JP3290108B2 - プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列 - Google Patents
プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列Info
- Publication number
- JP3290108B2 JP3290108B2 JP23499597A JP23499597A JP3290108B2 JP 3290108 B2 JP3290108 B2 JP 3290108B2 JP 23499597 A JP23499597 A JP 23499597A JP 23499597 A JP23499597 A JP 23499597A JP 3290108 B2 JP3290108 B2 JP 3290108B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- sequence
- seq
- dna
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
- C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、異種遺伝子を大量
に発現する上で有用な高い転写活性を有するプロモータ
ー、該プロモーターを担持する発現ベクター、該発現ベ
クターが導入された形質転換体、及び該形質転換体を培
養することを特徴とする異種蛋白質の生産方法に関す
る。
に発現する上で有用な高い転写活性を有するプロモータ
ー、該プロモーターを担持する発現ベクター、該発現ベ
クターが導入された形質転換体、及び該形質転換体を培
養することを特徴とする異種蛋白質の生産方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】メタノール資化性酵母は、メタノールを
唯一の炭素源として生育可能な酵母である。メタノール
資化性酵母におけるメタノール代謝は、最初の反応とし
てアルコールオキシダーゼによりメタノールと酸素から
ホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。生成した過
酸化水素はカタラーゼにより水と酸素に分解される。ホ
ルムアルデヒドは、ホルムアルデヒド脱水素酵素、S-ホ
ルミルグルタチオンヒドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素の作
用により、二酸化炭素まで酸化され、その際生じるNADH
は細胞のエネルギー源となる。それと同時にホルムアル
デヒドはジヒドロキシアセトンシンターゼによりキシル
ロース-5-リン酸と縮合し、グリセルアルデヒド-3-リン
酸とジヒドロキシアセトンへと変換され、その後ペント
ースリン酸経路を経て菌体構成成分となる。ここで挙げ
たアルコールオキシダーゼ、ジヒドロキシアセトンシン
ターゼ及びギ酸脱水素酵素は、メタノール存在化で培養
すると著量生産され、菌体内可溶性蛋白質の約40%に達
する。
唯一の炭素源として生育可能な酵母である。メタノール
資化性酵母におけるメタノール代謝は、最初の反応とし
てアルコールオキシダーゼによりメタノールと酸素から
ホルムアルデヒドと過酸化水素を生成する。生成した過
酸化水素はカタラーゼにより水と酸素に分解される。ホ
ルムアルデヒドは、ホルムアルデヒド脱水素酵素、S-ホ
ルミルグルタチオンヒドロラーゼ、ギ酸脱水素酵素の作
用により、二酸化炭素まで酸化され、その際生じるNADH
は細胞のエネルギー源となる。それと同時にホルムアル
デヒドはジヒドロキシアセトンシンターゼによりキシル
ロース-5-リン酸と縮合し、グリセルアルデヒド-3-リン
酸とジヒドロキシアセトンへと変換され、その後ペント
ースリン酸経路を経て菌体構成成分となる。ここで挙げ
たアルコールオキシダーゼ、ジヒドロキシアセトンシン
ターゼ及びギ酸脱水素酵素は、メタノール存在化で培養
すると著量生産され、菌体内可溶性蛋白質の約40%に達
する。
【０００３】前述のごとく、メタノール資化性酵母は安
価なメタノールで大量培養が可能であるうえに、他の酵
母には見られない強力な転写活性を有するメタノール代
謝酵素プロモーターを有するという点で、異種遺伝子発
現系として適した酵母であると考えられる。
価なメタノールで大量培養が可能であるうえに、他の酵
母には見られない強力な転写活性を有するメタノール代
謝酵素プロモーターを有するという点で、異種遺伝子発
現系として適した酵母であると考えられる。
【０００４】カンジダ・ボイジニイ(Candida boidinii)
は、メタノール資化性酵母の一種である。そして該酵母
を利用してアルコールオキシダーゼ遺伝子、ギ酸脱水素
酵素遺伝子の調節領域を用いた異種遺伝子の発現方法が
研究されている（特開平5-344895号公報、WO 97/10345
等）。一方、これらの発現系において発現ベクターが多
コピーで染色体に挿入された形質転換体が異種遺伝子を
高生産する例（Appl.Microbiol. Biotechnol., 42, 860
-864 (1995)、日本農芸化学会平成８年度大会講演要旨
集 257ページ、平成８年度日本生物工学会大会講演要旨
集314ページ）が少なくない。発現ベクターの形質転換
体内での安定性を考えると、低コピー数で高い発現量を
達成することがより望ましいと考えられるので、更に強
力な転写活性を有するプロモーターの開発が求められて
いる。
は、メタノール資化性酵母の一種である。そして該酵母
を利用してアルコールオキシダーゼ遺伝子、ギ酸脱水素
酵素遺伝子の調節領域を用いた異種遺伝子の発現方法が
研究されている（特開平5-344895号公報、WO 97/10345
等）。一方、これらの発現系において発現ベクターが多
コピーで染色体に挿入された形質転換体が異種遺伝子を
高生産する例（Appl.Microbiol. Biotechnol., 42, 860
-864 (1995)、日本農芸化学会平成８年度大会講演要旨
集 257ページ、平成８年度日本生物工学会大会講演要旨
集314ページ）が少なくない。発現ベクターの形質転換
体内での安定性を考えると、低コピー数で高い発現量を
達成することがより望ましいと考えられるので、更に強
力な転写活性を有するプロモーターの開発が求められて
いる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、異種遺伝子
を発現させるのに有用な強力な転写活性を有するプロモ
ーター、該プロモーターを担持する発現ベクター、該発
現ベクターが導入された形質転換体、及び該形質転換体
を用いた異種遺伝子発現産物の生産方法を提供すること
を目的とする。
を発現させるのに有用な強力な転写活性を有するプロモ
ーター、該プロモーターを担持する発現ベクター、該発
現ベクターが導入された形質転換体、及び該形質転換体
を用いた異種遺伝子発現産物の生産方法を提供すること
を目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
基づいて、転写活性の高いプロモーターを開発する目的
で鋭意研究を重ねた結果、メタノール資化性酵母カンジ
ダ・ボイジニイ(Canidida boidinii)において機能する
プロモーターDNA断片に特定塩基配列からなるヌクレオ
チドを付加して得られるDNA断片をプロモーターとして
利用することによって、その下流領域に位置する異種遺
伝子を効率よく発現させうることを見出し、本発明を完
成するに至った。
基づいて、転写活性の高いプロモーターを開発する目的
で鋭意研究を重ねた結果、メタノール資化性酵母カンジ
ダ・ボイジニイ(Canidida boidinii)において機能する
プロモーターDNA断片に特定塩基配列からなるヌクレオ
チドを付加して得られるDNA断片をプロモーターとして
利用することによって、その下流領域に位置する異種遺
伝子を効率よく発現させうることを見出し、本発明を完
成するに至った。
【０００７】即ち、本発明は配列番号１で表わされる塩
基配列又は該塩基配列において１若しくは複数の塩基が
欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、
プロモーター活性を上昇させるＤＮＡである。さらに、
本発明は、任意のプロモーターの前、後及び内部の領域
の少なくとも１箇所に、前記ＤＮＡの１個又は複数の断
片が正方向又は逆方向で配置された変異型プロモーター
である。
基配列又は該塩基配列において１若しくは複数の塩基が
欠失、置換、付加若しくは挿入された塩基配列を含み、
プロモーター活性を上昇させるＤＮＡである。さらに、
本発明は、任意のプロモーターの前、後及び内部の領域
の少なくとも１箇所に、前記ＤＮＡの１個又は複数の断
片が正方向又は逆方向で配置された変異型プロモーター
である。
【０００８】さらに、本発明は、前記変異型プロモータ
ー及び異種遺伝子を含む発現用組換えベクターである。
ここで異種遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子
を意味し、特に限定されるものではない。異種遺伝子と
しては、例えば酸性フォスファターゼ遺伝子、α−アミ
ラーゼ遺伝子、各種インターフェロン遺伝子、エリスロ
ポエチン遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子遺伝子等が挙
げられる。また、異種遺伝子は、いかなる手法によって
得られるものでもよい。さらに、本発明は、前記ベクタ
ーによって形質転換された形質転換体である。
ー及び異種遺伝子を含む発現用組換えベクターである。
ここで異種遺伝子とは、発現の対象となる任意の遺伝子
を意味し、特に限定されるものではない。異種遺伝子と
しては、例えば酸性フォスファターゼ遺伝子、α−アミ
ラーゼ遺伝子、各種インターフェロン遺伝子、エリスロ
ポエチン遺伝子、顆粒球コロニー刺激因子遺伝子等が挙
げられる。また、異種遺伝子は、いかなる手法によって
得られるものでもよい。さらに、本発明は、前記ベクタ
ーによって形質転換された形質転換体である。
【０００９】さらに、本発明は、任意のプロモーターの
前、後及び内部の領域の少なくとも１箇所に、前記ＤＮ
Ａの１個又は複数の断片を正方向又は逆方向で配置させ
ることを特徴とするプロモーター活性を増大させる方法
である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培
養し、得られる培養物から異種遺伝子の発現産物を採取
することを特徴とする前記発現産物の生産方法である。
ここで、培地としては、炭素源としてメタノールを含む
培地、メタノールにグリセロールを添加した培地、ある
いは任意の炭、窒素源にギ酸を添加した培地等が挙げら
れる。以下、本発明を詳細に説明する。
前、後及び内部の領域の少なくとも１箇所に、前記ＤＮ
Ａの１個又は複数の断片を正方向又は逆方向で配置させ
ることを特徴とするプロモーター活性を増大させる方法
である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培地に培
養し、得られる培養物から異種遺伝子の発現産物を採取
することを特徴とする前記発現産物の生産方法である。
ここで、培地としては、炭素源としてメタノールを含む
培地、メタノールにグリセロールを添加した培地、ある
いは任意の炭、窒素源にギ酸を添加した培地等が挙げら
れる。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の完成にあたり、メタノー
ル資化性酵母カンジダ・ボイジニイ（Canidida boidini
i）のギ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター（以下、FDHプ
ロモーターと略称することがある）転写活性に必須な領
域（以下、UAS配列という）を特定した。すなわち、本
発明のDNAは、配列番号２で表わされる塩基配列を有す
るCanidida boidiniiのギ酸脱水素酵素遺伝子プロモー
ターのうち、塩基番号841〜880の配列を有するものであ
り、UAS配列という。
ル資化性酵母カンジダ・ボイジニイ（Canidida boidini
i）のギ酸脱水素酵素遺伝子プロモーター（以下、FDHプ
