WO1999011779A1

WO1999011779A1 - Sequences d'adn ameliorant l'activite des promoteurs

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Publication number: WO1999011779A1
Application number: PCT/JP1998/003848
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Komeda
Original assignee: Kirin Beer Kabushiki Kaisha
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 1999-03-11
Also published as: EP0967275B1; DE69837751T2; EP0967275A1; EP0967275A4; JP3290108B2; ATE361976T1; DE69837751D1; US6274340B1; JPH1175843A

Description

明細書プロモーター活性を増大させる D N A配列技術分野

本発明は、異種遺伝子を大量に発現する上で有用な高い転写活性を有するプ口モーター、該プロモータ一を担持する発現べクタ一、該発現べクタ一が導入された形質転換体、及び該形質転換体を培養することを特徴とする異種蛋白質の生産方法に関する。背景技術

メタノール資化性酵母は、メタノールを唯一の炭素源として生育可能な酵母である。メタノール資化性酵母におけるメタノール代謝は、最初の反応としてアルコールォキシダ一ゼによりメタノールと酸素からホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。生成した過酸化水素は力タラ一ゼにより水と酸素に分解される。ホルムアルデヒドは、ホルムアルデヒド脱水素酵素、 S-ホルミルグルタチオンヒドロラ一ゼ、ギ酸脱水素酵素の作用により、二酸化炭素まで酸化され、その際生じる NADH は細胞のエネルギー源となる。それと同時にホルムアルデヒドはジヒドロキシァセトンシンタ一ゼによリキシルロース- 5-リン酸と縮合し、グリセルァルデヒド -3-リン酸とジヒドロキシァセトンへと変換され、その後ベント一スリン酸経路を経て菌体構成成分となる。ここで挙げたアルコールォキシダ一ゼ、ジヒドロキシアセトンシンターゼ及びギ酸脱水素酵素は、メタノール存在化で培養すると著量生産され、菌体内可溶性蛋白質の約 40%に達する。

前述のごとく、メタノ一ル資化性酵母は安価なメタノ一ルで大量培養が可能であるうえに、他の酵母には見られない強力な転写活性を有するメタノ一ル代謝酵素プロモータ一を有するという点で、異種遺伝子発現系として適した酵母であると考えられる。

カンジダ . ボイジニイ（Candi da bo i dini i )は、メタノール資化性酵母の一種である。そして該酵母を利用してアルコールォキシダ一ゼ遺伝子、ギ酸脱水素酵素遺伝子の調節領域を用いた異種遺伝子の発現方法が研究されている（特開平

5-344895号公報、 W0 97/ 10345等）。一方、これらの発現系において発現べクタ —が多コピーで染色体に揷入された形質転換体が異種遺伝子を高生産する例 (Appl . Mi crobiol . Biotechnol . , 42， 860-864 ( 1995)、日本農芸化学会平成 8 年度大会講演要旨集 257 ページ、平成 8年度日本生物工学会大会講演要旨集 314ページ）が少なくない。発現ベクターの形質転換体内での安定性を考えると、低コピー数で高い発現量を達成することがよリ望ましいと考えられるので、更に強力な転写活性を有するプロモーターの開発が求められている。発明の開示

本発明は、異種遺伝子を発現させるのに有用な強力な転写活性を有するプロモ —ター、該プロモーターを担持する発現ベクター、該発現べクタ一が導入された形質転換体、及び該形質転換体を用いた異種遺伝子発現産物の生産方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題に基づいて、転写活性の高いプロモータ一を開発する目的で鋭意研究を重ねた結果、メタノール資化性酵母カンジダ · ボイジニイ (Canidi da boidini i )において機能するプロモーター DNA 断片に特定塩基配列からなるヌクレオチドを付加して得られる DNA断片をプロモータ一として利用することによって、その下流領域に位置する異種遺伝子を効率よく発現させうることを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は配列番号 1で表わされる塩基配列からなる D N A、又は該塩基配列において 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつプロモーター活性を上昇させる D N Aである。

さらに、本発明は、任意のプロモーターの前、後及び内部の領域の少なくとも 1箇所に、前記 D N Aの 1個又は複数の断片が正方向又は逆方向で配置された変異型プロモーターである。

