DE69837751T2

DE69837751T2 - Dna sequenzen, welche die promotoraktivität erhöhen

Info

Publication number: DE69837751T2
Application number: DE69837751T
Authority: DE
Inventors: Toshihiro Yokohama-shi KOMEDA
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2018-08-29
Also published as: US6274340B1; EP0967275A4; DE69837751D1; EP0967275A1; EP0967275B1; JPH1175843A; ATE361976T1; WO1999011779A1; JP3290108B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Promotor mit starker transkriptioneller Aktivität, der bei der Expression von heterologen Genen auf hohem Niveau nützlich ist, einen Expressionsvektor, welcher den Promotor trägt, eine Transformante, in die der Expressionsvektor eingeschleust worden ist, und ein Verfahren zum Herstellen eines heterologen Proteins durch Kultivierung der Transformante.
Technischer Hintergrund
Eine Methanol-assimilierende Hefe, d. h. eine methylotrophe Hefe, ist in der Lage, auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen. In der Ausgangsreaktion des Methanol-Metabolismus durch die methylotrophe Hefe werden durch Alkoholoxidase Formaldehyd und Wasserstoffperoxid aus Methanol und Sauerstoff hergestellt. Das hergestellte Wasserstoffperoxid wird mit Hilfe der Katalase in Wasser und Sauerstoff katabolisiert. Das Formaledhyd wird durch die Einwirkungen der Formaldehyddehydrogenase, der S-Formylglutathionhydrolase und der Formatdehydrogenase in Kohlendioxid oxidiert. NADH, das sich in diesen Oxidationen bildet, wird zur Energiequelle für die Hefezelle. Gleichzeitig kondensiert das Formaldehyd aufgrund der Einwirkung der Dihydroxyacetonsynthase mit Xylulose-5-phosphat, und das Kondensationsprodukt wird in Glyceraldehyd-3-phosphat und Dihydroaceton umgewandelt, welche über den Pentosephosphatzyklus Bestandteile der Hefezelle werden. Wenn die methylotrophe Hefe in Gegenwart von Methanol kultiviert wird, werden die oben erwähnten Alkoholoxidase, Dihydroxyacetonsynthase und Formatdehydrogenase in einer extrem großen Menge hergestellt, welche ungefähr 40 % der intrazellulären löslichen Proteine erreicht.
Wie oben beschrieben wurde, wird die methylotrophe Hefe als geeigneter Wirt für ein Expressionssystem heterologer Gene angesehen, da es mit günstigem Methanol in Massen kultiviert werden kann, und da sie einen Promotor für einen Methanol-verstoffwechselndes Enzym mit starker transkriptioneller Aktivität aufweist, der in anderen Hefen nicht gefunden wird.
Candida boidinii ist eine Art einer methylotrophen Hefe. Unter Verwendung dieser Hefe sind Verfahren zum Exprimieren eines heterologen Gens durch die Verwendung von regulatorischen Bereichen des Alkoholoxidasegens und des Formatdehydrogenasegens untersucht worden ( JP-A-5-344895,1 WO 97/10345 , etc.). In den meisten Fällen eines solchen Expressionssystems wird ein heterologes Gen in einer größeren Menge innerhalb einer Transformante mit einem Chromosom produziert, in der eine höhere Kopienanzanl eines Expressionsvektors integriert worden ist (Appl. Microbiol. Biotechnol., 42, 860-864 (1995); Proceedings of Annual Meeting of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, 1997, S. 257; und Proceedings of Annual Meeting of Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, 1997, S. 314). Angesichts der Stabilität eines Expressionsvektors in einer Transformante, scheint es wünschenswerter zu sein, ein größeres Ausmaß der Expression bei einer niedrigeren Kopienanzahl zu erreichen, und es gab einen Bedarf für die Entwicklung von Promotoren mit stärkerer transkriptioneller Aktivität.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, einen Promotor mit starker transkriptioneller Aktivität bereitzustellen, welcher bei der Expression heterologer Gene nützlich ist, einen Expressionsvektor, der den Promotor trägt, eine Transformante, in die der Expressionsvektor eingeschleust worden ist, und ein Verfahren zum Herstellen eines heterologen Genexpressionsproduktes durch Benutzung der Transformante.
Zur Lösung dieses oben genannten Problems hat der vorstellige Erfinder intensive Studien zur Entwicklung von Promotoren mit hoher transkriptioneller Aktivität durchgeführt. Im Ergebnis hat der vorstellige Erfinder jetzt gefunden, dass ein DNA-Fragment, das durch Zufügung von Nucleotiden mit einer spezifischen Nucleotidsequenz zum Promotor-DNA-Fragment, welches in der methylotrophen Hefe Candida boidinii funktioniert, als Promotor verwendet wurde, um ein heterologes Gen stromabwärts des Promotors effizient zu exprimieren. Durch diesen Befund ist die vorliegende Erfindung erfüllt worden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine DNA zur Verstärkung der Promotoraktivität bereit, welche die Nucleotidsequenz umfasst, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen mutierten Promotor bereit, in dem ein oder mehrere Fragmente der oben beschriebenen DNA mindestens eine Position vor, nach oder innerhalb irgendeines Promotors in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung lokalisiert sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der den mutierten Promotor zusammen mit einem heterologen Gen umfasst. Das heterologe Gen, das hier verwendet wird, betrifft irgendein Gen, das Ziel der Expression und nicht auf ein spezifisches beschränkt ist. Beispiele des heterologen Gens schließen Gene für die saure Phosphatase, α-Amylase, zahlreiche Interferone, Erythropoietin und Granulocyten-Kolonien-stimulierenden Faktor ein. Die heterologen Gene, welche in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, sind nicht auf das Verfahren zu deren Herstellung begrenzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Transformante bereit, welche durch Transformieren einer Wirtszelle mit dem Vektor hergestellt wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verstärkung einer Promotoraktivität bereit, gekennzeichnet dadurch, dass ein oder mehrere Fragmente der oben definierten DNA mindestens eine Position vor, nach oder innerhalb irgendeines Promotors in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung lokalisiert sind.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Expressionsproduktes bereit, umfassend das Kultivieren der oben beschriebenen Transformante in einem Medium, und das Gewinnen des Expressionsproduktes eines heterologen Gens aus der erhaltenen Kultur. Beispiele für das Medium schließen ein Medium ein, das Methanol als Kohlenstoffquelle enthält, ein Medium, das Methanol, ergänzt mit Glycerol, enthält, und ein Medium, das Ameisensäure, ergänzt mit irgendeiner Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, enthält.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in genaueren Details beschrieben.