ロモーターと略称することがある）転写活性に必須な領
域（以下、UAS配列という）を特定した。すなわち、本
発明のDNAは、配列番号２で表わされる塩基配列を有す
るCanidida boidiniiのギ酸脱水素酵素遺伝子プロモー
ターのうち、塩基番号841〜880の配列を有するものであ
り、UAS配列という。
【００１１】本発明において「任意のプロモーター」と
は、宿主細胞内において転写活性を有するDNA断片であ
り、その種類が限定されるものではない。従って、本発
明でいう任意のプロモーター（プロモーターDNA断片）
は、転写活性を有すれば由来の生物は限定されず、ま
た、転写活性を有する限り、野生型プロモーターに由来
する塩基配列の一部に置換、欠失、付加、挿入等の変異
が生じてもよい。なお、置換、欠失、付加及び挿入の場
所及びその数に限定されない。本発明では、プロモータ
ーとしてCandida boidiniiギ酸脱水素酵素遺伝子プロモ
ーター（配列番号２）、Candida boidiniiアクチン遺伝
子プロモーター（配列番号３）が例示される。そして、
例えば配列番号２で示される塩基配列の第１番目から第
300番目まで欠失されたDNA断片でもCandida boidiniiに
おいて転写活性を有する限り、かかる欠失されたDNA断
片も本発明における任意のプロモーターに含まれる。な
お、変異の導入は、通常の遺伝子工学的手法により行う
ことができ、例えば制限酵素処理、化学合成したDNAの
利用、PCR法、部位特異的変異法、Exonuclease IIIを用
いた欠失体作製法などが挙げられる。
は、宿主細胞内において転写活性を有するDNA断片であ
り、その種類が限定されるものではない。従って、本発
明でいう任意のプロモーター（プロモーターDNA断片）
は、転写活性を有すれば由来の生物は限定されず、ま
た、転写活性を有する限り、野生型プロモーターに由来
する塩基配列の一部に置換、欠失、付加、挿入等の変異
が生じてもよい。なお、置換、欠失、付加及び挿入の場
所及びその数に限定されない。本発明では、プロモータ
ーとしてCandida boidiniiギ酸脱水素酵素遺伝子プロモ
ーター（配列番号２）、Candida boidiniiアクチン遺伝
子プロモーター（配列番号３）が例示される。そして、
例えば配列番号２で示される塩基配列の第１番目から第
300番目まで欠失されたDNA断片でもCandida boidiniiに
おいて転写活性を有する限り、かかる欠失されたDNA断
片も本発明における任意のプロモーターに含まれる。な
お、変異の導入は、通常の遺伝子工学的手法により行う
ことができ、例えば制限酵素処理、化学合成したDNAの
利用、PCR法、部位特異的変異法、Exonuclease IIIを用
いた欠失体作製法などが挙げられる。
【００１２】本発明の変異型プロモーターは、上記任意
のプロモーターDNA断片に上記UAS配列が正方向又は逆方
向に配置したものである。UAS配列が正方向に配置する
とは、UAS配列と相同な配列、すなわち配列：5'-TTTACC
ACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG-3'（配列番号
１）が、プロモーターDNA断片に、5'側から3'側への方
向と同じ向きで配置する（付加又は挿入される）ことを
意味する。また、逆方向に配置するとは、UAS配列と相
補的な配列、すなわち配列：5'-CTACCGTCTGATCCATGGATT
TTAATTGGATAGTGGTAAA-3'（配列番号４）が、プロモータ
ーDNA断片に、5'側から3'側への方向と同じ向きで配置
する（付加又は挿入される）ことを意味する。
のプロモーターDNA断片に上記UAS配列が正方向又は逆方
向に配置したものである。UAS配列が正方向に配置する
とは、UAS配列と相同な配列、すなわち配列：5'-TTTACC
ACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG-3'（配列番号
１）が、プロモーターDNA断片に、5'側から3'側への方
向と同じ向きで配置する（付加又は挿入される）ことを
意味する。また、逆方向に配置するとは、UAS配列と相
補的な配列、すなわち配列：5'-CTACCGTCTGATCCATGGATT
TTAATTGGATAGTGGTAAA-3'（配列番号４）が、プロモータ
ーDNA断片に、5'側から3'側への方向と同じ向きで配置
する（付加又は挿入される）ことを意味する。
【００１３】本発明の変異型プロモーターは、プロモー
ターDNA断片にUAS配列が単独で含有されていてもよく、
連なって複数個、好ましくは２個以上含有したものでも
よい。また、単独又は複数含有されるUAS配列の塩基配
列の方向性も問わず、正方向でも逆方向でもよく、さら
に正方向のものと逆方向のものとが混在していてもよ
い。本発明の(1)変異型プロモーターの作製、(2)発現ベ
クターの構築並びに(3)本発現ベクターを用いた形質転
換体の作製及び培養は、例えば、以下のようにして行
う。
ターDNA断片にUAS配列が単独で含有されていてもよく、
連なって複数個、好ましくは２個以上含有したものでも
よい。また、単独又は複数含有されるUAS配列の塩基配
列の方向性も問わず、正方向でも逆方向でもよく、さら
に正方向のものと逆方向のものとが混在していてもよ
い。本発明の(1)変異型プロモーターの作製、(2)発現ベ
クターの構築並びに(3)本発現ベクターを用いた形質転
換体の作製及び培養は、例えば、以下のようにして行
う。
【００１４】（１）変異型プロモーターの作製 本発明の変異型プロモーターは、プロモーターDNA断片
に化学合成したUAS配列を付加することによって調製す
ることができる。ここでプロモーターDNA断片は、すで
にプロモーター配列として同定されている配列を、通常
の遺伝子クローニング手法（例えば、Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor Lab., (1989)に記載の方法）、
PCRによる方法、化学合成による方法等で取得できる。
に化学合成したUAS配列を付加することによって調製す
ることができる。ここでプロモーターDNA断片は、すで
にプロモーター配列として同定されている配列を、通常
の遺伝子クローニング手法（例えば、Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor Lab., (1989)に記載の方法）、
PCRによる方法、化学合成による方法等で取得できる。
【００１５】また、宿主細胞内においてプロモーター活
性を有するDNA断片は、宿主細胞内で自律複製能を有す
るDNA配列とプロモーター配列を持たないマーカー遺伝
子とを有するプラスミドのマーカー遺伝子上流に制限酵
素等によって低分子化したDNA断片をクローニングした
ライブラリーを用いて取得してもよい。マーカー遺伝子
としては、G418耐性等の抗生物質耐性遺伝子、URA3、LE
U2等の栄養要求性相補遺伝子が例示される。作製したラ
イブラリーDNAを宿主細胞に形質転換すると、プロモー
ター活性を有するDNA断片がマーカー遺伝子の直前にク
ローニングされたプラスミドを有する形質転換体は、対
応するマーカーで選択されることから、得られた形質転
換体から全DNAを抽出して大腸菌に形質転換することに
より、プロモーター活性を有するDNA断片を効率よく分
離することができる。
性を有するDNA断片は、宿主細胞内で自律複製能を有す
るDNA配列とプロモーター配列を持たないマーカー遺伝
子とを有するプラスミドのマーカー遺伝子上流に制限酵
素等によって低分子化したDNA断片をクローニングした
ライブラリーを用いて取得してもよい。マーカー遺伝子
としては、G418耐性等の抗生物質耐性遺伝子、URA3、LE
U2等の栄養要求性相補遺伝子が例示される。作製したラ
イブラリーDNAを宿主細胞に形質転換すると、プロモー
ター活性を有するDNA断片がマーカー遺伝子の直前にク
ローニングされたプラスミドを有する形質転換体は、対
応するマーカーで選択されることから、得られた形質転
換体から全DNAを抽出して大腸菌に形質転換することに
より、プロモーター活性を有するDNA断片を効率よく分
離することができる。
【００１６】UAS配列の配置は、プロモーターDNA断片に
存在する制限酵素部位、又は通常の遺伝子工学的手法に
より人為的に付加した制限酵素部位を用いて行うことが
できる。例えば、UAS配列の両端に特定の制限酵素部位
を連結し、その制限酵素で認識される配列と同じ配列を
任意のプロモーターに組み込んだ後、両者を連結する方
法等が挙げられる。
存在する制限酵素部位、又は通常の遺伝子工学的手法に
より人為的に付加した制限酵素部位を用いて行うことが
できる。例えば、UAS配列の両端に特定の制限酵素部位
を連結し、その制限酵素で認識される配列と同じ配列を
任意のプロモーターに組み込んだ後、両者を連結する方
法等が挙げられる。
【００１７】（２）発現ベクターの構築 上記で得られた変異型プロモーターは、異種タンパク質
の構造遺伝子、ターミネーター、選択マーカー遺伝子、
相同領域等と共に適当なベクターの中に挿入され、異種
遺伝子発現ベクターとして使用される。使用されるベク
ターとしては、通常公知のベクターとして知られるpBR
系統、pUC系統、ブルースクリプト系統等の大腸菌プラ
スミドベクターが例示される。ターミネーター、選択マ
ーカー遺伝子、相同領域は、宿主内で機能するものであ
れば当業者が容易に決めることができる。ターミネータ
ーとしては、例えばアクチン遺伝子ターミネーター、ギ
酸脱水素酵素遺伝子ターミネーター等が挙げられ、選択
マーカー遺伝子としては、G418等の抗生物質耐性遺伝
子、URA3、LEU2等の栄養要求性相補遺伝子等が挙げられ
る。発現ベクターの構成成分をベクターに挿入すること
は、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術
により当業者が容易に実施することが可能である。
の構造遺伝子、ターミネーター、選択マーカー遺伝子、
相同領域等と共に適当なベクターの中に挿入され、異種
遺伝子発現ベクターとして使用される。使用されるベク
ターとしては、通常公知のベクターとして知られるpBR
系統、pUC系統、ブルースクリプト系統等の大腸菌プラ
スミドベクターが例示される。ターミネーター、選択マ
ーカー遺伝子、相同領域は、宿主内で機能するものであ
れば当業者が容易に決めることができる。ターミネータ
ーとしては、例えばアクチン遺伝子ターミネーター、ギ
酸脱水素酵素遺伝子ターミネーター等が挙げられ、選択
マーカー遺伝子としては、G418等の抗生物質耐性遺伝
子、URA3、LEU2等の栄養要求性相補遺伝子等が挙げられ
る。発現ベクターの構成成分をベクターに挿入すること
は、後記実施例の記載を参照して、あるいは慣用の技術
により当業者が容易に実施することが可能である。
【００１８】（３）形質転換体の作製および培養 本発明の形質転換体は、上記で得られた組み換え発現ベ
クターを適当な宿主細胞に導入されることによって調製
される。使用される宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母など特に限定されるものではないが、好ましくは酵
母、より好ましくはメタノール資化性酵母である。具体
的にはCandida boidiniiが例示される。宿主へのプラス
ミドの導入は、通常、形質転換に用いられる一般的な方
法を応用することが可能である。すなわち、プロトプラ
スト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、カル
シウム法等を適用することが出来る。
クターを適当な宿主細胞に導入されることによって調製
される。使用される宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母など特に限定されるものではないが、好ましくは酵
母、より好ましくはメタノール資化性酵母である。具体
的にはCandida boidiniiが例示される。宿主へのプラス
ミドの導入は、通常、形質転換に用いられる一般的な方
法を応用することが可能である。すなわち、プロトプラ
スト法、リチウム法、エレクトロポレーション法、カル
シウム法等を適用することが出来る。
【００１９】本発明の発現ベクターは、宿主染色体DNA
