JPH09135694A - カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のプロモーター／ターミネーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 アクチン遺伝子のプロモーター及びターミネ
ーターの提供。 【解決手段】 配列番号１で表される塩基配列を実質的
に含む、カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のプロ
モーター、配列番号２で表される塩基配列を実質的に含
む、カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のターミネ
ーター、並びに前記プロモーター、優性遺伝子マーカ
ー、目的遺伝子及び前記ターミネーターを含む遺伝子発
現カセット、該遺伝子発現カセットを含む組換え発現ベ
クター並びに該組換え発現ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、アクチン遺伝子の
プロモーター及び／又はターミネーター、並びに該プロ
モーター、ターミネーター、目的遺伝子及び優性遺伝子
マーカーを含む遺伝子カセット、該遺伝子カセットを含
む組換え発現ベクター並びに該発現ベクターによって形
質転換された形質転換体に関する。

【０００２】

【従来の技術】メタノール資化性酵母であるカンジダ・
ボイジニイ（Candida boidinii）は、一般に一倍体は稀
である。また、Candida boidinii ATCC32195株のperoxi
somalmembrane protein(PMP)遺伝子をプローブとしてサ
ザン解析を行った結果、分子量の異なった２本のバンド
を与えることが報告されている（J. Biol. Chem., 265,
20095 (1990)）。この結果は、当該酵母がヘテロな遺
伝子構成を持つ２倍体以上であることを示唆している。

【０００３】ところで、従来より、酵母の形質転換法に
おいて形質転換体を検出するには、主として宿主の栄養
要求性を組換えプラスミドで相補する方法により行われ
ていた。しかしながら、この方法では宿主としての栄養
要求性変異株を取得しなければならず、上記Candida bo
idinii ATCC 32195 株のような２倍体以上の株では一般
に劣性である栄養要求株を分離することは極めて困難で
ある。

【０００４】さらに、胞子形成能を欠くCandida boidin
iiでは、減数分裂により１倍体を得ることは極めて困難
である。従って、２倍体以上の当該酵母から栄養要求性
変異株を入手する場合、同機能を有する複数の遺伝子す
べてに変異を導入しなければならないために、目的とす
る変異株の出現は極めて低頻度となる。さらに、このよ
うな強い変異処理は他の様々な遺伝子にも同時に突然変
異を導入してしまうため、好ましくない性質を宿主に付
与する恐れもある。

【０００５】このため、栄養要求性の相補に拠らない形
質転換体の検出法が必要となる。かかる検出法として
は、薬剤耐性に代表される優性遺伝子マーカーを使用す
る方法が挙げられるが、一般に薬剤耐性遺伝子は、形質
転換酵母とは異なる生物の遺伝子（外来遺伝子）である
場合が多く、これを当該酵母内で発現させるためには、
発現に必要なプロモーター及びターミネーターが必要と
なる。

【０００６】これまで当該酵母より幾つかの遺伝子がク
ローニングされてきた。しかし、これらの遺伝子はアミ
ノ酸、核酸、メタノール代謝に関連したものであるため
培地成分等による制御を受けると考えられる。このため
マーカー遺伝子を発現するに最適であるとは言いがた
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記培地成
分等により制限を受けず、強力かつ構成的に発現するCa
ndida boidiniiの新規なアクチン遺伝子のプロモーター
及び／又はターミネーター、該プロモーター及び／又は
ターミネーターを含む遺伝子発現カセット、該遺伝子カ
セットを含む発現組換えベクター並びに該発現組換えベ
クターによって形質転換された形質転換体を提供するこ
とを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】発明者は、上記課題に基
づいて鋭意検討を重ねた結果、メタノール資化性酵母で
あるCandida boidiniiのアクチン遺伝子に構成的で強力
な転写活性を有することを見いだし、遺伝子を取得し、
その塩基配列を明らかにした。そして、この遺伝子のmR
NAを解析することによりプロモーター及びターミネータ
ーを単離し、さらに薬剤耐性等の遺伝子マーカーを発現
させることに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち、本発明は、配列番号１で表され
る塩基配列を実質的に含む、カンジダ・ボイジニイのア
クチン遺伝子のプロモーターである。さらに、本発明
は、配列番号２で表される塩基配列を実質的に含む、カ
ンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のターミネーター
である。

【００１０】ここで、「塩基配列を実質的に含む」とあ
るのは、目的とするプロモーター及び／又はターミネー
ター活性が得られる限り、配列番号１又は２で表される
塩基配列に、該塩基配列とは異なる塩基配列に置換さ
れ、該塩基配列の一部が欠失し、又は該塩基配列の一部
に他の塩基が挿入される等の変異が生じてもよいことを
意味する。例えば、配列番号１で表される塩基配列の第
３番目の「Ａ」が「Ｇ」に置換されても、本発明の目的
とするプロモーター活性が得られる限り、かかる置換さ
れた配列も本発明に含まれることを意味する。

【００１１】さらに、本発明は、前記プロモーター、優
性遺伝子マーカー、目的遺伝子及び前記ターミネーター
を含む遺伝子発現カセットである。「目的遺伝子」と
は、発現の対象となる遺伝子を意味し、同種であると異
種であるとを問わず、いずれの遺伝子をも含むものであ
る。

【００１２】さらに、本発明は、前記遺伝子発現カセッ
トを含む組換え発現ベクターである。さらに、本発明
は、前記組換え発現ベクターによって形質転換された形
質転換体である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のプロモーター及びターミネーターは、酵母カン
ジダ・ボイジニイ（Candida boidinii）のアクチン遺伝
子の塩基配列を決定した後、mRNAを解析することにより
得られるものである。

【００１４】(1) アクチン遺伝子 本発明では、まず、Candida 属に属する酵母からアクチ
ン遺伝子を単離する。アクチン遺伝子を取得するための
出発材料としては、Candida boidinii ATCC48180 株が
例示されるが、アクチン遺伝子は、酵母が有する必須遺
伝子であるため、その他のメタノール資化性Candida属
酵母であれば特に限定されない。例えば、Candida 属に
属するメタノール資化性酵母としては、IFO10035株、IF
O10240株、IFO10574株等が挙げられる。