Bei der Erfüllung der vorliegenden Erfindung hat der vorstellige Erfinder einen Bereich identifiziert (nachfolgend bezeichnet als „UAS-Sequenz"), welcher eine Voraussetzung für die transkriptionelle Aktivität eines Formatdehydrogenasegenpromotors (nachfolgend häufig abgekürzt als „FDH-Promotor") der methylotrophen Hefe Candida boidinii ist. Genauer gesagt, ist die DNA der vorliegenden Erfindung eine UAS-Sequenz, umfassend die Nucleotidsquenz 841-880 des Formatdehydrogenasegenpromotors aus Candida boidinii, mit der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist.
So wie es hier verwendet wird, bedeutet „irgendein Promotor" ein DNA-Fragment, das eine transkriptionelle Aktivität in einer Wirtszelle aufweist, welche nicht auf eine spezifische begrenzt ist. Daher kann jeder Promotor (d. h. ein Promotor-DNA-Fragment), welches in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, von irgendeinem Organismus stammen, solange er transkriptionelle Aktivität besitzt. Außerdem kann jeder Promotor teilweise eine Mutation, wie eine Substitution, Deletion, Addition oder Insertion in einer Nucleotidsequenz aus dem entsprechenden Wildtyp-Promotor enthalten, solange dieser Transkriptionsaktivität besitzt. Die Lokalisierung und die Anzahl der Substitution, Deletion, Addition oder Insertion ist nicht auf spezifische begrenzt. Als Promotor der Erfindung sind beispielhaft ein Candida boidinii Formatdehydrogenasegen-Promotor (SEQ ID Nr. 2) und ein Candida boidinii Actin-Gen-Promotor (SEQ ID Nr. 3) angegeben. Beispielsweise kann selbst ein DNA-Fragment mit einer Deletion der Nucleotide 1-300 in der Nucleotidsequenz, die in SEQ ID Nr. 2 gezeigt ist, als irgendein Promotor der Erfindung eingeschlossen sein, sofern dieser eine Transkriptionsaktivität in Candida boidinii aufweist. Die Einschleusung der Mutation kann durch allgemeine Gentechnikverfahren durchgeführt werden, einschließlich einer Behandlung mit Restriktionsenzymen, die Verwendung chemisch synthetisierter DNA, das PCR-Verfahren, die ortsspezifische Mutagenese und Verfahren zum Herstellen von Deletionsmutanten und Verwendung von Exonuclease III.
Der mutierte Promotor der vorliegenden Erfindung kann durch Lokalisieren der UAS-Sequenz an irgendeinem Promotor-DNA-Fragment hergestellt werden, wie oben beschrieben wurde, entweder in Vorwärts- oder in Rückwärtsrichtung.
Die Lokalisierung der UAS-Sequenz in Vorwärtsrichtung bedeutet die Lokalisierung (z. B. die Zufügung oder Inserierung) einer Sequenz, die zur UAS-Sequenz homolog ist, d. h. 5'-TTTACCACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG-3' (SEQ ID Nr. 1), am Promotor-DNA-Fragment in der gleichen 5'→3'-Richtung wie der Richtung des Promotor-DNA-Fragments. Andererseits bedeutet Lokalisieren der UAS-Sequenz in Rückwärtsrichtung die Lokalisierung (z. B. die Zufügung oder Inserierung) einer Sequenz, die komplementär zur UAS-Sequenz ist, d. h., 5'-CTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAA-3' (SEQ ID Nr. 4), als Promotor-DNA-Fragment in der gleichen 5'→3'-Orientierung wie der Orientierung des Promotor-DNA-Fragments.
Der mutierte Promotor, der in der Erfindung nützlich ist, kann ein Promotor-DNA-Fragment sein, welches eine einzelne UAS-Sequenz umfasst oder eine Vielzahl davon, vorzugsweise nicht mehr als zwei konsekutive UAS-Sequenzen. Die Nucleotidsequenzen der einzigen UAS-Sequenz oder der Vielzahl an UAS-Sequenzen können entweder in Vorwärts- oder Rückwärtsrich tung lokalisiert sein oder gemeinsam in Vorwärts- und Rückwärtsrichtungen vorliegen.
(1) Die Konstruktion eines mutierten Promotors, (2) die Konstruktion eines Expressionsvektors, und (3) die Konstruktion und Kultivierung einer Transformante mit dem Expressionsvektor kann durchgeführt werden, wie unten beschrieben.
(1) Konstruktion eines mutierten Promotors
Der mutierte Promotor der Erfindung kann durch Zufügen einer chemisch synthetisierten UAS-Sequenz zu einem Promotor-DNA-Fragment hergestellt werden. Das Promotor-DNA-Fragment, das bereits als Promotor-Sequenz identifiziert worden ist, ist durch gewöhnliche Gen-Klonierungstechniken zu gewinnen (z. B. durch die Methoden, die in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., 1989, beschrieben sind), PCR-Verfahren, Verfahren zur chemischen Synthese oder ähnliche.