に組み込まれる。また、宿主細胞内で自己複製可能な自
律性複製配列を有するベクターを用いて、プラスミド状
態で存在させることも可能である。なお、宿主細胞内に
存在する異種遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であ
ってもよい。
に組み込まれる。また、宿主細胞内で自己複製可能な自
律性複製配列を有するベクターを用いて、プラスミド状
態で存在させることも可能である。なお、宿主細胞内に
存在する異種遺伝子のコピー数は１コピーでも複数であ
ってもよい。
【００２０】このようにして得られた形質転換体を培養
し、得られる培養物から異種遺伝子発現産物を採取する
ことにより、目的とする遺伝子発現産物を取得すること
ができる。ここで、「遺伝子発現産物を採取する」と
は、培養菌体から遺伝子発現産物を抽出すること、培養
上清自体を回収すること、及び培養上清から発現産物を
精製することのいずれをも意味する。上記形質転換体
は、メタノールおよびギ酸により異種遺伝子を誘導発現
するので、培地としては以下のものが例示される。
し、得られる培養物から異種遺伝子発現産物を採取する
ことにより、目的とする遺伝子発現産物を取得すること
ができる。ここで、「遺伝子発現産物を採取する」と
は、培養菌体から遺伝子発現産物を抽出すること、培養
上清自体を回収すること、及び培養上清から発現産物を
精製することのいずれをも意味する。上記形質転換体
は、メタノールおよびギ酸により異種遺伝子を誘導発現
するので、培地としては以下のものが例示される。
【００２１】メタノールによって誘導発現させる際に
は、炭素源としてメタノールを含む他、酵母エキス、ト
リプトン、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、アンモニ
ウム塩等の１種以上の窒素源と、リン酸、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、マンガ
ン、コバルト等の無機塩類とを添加し、さらに必要に応
じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄
養素、誘導を阻害しない糖質原料を便宜添加した培地が
用いられる。
は、炭素源としてメタノールを含む他、酵母エキス、ト
リプトン、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、アンモニ
ウム塩等の１種以上の窒素源と、リン酸、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、銅、マンガ
ン、コバルト等の無機塩類とを添加し、さらに必要に応
じて各種ビタミン、アミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄
養素、誘導を阻害しない糖質原料を便宜添加した培地が
用いられる。
【００２２】ギ酸によって誘導発現させる際には、ギ酸
を含む他、グルコース、グリセロール等の１種以上の炭
素源、酵母エキス、トリプトン、肉エキス、ペプトン、
カザミノ酸、アンモニウム塩等の１種以上の窒素源、そ
してリン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カ
ルシウム、鉄、銅、マンガン、コバルト等の無機塩類を
添加し、さらに必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、
ヌクレオチド等の微量栄養素、誘導を阻害しない糖質原
料を便宜添加した培地が用いられる。
を含む他、グルコース、グリセロール等の１種以上の炭
素源、酵母エキス、トリプトン、肉エキス、ペプトン、
カザミノ酸、アンモニウム塩等の１種以上の窒素源、そ
してリン酸、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カ
ルシウム、鉄、銅、マンガン、コバルト等の無機塩類を
添加し、さらに必要に応じて各種ビタミン、アミノ酸、
ヌクレオチド等の微量栄養素、誘導を阻害しない糖質原
料を便宜添加した培地が用いられる。
【００２３】培地のpHは、５〜８の範囲が好ましい。ま
た培養温度は通常15〜45℃、好ましくは28℃前後であ
る。培養時間は24〜1000時間程度であり、培養は静置、
振とう、攪拌、通気下の回分培養又は連続培養により実
施することができる。培養終了後、培養物から遺伝子産
物を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用い
ることができる。例えば、形質転換細胞内に生産された
場合は、常法により菌体を超音波処理、磨砕処理、加圧
破砕等により遺伝子産物を抽出する。必要に応じてプロ
テアーゼ阻害剤を添加する。培養上清中に生産された場
合、培養液そのものを用いることができる。得られた溶
液をろ過、遠心分離等により固形部分の除去し、粗タン
パク質溶液を得る。必要によりプロタミン処理等による
核酸の除去を行う。
た培養温度は通常15〜45℃、好ましくは28℃前後であ
る。培養時間は24〜1000時間程度であり、培養は静置、
振とう、攪拌、通気下の回分培養又は連続培養により実
施することができる。培養終了後、培養物から遺伝子産
物を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用い
ることができる。例えば、形質転換細胞内に生産された
場合は、常法により菌体を超音波処理、磨砕処理、加圧
破砕等により遺伝子産物を抽出する。必要に応じてプロ
テアーゼ阻害剤を添加する。培養上清中に生産された場
合、培養液そのものを用いることができる。得られた溶
液をろ過、遠心分離等により固形部分の除去し、粗タン
パク質溶液を得る。必要によりプロタミン処理等による
核酸の除去を行う。
【００２４】粗タンパク質溶液から塩析法、溶媒沈殿
法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等の精製手法を組み合わせることにより、目
的タンパク質が分離精製される。
法、透析法、限外ろ過法、ゲル電気泳動法、あるいはイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティクロマト
グラフィー等の精製手法を組み合わせることにより、目
的タンパク質が分離精製される。
【００２５】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術
的範囲が限定されるものではない。 実施例１ 本実施例は、上流領域を欠失したCandida boidinii FDH
プロモーターを作製し、上流欠失型FDHプロモーターに
より支配される酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来
の酸性フォスファターゼ活性を測定することによりFDH
プロモーターの機能に必要な領域を同定した例である。
説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術
的範囲が限定されるものではない。 実施例１ 本実施例は、上流領域を欠失したCandida boidinii FDH
プロモーターを作製し、上流欠失型FDHプロモーターに
より支配される酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来
の酸性フォスファターゼ活性を測定することによりFDH
プロモーターの機能に必要な領域を同定した例である。
【００２６】（1-1）酸性フォスファターゼ発現プラス
ミドの作製 マーカー遺伝子としてURA3遺伝子を有する、FDHプロモ
ーター／ターミネーターによる酸性フォスファターゼ発
現プラスミドpPUF1（図１）は、WO97/10345に記載され
ている方法に従って作製した。宿主株はURA3遺伝子の変
異株であるCandida boidinii KST2515株を用いた。pPUF
1はWO97/10345に記載されている方法に従えば容易に得
ることが可能である。FDHプロモーター／ターミネータ
ー、URA3遺伝子、PHO5遺伝子は、それぞれWO97/10345、
Sakai Y. et al., J. Ferment. Bioeng., 73, 255-260
(1992)、Arima, K. et al., Nucleic Acids Res., 11,
1657(1983)に記載されている配列をもとに化学合成によ
って取得することも可能である。本実施例ではCandida
boidinii KST2515株を用いているが、他のCandidaboidi
nii株、例えばIFO 10035株を用いても、公知の方法（Sa
kai Y. et al., J.Bacteriol., 173, 7458(1991)）に従
えば容易にURA3遺伝子変異株を取得することができる。
ミドの作製 マーカー遺伝子としてURA3遺伝子を有する、FDHプロモ
ーター／ターミネーターによる酸性フォスファターゼ発
現プラスミドpPUF1（図１）は、WO97/10345に記載され
ている方法に従って作製した。宿主株はURA3遺伝子の変
異株であるCandida boidinii KST2515株を用いた。pPUF
1はWO97/10345に記載されている方法に従えば容易に得
ることが可能である。FDHプロモーター／ターミネータ
ー、URA3遺伝子、PHO5遺伝子は、それぞれWO97/10345、
Sakai Y. et al., J. Ferment. Bioeng., 73, 255-260
(1992)、Arima, K. et al., Nucleic Acids Res., 11,
1657(1983)に記載されている配列をもとに化学合成によ
って取得することも可能である。本実施例ではCandida
boidinii KST2515株を用いているが、他のCandidaboidi
nii株、例えばIFO 10035株を用いても、公知の方法（Sa
kai Y. et al., J.Bacteriol., 173, 7458(1991)）に従
えば容易にURA3遺伝子変異株を取得することができる。
【００２７】（1-2）上流欠失型FDHプロモーターにより
支配されるPHO5発現プラスミドの構築 上流領域を欠失したFDHプロモーターは、キロシークエ
ンス用デレーションキット（宝酒造社）及びPCRにて作
成した。プラスミドpPUF1をApa I-Xho Iで切断し、キロ
シークエンス用デレーションキットを用いて処理し、上
流欠失型FDHプロモーターにより支配されるPHO5発現プ
ラスミドpPUF15、pPUF24、pPUF44、pPUF54、pPUF56、pP
UF79、pPUF308及びpPUF310を取得した。これらのプラス
ミドを鋳型としてダイプライマーサイクルシークエンシ
ングキット（パーキンエルマー社）を用いて塩基配列を
決定し、プラスミドpPUF15、pPUF24、pPUF44、pPUF54、
pPUF56、pPUF79、pPUF308、pPUF310はFDHプロモーター
領域をそれぞれ1215bp、1000bp、839bp、690bp、756b
p、403bp、228bp、115bp有していることを確認した。PC
Rにて上流領域を欠失したFDHプロモーターを作成するた
めに、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
支配されるPHO5発現プラスミドの構築 上流領域を欠失したFDHプロモーターは、キロシークエ
ンス用デレーションキット（宝酒造社）及びPCRにて作
成した。プラスミドpPUF1をApa I-Xho Iで切断し、キロ
シークエンス用デレーションキットを用いて処理し、上
流欠失型FDHプロモーターにより支配されるPHO5発現プ
ラスミドpPUF15、pPUF24、pPUF44、pPUF54、pPUF56、pP
UF79、pPUF308及びpPUF310を取得した。これらのプラス
ミドを鋳型としてダイプライマーサイクルシークエンシ
ングキット（パーキンエルマー社）を用いて塩基配列を
決定し、プラスミドpPUF15、pPUF24、pPUF44、pPUF54、
pPUF56、pPUF79、pPUF308、pPUF310はFDHプロモーター
領域をそれぞれ1215bp、1000bp、839bp、690bp、756b