【００１５】本発明においては、アクチン遺伝子のクロ
ーニング工程は、公知の方法（Molecular Cloning (198
9), Methods in Enzymology 194 (1991)）に従って行な
うことが出来る。すなわち、(a) 上記酵母の全DNAを抽
出し、当該DNAに由来するDNA断片を組み込んだ遺伝子導
入用ベクターを宿主に導入して上記酵母の遺伝子ライブ
ラリーを作成する。(b) ついで、かかる遺伝子ライブラ
リーから所望のクローンを選択して、当該クローンを増
幅することにより上記のクローニング工程を実施するこ
とが出来る。

【００１６】(a) 上記酵母の遺伝子ライブラリーの調製 上記酵母の全DNAの抽出は、例えば酵母のプロトプラス
トを予め調製して、当該プロトプラストから、通常公知
のDNA抽出法、高塩濃度下での細胞残さ除去後のアルコ
ール沈殿法、フェノールやクロロホルム抽出後のアルコ
ール沈殿法等の常法を用いて行なうことが出来る。な
お、上記のプロトプラストを調製する方法の他に、ガラ
スビーズ等による細胞破砕法等によってもDNAの抽出を
行なうことが出来るが、高分子量のDNAを調製すること
が容易であるという点から上記プロトプラスト法を行な
うのが好ましい。

【００１７】なお、上記の全DNAを鋳型として、既知の
アクチン遺伝子に共通すると推定されるオリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてPCR法（PCR Technology. Henry
A.Erlich, Atockton press (1989)）により所望するア
クチン遺伝子を特異的に増幅させ、上記クローニング工
程における作業を効率化することも可能である。遺伝子
組み換えの手順又は方法は、遺伝子工学の分野において
慣用されているものであり、既に刊行されている実験書
であるMolecular Cloning(Cold SpringHarbor, Maniat
is et. al.)を参照することが出来る。

【００１８】この際用いられるベクターとしては、通常
公知の遺伝子ライブラリー調製用ベクターとして知られ
る、pBR系統、pUC系統、ブルースクリプト(Blue Scrip
t)系統等の一般に市販され入手可能なプラスミドを用い
ることも出来る。また、Charon系統若しくはEMBL系統の
ファージベクター又はコスミド等も広く用いることが出
来る。調製した遺伝子ライブラリー作製用ベクターで形
質転換又は形質導入を行なう宿主は、上記ベクターの種
類に応じたもの、例えば大腸菌JM109、DH5、DH5α、LE3
92(P2)、XL1-Blue(P2)を採用することが出来る。

【００１９】(b) クローンの選択 遺伝子ライブラリーから所望の遺伝子を有するクローン
を選択して、当該クローンを増幅する方法も通常公知の
方法を用いることが出来る。すなわち、上記遺伝子ライ
ブラリーから、所望のアクチン遺伝子を有するクローン
をアクチン遺伝子に特有の配列を含む標識プローブを用
いてコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・
ハイブリダイゼーション法等により選択し、所望のアク
チン遺伝子を大腸菌細胞内にて増幅して、あるいは所望
のアクチン遺伝子をアクチン遺伝子に特有な配列を含む
オリゴヌクレオチドをプライマーとしてPCR法で直接増
幅して得ることが出来る。

【００２０】コロニー・ハイブリダイゼーション法や、
プラーク・ハイブリダイゼーション法において使用する
プローブとしては、既知のアクチン遺伝子の塩基配列を
使用することが可能であり、部分的な合成オリゴヌクレ
オチドを使用することも可能である。また、ハイブリダ
イゼーション及び非特異的に吸着したプローブを洗い落
とす工程では、完全一致の遺伝子をプローブとして用い
る場合に比較して、高い塩濃度や低い温度で実施するこ
とが可能である。

【００２１】上記方法により得られる所望の遺伝子の塩
基配列の決定および確認は、例えばマクサム・ギルバー
トの化学修飾法（Maxam-Gilbert, Methods in Enzymolo
gy,65 , 499 (1980))、ジデオキシヌクレオチド鎖終結
法(Messing,J. and Vieire,J., Gene, 19, 269 (198
2)）又はこれらの自動化された変法等を用いて行なうこ
とができる。

【００２２】(2) コーディング領域の特定 アクチン遺伝子は、イントロンと呼ばれる介在配列によ
って蛋白質コード領域が分断される。介在配列の数、塩
基数や位置等は生物種によって異なるため、得られたア
クチン遺伝子の塩基配列から直接コーディング領域を特
定することは極めて困難である。一方、コーディング領
域が特定出来なければプロモーターやターミネーターの
領域を推定することは出来ないことは言うまでもない。

【００２３】メタノール資化性酵母であるCandida boid
iniiのイントロンに関する報告は今だ刊行されておら
ず、これまで報告されたCandida boidiniiの遺伝子はす
べてイントロンを含んでいないものであった。それゆ
え、遺伝子の塩基配列からイントロンの範囲を特定する
十分な情報はこれまでに得られてはいない。

【００２４】一般的には、イントロンを確認する方法と
して、第一にDNA-mRNAのヘテロデュプレックスを電子顕
微鏡で観察する方法、第二にS1マッピングを行なう方
法、第三にcDNAライブラリーを作製し、当該遺伝子をス
クリーニングし、クローニングし、そして塩基配列を決
定した後、該塩基配列を染色体DNAライブラリーから取
得した遺伝子の塩基配列と比較する方法等が挙げられ
る。しかし、第一の方法は操作が極めて困難であるうえ
にイントロンの正確な位置がわからないこと、第二の方
法はアクチン遺伝子のmRNAを純粋に単離精製することが
極めて困難であることに加え、やはり塩基配列レベルで
イントロンの正確な位置を決定することが出来ないこ
と、第三の方法はmRNAの単離、逆転写酵素によるcDNA鎖
の合成、相補鎖の合成、ベクターへの連結、コロニー又
はプラーク・ハイブリダイゼーション法によるスクリー
ニング及び塩基配列の決定という煩雑かつ多大の労力と
時間を消費する欠点を有している。