さらに、本発明は、前記変異型プロモーター及び異種遺伝子を含む発現用組換えベクターである。ここで異種遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子を意味し、特に限定されるものではない。異種遺伝子としては、例えば酸性フォスファタ一ゼ遺伝子、一アミラーゼ遺伝子、各種インタ一フエロン遺伝子、エリスロポェチン遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子遺伝子等が挙げられる。また、異種遺伝子は、いかなる手法によって得られるものでもよい。

さらに、本発明は、前記べクタ一によって形質転換された形質転換体である。さらに、本発明は、任意のプロモータ一の前、後及び内部の領域の少なくとも 1箇所に、前記 D N Αの 1個又は複数の断片を正方向又は逆方向で配置させることを特徴とするプロモータ一活性を増大させる方法である。

さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から異種遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする前記発現産物の生産方法である。ここで、培地としては、炭素源としてメタノールを含む培地、メタノールにグリセロールを添加した培地、あるいは任意の炭、窒素源にギ酸を添加した培地等が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の完成にあたり、メタノ一ル資化性酵母カンジダ · ボイジニイ (Canidida boidini i ) のギ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター（以下、 FDH プロモーターと略称することがある）転写活性に必須な領域（以下、 UAS 配列という）を特定した。すなわち、本発明の DNAは、配列番号 2で表わされる塩基配列を有する Canidi da boidini iのギ酸脱水素酵素遺伝子プロモータ一のうち、塩基番号 841〜880の配列を有するものであリ、 UAS配列という。

本発明において「任意のプロモータ一」とは、宿主細胞内において転写活性を有する DNA断片であり、その種類が限定されるものではない。従って、本発明でいう任意のプロモータ一（プロモータ一 DNA断片）は、転写活性を有すれば由来の生物は限定されず、また、転写活性を有する限り、野生型プロモーターに由来する塩基配列の一部に置換、欠失、付加、挿入等の変異が生じてもよい。なお、置換、欠失、付加及び挿入の場所及びその数に限定されない。本発明では、プロモータ一として Candida boi dini i ギ酸脱水素酵素遺伝子プロモータ一（配列番号 2 ) 、 Candida boi dini i ァクチン遺伝子プロモータ一（配列番号 3 ) が例示される。そして、例えば配列番号 2で示される塩基配列の第 1番目から第 300番目まで欠失された DNA断片でも Cand i da bo i d i ni i において転写活性を有する限リ、かかる欠失された DNA断片も本発明における任意のプロモータ一に含まれる。なお、変異の導入は、通常の遺伝子工学的手法により行うことができ、例えば制限酵素処理、化学合成した DNA の利用、 PCR 法、部位特異的変異法、 Exonuc l ease I I I を用いた欠失体作製法などが挙げられる。

本発明の変異型プロモーターは、上記任意のプロモータ一 DNA断片に上記 UAS 配列が正方向又は逆方向に配置したものである。

UAS 配列が正方向に配置するとは、 UAS 配列と相同な配列、すなわち配列： 5' -TTTACCACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG-3' (配列番号 1 ) が、プロモーター MA 断片に、 5'側から 3'側への方向と同じ向きで配置する（付加又は揷入される）ことを意味する。また、逆方向に配置するとは、 UAS 配列と相補的な配列、すなわち配列： 5' - CTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAA-3' (配列番号 4 ) 、プロモータ一 DNA 断片に、 5'側から 3'側への方向と同じ向きで配置する（付加又は挿入される）ことを意味する。

本発明の変異型プロモータ一は、プロモーター DNA 断片に UAS 配列が単独で含有されていてもよく、連なって複数個、好ましくは 2個以上含有したものでもよい。また、単独又は複数含有される UAS配列の塩基配列の方向性も問わず、正方向でも逆方向でもよく、さらに正方向のものと逆方向のものとが混在していてちょい。

本発明の（1)変異型プロモータ一の作製、（2)発現べクタ一の構築並びに（3)本発現べクタ一を用いた形質転換体の作製及び培養は、例えば、以下のようにして行う。

( 1 ) 変異型プロモーターの作製

本発明の変異型プロモータ一は、プロモータ一 DNA断片に化学合成した UAS配列を付加することによつて調製することができる。ここでプロモータ一 DNA断片は、すでにプロモータ一配列として同定されている配列を、通常の遺伝子クロ一ニング手法（例えば、 Mo lecul ar C l oning, Co ld Spring Harbor Lab. , ( 1989)に記載の方法）、 PCRによる方法、化学合成による方法等で取得できる。