p、403bp、228bp、115bp有していることを確認した。PC
Rにて上流領域を欠失したFDHプロモーターを作成するた
めに、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
【００２８】 PF819;CCCCTCGAGGAAATAGATACATTACCCAGTGTC（配列番号５） PF801;CCCCTCGAGTGTCATCGATATTATGCCCCGCC（配列番号６） PF779;CCCCTCGAGGCCTTTTTCACTTGAAACAATAACTAT（配列番号７） PF668;CCCCTCGAGTAATACTAGTCAGATGTTATAATTATATC（配列番号８） PF642;CCCCTCGAGTATCTTTACCACTATCCAATTAAAATCC（配列番号９） PF622;CCCCTCGAGTAAAATCCATGGATCAGACGGTAG（配列番号10） PF602;CCCCTCGAGTAGTTTTTATATCTGTAACATCTTAC（配列番号11） PF194;CCCCTCGAGTAAATTCAACTAAAAATTGAACTATTTAAACACTATG（配列番号12） PF161;CCCCTCGAGATGATTTCCTTCAATTATATTAAAATCAATTTC（配列番号13） PRV3;CAATGAGCCGTTGAATTGACGAGTG（配列番号14）
【００２９】オリゴヌクレオチドPF819、PF801、PF77
9、PF668、PF642、PF622、PF602、PF194、PF161のいず
れかとPRV3とを用いて、pPUF1を鋳型としたPCR（（94℃
で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイクル）を行
った。それぞれの増幅DNA断片をpT7 Blue T-Vector（ノ
バジェン社）にクローニングした後、Xho I-Not Iで切
り出し、pPUF1のXho I-Not Iに挿入した。プライマーPF
819から得たプロモーター領域を819bp有しているPHO5発
現プラスミドをpPUF819、プライマーPF801から得たプロ
モーター領域を801bp有しているPHO5発現プラスミドをp
PUF801、プライマーPF779から得たプロモーター領域を7
79bp有しているPHO5発現プラスミドをpPUF779、プライ
マーPF668から得たプロモーター領域を668bp有している
PHO5発現プラスミドをpPUF668、プライマーPF642から得
たプロモーター領域を642bp有しているPHO5発現プラス
ミドをpPUF642、プライマーPF622から得たプロモーター
領域を622bp有しているPHO5発現プラスミドをpPUF622、
プライマーPF602から得たプロモーター領域を602bp有し
ているPHO5発現プラスミドをpPUF602、プライマーPF194
から得たプロモーター領域を194bp有しているPHO5発現
プラスミドをpPUF194、プライマーPF161から得たプロモ
ーター領域を161bp有しているPHO5発現プラスミドをpPU
F161と命名した。
9、PF668、PF642、PF622、PF602、PF194、PF161のいず
れかとPRV3とを用いて、pPUF1を鋳型としたPCR（（94℃
で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイクル）を行
った。それぞれの増幅DNA断片をpT7 Blue T-Vector（ノ
バジェン社）にクローニングした後、Xho I-Not Iで切
り出し、pPUF1のXho I-Not Iに挿入した。プライマーPF
819から得たプロモーター領域を819bp有しているPHO5発
現プラスミドをpPUF819、プライマーPF801から得たプロ
モーター領域を801bp有しているPHO5発現プラスミドをp
PUF801、プライマーPF779から得たプロモーター領域を7
79bp有しているPHO5発現プラスミドをpPUF779、プライ
マーPF668から得たプロモーター領域を668bp有している
PHO5発現プラスミドをpPUF668、プライマーPF642から得
たプロモーター領域を642bp有しているPHO5発現プラス
ミドをpPUF642、プライマーPF622から得たプロモーター
領域を622bp有しているPHO5発現プラスミドをpPUF622、
プライマーPF602から得たプロモーター領域を602bp有し
ているPHO5発現プラスミドをpPUF602、プライマーPF194
から得たプロモーター領域を194bp有しているPHO5発現
プラスミドをpPUF194、プライマーPF161から得たプロモ
ーター領域を161bp有しているPHO5発現プラスミドをpPU
F161と命名した。
【００３０】（1-3）形質転換 上記実施例（1-2）で得たプラスミドDNA 5μgをBam HI
で切断し、Candida boidinii KST2515株に形質転換し
た。得られた形質転換体のコロニーを各プラスミドにつ
き数個拾い、メタノール1.5％、Yeast Nitrogen Base
0.67％、酵母エキス 0.5％を含むpH5.5の培地（ME培
地）、又はグルコース1.0％、ギ酸ナトリウム0.5％、Ye
ast Nitrogen Base 0.67％を含むpH5.5の培地（GF培
地）で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。
酸性フォスファターゼ活性の測定法は、Toh-eらの方法
（Toh-e, A. et al., J. Bacteriol., 113, 727 (197
3)）に従い、洗浄菌体懸濁液をそのまま酵素として用い
た。１単位の酵素活性は、30℃で１分間に1mmoleのp-ニ
トロフェノールを生成する酵素量とした。公知の文献
（SakaiY. et al., J. Bacteriol., 173, 7458(1991)）
によると、URA3をマーカーとした形質転換では、形質転
換細胞の約半分が、プラスミドが１コピー組み込まれた
ものであることから、各プラスミドからの形質転換体の
酸性フォスファターゼ活性の値の分布が最も大きい値
を、１コピー挿入形質転換体の酸性フォスファターゼ活
性の値とした。またこれら形質転換体について、実際に
プラスミドが１コピー組み込まれていることをサザン解
析によって確認した。pPUF1が示す酸性フォスファター
ゼ比活性（ユニット／OD610）を100としたときの各プラ
スミドからの形質転換体が示す酸性フォスファターゼ比
活性を図2 に示す。図２の結果から、メタノールによっ
て誘導する場合は、プロモーター領域を839bp以上、ギ
酸によって誘導する場合は、プロモーター領域を642bp
以上有していれば、活性が80％以上保持されることが明
らかとなった。なお、比活性は、プロモーター領域が欠
失していないプラスミドpPUF1の形質転換体が示す酸性
フォスファターゼ活性を100としたときの相対値を示し
ている。また親株とは、プラスミドを導入していないCa
ndida boidinii KST2515株の値である。
で切断し、Candida boidinii KST2515株に形質転換し
た。得られた形質転換体のコロニーを各プラスミドにつ
き数個拾い、メタノール1.5％、Yeast Nitrogen Base
0.67％、酵母エキス 0.5％を含むpH5.5の培地（ME培
地）、又はグルコース1.0％、ギ酸ナトリウム0.5％、Ye
ast Nitrogen Base 0.67％を含むpH5.5の培地（GF培
地）で培養し、酸性フォスファターゼ活性を測定した。
酸性フォスファターゼ活性の測定法は、Toh-eらの方法
（Toh-e, A. et al., J. Bacteriol., 113, 727 (197
3)）に従い、洗浄菌体懸濁液をそのまま酵素として用い
た。１単位の酵素活性は、30℃で１分間に1mmoleのp-ニ
トロフェノールを生成する酵素量とした。公知の文献
（SakaiY. et al., J. Bacteriol., 173, 7458(1991)）
によると、URA3をマーカーとした形質転換では、形質転
換細胞の約半分が、プラスミドが１コピー組み込まれた
ものであることから、各プラスミドからの形質転換体の
酸性フォスファターゼ活性の値の分布が最も大きい値
を、１コピー挿入形質転換体の酸性フォスファターゼ活
性の値とした。またこれら形質転換体について、実際に
プラスミドが１コピー組み込まれていることをサザン解
析によって確認した。pPUF1が示す酸性フォスファター
ゼ比活性（ユニット／OD610）を100としたときの各プラ
スミドからの形質転換体が示す酸性フォスファターゼ比
活性を図2 に示す。図２の結果から、メタノールによっ
て誘導する場合は、プロモーター領域を839bp以上、ギ
酸によって誘導する場合は、プロモーター領域を642bp
以上有していれば、活性が80％以上保持されることが明
らかとなった。なお、比活性は、プロモーター領域が欠
失していないプラスミドpPUF1の形質転換体が示す酸性
フォスファターゼ活性を100としたときの相対値を示し
ている。また親株とは、プラスミドを導入していないCa
ndida boidinii KST2515株の値である。
【００３１】実施例２ 本実施例は、内部領域を欠失したCandida boidinii FDH
プロモーターを作製し、内部欠失型FDHプロモーターに
より支配されるSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フ
ォスファターゼ活性を測定することによりFDHプロモー
ターの機能に必要な領域を同定した例である。
プロモーターを作製し、内部欠失型FDHプロモーターに
より支配されるSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フ
ォスファターゼ活性を測定することによりFDHプロモー
ターの機能に必要な領域を同定した例である。
【００３２】（2-1）内部欠失型FDHプロモーターにより
支配されるPHO5発現プラスミドの構築 内部領域を欠失したFDHプロモーターは、PCRにて作成し
た(図３にpPFID1の構築法を示す)。PCRにて内部領域を
欠失したFDHプロモーターを作成するために、以下のオ
リゴヌクレオチドを合成した。
支配されるPHO5発現プラスミドの構築 内部領域を欠失したFDHプロモーターは、PCRにて作成し
た(図３にpPFID1の構築法を示す)。PCRにて内部領域を
欠失したFDHプロモーターを作成するために、以下のオ
リゴヌクレオチドを合成した。
【００３３】 PF1478;CCCCTCGAGTCAACAAATCAATCAGCCAATCTACC（配列番号15） PF521;CCAGATCTTGATAATAAGGTATACTACATTTTATC（配列番号16） PC548;CCAGATCTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAGTGGTAGTAGTAAGATG（配列番号17） PC571;CCAGATCTAGTAGTAAGATGTTACAGATATAAAAACTACCG（配列番号18） PC599;CCAGATCTCTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGG（配列番号19） PC619;CCAGATCTTTAATTGGATAGTGGTAAAGATATAATTATAAC（配列番号20） PC641;CCAGATCTATAATTATAACATCTGACTAGTATTACC（配列番号21）
【００３４】オリゴヌクレオチドPF521とPRV3を用い
て、pPUF1を鋳型としたPCR（（94℃で30秒、55℃で１
分、72℃で１分）×20サイクル）を行い、増幅DNA断片
をpT7 BlueT-Vectorにクローニングした後、Bgl II-Not
Iで切り出した。PF1478とPC548、PC571、PC599、PC61
9、PC642のいずれかを用いて、pPUF1を鋳型としたPCR
（（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイク
ル）を行った。それぞれの増幅DNA断片をpT7 Blue T-Ve
ctorにクローニングした後、Xho I-Bgl IIで切り出し、