【００２５】本発明者は、この問題を解決するために鋭
意検討を重ね、困難を克服するに至った。本発明では、
得られたアクチン遺伝子のイントロンが開始コドンの極
く近傍に存在することが、既知のアクチン遺伝子との比
較より明らかになったことから、当該遺伝子の塩基配列
から蛋白質をコードしている領域（エクソン）を見つ
け、この領域を有するプライマーを合成する（リバース
プライマー）。酵母細胞よりcDNAライブラリーを作製
し、得られたcDNAライブラリーの3'末端上流に存在する
ベクター由来の塩基配列を利用したプライマーと前記リ
バースプライマーとを用いてPCR 増幅反応を行ない、増
幅産物の塩基配列を決定する。

【００２６】(3) プロモーター領域、ターミネーター領
域の単離 本発明のプロモーター領域は、本発明者が前記(2) で決
定されたアクチン遺伝子のN末端にイントロンを有する
点に着目し、mRNAを解析することによって開始コドン及
び5’上流を明らかにし、単離されたものである。ま
た、本発明のターミネーター領域は、終止コドンの下流
を単離したものである。

【００２７】プロモーター領域及びターミネーター領域
を取り出すには、制限酵素を用いて切り出すことも可能
でもあるが、一般的に、都合の良い制限酵素部位が適切
な位置に存在するとは限らない。そこで、コーディング
領域の制限酵素部位からエキソ型DNA 分解酵素によって
プロモーターの方向にアクチン遺伝子を削って行き、適
当なところまで削れたクローンを探す方法を用いること
ができる。また、予め制限酵素認識部位を末端に設けた
プライマーを用い、PCR 反応で所望のプロモーター領域
及びターミネーター領域を増幅し、取得することが容易
であるため、かかる方法を用いることもできる。さら
に、これらの領域を化学合成することも可能であるし、
一部の領域を化学合成し、クローン化したDNAと制限酵
素部位を利用して、半合成のプロモーターやターミネー
ターを作製することも可能である。

【００２８】配列番号１にプロモーター配列を例示する
が、本質的に転写活性を坦持する配列であればこの配列
に限定されるものではなく、欠失、挿入、置換、付加な
どによってその塩基配列を改変することが可能である。

【００２９】(4) マーカー遺伝子発現のDNA断片の構築 後述する形質転換体の検出を容易にするため、プロモー
ターとターミネーターとの間にマーカー遺伝子を挿入す
る。前記プロモーターと前記ターミネーターとの間に配
置するマーカー遺伝子は、検出が容易なものであればそ
の種類を問わない。例えば、薬剤耐性を与えるG-418、
ブラストサイジンS、シクロヘキシミド、スルホメチュ
ロン・メチル等の化学物質に耐性を与える遺伝子、重金
属に耐性を与えるCUP1等の遺伝子、β−ガラクトシダー
ゼ等の平板培地上で活性の容易に検出できる遺伝子、又
は当該酵母が保有しないショ糖分解酵素のSUC遺伝子若
しくはメリビオース分解酵素のMEL遺伝子を挙げること
が出来る。

【００３０】(5) 形質転換 形質転換の対象となる酵母へのプラスミドの導入は、酵
母の形質転換に用いられてきた一般的な方法を応用する
ことが可能である。すなわち、プロトプラスト法、リチ
ウム法、エレクトロポレーション法、又はこれらの変法
を適用することが出来る。

【００３１】目的とする形質転換体を得るためには、導
入した形質を示さなければ生育することのできない培地
で培養することによって行う。例えば、プロモーターと
ターミネーターとの間に薬剤耐性を与えるG-418遺伝子
を導入した場合は、宿主細胞が生育することのできない
量のG418を含む培地に形質転換体を塗布し、このうち生
育した細胞を目的の形質転換体として得ることができ
る。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例に何ら限定され
るものではない。 〔実施例１〕Candida boidiniiのアクチン遺伝子の単離 (1) Candida boidiniiのゲノムDNAライブラリーの作製 YPD培地（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース
２％、pH6.0)で培養したCandida boidinii ATCC48180株
の菌体より、酢酸カリウム法（Methods Enzymol., 65,
404 (1980)）に基づき染色体DNAを調製した。

【００３３】Frischaufらの方法（Methods in Enzymolo
gy, 152, 183, Academic press (1987)）に従い、染色
体DNAを制限酵素Sau3AIを用いて部分分解し、10〜40％
ショ糖密度勾配遠心分離を行なって15〜20kb画分のDNA
を調製した。ベクターDNAとしてpUC118を用いた。pUC11
8は制限酵素BamHI切断の後、アルカリフォスファターゼ
で処理した。

【００３４】100ngのSau3AIで部分分解したCandida boi
dinii ATCC48180株染色体DNA断片と50ngのBamHI切断し
たpUC118とを混合した後、DNAライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて16℃、30分間の反応により連結
した。Hanahanの方法（Gene, 10, 63 (1980)）に基づ
き、形質転換細胞として調製した大腸菌DH5α株に上記
組換えプラスミドを形質転換したところ、約20,000個の
形質転換体が得られた。

【００３５】(2) アクチン遺伝子の単離 Candida boidiniiアクチン遺伝子は、放射性同位元素で
標識した相同的なサッカロミセス・セレビシエ（Saccha
romyces cerevisiae）のアクチン遺伝子とのハイブリダ
イズにより単離された。Saccharomyces cerevisiaeのア
クチン遺伝子の調製にはPCR法を用いた。既知のSacchar
omyces cerevisiaeのアクチン遺伝子（Gallwitz, D. ,S
ures, I., Proc.Natl. Acad.Sci. U.S.A., 77, 2546 (1
980)）の塩基配列に従ってPCR法のプライマーとして下
記の２種類のオリゴヌクレオチドを、394型DNA/RNAシン
セサイザー（アプライドバイオシステム社）を用いて合
成した。

【００３６】 PScAC1：配列番号３ PScAC2：配列番号４ プライマーPScAC1、PScAC2は、それぞれSaccharomyces
cerevisiaeのアクチン遺伝子のエクソン２領域のＮ末端
側、Ｃ末端側のアミノ酸配列に相当する塩基配列であ
る。

【００３７】Saccharomyces cerevisiae S288C株から調
製された染色体DNAと、プライマーPScAC1及びPScAC2と
を混合し、PCR反応を行なった。PCR は、94℃で30秒、5
5℃で１分及び72℃で２分を１サイクルとしてこれを25
サイクル行った。反応生成物をアガロースゲル電気泳動
し、増幅されたDNA断片を回収した。このDNA断片をメガ
プライマーDNAラベリングシステム（アマシャム社）を
用いて³²Ｐで放射性標識した。