また、宿主細胞内においてプロモータ一活性を有する DNA断片は、宿主細胞内で自律複製能を有する DNA配列とプロモータ一配列を持たないマーカ一遺伝子とを有するプラスミドのマ一力一遺伝子上流に制限酵素等によって低分子化した DNA 断片をクロ一ニングしたライブラリ一を用いて取得してもよい。マーカー遺伝子としては、 G418 耐性等の抗生物質耐性遺伝子、 URA3、 LEU2 等の栄養要求性相補遺伝子が例示される。作製したライブラリ一 DNAを宿主細胞に形質転換すると、プロモータ一活性を有する DNA断片がマーカ一遺伝子の直前にクロ一ニングされたプラスミドを有する形質転換体は、対応するマ一カーで選択されることから、得られた形質転換体から全 DNAを抽出して大腸菌に形質転換することによリ、プロモーター活性を有する DNA断片を効率よく分離することができる。

UAS配列の配置は、プロモータ一 DNA断片に存在する制限酵素部位、又は通常の遺伝子工学的手法によリ人為的に付加した制限酵素部位を用いて行うことができる。例えば、 UAS 配列の両端に特定の制限酵素部位を連結し、その制限酵素で認識される配列と同じ配列を任意のプロモーターに組み込んだ後、両者を連結する方法等が挙げられる。

( 2 ) 発現べクタ一の構築

上記で得られた変異型プロモータ一は、異種タンパク質の構造遺伝子、タ一ミネ一タ一、選択マーカ一遺伝子、相同領域等と共に適当なベクタ一の中に揷入され、異種遺伝子発現べクタ一として使用される。使用されるベクターとしては、通常公知のベクタ一として知られる pBR系統、 pUC系統、ブル一スクリプト系統等の大腸菌プラスミドベクタ一が例示される。ターミネータ一、選択マ一力一遺伝子、相同領域は、宿主内で機能するものであれば当業者が容易に決めることができる。タ一ミネ一ターとしては、例えばァクチン遺伝子タ一ミネ一ター、ギ酸脱水素酵素遺伝子ターミネータ一等が挙げられ、選択マーカ一遺伝子としては、 G418 等の抗生物質耐性遺伝子、 URA3、 LEU2 等の栄養要求性相補遺伝子等が挙げられる。発現ベクターの構成成分をベクターに挿入することは、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術により当業者が容易に実施することが可能である。

( 3 ) 形質転換体の作製および培養

本発明の形質転換体は、上記で得られた組み換え発現べクタ一を適当な宿主細胞に導入されることによって調製される。

使用される宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母など特に限定されるものではないが、好ましくは酵母、より好ましくはメタノール資化性酵母である。具体的には Candi da boi dini i が例示される。宿主へのプラスミドの導入は、通常、形質転換に用いられる一般的な方法を応用することが可能である。すなわち、プロトプラスト法、リチウム法、エレクト口ポレーシヨン法、カルシウム法等を適用することが出来る。

本発明の発現ベクターは、宿主染色体 DNAに組み込まれる。また、宿主細胞内で自己複製可能な自律性複製配列を有するベクターを用いて、プラスミド状態で存在させることも可能である。なお、宿主細胞内に存在する異種遺伝子のコピー数は 1 コピーでも複数であってもよい。

このようにして得られた形質転換体を培養し、得られる培養物から異種遺伝子発現産物を採取することにより、目的とする遺伝子発現産物を取得することができる。ここで、「遺伝子発現産物を採取する」とは、培養菌体から遺伝子発現産物を抽出すること、培養上清自体を回収すること、及び培養上清から発現産物を精製することのいずれをも意味する。

上記形質転換体は、メタノールぉよびギ酸によリ異種遺伝子を誘導発現するので、培地としては以下のものが例示される。

メタノールによって誘導発現させる際には、炭素源としてメタノールを含む他、酵母エキス、トリプトン、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、アンモニゥム塩等の 1種以上の窒素源と、リン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシゥム、鉄、銅、マンガン、コバルト等の無機塩類とを添加し、さらに必要に応.じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、誘導を阻害しない糖質原料を便宜添加した培地が用いられる。

ギ酸によって誘導発現させる際には、ギ酸を含む他、グルコース、グリセ口一ル等の 1種以上の炭素源、酵母エキス、トリプトン、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、アンモニゥム塩等の 1種以上の窒素源、そしてリン酸、ナトリウム、力リウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、マンガン、コバルト等の無機塩類を添力 Qし、さらに必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、誘導を阻害しな、糖質原料を便宜添加した培地が用いられる。