前述のBgl II-Not IDNA断片とともに、pPUF1のXho I-No
t Iに挿入した。プライマーPC548から得た配列番号２の
932番目から957番目の塩基配列が欠失したFDHプロモー
ター領域を有しているPHO5発現プラスミドをpPFID1、プ
ライマーPC571から得た配列番号２の909番目から957番
目の塩基配列が欠失したFDHプロモーター領域を有して
いるPHO5発現プラスミドをpPFID2、プライマーPC599か
ら得た配列番号２の881番目から957番目の塩基配列が欠
失したFDHプロモーター領域を有しているPHO5発現プラ
スミドをpPFID3、プライマーPC619から得た配列番号２
の861番目から957番目の塩基配列が欠失したFDHプロモ
ーター領域を有しているPHO5発現プラスミドをpPFID4、
プライマーPC642から得た配列番号２の839番目から957
番目の塩基配列が欠失したFDHプロモーター領域を有し
ているPHO5発現プラスミドをpPFID5と命名した。
て、pPUF1を鋳型としたPCR（（94℃で30秒、55℃で１
分、72℃で１分）×20サイクル）を行い、増幅DNA断片
をpT7 BlueT-Vectorにクローニングした後、Bgl II-Not
Iで切り出した。PF1478とPC548、PC571、PC599、PC61
9、PC642のいずれかを用いて、pPUF1を鋳型としたPCR
（（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイク
ル）を行った。それぞれの増幅DNA断片をpT7 Blue T-Ve
ctorにクローニングした後、Xho I-Bgl IIで切り出し、
前述のBgl II-Not IDNA断片とともに、pPUF1のXho I-No
t Iに挿入した。プライマーPC548から得た配列番号２の
932番目から957番目の塩基配列が欠失したFDHプロモー
ター領域を有しているPHO5発現プラスミドをpPFID1、プ
ライマーPC571から得た配列番号２の909番目から957番
目の塩基配列が欠失したFDHプロモーター領域を有して
いるPHO5発現プラスミドをpPFID2、プライマーPC599か
ら得た配列番号２の881番目から957番目の塩基配列が欠
失したFDHプロモーター領域を有しているPHO5発現プラ
スミドをpPFID3、プライマーPC619から得た配列番号２
の861番目から957番目の塩基配列が欠失したFDHプロモ
ーター領域を有しているPHO5発現プラスミドをpPFID4、
プライマーPC642から得た配列番号２の839番目から957
番目の塩基配列が欠失したFDHプロモーター領域を有し
ているPHO5発現プラスミドをpPFID5と命名した。
【００３５】（2-2）形質転換 上記実施例（2-1）で得たプラスミドを実施例（1-3）と
同様の方法で、Candida boidiniiに形質転換し、ME培
地、GF培地での酸性フォスファターゼ活性を測定した。
pPUF1が示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット／O
D610）を100としたときの各プラスミドからの形質転換
体が示す酸性フォスファターゼ比活性を図４に示す。な
お、比活性は、プロモーター領域が欠失していないプラ
スミドpPUF1の形質転換株が示す酸性フォスファターゼ
活性を100としたときの相対値を示している。
同様の方法で、Candida boidiniiに形質転換し、ME培
地、GF培地での酸性フォスファターゼ活性を測定した。
pPUF1が示す酸性フォスファターゼ比活性（ユニット／O
D610）を100としたときの各プラスミドからの形質転換
体が示す酸性フォスファターゼ比活性を図４に示す。な
お、比活性は、プロモーター領域が欠失していないプラ
スミドpPUF1の形質転換株が示す酸性フォスファターゼ
活性を100としたときの相対値を示している。
【００３６】配列番号２の881番目から957番目の塩基配
列が欠失したものではFDHプロモーター活性には全く影
響を与えなかったが、861番目から957番目の塩基配列が
欠失したものではメタノール及びギ酸による誘導が全く
見られなかった。本結果と実施例１の結果より、配列番
号２の837番目から880番目の塩基配列が、メタノール及
びギ酸によって誘導するには、FDHプロモーター活性に
必要であると考えられた。
列が欠失したものではFDHプロモーター活性には全く影
響を与えなかったが、861番目から957番目の塩基配列が
欠失したものではメタノール及びギ酸による誘導が全く
見られなかった。本結果と実施例１の結果より、配列番
号２の837番目から880番目の塩基配列が、メタノール及
びギ酸によって誘導するには、FDHプロモーター活性に
必要であると考えられた。
【００３７】実施例３ 本実施例は、UAS配列を付加したCandida boidinii FDH
プロモーターを作製し、該プロモーターにより支配され
るSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フォスファター
ゼ活性を測定したものである。
プロモーターを作製し、該プロモーターにより支配され
るSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フォスファター
ゼ活性を測定したものである。
【００３８】（3-1）PHO5発現プラスミドの構築 5'末端にXho I部位を有するFDHプロモーター領域1000bp
を単離するために以下のオリゴヌクレオチドPXF1000を
合成した。 PXF1000;CCCTCGAGGCTGGGTTTTTACTGAATTCAGTC（配列番号22） オリゴヌクレオチドPXF1000とPRV3を用いて、pPUF24を
鋳型としたPCR（（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１
分）×20サイクル）を行い、増幅DNA断片をpT7 Blue T-
Vectorにクローニングした後、XhoI-Not Iで切り出し、
pPUF1のXho I-NotIに挿入した。得られたプラスミドをp
PUF24Xと命名した。実施例１、２より推定されるFDHプ
ロモーター活性に必要であると考えられる配列番号１の
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドUA3、UA3Cを合成し
た。
を単離するために以下のオリゴヌクレオチドPXF1000を
合成した。 PXF1000;CCCTCGAGGCTGGGTTTTTACTGAATTCAGTC（配列番号22） オリゴヌクレオチドPXF1000とPRV3を用いて、pPUF24を
鋳型としたPCR（（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１
分）×20サイクル）を行い、増幅DNA断片をpT7 Blue T-
Vectorにクローニングした後、XhoI-Not Iで切り出し、
pPUF1のXho I-NotIに挿入した。得られたプラスミドをp
PUF24Xと命名した。実施例１、２より推定されるFDHプ
ロモーター活性に必要であると考えられる配列番号１の
塩基配列を含むオリゴヌクレオチドUA3、UA3Cを合成し
た。
【００３９】 UA3;TCGAGTTTACCACTATCCAATTAAAATCCATGGATCAGACGGTAGCTTTACCACTATCCAATTAAAAT
CCATGGATCAGACGGTAG（配列番号23） UA3C;TCGACTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAAGCTACCGTCTGATCCATGGATTT
TAATTGGATAGTGGTAAAC（配列番号24）
CCATGGATCAGACGGTAG（配列番号23） UA3C;TCGACTACCGTCTGATCCATGGATTTTAATTGGATAGTGGTAAAGCTACCGTCTGATCCATGGATTT
TAATTGGATAGTGGTAAAC（配列番号24）
【００４０】合成後、オリゴヌクレオチドUA3、UA3CをT
4ポリヌクレオチド・キナーゼ(宝酒造社)により5'末端
をリン酸化し、それぞれ100pmol/μlになるように、ア
ニーリングバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1mM
EDTA, 100mM NaCl）に溶解した。前述オリゴヌクレオチ
ドUA3、UA3C溶液を等量混合し、95℃で５分間加熱し、
徐冷して両鎖をアニーリングした。得られた２本鎖DNA
断片は、両末端がXho I部位とライゲーション可能であ
り、ライゲーション後、図５に示すように片方のみが再
びXho Iで切断される。
4ポリヌクレオチド・キナーゼ(宝酒造社)により5'末端
をリン酸化し、それぞれ100pmol/μlになるように、ア
ニーリングバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1mM
EDTA, 100mM NaCl）に溶解した。前述オリゴヌクレオチ
ドUA3、UA3C溶液を等量混合し、95℃で５分間加熱し、
徐冷して両鎖をアニーリングした。得られた２本鎖DNA
断片は、両末端がXho I部位とライゲーション可能であ
り、ライゲーション後、図５に示すように片方のみが再
びXho Iで切断される。
【００４１】pPUF24XをXho Iで切断した後、先のアニー
リングしたDNA断片とライゲーションし、大腸菌DH5に形
質転換した。数個の形質転換体よりプラスミドDNAを調
整し、制限酵素分析により、合成DNA断片が挿入されて
いるプラスミドを選択し、さらに挿入されている合成DN
A断片のコピー数及び、方向を決定した。配列番号１の
塩基配列が２コピー正方向に挿入されたプラスミドをpM
FPH2、２コピー逆方向に挿入されたプラスミドをpMFPH2
R、４コピー正方向に挿入されたプラスミドをpMFPH4と
名付けた。得られたプラスミドのプロモーター領域の構
造の一部を図６に示す。
リングしたDNA断片とライゲーションし、大腸菌DH5に形
質転換した。数個の形質転換体よりプラスミドDNAを調
整し、制限酵素分析により、合成DNA断片が挿入されて
いるプラスミドを選択し、さらに挿入されている合成DN
A断片のコピー数及び、方向を決定した。配列番号１の
塩基配列が２コピー正方向に挿入されたプラスミドをpM
FPH2、２コピー逆方向に挿入されたプラスミドをpMFPH2
R、４コピー正方向に挿入されたプラスミドをpMFPH4と
名付けた。得られたプラスミドのプロモーター領域の構
造の一部を図６に示す。
【００４２】（3-2）形質転換 上記実施例（3-1）で得たプラスミド，pMFPH2，pMFPH2
R，pMFPH4及びpPUF1を実施例（1-3）と同様の方法でCan
dida boidiniiに形質転換し、ME培地、GF培地での酸性
フォスファターゼ活性（ユニット／OD610）を測定し
た。なお、１単位の酵素活性は、30℃で１分間に1mmole
のp-ニトロフェノールを生成する酵素量とした。各プラ
スミドからの１コピー挿入型形質転換体が示す酸性フォ
スファターゼ比活性を図６に示す（活性はmU/OD610で表
示）。酸性フォスファターゼ比活性は挿入したDNA断片
により、大幅に上昇した。また、この効果はそのコピー
数に依存するものの、挿入方向とは無関係であった。
R，pMFPH4及びpPUF1を実施例（1-3）と同様の方法でCan
dida boidiniiに形質転換し、ME培地、GF培地での酸性
フォスファターゼ活性（ユニット／OD610）を測定し
た。なお、１単位の酵素活性は、30℃で１分間に1mmole
のp-ニトロフェノールを生成する酵素量とした。各プラ
スミドからの１コピー挿入型形質転換体が示す酸性フォ
スファターゼ比活性を図６に示す（活性はmU/OD610で表
示）。酸性フォスファターゼ比活性は挿入したDNA断片
により、大幅に上昇した。また、この効果はそのコピー
数に依存するものの、挿入方向とは無関係であった。
【００４３】以上の結果より、挿入した配列番号１の塩
基配列はFDHプロモーターがメタノール及びギ酸により
誘導される際に、必須な配列、すなわちFDHプロモータ
ーのUAS配列として機能していること、及びUAS配列はプ
ロモーターの転写活性を挿入方向に依存せずに増強させ