Das DNA-Fragment, welches in einer Wirtszelle Promotor-Aktivität aufweist, kann unter Verwendung einer Bibliothek gewonnen werden, welche durch Klonieren eines niedrig DNA-Fragments mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt wird, welches aus der Spaltung mit Restriktionsenzymen oder ähnlichen an einer stromaufwärts gelegenen Stelle eines Markergens eines Plasmids hergestellt werden, welches eine DNA-Sequenz umfasst, die die Fähigkeit hat, sich autonom in einer Wirtszelle zu replizieren, und ein Markergen, welches keine Promotor-Sequenz enthält. Beispielhafte Markergene sind Antibiotika-Resistenzgene, z. B. das G418-Resistenzgen, und auxotroph komplementäre Gene, z. B. URA3- und LEU2-Gene. Wenn eine Wirtszelle mit der hergestellten DNA-Bibliothek transformiert wird, wird eine Transformante, die das Plasmid enthält, in das das DNA-Fragment mit der Promotor-Aktivität in eine Stelle direkt stromaufwärts des Markergens kloniert ist, durch den entsprechenden Marker ausgewählt werden. Daher kann gesamte DNA aus der erhaltenen Transformante extrahiert und in E. coli transformiert werden, wodurch das DNA-Fragment mit der Promotor-Aktivität effizient isoliert wird.
Die UAS-Sequenz kann unter Verwendung einer oder mehrere Restriktionsenzymstellen, die in dem Promotor-DNA-Fragment vorhanden sind, eingeschleust werden, oder durch eine Restriktionsenzymstelle/-stellen, die durch allgemeine genetische Techniken künstlich dem Promotor-DNA-Fragment hinzugefügt worden sind. Beispielsweise gibt es ein Verfahren, bei dem spezifische Restriktionsenzymstellen an beiden Enden der UAS-Sequenz eingeschleust werden; eine Sequenz, die durch das gleiche Restriktionsenzym er kannt wird, wird in irgendeinen Promotor eingeschleust; und die UAS-Sequenz und der Promotor werden miteinander verbunden.
(2) Konstruktion eines Expressionsvektors
Der so erhaltene mutierte Promotor wird zusammen mit einem Strukturgen für ein heterologes Protein, einen Terminator, einem selektiven Markergen, einer homologen Region und ähnliche in einen geeigneten Vektor eingeschleust, wodurch der erhaltene Vektor als heterologer Gen-Expressionsvektor verwendet wird. Beispielhafte Vektoren sind gut bekannte Vektoren, einschließlich der E. coli-Plasmidvektoren, beispielsweise pBR, pUC und die Bluescript-Reihen. Der Terminator, das Selektionsmarkergen und die homologe Region kann durch Fachleute im Gebiet entsprechend ausgewählt werden, sofern sie fähig sind, in einem Wirt zu arbeiten. Als Terminator können beispielhaft Terminatoren für Actin und Formatdehydrogenasegene angegeben werden. Beispiele des Selektionsmarkergens schließen Antibiotica-Resistenzgene, beispielsweise das G418-Resistenzgen und auxotrophe komplementäre Gene wie URA3 und LEU2 ein. Die Insertion der oben erwähnten Elemente in einen Vektor zum Bilden eines Expressionsvektors sollte für Fachleute auf dem Gebiet auf Grundlage der unten beschriebenen Beispiele und bekannter Techniken leicht durchzuführen sein.
(3) Konstruktion und Kultivierung einer Transformante
Die Transformante der vorliegenden Erfindung kann durch Einschleusen des oben erhaltenen rekombinanten Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle hergestellt werden.
Wirte, die in der Erfindung nützlich, aber nicht darauf beschränkt sind, sind E. coli, Bacillus subtilis, Hefe oder ähnliche, vorzugsweise Hefe, mehr bevorzugt methylotrophe Hefe (d. h. Methanol-assimilierende Hefe). Ein spezifisches Beispiel dafür ist Candida boidinii. Die Einschleusung des Plasmids in den Wirt kann durch allgemeine Verfahren, die für die Transformation verwendet werden, durchgeführt werden, z. B. das Protoplastenverfahren, das Lithiumverfahren, das Electroporationsverfahren, das Calciumverfahren etc.
Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung kann in die chromosomale Wirts-DNA integriert werden. Alternativ dazu kann der Expressionsvektor in Form eines Plasmids vorliegen, indem ein Vektor verwendet wird, der eine autonom replizierende Sequenz aufweist, die zur Selbstreplikation in der Wirtszelle in der Lage ist. Die Kopienzahl des heterologen Gens, welche in der Wirtszelle vorhanden ist, kann eine oder mehrere sein.
Die so erhaltene Transformante wird dann kultiviert. Aus der erhaltenen Kultur wird ein heterologes Genexpressionsprodukt gewonnen, wodurch ein Genexpressionsprodukt von Interesse gewonnen wird. So wie es hier verwendet wird, bedeutet „das Genexpressionsprodukt wird gewonnen" das Extrahieren eines Genexpressionsproduktes aus der kultivierten Zelle, oder das Einsammeln eines Überstands der Kultur, oder das Reinigen eines Expressionsproduktes aus einem Überstand der Kultur.
Da die oben beschriebene Transformante die Expression eines heterologen Gens durch Methanol oder Ameisensäure induzieren kann, können beispielhaft die folgenden Medien angegeben werden:
Wenn die Expression mit Methanol induziert wird, kann ein Medium verwendet werden, welches zusätzlich zu Methanol als Kohlenstoffquelle eine oder mehrere Stickstoffquellen enthält, beispielsweise Hefeextrakt, Trypton, Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure, und Ammoniumsalze, und organische Salze, z. B. Phosophorsäure, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Eisen, Kupfer, Mangan und Kobalt. Gegebenenfalls kann das Medium weitere Spurennährstoffe einschließen, wie verschiedene Arten an Vitaminen, Aminosäuren und Nucleotiden sowie Zuckermaterialien, die die Induktion nicht inhibieren.