【００３８】ハイブリダイゼーションは、常法（Molecu
lar cloning 2nd edn., ed.Sambrook, J. et al., Cold
Spring Harbor Laboratory U.S.A.(1989)）に従い、65
℃で16時間行ない、フィルターを0.1％SDSを含む２×SS
PE緩衝液で２回、0.1％ SDSを含む１×SSPE緩衝液で１
回洗浄した後、オートラジオグラフィーによって陽性ク
ローンを検出した。

【００３９】得られた４個の陽性クローンによりアルカ
リ抽出法（Molecular cloning 2ndedn., ed.Maniatis e
t al., Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A.(198
9)）に従って、プラスミドDNAを単離した。得られたプ
ラスミドDNA及び、Candida boidinii ATCC48180株の染
色体DNAを種々の制限酵素で切断し、サザンハイブリダ
イゼーションを行なった。ハイブリダイズしたバンドの
大きさを比較したところ、プラスミドpAc1を有するクロ
ーンがアクチン遺伝子領域を含むものと考えられた。

【００４０】(3) サブクローニング アクチン遺伝子の制限酵素地図を作成するために、プラ
スミドpAc1を制限酵素Kpn I、Sma I切断し、アクチン遺
伝子を担持する約６kbの断片をpBluescript IIKS+のKpn
I、Sma I部位に挿入したプラスミドpAc1-7を作製し
た。このpAc1-7について更に詳細な制限酵素地図を作製
した（図１参照）。サザンハイブリダイゼーションによ
って解析したところ、約５kbのKpn I-Cla I領域にアク
チン遺伝子があると考えられた。塩基配列決定のため、
更にサブクローニングを行なった。まず、pAc1-7をKpn
I-Hind III切断し、約3.4kbの断片を抽出し、T4 DNAポ
リメラーゼで平滑化した後、pBluescript II KS+のSma
I部位に挿入したpAc1-7-10、方向が逆向きに挿入された
pAc1-7-17を作製した。次にpAc1-7を制限酵素Cla I切断
し得られた約２kbの断片をpBluescript II KS+のCla I
部位に挿入したプラスミドpAc1-7/Claを作製した（図１
参照）。

【００４１】(4) 塩基配列決定 プラスミドpAc1-7-10、pAc1-7-17、及びpAc1-7/Claから
キロシーケンス用デレーションキット（宝酒造社）を用
いて種々の欠失変異プラスミドを作製した。これらのプ
ラスミドを鋳型としてダイプライマーサイクルシーケン
スキット（パーキンエルマー社）を用いて塩基配列を決
定した。決定したプラスミドpAc1-7-10、pAc1-7/Claの
塩基配列をつなぎ合わせることにより、図１の約５kbの
KpnI-ClaI 領域の全塩基配列が決定された（図２，配列
番号５）。

【００４２】この配列から、アクチン遺伝子のコーディ
ング領域を決定した。TimeSaver cDNA Synthesis Kit、
Directional Cloning Toolbox（ファルマシア社）を用
いて、Candida boidinii ATCC48180株より、mRNAの5'末
端にEcoRI突出末端、3'末端にNotI突出末端を有するcDN
Aを合成した。合成したcDNAは、Phagemid Directional
Cloning Vector（ファルマシア社）を用いて、プラスミ
ドpT7T3DのEcoRI-NotI部位に結合し、これをcDNAライブ
ラリーとした。Saccharomyces cerevisiaeのアクチン遺
伝子と高い相同性を示した配列（配列番号５で表される
塩基配列の2858番目から3558番目の領域）からオリゴヌ
クレオチドPCBACを、ベクターpT7T3DのEcoRI部位上流の
塩基配列からオリゴヌクレオチドPT3T7を合成した。

【００４３】 PCBAC ：配列番号１２ PT7T3 ：配列番号１３ 上記cDNAライブラリーにプライマーPCBAC及びPT7T3を混
合し、rTaqポリメラーゼ（宝酒造社）を用いたPCR反応
を行なった。PCR は、94℃で30秒、55℃で１分、72℃で
30秒を１サイクルとしてこれを25サイクル行った。反応
生成物をアガロースゲル電気泳動し、増幅DNA断片を回
収した。回収したDNA断片とベクターpT7 Blue T-Vector
を結合した。これらのプラスミドを鋳型として、ダイプ
ライマーサイクルシーケンスキットを用いて塩基配列を
決定した。もっとも長いクローンの塩基配列は配列番号
５で表される塩基配列の1922番目から開始し、1974番目
から2508番目の領域と2524番目から2853番目の領域を欠
いていた。欠いている領域はイントロンであり、cDNAに
おいて最初に現れるATGの配列（配列番号５で表される
塩基配列の1965番目）が開始コドンであると考えられ
た。推定される遺伝子産物のアミノ酸配列についてSacc
haromyces cerevisiaeのアクチン遺伝子とのホモロジー
を調べた結果、互いに96％のホモロジーを示したことか
ら取得した遺伝子がCandida boidiniiのアクチン遺伝子
であり、またコーディング領域は、配列番号５で表され
る塩基配列の1965番目から始まることを断定した。

【００４４】〔実施例２〕優性マーカー遺伝子を含む発
現カセットの作製 (1) プロモーター及びターミネーター領域の単離 アクチン遺伝子のプロモーター領域、ターミネーター領
域の単離はPCR法を用いて行った（図２参照）。プロモ
ーター領域として翻訳開始コドンATG上流約１kb、ター
ミネーター領域として終止コドンTAAの下流約0.5kbを増
幅するために、以下に示す４種類のオリゴヌクレオチド
を合成した。

【００４５】 PP5 : 配列番号６ PP3 : 配列番号７ PT5 : 配列番号８ PT3 : 配列番号９ PP5及びPP3は、それぞれプロモーター領域の5'末端、3'
末端の塩基配列を含み、それぞれのオリゴヌクレオチド
の5'末端に、PP5については制限酵素EcoRI認識部位の塩
基配列（配列番号６の第３〜８番目の配列）、PP3につ
いては制限酵素SalI認識部位の塩基配列（配列番号７の
第５〜10番目の配列）を有する。PT5及びPT3は、それぞ
れターミネーター領域の5'末端、3'末端の塩基配列を含
み、それぞれオリゴヌクレオチドの5'末端に、PT5につ
いては制限酵素SalIとPstIの認識部位の塩基配列（配列
番号８の第１〜12番目の配列）、PT3については制限酵
素HindIIIとPstIの認識部位の塩基配列（配列番号９の
第１〜12番目の配列）を有する。