ることが明らかとなった。
基配列はFDHプロモーターがメタノール及びギ酸により
誘導される際に、必須な配列、すなわちFDHプロモータ
ーのUAS配列として機能していること、及びUAS配列はプ
ロモーターの転写活性を挿入方向に依存せずに増強させ
ることが明らかとなった。
【００４４】実施例４ 本実施例は、UAS配列を付加したCandida boidiniiアク
チン遺伝子プロモーターを作製し、該プロモーターによ
り支配されるSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フォ
スファターゼ活性を測定したものである。
チン遺伝子プロモーターを作製し、該プロモーターによ
り支配されるSaccharomyces cerevisiae由来の酸性フォ
スファターゼ活性を測定したものである。
【００４５】（4-1）PHO5発現プラスミドの構築 アクチンプロモーターによるPHO5発現プラスミドを構築
するため、Candida boidiniiアクチン遺伝子のプロモー
ター領域をPCRにて取得した。配列番号３に記載されて
いるCandida boidiniiアクチン遺伝子のプロモーター領
域の塩基配列をもとに、以下のオリゴヌクレオチドを合
成した。 XCAC5;TTCTCGAGTCAATAAGAGTGTGATTATATACAATCAGC（配列番号25） NCAC3;TTGCGGCCGCTTTTGTAATATATATTAAATTAAATTTATAAAATCTATC（配列番号26）
するため、Candida boidiniiアクチン遺伝子のプロモー
ター領域をPCRにて取得した。配列番号３に記載されて
いるCandida boidiniiアクチン遺伝子のプロモーター領
域の塩基配列をもとに、以下のオリゴヌクレオチドを合
成した。 XCAC5;TTCTCGAGTCAATAAGAGTGTGATTATATACAATCAGC（配列番号25） NCAC3;TTGCGGCCGCTTTTGTAATATATATTAAATTAAATTTATAAAATCTATC（配列番号26）
【００４６】オリゴヌクレオチドXCAC5とNCAC3を用い
て、WO97/10345に記載のpAc1-7を鋳型としたPCR（（94
℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイクル）を
行った。なお、本実施例ではPCRの鋳型DNAとしてプラス
ミドpAc1-7を用いているが、Candida boidinii ATCC481
80株より取得した染色体DNAを用いて行うことも可能で
ある。増幅DNA断片をpT7 Blue T-Vectorにクローニング
した後、Xho I-Not Iで切り出し、pPUF1のXho I-Not I
に挿入した。得られたプラスミドpAcPH(図7)はマーカー
がURA3遺伝子で、Candida boidiniiアクチン遺伝子プロ
モーター、FDH遺伝子ターミネーターによるPHO5発現プ
ラスミドである。
て、WO97/10345に記載のpAc1-7を鋳型としたPCR（（94
℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分）×20サイクル）を
行った。なお、本実施例ではPCRの鋳型DNAとしてプラス
ミドpAc1-7を用いているが、Candida boidinii ATCC481
80株より取得した染色体DNAを用いて行うことも可能で
ある。増幅DNA断片をpT7 Blue T-Vectorにクローニング
した後、Xho I-Not Iで切り出し、pPUF1のXho I-Not I
に挿入した。得られたプラスミドpAcPH(図7)はマーカー
がURA3遺伝子で、Candida boidiniiアクチン遺伝子プロ
モーター、FDH遺伝子ターミネーターによるPHO5発現プ
ラスミドである。
【００４７】pACPHのアクチン遺伝子プロモーターの5'
末端側に存在するXho I部位に、実施例(3-1)と同様の方
法でUAS配列を含むDNA断片を挿入し、UAS配列が２コピ
ー正方向に挿入されたプラスミドpUAcPH2、UAS配列が４
コピー正方向に挿入されたプラスミドpUAcPH4を作製し
た。
末端側に存在するXho I部位に、実施例(3-1)と同様の方
法でUAS配列を含むDNA断片を挿入し、UAS配列が２コピ
ー正方向に挿入されたプラスミドpUAcPH2、UAS配列が４
コピー正方向に挿入されたプラスミドpUAcPH4を作製し
た。
【００４８】（4-2）形質転換 上記実施例（4-1）で得たプラスミドpAcPH、pUAcPH2、p
UAcPH4及びpPUF1を実施例（1-3）と同様の方法で、Cand
ida boidiniiに形質転換した。ただし、プラスミドDNA
の切断にはHind IIIを用いた。得られた形質転換体のME
培地、GF培地、及びグルコース1.0％、Yeast Nitrogen
Base 0.67％を含むpH5.5の培地（GS培地）での酸性フォ
スファターゼ活性を測定した。各プラスミドからの１コ
ピー挿入型形質転換体が示す酸性フォスファターゼ比活
性を図８に示す。
UAcPH4及びpPUF1を実施例（1-3）と同様の方法で、Cand
ida boidiniiに形質転換した。ただし、プラスミドDNA
の切断にはHind IIIを用いた。得られた形質転換体のME
培地、GF培地、及びグルコース1.0％、Yeast Nitrogen
Base 0.67％を含むpH5.5の培地（GS培地）での酸性フォ
スファターゼ活性を測定した。各プラスミドからの１コ
ピー挿入型形質転換体が示す酸性フォスファターゼ比活
性を図８に示す。
【００４９】UAS配列を持たないアクチン遺伝子プロモ
ーター(pAcPH)では、GS培地、GF培地、ME培地で酸性フ
ォスファターゼ活性には顕著な差が見られなかったもの
の、UAS配列を有するアクチン遺伝子プロモーター(pUAc
PH2、pUAcPH4)では、ギ酸脱水素酵素遺伝子プロモータ
ーと同様に、GF培地、ME培地で著しい活性の上昇が見ら
れた。以上の結果から、実施例３で示したUAS配列はFDH
プロモーターのみならず他のプロモーターの活性を増大
させる効果があることが判明した。
ーター(pAcPH)では、GS培地、GF培地、ME培地で酸性フ
ォスファターゼ活性には顕著な差が見られなかったもの
の、UAS配列を有するアクチン遺伝子プロモーター(pUAc
PH2、pUAcPH4)では、ギ酸脱水素酵素遺伝子プロモータ
ーと同様に、GF培地、ME培地で著しい活性の上昇が見ら
れた。以上の結果から、実施例３で示したUAS配列はFDH
プロモーターのみならず他のプロモーターの活性を増大
させる効果があることが判明した。
【００５０】
【発明の効果】本発明により、高い転写活性を有するプ
ロモーター、該プロモーターを担持する発現ベクター、
該発現ベクターが導入された形質転換体並びにプロモー
ター活性を増大させる方法及び異種蛋白質の生産方法が
提供される。本発明により得られる変異型プロモーター
は、野生型プロモーターと比べてプロモーター活性が格
段に増強されているため、異種遺伝子を発現させるプロ
モーターとして利用価値が極めて高く、本発明の発現ベ
クターは種々の有用なタンパク質を、効率良く発現、生
産することができる。
ロモーター、該プロモーターを担持する発現ベクター、
該発現ベクターが導入された形質転換体並びにプロモー
ター活性を増大させる方法及び異種蛋白質の生産方法が
提供される。本発明により得られる変異型プロモーター
は、野生型プロモーターと比べてプロモーター活性が格
段に増強されているため、異種遺伝子を発現させるプロ
モーターとして利用価値が極めて高く、本発明の発現ベ
クターは種々の有用なタンパク質を、効率良く発現、生
産することができる。
【００５１】
配列番号：１ 配列の長さ：40 配列の型:核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTACCACTA TCCAATTAAA ATCCATGGAT CAGACGGTAG 40
【００５２】配列番号：２ 配列の長さ：1478 配列の型:核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii） 株名：S2 AOU-1 配列 GTCAACAAAT CAATCAGCCA ATCTACCAAT CAATTAAAAA TACACTGAAG TGATATAGTT 60 TAGTCTAATC AAAGTTGAAT AACCCCAGAC ATGGTTGAAA TCTTAGAAGC CACAAATATC 120 AACAGGCCAA ATCGGCTCTC GGAGAATCTT TTCTGGCTTC CAGTGTATGG GCTGTTACGC 180 TACACTCAGT AAACTGCCTC CTCTCTGCAT CTCCATCTTC CCCACATTTT ATGCACTAAA 240 CGCCATCGCA ATATTTCACT AGACTTACAG AACCTTTCAC AATATTAACT CTCTGTCTCT 300 GATGTAATCG ATACAATTCA ATTCAACTAA ATACCATGAT AAACTCAAAT AATTGAAGGA 360 CTCCGATTTA TGCTTATCCA ACACTTATAT CCACTTGTAT TCATTACCGT GCTGTCTTCC 420 GTGGATCAGA TTGCCTCTGT CTCCCTATTC GTCAAATGGC AGAGCAATCA GGGAAAAAGC 480 TGGGTTTTTA CTGAATTCAG TCAAGTAATC CTGTCGGACT TTTTAATATC TAGCTTTCAC 540 AAAAACCAAC AACAACAACC GCTAATCCCA TCAAACAATT AAACAATTGT TACAATTGTC 600 ACAATTCTTG GATATACAAT AATTAAACAT ACGTACATTC TTACATACAT ATAGAGTTTG 660 AAATAGATAC ATTACCCAGT GTCATCGATA TTATGCCCCG CCTTTTTCAC TTGAAACAAT 720 AACTATTATT ACTACTATTA TTATTTCTAT TCATATATCC TAAAAATTAT ATTAAAATTG 780 GCTCTTTTAT GCAAAAAATG TACATTTATG GTAATACTAG TCAGATGTTA TAATTATATC 840 TTTACCACTA TCCAATTAAA ATCCATGGAT CAGACGGTAG TTTTTATATC TGTAACATCT 900 TACTACTACC ACTACTACTA CCACTACTAC TACCACTACT ACTACCACTA CTACTACTGA 960 TAATAAGGTA TACTACATTT TATCATACGT GAAATGTAAC GCGTAGATTA AACATTTTTT 1020 TAAAATTACT GATCAGTACT TTCCACAATA AGCACTTATT AATATGTGCC TCTTTAAAAT 1080 TACTTAATTC CCTTTACTTT TCATTTTTAC AACCGCTTTG GTATTTACCC CCAGAGTGTT 1140 TTAATTGCAA TTGAATTCTT ATTTTAATTT CCATTACTTT CTTTGTACCA TAATGAAATT 1200 GCCGAGTTGT CCCTCCTTTG AATTTAAATC ATTCTCTAAT ATTTAACTTT AATTTTAATA 1260 TTTTAGTTAT TTATTTGAAT TAAAGTAAAT TCAACTAAAA ATTGAACTAT TTAAACACTA 1320 TGATTTCCTT CAATTATATT AAAATCAATT TCATATTTCC TTACTTCTTT TTGCTTTATT 1380 ATACATCAAT AACTCAATTA ACTCATTGAT TATTTGAAAA AAAAAAACAT TTATTAACTT 1440 AACTCCCCGA TTATATATTA TATTATTGAC TTTACAAA 1478