培地の pHは、 5〜 8の範囲が好ましい。また培養温度は通常 15〜45°C、好ましくは 28°C前後である。培養時間は 24〜1000時間程度であり、培養は静置、振とう、攪拌、通気下の回分培養又は連続培養により実施することができる。培養終了後、培養物から遺伝子産物を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用いることができる。例えば、形質転換細胞内に生産された場合は、常法によリ菌体を超音波処理、磨砕処理、加圧破砕等により遺伝子産物を抽出する。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。培養上清中に生産された場合、培養液そのものを用いることができる。得られた溶液をろ過、遠心分離等により固形部分の除去し、粗タンパク質溶液を得る。必要によリブロタミン処理等による核酸の除去を行う。

粗タンパク質溶液から塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー等の精製手法を組み合わせることにより、目的タンパク質が分離精製される。図面の簡単な説明

図 1は、プラスミド pPUFlの構造を示す図である。

図 2は、上流欠失型 FDHプロモーターの支配下で発現される酸性フォスファタ —ゼ活性を示す図である。

図 3は、内部領域が欠失した FDHプロモータ一による酸性フォスファタ一ゼ発現プラスミド pPFIDlの構築法を示す図である。

図 4は、内部領域が欠失した FDHプロモーターの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示す図である。

図 5は、 UAS 配列と考えられる配列番号 1に相当する配列を含む化学合成した DNA断片、及びそれが Xho I部位に揷入される様式を示す図である。

図 6は、 UAS 配列と考えられる配列番号 1に相当する配列を付加した変異型 FDH プロモータ一の構造、及びそれらの支配下で発現される酸性フォスファタ一ゼ活性を示す図である。図 7は、プラスミド pAcPHの構造を示す図である。

図 8は、 UAS 配列と考えられる配列番号 1に相当する配列を付加した変異型ァクチンプロモーターの構造、及びそれらの支配下で発現される酸性フォスファタ —ゼ活性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

実施例 1

本実施例は、上流領域を欠失した Candida boidinii FDHプロモータ一を作製し、上流欠失型 FDH プロモータ一により支配される酵母（ Saccharomyces cerevisiae) 由来の酸性フォスファタ一ゼ活性を測定することにより FDHプロモ一ターの機能に必要な領域を同定した例である。

(1-1) 酸性フォスファターゼ発現プラスミドの作製

マ一力一遺伝子として URA3遺伝子を有する、 FDH プロモーター/ターミネ一ターによる酸性フォスファタ一ゼ発現プラスミド pPUFl (図 1 ) は、 W097/10345 に記載されている方法に従って作製した。宿主株は URA3 遺伝子の変異株である Candida boidinii KST25 株を用いた。 PUFl は W097/10345に記載されている方法に従えば容易に得ることが可能である。 FDHプロモータ一 Zターミネータ一、 URA3 遺伝子、 PH05 遺伝子は、それぞれ W097/ 10345、 Sakai Y. et al., J. Ferment. Bioeng. , 73, 255-260 (1992)、 Arima, K. et al. , Nucleic Acids Res., 11, 1657(1983)に記載されている配列をもとに化学合成によって取得することも可能である。本実施例では Candida boidinii KST25 株を用いている力他の Candida boidinii株、例えば IFO 10035株を用いても、公知の方法（Sakai Y. et al., J. Bacteriol., 173, 7458(1991)) に従えば容易に URA3遺伝子変異株を取得することができる。

(1-2) 上流欠失型 FDHプロモータ一によリ支配される 1¾05発現ブラスミドの構築

上流領域を欠失した FDHプロモータ一は、キロシークェンス用デレ一シヨンキット（宝酒造社）及び PCRにて作成した。プラスミド pPUFlを Apa I -Xho Iで切断し、キロシークェンス用デレ一シヨンキットを用いて処理し、上流欠失型 FDH プロモータ一により支配される PH05発現プラスミド pPUF15、 pPUF24、 pPUF44、 pPUF54、 pPUF56、 pPUF79、 pPUF308及び pPUF310を取得した。これらのプラスミドを錡型としてダイプライマ一サイクルシークェンシングキット（パーキンエルマ一社）を用いて塩基配列を決定し、プラスミド pPUF15、 pPUF24, pPUF44、 pPUF54、 pPUF56、 pPUF79、 pPUF308、 pPUF310 は FDH プロモータ一領域をそれぞれ 1215bp、 1000bp、 839bp、 690bp、 756bp、 403bp、 228bp、 115bp有していることを確認した。