Wenn die Expression mit Ameisensäure induziert wird, kann das verwendete Medium zusätzlich zur Ameisensäure eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, beispielsweise Glucose und Glycerol enthalten; eine oder mehrere Stickstoffquellen, beispielsweise Hefeextrakt, Trypton, Fleischextrakt, Pepton, Casaminosäure und Ammoniumsalze; anorganische Salze, z. B. Phosphorsäure, Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium, Eisen, Kupfer, Mangan und Kobalt; und gegebenenfalls Spurennährstoffe, z. B. verschiedene Arten an Vitaminen, Aminosäuren und Nucleotiden, und Zuckermaterialien, die die Induzierung nicht inhibieren.
Der pH-Wert des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8. Die Kultivierungstemperatur beträgt normalerweise 15-45°C, vorzugsweise um 28°C. Die Kultivierung kann entweder Batch-weise oder in kontinuierlicher Weise über einen Zeitraum von ungefähr 24 bis 1.000 Stunden unter Stehenlassen, Schütteln, Bewegen oder Belüftungsbedingungen durchgeführt werden.
Zum Ende der Kultivierung kann das Genexpressionsprodukt unter Verwendung eines gewöhnlichen Proteinreinigungsverfahrens aus der Kultur gewonnen werden etc. Beispielsweise kann es, wenn das Genexpressionsprodukt intrazellulär in einer transformierten Zelle produziert wird, nach irgendeinem gewöhnlichen Verfahren zum Unterwerfen der Zelle gegenüber Beschallung, Mahlen, Zerstörung unter Druck oder ähnlichen extrahiert werden. Falls notwendig, kann ein Protease-Inhibitor hinzugegeben werden. Wenn ein Genprodukt im Überstand einer Kultur hergestellt wird, kann die Kulturlösung als solche verwendet werden. Die gewonnene Lösung kann filtriert werden und anschließend können Feststoffe durch Zentrifugieren aus dem Filtrat entfernt werden, wodurch eine Rohproteinlösung gewonnen wird. Falls notwendig, können Nucleinsäuren durch Protaminbehandlung etc. entfernt werden.
Aus der Rohproteinlösung kann ein Zielprotein durch eine Kombination an Reinigungstechniken wie Aussalzen, Lösungsmittelpräzipitierung, Dialyse, Ultrafiltration, Gelelectrophorese, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Affinitätschromatographie isoliert und gereinigt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Struktur des Plasmids pPUF1.
2 zeigt die Aktivitäten der sauren Phosphatase, die unter Kontrolle des stromaufwärts deletierten FDH-Promotortyps exprimiert wird.
3 zeigt die Konstruktion eines Säurephosphatase-Expressionsplasmids pPFID1, in dem die interne Region des FDH-Promotors deletiert worden ist.
4 zeigt die Aktivitäten der sauren Phosphatase, die unter Kontrolle von modifizierten FDH-Promotoren exprimiert wird, in denen die interne Region des FDH-Promotors teilweise deletiert worden ist.
5 zeigt das chemisch synthetisierte DNA-Fragment, das eine Sequenz umfasst, die SEQ ID Nr. 1 entspricht, welche als UAS-Sequenz angesehen wird, sowie den Weg der Inserierung des DNA-Fragments in die XhoI-Schnittstelle.
6 zeigt die Strukturen mutierter FDH-Promotoren mit einer Sequenz, die SEQ ID Nr. 1 entspricht, welche als die UAS-Sequenz angesehen wird, sowie die Aktivitäten der sauren Phosphatase, die unter Kontrolle der mutierten FDH-Promotoren exprimiert wird.
7 zeigt die Struktur des Plasmids pAcPH.
8 zeigt die Strukturen der mutierten Actinpromotoren mit einer Sequenz, die SEQ ID Nr. 1 entspricht, welche als UAS-Sequenz angesehen wird, sowie die Säurephosphatase-Aktivitäten, die unter Kontrolle der mutierten Actin-Promotoren exprimiert wird.
Beste Art der Durchführung der Erfindung
Die folgenden Beispiele stellen den Gegenstand der vorliegenden Erfindung in genaueren Details dar, aber sie beabsichtigen nicht, irgendeinen technischen Bereich der Erfindung zu begrenzen.
Beispiel 1
Im vorliegenden Beispiel werden modifizierte FDH-Promotoren, in denen der stromaufwärts liegende Bereich des Candida boidinii FDH-Promotors teilweise deletiert worden ist, hergestellt, um einen Bereich zu identifizieren, der für die Funktion des FDH-Promotors notwendig ist, indem die Aktivität der sauren Phosphatase der Hefe Saccharomyces cerevisiae unter Kontrolle des stromaufwärts deletierten FDH-artigen Promotors bestimmt wird.
(1-1) Herstellung des saure Phosphatase-Expressionsplasmids
Das saure Phosphatase-Expressionsplasmid pPUF1, welches einen FDH-Promotor/Terminator und das URA3-Gen als Markergen (1) enthält, wurde gemäß dem Verfahren, das in WO 97/10345 beschrieben ist, hergestellt. Der Candida boidinii-Stamm KST2515 ura3 wurde als Wirtsstamm verwendet. Plasmid pPUF1 kann leicht gemäß dem Verfahren, das in WO 97/10345 beschrieben ist, gewonnen werden. Der FDH-Promotor/Terminator, das URA3-Gen, und das PHO5-Gen können durch chemische Synthese auf Grundlage der Sequenzen, die in WO 97/10345 , Sakai Y. et al., J. Ferment. Bioeng., 73, 255-260 (1992), bzw. Arima, K. et al., Nucleic Acids Res., 11, 1657 (1983) beschrieben sind, gewonnen werden. Obwohl der Candida boidinii-Stamm KST2515 im vorliegenden Beispiel verwendet worden ist, kann der ura3-Stamm leicht unter Verwendung irgendeines anderen Candida boidinii-Stamms, wie beispielsweise IFO 10035, nach einem bekannten Verfahren (Sakai Y., et al., J. Bacteriol., 173, 7458 (1991)) gewonnen werden.
