht, oder DNA, die aus der GAP-Promotorsequenz besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält.
Verfahren zum Herstellen von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man: (a) Hefezellen von Saccharomyces, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, welche aus einem Hefeintegrationsexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen aus Cassava (Manihot esculenta) aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und (b) die S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei Saccharomyces ein diploider Stamm ist und wobei der Hefeintegrationsexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des GAP- (Glycerol-Aldehyd-Phosphat-Dehydrogenase) Promotors aus der Hefe Saccharomyces besteht, oder DNA, die aus der GAP-Promotorsequenz besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält.
Verfahren zum Herstellen von S-Hydroxynitrillyase, welches die Stufen umfaßt, in denen man: (a) Hefezellen von Pichia, die mit rekombinanter DNA transformiert wurden, welche aus einem Hefeintegrationsexpressionsvektor besteht, in den das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen aus Cassava (Manihot esculenta) aufgenommen wurde, in einem Medium kultiviert und (b) S-Hydroxynitrillyase aus der Kultur sammelt, wobei der Hefeintegrationsexpressionsvektor DNA, die aus einer Nukleotidsequenz des AOX1- (Alkoholoxidase) Promotors aus der Hefe Pichia besteht, oder DNA, die aus der Sequenz des AOX1-Promotors besteht, bei der eine oder mehrere Basen deletiert, substituiert oder hinzugefügt wurden, während die Promotoraktivität beibehalten wird, enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei zwei oder mehr Expressionskassetten, die das S-Hydroxynitrillyase (EC 4.1.2.37) codierende Gen aus Cassava (Manihot esculenta) enthalten, in einen Hefeintegrationsexpressionsvektor eingeführt werden.