PCRにて上流領域を欠失した FDHプロモータ一を作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。

PF819 ; CCCCTCGAGGAAATAGATACATTACCCAGTGTC (配列番号 5 )

PF801； CCCCTCGAGTGTCATCGATATTATGCCCCGCC (配列番号 6 )

PF779； CCCCTCGAGGCCTTTTTCACTTGAAACAATAACTAT (配列番号 7 )

PF668； CCCCTCGAGTAATACTAGTCAGATGTTATAATTATATC (配列番号 8 )

PF642； CCCCTCGAGTATCTTTACCACTATCCAATTAAAATCC (配列番号 9 )

PF622； CCCCTCGAGTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG (配列番号 10)

PF602； CCCCTCGAGTAGTTTTTATATCTGTAACATCTTAC (配列番号 1 1 )

PF 194； CCCCTCGAGTAAATTCAACTAAAAATTGAACTATTTAAACACTATG (配列番号 12) PF161 ; CCCCTCGAGATGATTTCCTTCAATTATATTAAAATCAATTTC (配列番号 13) PRV3； CAATGAGCCGTTGAATTGACGAGTG (配列番号 14)

オリゴヌクレオチド PF819、 PF801、 PF779、 PF668、 PF642、 PF622、 PF602、 PF194、 PF161 のいずれかと PRV3 とを用いて、 pPUFl を铸型とした PCR ( ( 94°C で 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20サイクル）を行った。それぞれの増幅 DNA 断片を pT7 B lue T-Vector (ノバジェン社）にクロ一ニングした後、 Xho I - Not I で切り出し、 pPUFlの Xho I -Not I に揷入した。プライマ一 PF819から得たプロモータ一領域を 819bp有している PH05発現プラスミドを pPUF819、ブライマ一 PF801 から得たプロモーター領域を 801bp有している PH05発現プラスミドを pPUF801、プライマー PF779から得たプロモータ一領域を 779bp有している PH05発現プラスミドを _PPUF779、プライマ一 PF668から得たプロモータ一領域を 668bp有している PH05発現プラスミドを pPUF668、プライマ一 PF642から得たプ口モータ—領域を _642bp有している PH05発現プラスミドを pPUF642、プライマ一 PF622から得たプロモーター領域を 622bp有している PH05発現プラスミドを pPUF622、プライマ一 PF602から得たプロモータ一領域を 602bp有している PH05 発現プラスミドを pPUF602、プライマ一 PF194 から得たプロモーター領域を 194bp有している PH05発現プラスミドを pPUF194、プライマ一 PF161から得たプ口モータ一領域を 161bp有している 1¾05発現プラスミドを pPUF161と命名した。 (1-3) 形質転換

上記実施例（ 2) で得たプラスミド DNA 5/ g を Bam HI で切断し、 Candida boidinii KST25 株に形質転換した。得られた形質転換体のコロニーを各ブラスミドにっき数個拾い、メタノール 1.5%、 Yeast Nitrogen Base 0.67%、酵母エキス 0.5%を含む pH5.5 の培地（ME 培地）、又はグルコース 1.0%、ギ酸ナトリウム 0.5%、 Yeast Nitrogen Base 0.67%を含む pH5.5の培地（GF培地）で培養し、酸性フォスファタ一ゼ活性を測定した。酸性フォスファターゼ活性の測定法は、 Toh - e らの方法（Toh-e, に et al.， J. Bacteriol. , 113， 727 (1973)) に従い、洗浄菌体懸濁液をそのまま酵素として用いた。 1単位の酵素活性は、 30°Cで 1分間に lmmoleの P-ニトロフエノールを生成する酵素量とした。公知の文献（Sakai Y. et al. , J. Bacteriol., 173， 7458(1991)) によると、 URA3 をマーカ一とした形質転換では、形質転換細胞の約半分が、プラスミドが 1 コピー組み込まれたものであることから、各プラスミドからの形質転換体の酸性フォスファターゼ活性の値の分布が最も大きい値を、 1コピー挿入形質転換体の酸性フォスファタ一ゼ活性の値とした。またこれら形質転換体について、実際にブラスミドが 1コピー組み込まれていることをサザン解析によって確認した。 pPUFl が示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット Z0D610) を 100 としたときの各プラスミドからの形質転換体が示す酸性フォスファタ一ゼ比活性を図 2 に示す。図 2の結果から、メタノールによって誘導する場合は、プロモータ一領域を 839bp以上、ギ酸によって誘導する場合は、プロモータ一領域を 642bp以上有していれば、活性が 80%以上保持されることが明らかとなつた。なお、比活性は、プロモータ一領域が欠失していないプラスミド pPUFl の形質転換体が示す酸性フォスファターゼ活性を 100としたときの相対値を示している。また親株とは、プラスミドを導入していない Candi da bo i d i ni i KST2515 株の値である。実施例 2