(1-2) Konstruktion der PHO5-Expressionsplasmide unter Kontrolle eines stromaufwärts deletierten FDH-Promotortyps
Modifizierte FDH-Promotoren, in denen der Bereich stromaufwärts des FDH-Promotors teilweise deletiert worden ist, wurden mit dem Kilo-Sequence-Deletion-Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.) und PCR hergestellt. Plasmid pPUF1 wurde an den ApaI- und XhoI-Schnittstellen gespalten und mit Kilo-Sequence-Deletion-Kit behandelt, um die PHO5-Expressionsplasmide pPUF15, pPUF24, pPUF44, pPUF54, pPUF56, pPUF79, pPUF308 und pPUF310 zu gewinnen, welches Plasmide sind, die unter Kontrolle des stromaufwärts deletierten FDH-artigen Promotors liegen. Unter Verwendung dieser Plasmide als Matrizen, zusammen mit dem Dye Primer Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer Co.), wurden die Nucleotidsequenzen bestimmt, wodurch bestätigt wurde, dass die Plasmide pPUF15, pPUF24, pPUF44, pPUF54, pPUF56, pPUF79, pPUF308 und pPUF310 FDH-Promotorbereiche von 1.215 bp, 1.000 bp, 839 bp, 690 bp, 756 bp, 403 bp, 228 bp beziehungsweise 115 bp hatten.
Um die stromaufwärts deletierten FDH-artigen Promotoren durch PCR herzustellen, wurden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert:
PF819; CCCCTCGAGGAAATAGATACATTACCCAGTGTC (SEQ ID Nr. 5)
PF801; CCCCTCGAGTGTCATCGATATTATGCCCCGCC (SEQ ID Nr. 6)
PF779; CCCCTCGAGGCCTTTTTCACTTGAAACAATAACTAT (SEQ ID Nr. 7)
PF668; CCCCTCGAGTAATACTAGTCAGATGTTATAATTATATC (SEQ ID Nr. 8)
PF642; CCCCTCGAGTATCTTTACCACTATCCAATTAAAATCC (SEQ ID Nr. 9)
PF622; CCCCTCGAGTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG (SEQ ID Nr. 10)
PF602; CCCCTCGAGTAGTTTTTATATCTGTAACATCTTAC (SEQ ID Nr. 11)
PF194; CCCCTCGAGTAAATTCAACTAAAAATTGAACTATTTAAACACTATG (SEQ ID Nr. 12)
PF161; CCCCTCGAGATGATTTCCTTCAATTATATTAAAATCAATTTC (SEQ ID Nr. 13)
PRV3; CAATGAGCCGTTGAATTGACGAGTG (SEQ ID Nr. 14)
Unter Verwendung des Oligonucleotids PRV3 und irgendeines der Oligonucleotide PF819, PF801, PF779, PF668, PF642, PF622, PF602, PF194 und PF161 zusammen mit pPUF1 als Matrize, wurde eine PCR durchgeführt (20 Zyklen aus: 94°C für 30 sec.; 55°C für 1 min. und 72°C für 1 min.). Jedes der amplifizierten DNA-Fragmente wurde in den pT7Blue T-Vektor (Novagen, Inc.) kloniert, aus dem ein Restriktionsfragment XhoI-NotI ausgeschnitten wurde, und dann in XhoI-NotI von pPUF1 insiert. PHOS-Expressionsplasmide haben:
die Promotor-Region von 819 bp des Primers PF819;
die Promotor-Region von 801 bp des Primers PF801;
die Promotor-Region von 779 bp des Primers PF779;
die Promotor-Region von 668 bp des Primers PF668;
die Promotor-Region von 642 bp des Primers PF642;
die Promotor-Region von 622 bp des Primers PF622;
die Promotor-Region von 602 bp des Primers PF602;
die Promotor-Region von 194 bp des Primers PF194; und
die Promotor-Region von 161 bp des Primers PF161; und wurden bezeichnet als pPUF819, pPUF810, pPUF779, pPUF668, pPUF642, pPUF622, pPUF602, pPUF194 beziehungsweise pPUF161.
(1-3) Transformation
Fünf μg jeder Plasmid-DNA, die in (1-2) des vorliegenden Beispiels hergestellt wurden, wurden mit BamHI ausgeschnitten und anschließend in den Candida boidinii-Stamm KST2515 transformiert. Mehrere Kolonien der so erhaltenen Transformanten wurden für die entsprechenden Plasmide herausgepickt. Die Kolonien wurden in einem Medium, pH 5,5, enthaltend 1,5 % Metha nol, 0,67 % Hefe-Stickstoffbase und 0,5 % Hefeextrakt (ME media) kultiviert, oder in einem Medium, pH 5,5, enthaltend 1,0 % Glucose, 0,5 % Natriumformat und 0,67 % Hefe-Stickstoffbase (GF media), um die Aktivität der sauren Phosphatase zu bestimmen. Die die Aktivität der sauren Phosphatase wurde durch das Verfahren von Toh-e, A. et al., (J. Bacteriol., 113, 727 (1973)) unter Verwendung der gewaschenen Zellsuspension selbst als Enzym gemessen. Eine Einheit Enzymaktivität wurde als die Menge an Enzym definiert, die für die Erzeugung 1 mmol an p-Nitrophenol bei 30°C in 1 min. benötigt wurde. Nach der bekannten Literatur (Sakai Y. et al., J. Bacteriol., 173, 7458 (1991)), inkorporieren in einer Transformation unter Verwendung von URA3 als Marker ungefähr die Hälfte der transformierten Zellen einer einzelnen Kopie eines Plasmids. Auf dieser Grundlage wurde der Wert der die Aktivität der sauren Phosphatase mit der maximalen Verteilung jeder Transformante, die mit den oben erwähnten Plasmiden hergestellt worden waren, als Wert der die Aktivität der sauren Phosphatase der Einzelkopien-inserierten Transformanten angesehen. So wurde bestätigt durch Southern-Analyse, dass eine Einzelkopie eines Plasmids in jeder Transformante inkorporiert worden ist. Jede spezifische die Aktivität der sauren Phosphatase (Einheit/OD₆₁₀) der mit den Plasmiden hergestellten Transformanten ist in 2 gezeigt, wobei die spezifische Aktivität der Säurephosphate von pPUF1 100 % ist. Die Ergebnisse in 2 zeigen, dass die spezifische Aktivität bei 80°C oder mehr bewahrt wird, im Fall der Induktion mit Methanol, wenn der Promotorbereich 839 bp oder größer ist, und im Falle einer Induktion mit Ameisensäure, wenn der Promotorbereich 642 bp oder größer ist.