【００４６】アクチン遺伝子を有するプラスミドpAc1-7
とプライマーPP5及びPP3とを混合し、rTaqポリメラーゼ
（宝酒造社）を用いたPCR反応を行なった（図２）。PCR
は、94℃で30秒、55℃で１分及び72℃で１分を１サイ
クルとしてこれを25サイクル行った。

【００４７】反応生成物をアガロースゲル電気泳動し、
増幅DNA断片を回収した。回収したDNA断片とベクターpT
7 Blue T-Vector（ノバジェン社）を結合し、アクチン
遺伝子のプロモーター領域を含んでいるpAcPを作成し
た。同様に、PT5及びPT3を用いたPCR 反応〔（94℃で30
秒、45℃で１分及び72℃で１分）×25サイクル〕によ
り、アクチン遺伝子のターミネーター領域を含んでいる
pAcTを作成した。これらのプラスミドを鋳型として、ダ
イプライマーサイクルシーケンスキット及びダイターミ
ネーターサイクルシーケンスキット（パーキンエルマー
社）を用いて塩基配列を決定し、プローモーター及びタ
ーミネーター領域が正確に増幅されていることを確認し
た。単離したプロモーターの塩基配列を配列番号１に、
ターミネーターの塩基配列を配列番号２に示す。

【００４８】(2) 発現カセットの作成 プラスミドpAcPをEcoRI-SalIで切断した後、アガロース
電気泳動で1.0kbのアクチン遺伝子プロモーター領域を
分離した。同様にプラスミドpAcTをSalI-HindIIIで切断
することにより0.5kbのアクチン遺伝子ターミネーター
領域を分離した。この２種類のDNA断片をpUC118のEcoRI
-HindIII間に挿入し、pMAcを作成した（図２参照）。

【００４９】プラスミドpMAcは、pUC118のEcoRI-HindII
I間にアクチン遺伝子のプロモーター及びターミネータ
ー領域を持ち、プロモーターとターミネーターとの間の
SalI及びPstI部位に種々の構造遺伝子を挿入することが
できるものである。

【００５０】〔実施例３〕G418耐性遺伝子を用いたCand
ida boidiniiの形質転換 本実施例は、G418耐性遺伝子を含む発現カセットがCand
ida boidiniiの染色体DNAに組み込まれた形質転換細胞
を、G418耐性を指標に選抜した例である。 (1) 発現ベクターの作成 アクチン遺伝子のプロモーターとターミネーターとの間
にG418耐性遺伝子を挿入した発現プラスミドを構築し
た。トランスポゾンTn5由来のG418耐性遺伝子は、プラ
スミドpNEO（ファルマシア社）よりPCR法を用いて取得
した。Jorgensenら（Jorgensen, R. A. et al., Mol. G
en. Genet. 177,65 (1979)）の報告に基づいて、下に示
す２種類のプライマーを合成した。

【００５１】 PGR5：配列番号10 PGR3：配列番号11 これらのプライマーとpNEOを混合し、rTaqポリメラーゼ
を用いたPCR反応を行なった（図３）。PCR は、94℃で3
0秒、55℃で１分及び72℃で１分を１サイクルとしてこ
れを25サイクル行った。

【００５２】反応生成物をアガロースゲル電気泳動し、
増幅DNA断片を回収した。回収したDNA断片とベクターpT
7 Blue T-Vectorを結合し、プラスミドpTA-NEOを作成し
た。プラスミドpTA-NEOをNdeI-SmaIで切断し、T4ポリメ
ラーゼで平滑化した後、アガロース電気泳動でG418耐性
遺伝子DNA断片を回収した。このG418耐性遺伝子DNA断片
をSalI-PstIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平滑化し
たpMAcを結合し、pAcNEO1を作成した（図３参照）。pAc
NEO1は、アクチン遺伝子のプロモーター、G418耐性遺伝
子及びアクチン遺伝子のターミネーターを含む発現ベク
ターである。

【００５３】(2) 形質転換用プラスミドの作成 G418耐性遺伝子を含む発現カセットをCandida boidinii
染色体DNAのアクチン座に組み込むため、プラスミドを
構築した。pAcNEO1からG418耐性遺伝子を含むDNA断片を
EcoRI切断により分離し、pUC118のEcoRI部位に挿入して
プラスミドpAcNEO2を作成した。アクチン遺伝子を有す
るプラスミドpAc1-7からClaIで２kbのDNA断片を分離
し、T4ポリメラーゼで平滑化した後、プラスミドpAcNEO
2のSmaI部位に挿入してpAcNEO3を作成した（図４参
照）。

【００５４】(3) 形質転換 Candida boidinii ATCC48180株をBglIIで切断したプラ
スミドpAcNEO3で形質転換し、G418耐性を示す形質転換
細胞を取得した。形質転換法はSakaiによって詳しく開
示されている（Sakai Y. et al., J. Bacteriol., 175,
3556-3562(1993)）方法に従った。

【００５５】形質転換細胞を、宿主細胞が生育すること
のできない0.3mg/mlのG418を含むYPD平板培地に塗布し
たところ、G418存在下でも生育可能な細胞を取得するこ
とができた。このG418耐性酵母から染色体DNAを調製
し、前述したプライマーPGR5、PGR3を用いたPCR反応を
行なったところ、トランスポゾンTn5由来のG418耐性遺
伝子に該当するDNA断片が形質転換細胞からのみ増幅さ
れた（図５参照）。

【００５６】Candida boidinii IFO10035、Candida boi
dinii IFO10240、Candida boidiniiIFO10574株について
も同様の形質転換を実施したところ、G418耐性を獲得し
た形質転換細胞を得ることができた。これらの結果か
ら、アクチン遺伝子のプロモーター及びターミネーター
を利用した発現カセットはCandida boidinii宿主細胞内
で機能し、この発現カセットを用いたG418耐性遺伝子は
Candida boidiniiの形質転換における優性マーカーとし
て機能することが証明された。このことは、本発明のプ
ロモーター、ターミネーター及び優性マーカーを含むプ
ラスミドにより、宿主細胞の倍数性にかかわらず目的の
形質転換体を分離することができることを意味する。