本実施例は、内部領域を欠失した Candi da boi dini i FDH プロモータ一を作製し、内部欠失型 FDH プロモーターにより支配される Saccharomyces cerevi s i ae 由来の酸性フォスファタ一ゼ活性を測定することにより FDHプロモータ一の機能に必要な領域を同定した例である。

(2-1 ) 内部欠失型 FDHプロモータ一により支配される PH05発現プラスミドの構築

内部領域を欠失した FDHプロモータ一は、 PCRにて作成した（図 3に pPFIDlの構築法を示す）。 PCR にて内部領域を欠失した FDH プロモーターを作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。

PF1478； CCCCTCGAGTCAACAAATCAATCAGCCAATCTACC (配列番号 15)

PF521； CCAGATCTTGATAATAAGGTATACTACATTTTATC (配列番号 16)

PC548； CCAGATCTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAAGATG (配列番号 17) PC571； CCAGATCTAGTAGTAAGATGTTACAGATATAAAAACTACCG (配列番号 18)

PC599； CCAGATCTCTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGG (配列番号 19)

PC619； CCAGATCTTTAATTGGATAGTGGTAAAGATATAATTATAAC (配列番号 20)

PC641； CCAGATCTATAATTATAACATCTGACTAGTATTACC (配列番号 21 )

オリゴヌクレオチド PF521 と PRV3を用いて、 pPUFlを铸型とした PCR ( (94°C で 30 秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20 サイクル）を行い、増幅 DNA 断片を pT7 B lue T-Vectorにクローニングした後、 Bgl I I-Not Iで切り出した。 PF1478 と PC548、 PC571、 PC599、 PC619、 PC642のいずれかを用いて、 pPUFl を錡型とした PCR ( (94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20サイクル）を行った。それぞれの増幅 DNA 断片を pT7 Blue T- Vector にクロ一ニングした後、 Xho I - Bgl I Iで切り出し、前述の Bgl I I-Not I DNA断片とともに、 pPUFlの Xho I -Not I に挿入した。プライマー PC548から得た配列番号 2の 932番目から 957番目の塩基配列が欠失した FDH プロモータ一領域を有している PH05発現プラスミドを pPFIDl、プライマ一 PC571から得た配列番号 2の 909番目から 957番目の塩基配列が欠失した FDHプロモータ一領域を有している PH05発現プラスミドを pPFID2、プライマー PC599から得た配列番号 2の 881番目から 957番目の塩基配列が欠失した FDHプロモータ一領域を有している PH05発現プラスミドを pPFID3、プライマ一 PC619 から得た配列番号 2の 861番目から 957番目の塩基配列が欠失した FDHプロモータ一領域を有している PH05発現プラスミドを pPFID4、プライマー PC642 から得た配列番号 2の 839 番目から 957 番目の塩基配列が欠失した FDH プロモータ一領域を有している PH05発現プラスミドを pPFID5と命名した。

(2-2) 形質転換

上記実施例（2-1 ) で得たプラスミドを実施例（1-3 ) と同様の方法で、 Candi da bo i dini i に形質転換し、 ME培地、 GF培地での酸性フォスファタ一ゼ活性を測定した。 pPUFl が示す酸性フォスファタ一ゼ比活性（ユニット Z0D610) を 100としたときの各プラスミドからの形質転換体が示す酸性フォスファタ一ゼ比活性を図 4に示す。なお、比活性は、プロモーター領域が欠失していないブラスミド pPUFlの形質転換株が示す酸性フォスファタ一ゼ活性を 100としたときの相対値を示している。

配列番号 2の 881番目から 957番目の塩基配列が欠失したものでは FDHプロモ —ター活性には全く影響を与えなかったが、 861番目から 957番目の塩基配列が欠失したものではメタノール及びギ酸による誘導が全く見られなかった。本結果と実施例 1の結果より、配列番号 2の 837番目から 880番目の塩基配列が、メタノール及びギ酸によって誘導するには、 FDH プロモータ一活性に必要であると考えられた。実施例 3