Jede spezifische Aktivität wird als relativer Wert zur Säurephosphatase-Aktivität einer Transformante dargestellt, welche mit dem Plasmid pPUF1 ohne Deletion in seine Promotor-Region hergestellt wurde. Die Werte des Parentalstamms entsprachen dem Candida boidinii-Stamm KST2515, in das kein Plasmid eingeschleust worden ist.
Beispiel 2
Im vorliegenden Beispiel wurden modifizierte FDH-Promotoren, in dessen der innere Bereich des Candida boidinii-FDH-Promotors teilweise deletiert worden ist, hergestellt, und anschließend wurde die Aktivität der sauren Phosphatase aus Saccharomyces cerevisiae gemessen, welche durch den intern deletierten FDH-Promotortyp reguliert wird, um einen Bereich zu identifizieren, der für die Funktion des FDH-Promotors notwendig ist.
(2-1) Konstruktion der PHO5-Expressionsplasmide unter Kontrolle des intern deletierten FDH-Promotortyps
Modifizierte FDH-Promotoren, in denen der innere Bereich des FDH-Promotors teilweise deletiert worden ist, wurden durch PCR hergestellt (siehe 3, welche die Konstruktion von pPFID1 zeigt). Um die intern deletierten FDH-Promotortypen durch PCR herzustellen, wurden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert:
PF1478; CCCCTCGAGTCAACAAATCAATCAGCCAATCTACC (SEQ ID Nr. 15)
PF521; CCAGATCTTGATAATAAGGTATACTACATTTTATC (SEQ ID Nr. 16)
PC548; CCAGATCTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAAGATG (SEQ ID Nr. 17)
PC571; CCAGATCTAGTAGTAAGATGTTACAGATATAAAAACTACCG (SEQ ID Nr. 18)
PC599; CCAGATCTCTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGG (SEQ ID Nr. 19)
PC619; CCAGATCTTTAATTGGATAGTGGTAAAGATATAATTATAAC (SEQ ID Nr. 20)
PC641; CCAGATCTATAATTATAACATCTGACTAGTATTACC (SEQ ID Nr. 21)
Unter Verwendung der Oligonucleotide PF521 und PRV3 zusammen mit pPUF1 als Matrize wurde eine PCR durchgeführt (20 Zyklen aus: 94°C für 30 sec.; 55°C für 1 min. und 72° für 1 min.). Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in den pT7Blue T-Vektor kloniert, aus dem das Restriktionsfragment BglII-NotI ausgeschnitten wurde. Anschließend wurde eine PCR unter Verwendung des Oligonucleotids PF1478 und irgendeines der Oligonucleotide PC548, PC571, PC599, PC619 und PC642 durchgeführt (PCR-Bedingungen: 20 Zyklen aus: 94°C für 30 sec.; 55°C für 1 min. und 72°C für 1 min.). Jedes der amplifizierten DNA-Fragmente wurde in pT7Blue T-Vektor kloniert, aus dem das Restriktionsfragment XhoI-BglII ausgeschnitten wurde. Dieses Restriktionsfragment wurde zusammen mit dem oben erwähnten BglII-NotI DNA-Fragment in die XhoI-NotI-Schnittstelle des pPUF1 inseriert. PHO5 Expressionsplasmide haben:
das FDH-Promotor-Fragment, das mit dem Primer PC548 gewonnen wird, in dem die Nucleotide 932-957 des FDH-Promotors, welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, deletiert worden sind;
das FDH-Promotor-Fragment, das mit dem Primer PC571 gewonnen wird, in dem die Nucleotide 909-957 des FDH-Promotors, welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, deletiert worden sind;
das FDH-Promotor-Fragment, das mit dem Primer PC559 gewonnen wird, in dem die Nucleotide 881-957 des FDH-Promotors, welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, deletiert worden sind;
das FDH-Promotor-Fragment, das mit dem Primer PC619 gewonnen wird, in dem die Nucleotide 861-957 des FDH-Promotors, welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, deletiert worden sind; und
das FDH-Promotor-Fragment, das mit dem Primer PC642 gewonnen wird, in dem die Nucleotide 839-957 des FDH-Promotors, welcher in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, deletiert worden sind;
und wurden als pPFID1, pPFID2, pPFID3, pPFID4 beziehungsweise pPFID5 bezeichnet.
(2-2) Transformation
Die Plasmide, die in (2-1) dieses Beispiels hergestellt worden sind, wurden in Candida boidinii wie in (1-3) des Beispiels 1 beschrieben wurde, transformiert, um die Aktivität der sauren Phosphatase in ME- und GF-Medien zu bestimmen. Jede spezifische Aktivität der sauren Phosphatase (Einheit/OD₆₁₀) der Transformanten, die mit den oben erwähnten Plasmiden hergestellt worden sind, ist in 4 gezeigt, wobei die spezifische Aktivität der sauren Phosphatase von pPUF1 100 % beträgt. Jede spezifische Aktivität wird als relativer Wert zu der sauren Phosphatase-Aktivität einer Transformante dargestellt, welche mit dem Plasmid pPUF1 ohne Deletion in seiner Promotor-Reaktion hergestellt wurde.