【００５７】

【発明の効果】本発明により、アクチン遺伝子のプロモ
ーター及びターミネーターが提供される。該プロモータ
ー及びターミネーターは、目的とする遺伝子を強力かつ
構成的に発現させる一方、薬剤耐性遺伝子等の形質転換
酵母とは異なる外来遺伝子を当該酵母内で発現させるこ
とができる。

【００５８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii) 株名：ATCC 48180 配列： TCAATAAGAG TGTGATTATA TACAATCAGC TGGTGTTAAC TAAATATAGT TATGAAATTT 60 CACCGCGCGT TTGGTTCACG TTTCAGTACC AAGAATTGAT AATATTGGCA GCGGTTCAGT 120 GCGTTTGCTG CTTCACCTCC CGCATTCTCT AGTCCGGATT CTCTGTATTC CCCCTTACAT 180 TGCTGGCCAT TGCTGGCCAT TCCTGGCAAG GTATATGCCA CTACTGTGCC TGATTTCTTT 240 CACGCCTGCC TTACCATCAT GTCTCTTCTG TATATCCGCC CAACCGGCAG GACATCCGCT 300 TACCACGCAG CCCACCGCGT TTATGTGAGC GTCTTGACCT CGTCTCCTTC CCGTTTGCCC 360 CTGTCAACCG CCTCATCACT CACCACAGCC CCTGAAATAT ACACCGGATC ATCCAGAAAT 420 TACGGCTGAC ACAGCCTCTG GATCCCAGGC AGGCATTAAG GCATTACATC AGATAGCGAC 480 CACCATGACT GTACCCACTT TAGCCACTTT AACCACTCTG CTACCGCTCT TCTCTGTCTT 540 CCAGCTTGTC GCATTAGCCT GCGAGTCTTC CCACTGAGTT CCTTCTTTCT GTTTCTGTTT 600 CTCCCAGTGT CTCCGAGTTT ACCCACTTGT TTTCATTCTC GTTGTTGTCT CTTGTTTGTT 660 CAATTACCAC TCCCACCCAT TTTCTCTCAT TTTCTCTCTA TTCTTTCCTC CCAGATTCTG 720 TATCCGCCAT TTCATTCATC ATTCATTCAC TTATTCATCC TTCATCATCC ATTCATTCAT 780 TCATTTACCC AATTAACCTT CCAATCTATC AATTCATTAA TCAATCAACG CCTTTCCCTC 840 CGAACACTTC ACTCAATTCC TCTTCTGATA CACTCTTCGA CAATCAACAA TCAAATATAA 900 ATCAGTATAT CAATTTAGAT TCGTATATCT AAGTCTCTTC TATATCCATA TTTGATTTGT 960 TCTCTTTCTG ATCAACTAGA TTTATAACCT AGATAGATTT TATAAATTTA ATTTAATATA 1020 TATTACAAAA 1030

【００５９】 配列番号：２ 配列の長さ：６３０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii) 株名：ATCC 48180 配列： GGAATTTAAT CATTTTCAAC ATAAAATCTT GTCAATTTTT ATTAAAGTCA TTTTTCATTA 60 ATCTTTTAAT GTATTCTTTT ATTTGATTTT TCAATATTTC TTGATAAATA AATTTGTTGT 120 TGAATTTCAT TGATTATTTA TATTTCTTAG ATTTTAAAAA AATATTTTCC TCTTTTTTTA 180 TTTTCCTTTG TTTTTCAAAT TTAAAATGAT AGAATGAAAG AATAAAAATA TATATATTAT 240 TATTATTATT ATTACTGTCA AACGTTTAAA AAGAAGTAGT ATTAAACTTA ACACTCTTCT 300 GAGTTATAAT GGTAATAACA GTGATTTAAT ATACCTTTTT TTTCCAAATT TTTTTCAATT 360 ATTCATTTTG GTATTTGGTT AATTATGGTG AATAAAAAAA AAGAAAAATT TCTTGTTTCT 420 TTTGTTGTTT ATTCTTGTTT TAATTTTTTT TTGTATCAAT CTTTAAATTT AGTTTTAAAT 480 TTTTTATTAT TATTCTAATT TTAAATTATT AATTGTTGTA ATTAAATTAT TAATTAATTT 540 CTAATTTTTT TGAACAAAAC GTTTTTATAA TTTTAGAATA TTTAATTAAT TTATTAAATT 600 TGTTTAAATT GGTATACCAT TTTTTTTTTA 630

【００６０】 配列番号：３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GAGGTTGCTG CTTTGGTTAT T

【００６１】 配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GAAACACTTG TGGTGAACGA T

【００６２】 配列番号：５ 配列の長さ：４８１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：カンジダ・ボイジニイ（Candida boidinii) 株名：ATCC 48180 配列： CATATAACGG ATCCCACTTA TATGACTGTA AGGCAAAGAA AGGGATTGCA AAAATTGAAA 60 GAATATGATT CCCATGAATA CTGGACTGAC TAAATGTCCT ATCACGTTGC CATAAATATC 120 ACTCAAGAAT CACGGTTCGG TGAAGTTTCC AAACAATAAA GAAACCATAT AGGGTAAAGA 180 TAAGAATTTT AATTTAGTAA ATGAATTAAA TTCAGTATGA TGGCAAGAAA CACATCATTA 240 CACCATATTT TACTCCTCTA TTCAGTCTTT GAGCAGTTTG GTGTAATATA ATATTGATGT 300 GTTGGCATCT TTGACTGATT TCGCATTTGA TCAATGGCGG CCCTAAATTC CGGCGCGATT 360 TTTGGTAGAC GTGCCATGTG GTCACTGATA TGTGTAGAGA GAGATCACTG ATTGGAGTTT 420 GCACATACCA GGAAATAACC AGACATTGAA ATGCCTATCT ATTCAAAGGG CGAACAGCTT 480 TTAATAAAAT TCACTTCAAC ACACTCATTA ATTACATCAG CCATTATGTA TAAATCCTGT 540 CTAGGTGTCC TAAAACATAT CTTTTTTCTC TTATCTATAC AAGGAGTGGC GCAGGCTTTT 600 AGTGAGAGGA GAGAGTTAAA ATTAGTTCGA TGGCTGAGGA TATTTGAGAG ATGATCATGG 660 CGCAGGCAGG AACATGGCAG GCGCAGTCTC GAGTTGCCAC CCTCGATTAC TCAGAGCTTT 720 TACATTTACA GCCATAATGG GAGGCTCTGA GGCATATAAT GTTGCTTCAA CCCCACGGGT 780 TCACACCATG AACAGTTCTC TCACCGGGCG CTTTTTCACC TGGCTGAAAG TGCAATTAAA 840 TCAAGAGACA ATAAGAGCAC GCATCTGATT TGTAAGAATG TTACGGATCG ATTGTTAGTA 900 GTACGTAATC ATAATAGGTA GTTATGCACT GCAATCAATA AGAGTGTGAT TATATACAAT 960 CAGCTGGTGT TAACTAAATA TAGTTATGAA ATTTCACCGC GCGTTTGGTT CACGTTTCAG 1020 TACCAAGAAT TGATAATATT GGCAGCGGTT CAGTGCGTTT GCTGCTTCAC CTCCCGCATT 1080 CTCTAGTCCG GATTCTCTGT ATTCCCCCTT ACATTGCTGG CCATTGCTGG CCATTCCTGG 1140 CAAGGTATAT GCCACTACTG TGCCTGATTT CTTTCACGCC TGCCTTACCA TCATGTCTCT 1200 TCTGTATATC CGCCCAACCG GCAGGACATC CGCTTACCAC GCAGCCCACC GCGTTTATGT 1260 GAGCGTCTTG ACCTCGTCTC CTTCCCGTTT GCCCCTGTCA ACCGCCTCAT CACTCACCAC 1320 AGCCCCTGAA ATATACACCG GATCATCCAG AAATTACGGC TGACACAGCC TCTGGATCCC 1380 AGGCAGGCAT TAAGGCATTA CATCAGATAG CGACCACCAT GACTGTACCC ACTTTAGCCA 1440 CTTTAACCAC TCTGCTACCG CTCTTCTCTG TCTTCCAGCT TGTCGCATTA GCCTGCGAGT 1500 CTTCCCACTG AGTTCCTTCT TTCTGTTTCT GTTTCTCCCA GTGTCTCCGA GTTTACCCAC 1560 TTGTTTTCAT TCTCGTTGTT GTCTCTTGTT TGTTCAATTA CCACTCCCAC CCATTTTCTC 1620 TCATTTTCTC TCTATTCTTT CCTCCCAGAT TCTGTATCCG CCATTTCATT CATCATTCAT 1680 TCACTTATTC ATCCTTCATC ATCCATTCAT TCATTCATTT ACCCAATTAA CCTTCCAATC 1740 TATCAATTCA TTAATCAATC AACGCCTTTC CCTCCGAACA CTTCACTCAA TTCCTCTTCT 1800 GATACACTCT TCGACAATCA ACAATCAAAT ATAAATCAGT ATATCAATTT AGATTCGTAT 1860 ATCTAAGTCT CTTCTATATC CATATTTGAT TTGTTCTCTT TCTGATCAAC TAGATTTATA 1920 ACCTAGATAG ATTTTATAAA TTTAATTTAA TATATATTAC AAAAATGGAC GGTGGTATGT 1980 AATTTATTAC ATTTTATTAT TCTTTGATTA AATTGATGAA TCAATCAATT AATCAATCAA 2040 CCAATCAATT AATCGATCAA TTAATCTCCC GATTCGTCAA TCTCAATGAA GCATCTTGAT 2100 TTAGTTAGTC GATCTCATTA TCGACAGATA TTGTATCAAT CTTTTCAATT GATTTATCAA 2160 ATGGTTTCAT GGAATCCGAT ATTCATCCAT CCATTTGTCG ATTTGATGAG TATTTGATGT 2220 TTTCAATGTT ACATCAATCA AACTGTCAAT TGACCTGTTG AATCAATCAA CTTTTACTAT 2280 CAGCCGGAAA TATATAAACT TTCTCTATTA CAATGATCAA TTGATAATAC ATTAATTTAT 2340 ATTCAATAGA TCATTCAGAT ATCTTTGTCC ATCAAAAATA GAGAAAGATG AAATTGATTT 2400 AAATGGATTG TCCTTTGATT ATTGATTCGG GGTGATTGAT TGTGATTTTA CCTGTGATTT 2460 TTTGATACCT TATTTTTTAA AGTTTCTTAT TACTAACACC TTTTAATAGA AGACGTTGCT 2520 GCTGTATGTA ACATATACTT ACAATTTTCT TTTTCTTTTT TTTCTATTTT GAAAATGATA 2580 GTTGATTTGA TTGATTGCTC TTTCCAATGG ATTTCAGTTC ACGACGCGTT TCAATTATAA 2640 AAGAAAGATG TTATCTTCAT TTAATTCGAT TAATCGATTG ATAAATCACT TAAGATATCA 2700 ATTCATCTAT CAAGATATTG GTTGCTCACC ATTCTAATCA AGCAATCAAT TAATTCAAGT 2760 CAATTCATTT CAAAATATCA TCTTCTAATT CATCATCTAT TGAGATTTTT TAATACTAAC 2820 ATTTTTTTCT TCTTTTTTTT TGTATTTTTA CAGTTAGTTA TTGATAACGG TTCCGGTATG 2880 TGTAAAGCCG GTTTCGCCGG TGATGACGCT CCAAGAGCTG TTTTCCCATC AATTGTTGGT 2940 AGACCAAGAC ATCAAGGTAT CATGGTTGGT ATGGGTCAAA AAGATTCCTA CGTTGGAGAT 3000 GAAGCCCAAT CCAAGAGAGG TATTTTAACT TTAAGATACC CAATTGAACA CGGTATTGTC 3060 ACAAACTGGG ATGATATGGA AAAAATCTGG CATCACACTT TCTACAACGA ATTAAGAGTT 3120 GCCCCAGAAG AACACCCAGT CTTATTAACT GAAGCCCCAA TGAATCCAAA GAACAACAGA 3180 GAAAAGATGA CTCAAATCTT ATTCGAAACT TTCAATGTTC CAGCTTTCTA CGTTTCTATT 3240 CAAGCTGTCT TATCTTTATA CTCTTCTGGT AGAACTACCG GTATTGTTTT AGATTCTGGT 3300 GATGGTGTTA CCCACGTTGT CCCAATTTAC GCTGGTTTCT CCTTACCACA CGCTATCTTA 3360 AGATTAGATT TAGCTGGTAG AGATTTAACT GACTACTTAA TGAAGATCTT ATCTGAAAGA 3420 GGTTACACTT TCTCCACCAC TGCTGAAAGA GAAATTGTTA GAGATATCAA GGAAAAATTA 3480 TGTTACGTTG CTTTAGATTT CGATCAAGAA TTACAAACAT CATCTCAATC TTCTTCTATT 3540 GAAAAATCTT ATGAATTACC AGATGGTCAA GTTATTACCA TTGGTAACGA AAGATTCAGA 3600 GCTCCAGAAG CTTTATTCCA CCCATCTGTC TTAGGTTTAG AAGCCTCTGG TATTGATCAA 3660 ACCACTTTCA ACTCCATCAT GAAGTGTGAT GTTGATGTCC GTAAGGAATT ATACGGTAAC 3720 ATTGTTATGT CTGGTGGTAC TACCATGTTC CCAGGTATTG CTGAACGTAT GCAAAAGGAA 3780 ATTACTGCTT TAGCTCCATC TTCCATGAAG GTCAAGATCA TTGCTCCACC AGAAAGAAAG 3840 TACTCCGTTT GGATTGGTGG TTCTATCTTA GCTTCCTTAT CTACTTTCCA ACAAATGTGG 3900 ATTTCAAAGC AAGAATACGA CGAATCAGGA CCATCAATTG TCCACCTCAA GTGTTTCTAA 3960 GGAATTTAAT CATTTTCAAC ATAAAATCTT GTCAATTTTT ATTAAAGTCA TTTTTCATTA 4020 ATCTTTTAAT GTATTCTTTT ATTTGATTTT TCAATATTTC TTGATAAATA AATTTGTTGT 4080 TGAATTTCAT TGATTATTTA TATTTCTTAG ATTTTAAAAA AATATTTTCC TCTTTTTTTA 4140 TTTTCCTTTG TTTTTCAAAT TTAAAATGAT AGAATGAAAG AATAAAAATA TATATATTAT 4200 TATTATTATT ATTACTGTCA AACGTTTAAA AAGAAGTAGT ATTAAACTTA ACACTCTTCT 4260 GAGTTATAAT GGTAATAACA GTGATTTAAT ATACCTTTTT TTTCCAAATT TTTTTCAATT 4320 ATTCATTTTG GTATTTGGTT AATTATGGTG AATAAAAAAA AAGAAAAATT TCTTGTTTCT 4380 TTTGTTGTTT ATTCTTGTTT TAATTTTTTT TTGTATCAAT CTTTAAATTT AGTTTTAAAT 4440 TTTTTATTAT TATTCTAATT TTAAATTATT AATTGTTGTA ATTAAATTAT TAATTAATTT 4500 CTAATTTTTT TGAACAAAAC GTTTTTATAA TTTTAGAATA TTTAATTAAT TTATTAAATT 4560 TGTTTAAATT GGTATACCAT TTTTTTTTTA CTCTATTTAC CTATTTAATT TTATTATATT 4620 ATTATCGAAA AAAACCTTAA AAAGGACTTC GTAAATTTTA TTGTAATAAA CGCAAAAATG 4680 ACATATATAA GAAAAAAAAT AAAAAGAAAT AAAAAAAACA AGTGGTTGAT TTTACTTTTA 4740 ACTAAGTCAA AGTCTAATAA ATTTCTATTT TTTTTTAAGG AAGAATTAAC TAGATTTATC 4800 AAGTAATCTT TTATCGAT 4818