本実施例は、 UAS 配列を付加した Cand i da bo id ini i FDH プロモータ一を作製し、該プロモータ一によリ支配される Saccharomyces cerevi s i ae 由来の酸性フォスファタ一ゼ活性を測定したものである。 ( 3-1 ) PH05発現プラスミドの構築

5'末端に Xho I 部位を有する FDHプロモーター領域 lOOObp を単離するために以下のオリゴヌクレオチド PXF1000を合成した。

PXF1000； CCCTCGAGGCTGGGTTTTTACTGAATTCAGTC (配列番号 22)

オリゴヌクレオチド PXF1000 と PRV3 を用いて、 pPUF24 を錡型とした PCR ( (94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X 20サイクル）を行い、増幅 DNA 断片を pT7 B lue T-Vector にクローニングした後、 Xho l -Not I で切り出し、 pPUFlの Xho I - Not I に揷入した。得られたプラスミドを pPUF24X と命名した。実施例 1、 2よリ推定される FDHプロモータ一活性に必要であると考えられる配列番号 1の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド UA3、 UA3Cを合成した。

AAAATCCATGGATCAGACGGTAG (配列番号 23)

UA3C ; TCGACTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAAGCTACCGTCTGATCCATG GATTTTAATTGGATAGTGGTAAAC (配列番号 24)

合成後、ォリゴヌクレオチド UA3、 UA3Cを T4ポリヌクレオチド ·キナーゼ（宝酒造社）により 5'末端をリン酸化し、それぞれ 100pmo l / / l になるように、ァニ —リングバッファ一（10mM Tri s-HC l , pH8. 0, 0. ImM EDTA, lOOmM NaC l ) に溶解した。前述オリゴヌクレオチド UA3、 UA3C溶液を等量混合し、 95°Cで 5分間加熱し、徐冷して両鎖をアニーリングした。得られた 2本鎖 DNA 断片は、両末端が Xho I 部位とライゲ一シヨン可能であり、ライゲ一シヨン後、図 5に示すように片方のみが再び Xho Iで切断される。

PPUF24Xを Xho Iで切断した後、先のァニ一リングした DNA断片とライゲーシヨンし、大腸菌 DH5に形質転換した。数個の形質転換体よりプラスミド DNAを調整し、制限酵素分析にょリ、合成 DNA断片が揷入されているプラスミドを選択し、さらに挿入されている合成 DNA断片のコピー数及び、方向を決定した。配列番号 1の塩基配列が 2コピー正方向に挿入されたプラスミドを pMFPH2、 2コピー逆方向に揷入されたプラスミドを pMFPH2R、 4コピー正方向に挿入されたプラスミドを pMFPH4 と名付けた。得られたプラスミドのプロモータ一領域の構造の一部を図 6に示す。 (3-2) 形質転換

上記実施例（3-1) で得たプラスミド， pMFPH2, pMFPH2R, _PMFPH4 及び pPUFl を実施例（1-3) と同様の方法で Candida boidinii に形質転換し、 ME 培地、 GF 培地での酸性フォスファタ一ゼ活性（ユニットノ 0D610) を測定した。なお、 1 単位の酵素活性は、 30°Cで 1分間に Immoleの P-ニトロフエノールを生成する酵素量とした。各プラスミドからの 1コピー挿入型形質転換体が示す酸性フォスファタ一ゼ比活性を図 6に示す（活性は mU/0D610 で表示）。酸性フォスファタ一ゼ比活性は挿入した DNA断片により、大幅に上昇した。また、この効果はそのコピ一数に依存するものの、揷入方向とは無関係であった。

以上の結果よリ、揷入した配列番号 1の塩基配列は FDHプロモータ一がメタノ —ル及びギ酸により誘導される際に、必須な配列、すなわち FDHプロモーターの UAS配列として機能していること、及び UAS配列はプロモータ一の転写活性を揷入方向に依存せずに増強させることが明らかとなった。実施例 4

本実施例は、 UAS 配列を付加した Candida boidinii ァクチン遺伝子プロモ一タ一を作製し、該ブロモータ一により支配される Saccharomyces cerevisiae 由来の酸性フォスファタ一ゼ活性を測定したものである。

(4-1) PH05発現プラスミドの構築

ァクチンプロモータ一による PH05 発現プラスミドを構築するため、 Candida boidinii ァクチン遺伝子のプロモーター領域を PCR にて取得した。配列番号 3 に記載されている Candida boidinii ァクチン遺伝子のプロモーター領域の塩基配列をもとに、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。

XCAC5； TTCTCGAGTCAATAAGAGTGTGATTATATACAATCAGC (配列番号 25)

NCAC3； TTGCGGCCGCTTTTGTAATATATATTAAATTAAATTTATAAAATCTATC (配列番号

26)

オリゴヌクレオチド XCAC5と NCAC3を用いて、 W097/10345に記載の pAcl-7を錡型とした PCR ( (94°Cで 30秒、 55°Cで 1分、 72°Cで 1分） X20サイクル）を行った。なお、本実施例では PCRの錡型 DNA としてプラスミド pAc卜 7 を用いているが、 Candi da bo i d i ni i ATCC48180 株より取得した染色体 DNA を用いて行うことも可能である。増幅 DNA断片を pT7 B lue T-Vectorにクロ一ニングした後、 Xho I - Not I で切り出し、 pPUFl の Xho I -Not I に挿入した。得られたプラスミド pAcPH (図 7)はマーカ一が URA3遺伝子で、 Candi da bo i dini i ァクチン遺伝子プロモータ一、 FDH遺伝子タ一ミネ一ターによる PH05発現ブラスミドである。 pACPHのァクチン遺伝子プロモーターの 5'末端側に存在する Xho I部位に、実施例（3-1)と同様の方法で UAS配列を含む DNA断片を揷入し、 UAS配列が 2コピ一正方向に挿入されたプラスミド pUAcPH2、 UAS 配列が 4コピー正方向に挿入されたプラスミド pUAcPMを作製した。

(4-2) 形質転換

上記実施例（4-1) で得たプラスミド pAcPH、 pUAcPH2、 pUAcPH4及び pPUFl を実施例 U - 3) と同様の方法で、 Candi da bo i dini i に形質転換した。ただし、プラスミド DNAの切断には Hind I I I を用いた。得られた形質転換体の ME培地、 GF 培地、及びグルコース 1. 0%、 Yeast Ni trogen Base 0. 67%を含む pH5. 5の培地 (GS 培地）での酸性フォスファタ一ゼ活性を測定した。各プラスミドからの 1 コピ一挿入型形質転換体が示す酸性フォスファタ一ゼ比活性を図 8に示す。

UAS配列を持たないァクチン遺伝子プロモーター（pAcPH)では、 GS培地、 GF培地、 ME培地で酸性フォスファタ一ゼ活性には顕著な差が見られなかったものの、 UAS 配列を有するァクチン遺伝子プロモーター（pUAcPH2、 pUAcP )では、ギ酸脱水素酵素遺伝子プロモーターと同様に、 GF 培地、 ME 培地で著しい活性の上昇が見られた。

以上の結果から、実施例 3で示した UAS配列は FDHプロモーターのみならず他のプロモーターの活性を上昇させる効果があることが判明した。産業上の利用可能性

本発明により、高い転写活性を有するプロモーター、該プロモータ一を担持する発現べクタ一、該発現べクタ一が導入された形質転換体並びにプロモーター活性を増大させる方法及び異種蛋白質の生産方法が提供される。本発明により得られる変異型プロモーターは、野生型プロモーターと比べてプロモーター活性が格段に増強されているため、異種遺伝子を発現させるプロモータ一として利用価値が極めて高く、本発明の発現べクタ一は種々の有用なタンパク質を、効率良く発現、生産することができる。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1で表わされる塩基配列からなる DNA、又は該塩基配列において 1若しくは複数の塩基が欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列からなり、かつプロモータ一活性を上昇させる DNA。

2. 任意のプロモーターの前、後及び内部の領域の少なくとも 1箇所に、請求項 1記載の DNAの 1個又は複数の断片が正方向又は逆方向で配置された変異型プロモーター。

3. 請求項 2記載の変異型プロモータ一及び異種遺伝子を含む発現用組換えべクタ一。

4. 請求項 3記載のベクタ一によって形質転換された形質転換体。

5. 任意のプロモータ一の前、後及び内部の領域の少なくとも 1箇所に、請求項 1記載の DNAの 1個又は複数の断片を正方向又は逆方向で配置させることを特徴とするプロモータ一活性を増大させる方法。

6. 請求項 4記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から異種遺伝子の発現産物を採取することを特徴とする前記発現産物の生産方法。