【００５３】配列番号：３ 配列の長さ：1030 配列の型:核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii） 株名：ATCC 48180 配列 TCAATAAGAG TGTGATTATA TACAATCAGC TGGTGTTAAC TAAATATAGT TATGAAATTT 60 CACCGCGCGT TTGGTTCACG TTTCAGTACC AAGAATTGAT AATATTGGCA GCGGTTCAGT 120 GCGTTTGCTG CTTCACCTCC CGCATTCTCT AGTCCGGATT CTCTGTATTC CCCCTTACAT 180 TGCTGGCCAT TGCTGGCCAT TCCTGGCAAG GTATATGCCA CTACTGTGCC TGATTTCTTT 240 CACGCCTGCC TTACCATCAT GTCTCTTCTG TATATCCGCC CAACCGGCAG GACATCCGCT 300 TACCACGCAG CCCACCGCGT TTATGTGAGC GTCTTGACCT CGTCTCCTTC CCGTTTGCCC 360 CTGTCAACCG CCTCATCACT CACCACAGCC CCTGAAATAT ACACCGGATC ATCCAGAAAT 420 TACGGCTGAC ACAGCCTCTG GATCCCAGGC AGGCATTAAG GCATTACATC AGATAGCGAC 480 CACCATGACT GTACCCACTT TAGCCACTTT AACCACTCTG CTACCGCTCT TCTCTGTCTT 540 CCAGCTTGTC GCATTAGCCT GCGAGTCTTC CCACTGAGTT CCTTCTTTCT GTTTCTGTTT 600 CTCCCAGTGT CTCCGAGTTT ACCCACTTGT TTTCATTCTC GTTGTTGTCT CTTGTTTGTT 660 CAATTACCAC TCCCACCCAT TTTCTCTCAT TTTCTCTCTA TTCTTTCCTC CCAGATTCTG 720 TATCCGCCAT TTCATTCATC ATTCATTCAC TTATTCATCC TTCATCATCC ATTCATTCAT 780 TCATTTACCC AATTAACCTT CCAATCTATC AATTCATTAA TCAATCAACG CCTTTCCCTC 840 CGAACACTTC ACTCAATTCC TCTTCTGATA CACTCTTCGA CAATCAACAA TCAAATATAA 900 ATCAGTATAT CAATTTAGAT TCGTATATCT AAGTCTCTTC TATATCCATA TTTGATTTGT 960 TCTCTTTCTG ATCAACTAGA TTTATAACCT AGATAGATTT TATAAATTTA ATTTAATATA 1020 TATTACAAAA 1030
【００５４】配列番号：４ 配列の長さ：40 配列の型:核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 (UASの逆方向) CTACCGTCTG ATCCATGGAT TTTAATTGGA TAGTGGTAAA 40
【００５５】配列番号：５ 配列の長さ：33 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGG AAATAGATAC ATTACCCAGT GTC 33
【００５６】配列番号：６ 配列の長さ：32 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT GTCATCGATA TTATGCCCCG CC 32
【００５７】配列番号：７ 配列の長さ：36 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGG CCTTTTTCAC TTGAAACAAT AACTAT 36
【００５８】配列番号：８ 配列の長さ：38 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT AATACTAGTC AGATGTTATA ATTATATC 38
【００５９】配列番号：９ 配列の長さ：37 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT ATCTTTACCA CTATCCAATT AAAATCC 38
【００６０】配列番号：10 配列の長さ：33 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT AAAATCCATG GATCAGACGG TAG 33
【００６１】配列番号：11 配列の長さ：35 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT AGTTTTTATA TCTGTAACAT CTTAC 35
【００６２】配列番号：12 配列の長さ：46 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列) CCCCTCGAGT AAATTCAACT AAAAATTGAA CTATTTAAAC ACTATG 46
【００６３】配列番号：13 配列の長さ：42 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGA TGATTTCCTT CAATTATATT AAAATCAATT TC 42
【００６４】配列番号：14 配列の長さ：25 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CAATGAGCCG TTGAATTGAC GAGTG 25
【００６５】配列番号：15 配列の長さ：35 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCCTCGAGT CAACAAATCA ATCAGCCAAT CTACC 35
【００６６】配列番号：16 配列の長さ：35 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTTG ATAATAAGGT ATACTACATT TTATC 35
【００６７】配列番号：17 配列の長さ：44 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTAG TAGTAGTGGT AGTAGTAGTG GTAGTAGTAA GATG 44
【００６８】配列番号：18 配列の長さ：41 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTAG TAGTAAGATG TTACAGATAT AAAAACTACC G 41
【００６９】配列番号：19 配列の長さ：37 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTCT ACCGTCTGAT CCATGGATTT TAATTGG 37
【００７０】配列番号：20 配列の長さ：41 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTTT AATTGGATAG TGGTAAAGAT ATAATTATAA C 41
【００７１】配列番号：21 配列の長さ：36 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCAGATCTAT AATTATAACA TCTGACTAGT ATTACC 36
【００７２】配列番号：22 配列の長さ：32 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 CCCTCGAGGC TGGGTTTTTA CTGAATTCAG TC 32
【００７３】配列番号：23 配列の長さ：86 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 TCGAGTTTAC CACTATCCAA TTAAAATCCA TGGATCAGAC GGTAGCTTTA CCACTATCCA 60 ATTAAAATCC ATGGATCAGA CGGTAG 86
【００７４】配列番号：24 配列の長さ：86 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 TCGACTACCG TCTGATCCAT GGATTTTAAT TGGATAGTGG TAAAGCTACC GTCTGATCCA 60 TGGATTTTAA TTGGATAGTG GTAAAC 86
【００７５】配列番号：25 配列の長さ：38 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 TTCTCGAGTC AATAAGAGTG TGATTATATA CAATCAGC 38
【００７６】配列番号：26 配列の長さ：49 配列の型:核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列 TTGCGGCCGC TTTTGTAATA TATATTAAAT TAAATTTATA AAATCTATC 49
【図１】プラスミドpPUF1の構造を示す図である。
【図２】上流欠失型FDHプロモーターの支配下で発現さ
れる酸性フォスファターゼ活性を示す図である。
れる酸性フォスファターゼ活性を示す図である。
【図３】内部領域が欠失したFDHプロモーターによる酸
性フォスファターゼ発現プラスミドpPFID1の構築法を示
す図である。
性フォスファターゼ発現プラスミドpPFID1の構築法を示
す図である。
【図４】内部領域が欠失したFDHプロモーターの支配下
で発現される酸性フォスファターゼ活性を示す図であ
る。
で発現される酸性フォスファターゼ活性を示す図であ
る。
【図５】UAS配列と考えられる配列番号１に相当する配
列を含む化学合成したDNA断片、及びそれがXho I部位に
挿入される様式を示す図である。
列を含む化学合成したDNA断片、及びそれがXho I部位に
挿入される様式を示す図である。
【図６】UAS配列と考えられる配列番号１に相当する配
列を付加した変異型FDHプロモーターの構造、及びそれ
らの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示
す図である。
列を付加した変異型FDHプロモーターの構造、及びそれ
らの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性を示
す図である。
【図７】プラスミドpAcPHの構造を示す図である。
【図８】UAS配列と考えられる配列番号１に相当する配
列を付加した変異型アクチンプロモーターの構造、及び
それらの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性
を示す図である。
列を付加した変異型アクチンプロモーターの構造、及び
それらの支配下で発現される酸性フォスファターゼ活性
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:72） Ｃ１２Ｒ 1:72）
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１で表される塩基配列を含み、
プロモーター活性を上昇させるDNA。 - 【請求項２】 任意のプロモーターの前、後及び内部の
領域の少なくとも１箇所に、請求項１記載のDNAの１個
又は複数の断片を正方向又は逆方向に挿入してなる、当
該プロモーターの活性が上昇した変異型プロモーター。 - 【請求項３】 請求項２記載の変異型プロモーター及び
異種遺伝子を含む発現用組換えベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載のベクターによって形質転
換された酵母宿主。 - 【請求項５】 請求項４記載の形質転換された酵母宿主
を培地にて培養し、得られる培養物から異種遺伝子の発
現産物を採取することを特徴とする前記発現産物の生産
方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23499597A JP3290108B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列 |