【００６３】 配列番号６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CTGAATTCAA TAAGAGTGTG ATTATATAC

【００６４】 配列番号７ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CACCGTCGAC TTTTGTAATA TATATTAAA

【００６５】 配列番号８ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTCGACCTGC AGGGAATTTA ATCATTTTCA AC

【００６６】 配列番号９ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AAGCTTGAAT TCTAAAAAAA AAATGGTATA CC

【００６７】 配列番号１０ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： ATGATTGAAC AAGATGGATT GC

【００６８】 配列番号１１ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TCAGAAGAAC TCGTCAAGAA GG

【００６９】 配列番号１２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GGATTCATTG GGGCTTCAG

【００７０】 配列番号１３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TGATTACGAA TTTAATACGA CTCACT

【図面の簡単な説明】

【図１】アクチン遺伝子を含むプラスミドの制限酵素地
図である。

【図２】アクチン遺伝子のプロモーター及びターミネー
ター各断片の取得法、並びに当該プロモーター及びター
ミネーターを利用した発現プラスミドの構築法を示した
図である。

【図３】アクチン遺伝子のプロモーター及びターミネー
ターを利用したG418耐性遺伝子発現プラスミドpAcNEO1
の構築法を示した図である。

【図４】プラスミドpAcNEO2、pAcNEO3の構築法を示した
図である。

【図５】Candida boidinii ATCC488180株の親株及び形
質転換株のPCR解析の結果を示す電気泳動写真である。

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【手続補正書】

【提出日】平成８年７月１０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で表される塩基配列を実質的
   に含む、カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のプロ
   モーター。
2. 【請求項２】 配列番号２で表される塩基配列を実質的
   に含む、カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のター
   ミネーター。
3. 【請求項３】 請求項１記載のプロモーター、優性遺伝
   子マーカー、目的遺伝子及び請求項２記載のターミネー
   ターを含む遺伝子発現カセット。
4. 【請求項４】 目的遺伝子がＧ４１８耐性遺伝子である
   請求項３記載の遺伝子発現カセット。
5. 【請求項５】 請求項３又は４記載の遺伝子発現カセッ
   トを含む組換え発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換え発現ベクターによ
   って形質転換された形質転換体。