Die Deletion der Nucleotide 881-957, welche in SEQ ID Nr. 2 gezeigt wird, beeinflusste die FDH-Promotor-Aktivität überhaupt nicht. Jedoch wurde beim Plasmid mit der Deletion der Nucleotide 861-957 keine Induktion der Expression durch Methanol oder Ameisensäure beobachtet. Aus diesen Ergebnissen und den Ergebnissen, die in Beispiel 1 gewonnen wurden, wurde die Nucleotidsequenz 837-880 der SEQ ID Nr. 2 als notwendig für die FDH-Promotor-Aktivität nach Induktion der Expression mit Methanol oder Ameisensäure angesehen.
Beispiel 3
In dem vorliegenden Beispiel wurde ein Candida boidinii FDH-Promotor, welcher zusätzliche UAS-Sequenzen umfasst, hergestellt, um die Aktivität der Säurephosphatase aus Saccharomyces cerevisiae unter der Kontrolle des Promotors zu bestimmen.
(3-1) Konstruktion des PHO5-Expressionsplasmids
Um eine 1.000 bp FDH-Promotor-Region mit einer XhoI-Schnittstelle am 5'-Ende zu isolieren, wurde folgendes Oligonucleotid PXF1000 synthetisiert.
PXF1000; CCCTCGAGGCTGGGTTTTTACTGAATTCAGTC (SEQ ID Nr. 22)
Unter Verwendung der Oligonucleotide PXF1000 und PRV3 zusammen mit pPUF24 als Matrize wurde eine PCR durchgeführt (20 Zyklen von: 94°C für 30 sec.; 55°C für 1 min. und 72°C für 1 min.). Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in den pT7Blue T-Vektor kloniert, aus dem das Restriktionsfragment XhoI-NotI ausgeschnitten wurde und anschließend in XhoI-NotI von pPUF1 inseriert wurde. Das so erhaltene Plasmid wurde als pPUF24X bezeichnet. Oligonucleotide UA3 und UA3C, welche die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nucleotidsequenz enthalten, von der vermutet wurde, dass sie für die FDH-Promotor-Aktivität notwendig wäre, die auf Ergebnissen der Beispiele 1 und 2 basierte, wurden synthetisiert.
UA3;
TCGAGTTTACCACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAGCTTTACCACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG (SEQ ID Nr. 23)
UA3C;
TCGACTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAAGCTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAC (SEQ ID Nr. 24)
Nach der Synthese wurden die 5'-Enden der Oligonucleotide UA3 und UA3C mit T4 Polynucleotidkinase (Takaro Shuzo Co., Ltd.) phosphoryliert. Die Oligonucleotide wurden bis auf eine Endkonzentration von 100 pmol/μl in einem Anlagerungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl) gelöst. Die Lösungen der Oligonucleotide UA3 und UA3C wurden 1:1 (nach Volumen) gemischt und für 5 Minuten auf 95°C erwärmt und danach wurden beide Ketten aneinander gelagert, während sie sich graduierlich abkühlen. Beide Enden des erhaltenen doppelsträngigen DNA-Fragments ermöglichten die Ligation mit der XhoI-Schnittstelle. Nach der Ligierung, wie in 5 gezeigt ist, wurde nur ein Ende mit XhoI erneut gespalten.
Plasmid pPUF24X wurde mit XhoI gespalten und dann mit dem oben beschriebenen angelagerten DNA-Fragment ligiert. Anschließend wurden E. coli DH5 mit dem erhaltenen Plasmid transformiert. Von den verschiedenen Transformanten wurden Plasmid-DNAs hergestellt, und dann auf Plasmide selektiert, in die das synthetische DNA-Fragment inseriert worden ist, in dem eine Restriktionsenzym-Analyse durchgeführt wurde. Die Kopienanzahl und die Richtung des inserierten DNA-Fragments wurden weiter bestimmt. Ein Plasmid, in das 2 Kopien der Nucleotidsequenz inseriert wurden, die durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, in Vorwärtsrichtung, ein Plasmid, in dem in Rückwärtsrichtung 2 Kopien inseriert wurden, und ein Plasmid, in das 4 Kopien in Vorwärtsrichtung inseriert wurden, wurden als pMFPH2, pMFPH2R beziehungsweise pMFPH4 bezeichnet. Jede Teilstruktur der Promotor-Region der so erhaltenen Plasmide ist in 6 gezeigt.
(3-2) Transformation
Die Plasmide pMFPH2, pMFPH2R, pMFPH4 und pPUF1, die in (3-1) des entsprechenden Beispiels hergestellt worden waren, wurden in Candida boidinii wie in (1-3) des Beispiels 1 beschrieben, transformiert, um die Aktivität der sauren Phosphatase (Einheit/OD₆₁₀) in ME- und GF-Medien zu messen. In dieser Messung wurde 1 Einheit der Enzymaktivität als die Menge an Enzym definiert, welche für die Erzeugung von 1 mmol p-Nitrophenol bei 30°C in einer Minute benötigt wird. Jede spezifische Aktivität der sauren Phosphatase der mit einer Einzelkopie inserierten Transformanten, welche mit den oben erwähnten Plasmiden hergestellt wurden, ist in 6 gezeigt, wobei die Aktivität in mU/OD₆₁₀ dargestellt ist. Die Inserierung des DNA-Fragments führte zu einem drastischen Anstieg der spezifischen Aktivität der sauren Phosphatase. Diese Wirkung hängt von der Kopienanzahl und nicht von der Richtung der Insertion ab.
Aus den oben erwähnten Ergebnissen wurde deutlich, dass die inserierte Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 als UAS-Sequenz des FDH-Promotors diente, d. h. es war eine Sequenz, die für die Induzierung des FDH-Promotors mit Methanol und Ameisensäure notwendig war, und dass die UAS-Sequenz die transkriptionelle Aktivität des Promotors ohne Abhängigkeit von der Richtung der Insertion verstäkt.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wurde ein Candida boidinii Actin-Gen-Promotor mit der UAS-Sequenz hergestellt, um die Aktivität der sauren Phosphatase von Saccharomyces cerevisiae unter der Kontrolle des Promotors zu bestimmen.
(4-1) Konstruktion des PHO5-Expressionsplasmids
Um das PHO5-Expressionsplasmid herzustellen, das den Actinpromotor umfasst, wurde die Promotor-Region des Candida boidinii Actin-Gens durch PCR hergestellt. Die folgenden Oligonucleotide wurden auf Grundlage der Nucleotidsequenz der Promotorregion des Candida boidinii-Gens, das in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, synthetisiert:
XCA5; TTCTCGAGTCAATAAGAGTGTGATTATATACAATCAGC (SEQ ID Nr. 25)
NCAC3; TTGCGGCCGCTTTTGTAATATATATTAAATTAAATTTATAAAATCTATC (SEQ ID Nr. 26)
Unter Verwendung der Oligonucleotide XCAC5 und NCAC3 zusammen mit pAcl-7, welches in WO 97/10345 als Matrize beschrieben wurde, wurde ein PCR durchgeführt (20 Zyklen von: 94°C für 30 sec.; 55°C für 1 min. und 72°C für 1 min.). Im vorliegenden Beispiel kann die PCR, obwohl Plasmid pAcl-7 als Matrizen-DNA der PCR verwendet wird, die PCR ebenfalls unter Verwendung einer chromosomalen DNA durchgeführt werden, welche aus dem Candida boidinii-Stamm ATCC 48180 stammt. Nach der Klonierung des amplifizierten DNA-Fragments in den pT7Blue T-Vektor, wurde das Restriktionsfragment XhoI-NotI ausgeschnitten und anschließend in die XhoI-NotI-Schnittstelle von pPUF1 inseriert. Das so gewonnene Plasmid pAcPH (7) war das PHO5-Expressionsplasmid, welches ein URA3-Gen als Marker enthält, den Candida boidinii Actin-Gen-Promotor und den FDH-Genterminator.
In die XhoI-Schnittstelle, welche am 5'-Ende des Actin-Gen-Promotors von pACPH vorhanden ist, wurde ein DNA-Fragment, das die UAS-Sequenz enthält, in gleicher Weise wie im Verfahren, das in (3-1) des Beispiels 1 beschrieben ist, inseriert. Im Ergebnis wurden die folgenden Produkte gewonnen: das Plasmid pUAcPH2, in das 2 Kopien der UAS-Sequenzen in einer Vorwärtsrichtung inseriert wurden; und das Plasmid pUAcPH4, in das 4 Kopien der UAS-Sequenzen in Vorwärtsrichtung inseriert wurden.
(4-2) Transformation
Die Plasmide pAcPH, pUAcPH2, pUAcPH4 und pPUF1, die in (4-1) des vorliegenden Beispiels hergestellt wurden, wurden in Candida boidinii in gleicher Weise wie in dem Verfahren, das in (1-3) des Beispiels 1 beschrieben ist, transformiert, außer dass HindIII verwendet wurde, um die Plasmid-DNA zu spalten. Die Aktivität der sauren Phosphatase der erhaltenen Transformanten wurde in ME-Medium, GF-Medium und einem Medium, pH 5,5, enthaltend 1,0 % Glucose und 0,67 % Hefestickstoff-Base (d. h. GS-Medium) bestimmt. Jede spezifische Aktivität der sauren Phosphatase der Transformanten, in die eine einzelne Kopie inseriert wurde, welche mit den oben erwähnten Plasmiden hergestellt wurden, ist in 8 gezeigt.
Im Fall des Actingen-Promotors ohne die UAS-Sequenz (d. h. pAcPH) gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den Säurephosphatase-Aktivitäten in GS-, GF- und ME-Medien. Im Gegensatz dazu zeigten die Actin-Gen-Promotoren mit der UAS-Sequenz (d. h. pUAcPH2 und pUAcPH4) einen merklichen Anstieg der Aktivität in den GF- und ME-Medien, wobei das Ergebnis ähnlich wie im Fall des Promotors des Formatdehydrogenasegens ist.
Die oben beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass die UAS-Sequenz, die in Beispiel 3 beschrieben wurde, die Wirkung hatte, nicht nur die Aktivität des FDH-Promotors zu verstärken, sondern auch die Aktivitäten anderer Promotoren.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Promotor mit einer starken transkriptionellen Aktivität bereitgestellt, ein Expressionsvektor, der den Promotor trägt, eine Transformante, in die der Expressionsvektor eingeschleust wurde, ein Verfahren zum Verstärken der Promotoraktivität und ein Verfahren zum Produzieren heterologer Proteine. Der mutierte Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung hat eine merklich verstärkte Promotor-Aktivität verglichen mit der eines Wildtyp-Promotors. Das bedeutet, dass er sehr nützlich als Promotor zum Exprimieren heterologer Gene ist. Der Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, zahlreiche nützliche Proteine zu exprimieren und herzustellen.
SEQUENZLISTE
SEQUENZLISTE

Claims

DNA zum Verstärken der Promotoraktivität, welche aus der Nukleotidsequenz besteht, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist.
Mutierter Promotor, worin eine oder mehrere DNAs gemäß Anspruch 1 mindestens an einer Position vor, nach oder innerhalb irgendeines Promotors in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung lokalisiert sind.
Mutierter Promotor gemäß Anspruch 2, worin der Promotor Candida boidinii Actin-Gen-Promotor ist.
Mutierter Promotor gemäß irgendeinem der Ansprüche 2 bis 3, worin die Anzahl der DNAs zwei oder vier ist.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend den mutierten Promotor gemäß irgendeinem der Ansprüche 2 bis 4, zusammen mit einem heterologen Gen.
Wirtszelle, umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.
Verfahren zum Verstärken der Promotoraktivität, dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Kopien der DNA gemäß Anspruch 1 mindestens an einer Position vor, nach oder innerhalb eines Candida boidinii Actin-Gen-Promotors in Vorwärts- oder Rückwärtsrichtung lokalisiert sind.
Verfahren zum Herstellen eines Expressionsprodukts, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 in einem Medium und das Gewinnen des Expressionsprodukts eines heterologen Gens aus der erhaltenen Kultur.