| US09/297,053 US6274340B1 (en) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | DNA sequences enhancing promoter activity |
| EP98940610A EP0967275B1 (en) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | Dna sequences enhancing promoter activity |
| DE69837751T DE69837751T2 (de) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | Dna sequenzen, welche die promotoraktivität erhöhen |
| AT98940610T ATE361976T1 (de) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | Dna sequenzen, welche die promotoraktivität erhöhen |
| PCT/JP1998/003848 WO1999011779A1 (fr) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | Sequences d'adn ameliorant l'activite des promoteurs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23499597A JP3290108B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175843A JPH1175843A (ja) | 1999-03-23 |
| JP3290108B2 true JP3290108B2 (ja) | 2002-06-10 |
Family
ID=16979507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23499597A Expired - Fee Related JP3290108B2 (ja) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6274340B1 (ja) |
| EP (1) | EP0967275B1 (ja) |
| JP (1) | JP3290108B2 (ja) |
| AT (1) | ATE361976T1 (ja) |
| DE (1) | DE69837751T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999011779A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2583900A1 (en) | 2004-10-13 | 2006-04-27 | The Washington University | Use of baff to treat sepsis |
| AT501955B1 (de) * | 2005-02-23 | 2007-08-15 | Univ Graz Tech | Mutierte aox1-promotoren |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09135694A (ja) * | 1995-09-12 | 1997-05-27 | Kirin Brewery Co Ltd | カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のプロモーター／ターミネーター |
| EP0805208B1 (en) * | 1995-09-12 | 2003-03-05 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Promoter/terminator of formate dehydrogenase gene of candida boidinii |
-
1997
- 1997-08-29 JP JP23499597A patent/JP3290108B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-08-28 DE DE69837751T patent/DE69837751T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-28 EP EP98940610A patent/EP0967275B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-28 AT AT98940610T patent/ATE361976T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-08-28 US US09/297,053 patent/US6274340B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-28 WO PCT/JP1998/003848 patent/WO1999011779A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999011779A1 (fr) | 1999-03-11 |
| JPH1175843A (ja) | 1999-03-23 |
| EP0967275A1 (en) | 1999-12-29 |
| EP0967275A4 (en) | 2002-09-18 |
| DE69837751D1 (de) | 2007-06-21 |
| US6274340B1 (en) | 2001-08-14 |
| EP0967275B1 (en) | 2007-05-09 |
| ATE361976T1 (de) | 2007-06-15 |
| DE69837751T2 (de) | 2008-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6833812B2 (ja) | プロモーター変異体 | |
| EP2106447B1 (en) | Method for methanol independent induction from methanol inducible promoters in pichia | |
| Moracci et al. | Expression of the thermostable beta-galactosidase gene from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus in Saccharomyces cerevisiae and characterization of a new inducible promoter for heterologous expression | |
| JP5804378B2 (ja) | クルイベロマイセス・マルシアヌス由来の高発現プロモーター | |
| US6534315B1 (en) | Yeast transformation cassette | |
| JP3396224B2 (ja) | カンジダ・ボイジニイのギ酸脱水素酵素遺伝子のプロモーター／ターミネーター | |
| JP3290108B2 (ja) | プロモーター活性を増大させるｄｎａ配列 | |
| US6699691B2 (en) | Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast | |
| AU748759B2 (en) | Expression vector for improved production of polypeptides in yeast | |
| AU2002307504A1 (en) | Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast | |
| Lin et al. | An intron‐containing meiosis‐induced recombination gene, rec15, of Schizosaccharomyces pombe | |
| US20080299616A1 (en) | Malate Synthase Regulatory Sequences for Heterologous Gene Expression in Pichia | |
| KR20050025180A (ko) | 메틸트로픽 효모로부터 유도된 변화된 전사 효율을 갖는프로모터 | |
| KR100538990B1 (ko) | 티벡터와 발현벡터로의 기능을 동시에 가지는 플라스미드및 이를 이용한 목적유전자의 발현 | |
| JP4671394B2 (ja) | キャンディダ・ユティリス由来のプロモーターｄｎａ | |
| WO2022161914A1 (en) | High temperature fermentation process and microorganisms | |
| WO2023219575A1 (en) | EXPRESSION PLASMID FOR TARGET PROTEIN PRODUCTION USING SUCROSE CONTAINING MEDIA, RECOMBINANT THERMOTOLERANT YEAST Ogataea FOR TARGET PROTEIN PRODUCTION | |
| JP3505743B2 (ja) | 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 | |
| WO2011099243A1 (ja) | サッカロマイセス・セレビシエ由来の特定のプロモーターを、クルイベロマイセス・マルシアヌスにおいて用いる目的遺伝子の発現方法 | |
| CN114657190A (zh) | Msn2p作为负调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用 | |
| JPH0249715B2 (ja) | ||
| CN116574746A (zh) | 重组脱氧核糖核酸酶i的制备方法 | |
| JP2018078883A (ja) | 新規高温耐性付与遺伝子とその利用法 | |
| JP2002199887A (ja) | 分裂酵母ゲノム上ｌｙｓ１座位へ外来ＤＮＡを効率よく導入する方法とそれに用いるベクター | |
| JPH09135694A (ja) | カンジダ・ボイジニイのアクチン遺伝子のプロモーター／ターミネーター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080322 Year of fee payment: 6 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090322 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090322 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100322 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110322 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110322 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120322 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130322 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140322 Year of fee payment: 12 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |