DE69737007T2

DE69737007T2 - Protein-disulfidisomerase-Gen eines methylotrophen Hefestammes

Info

Publication number: DE69737007T2
Application number: DE69737007T
Authority: DE
Inventors: Yasuyoshi Otsu-shi Sakai; Nobuo Kameoka-shi Kato; Yuji Toyonaka-shi Shibano
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2017-09-05
Also published as: EP0828004A2; EP0828004B1; ATE346941T1; US5965426A; EP0828004A3; DE69737007D1; DK0828004T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Proteindisulfidisomerase, ein Enzym, das die Bildung einer Proteinkonformation durch Katalyse der Bildung von Disulfidbindungen in einem Protein unterstützt und ein Gen hierfür. Die vorliegende Erfindung betrifft unter den Proteindisulfidisomerasen die Proteindisulfidisomerase, abstammend von einem Stamm einer methylotrophen Hefe, einem Mikroorganismus, der aufgrund seiner hohen Expressionseffizienz heterologer Gene und Sekretion der Expressionsprodukte für eine industrielle Erzeugung wertvoller Proteine geeignet ist und ein Gen hierfür.
Die Proteindisulfidisomerase (PDI) ist ein Hauptprotein, das im Lumen des endoplasmatischen Reticulums (hierin bezeichnet als ER) vorliegt und wurde zunächst, als mit einer Fähigkeit versehen entdeckt, die eine oxidative Umfaltung einer reduzierten RNase bewirkt (Goldberger, R. F. et al. (1963) J. Biol. Chem. 238:628-635). Es wird angenommen, dass PDI ein Enzym ist, das die Bildung einer stabilen Konformation durch Rekombination von Disulfidbindungen sekretorischer Proteine katalysiert.
Es wurde darauf hingewiesen, dass die Rekombination von Disulfidbindungen durch PDI wie auch eine Proteinfaltung durch die Peptidyl-prolyl-cis-trans-Isomerase (PPI) ein die Geschwindigkeit begrenzender Schritt bei dem sekretorischen Prozess von Proteinen ist, und zwar im Fall von heterologen Proteinen, insbesondere sekretorischen Proteinen, die häufig Disulfidbindungen aufweisen (Gething, M.J. und Sambrook, J. (1992) Nature 355:33-45). Es wurde auch demonstriert, dass PDI die Faltung von Proteinen unterstützt, die aus einer einzelnen Domäne bestehen, wie z.B. der RNase und zwar auch in vitro (Jaenicke, R. (1993) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:104-102).
Andererseits wurden Stämme von methylotrophen Hefen, da sie unter Verwendung von Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen und hohe Zellerträge aufweisen, für die Produktion von Materialien zur Verwendung in der synthetischen chemischen Industrie verwendet, einschließlich z.B. Aldehyden, wie Formaldehyd, Epoxiden, Methylethylketon und Ameisensäure. Es wurden Forschungen im Hinblick auf eine mögliche Verwendung dieser Zellen per se als Proteinquelle durchgeführt und die Verwendung zur Produktion von Zellkomponenten, wie Aminosäuren, Vitaminen und ähnlichem und einiges wurde auch der praktischen Verwendung zugeführt. In den letzten Jahren wurde außerdem ein Expressionssystem heterologer Gene unter Verwendung von Stämmen methylotropher Hefen als Wirt entwickelt und es wurde gezeigt, dass dieses System eine höhere Produktivität als Saccharomyces-Hefen aufweist (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-344895).
Ihre Produktivität ist insbesondere für sekretorische Proteine hoch. Die Produktivität der Glucoamylase, abgeleitet von filamentösen Pilzen der Gattung Rhizopus betrug z.B. 3,4 g/l, was ungefähr 10-mal höher ist als die Produktivität durch die Saccharomyces-Hefen (Sakai, Y., et al. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1308:81-87). Als Stämme methylotropher Hefen sind z.B. Candida boidinii, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha und ähnliche bekannt.
Wenn heterologe Proteine durch sekretorische Produktion unter Verwendung einer rekombinanten DNA-Technologie erzeugt werden nimmt man an, dass die Effizienz der Sekretion durch Erhöhung der Geschwindigkeit der Faltung der Proteine erhöht wird. Basierend auf einer solchen Idee wurde ein Beispiel offenbart, worin die sezernierte menschliche Albuminmenge um durchschnittlich 60 % durch Koexpression eines menschlichen PDI-Gens mit dem gewünschten Gen in einer Saccharomyces-Hefe erhöht war (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 6-38771, korrespondierend zu EP-A-0909841).
Die Bildung oder der Austausch von Disulfidbindungen, die für eine richtige Faltung von Proteinen notwendig sind, benötigt eine Umgebung, die hierfür geeignet ist. Zu diesem Zweck weisen eukaryontische Zellen intrazelluläre Kompartimente auf, wie z.B. das ER oder den Golgi-Apparat, usw. Während sie durch diese Kompartimente passieren, werden die sekretorischen Proteine einer geeigneten Faltung oder einer Addition von Zuckerketten ausgesetzt und dann aus der Zelle durch eine Exocytose sezerniert. Viele sekretorische Proteine von eukaryontischem Ursprung weisen intramolekulare Disulfidbindungen auf und die Bildung und der Austausch dieser Disulfidbindungen, die im ER stattfinden, sind für die Bildung der Proteinkonformation und ihre Sekretion essentiell.
Dementsprechend muss die PDI, die Reaktionen zur Bildung und/oder dem Austausch von Disulfidbindungen katalysiert im ER lokalisiert sein oder dort bleiben. Zu diesem Zweck hat die PDI an ihrem C-terminalen Ende eine einzigartige Aminosäuresequenz, die ER-Rückhaltesignalsequenz genannt wird. Als ER-Rückhaltesignalsequenzen sind Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 2) für Tiere und His-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 3) für Saccharomyces-Hefen bekannt. Wenn das menschliche PDI-Gen wie oben beschrieben in einer Saccharomyces-Hefe exprimiert wird, funktioniert die ER-Rückhaltesignalsequenz des menschlichen PDI nicht vollständig, was vermutlich auf eine nicht geeignete Lokalisierung der PDI im ER zurückzuführen war. So wurde angenommen, dass selbst das hoch exprimierte PDI-Gen nicht zu einer Verstärkung der PDI-Aktivität führte entsprechend der Expression im ER und dementsprechend die Erhöhung der sezernierten Menge des koexprimierten sekretorischen Proteins bei einem Wert von 60 % verblieb.
Damit eine PDI, die in einem Stamm einer methylotrophen Hefe exprimiert wird ihre Funktionen vollständig ausüben kann, wird es bevorzugt PDI, abstammend von einem Stamm einer methylotrophen Hefe zu verwenden. Der Grund, warum der Stamm einer methylotrophen Hefe eine hohe Fähigkeit für eine Sekretion von Proteinen aufweist, wie oben beschrieben, ist derjenige, der die Rekombination der Disulfidbindungen durch die PDI, wobei es sich um den geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt des Proteinsekretionsverfahrens handelt, effizient stattfindet und dass die von dem Stamm einer methylotrophen Hefe abgeleitete PDI eine höhere spezifische Aktivität aufweist, als eine PDI, die von anderen Quellen abstammt oder eine höhere Aktivität im ER aufweist. Die PDI des Stamms der methylotrophen Hefe oder ein Gen dafür waren jedoch unbekannt. Dementsprechend wurden keine Untersuchungen im Hinblick auf eine Erhöhung der Produktivität im Expressionssystem eines Stamms einer methylotrophen Hefe unter Verwendung der obigen PDI oder des Gens dafür durchgeführt.
Die Erfinder haben intensive Studien zum Klonieren des PDI-Gens durchgeführt, das von einem Stamm einer methylotrophen Hefe getragen wird, um die Nucleotidsequenz dafür aufzuklären und die Eigenschaften der PDI des Stamms der methylotrophen Hefe darzustellen. So war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung das PDI-Gen bereitzustellen, abstammend von einem Stamm methylotropher Hefen, um eine sekretorische Produktion heterologer Gene durch einen Stamm einer methylotrophen Hefe in effizienterer Weise bewirken zu können.
Um die oben erwähnte Aufgabe zu erreichen, haben die Erfinder ein DNA-Fragment erhalten, amplifiziert durch PCR, unter Verwendung eines Oligonucleotids, synthetisiert basierend auf einer Aminosäuresequenz des konservierten Bereichs, der in der aktiven Stelle der PDI vorliegt, als Primer. Durch das Kolonie-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung dieses amplifizierten DNA-Fragments als Sonde, haben die Erfinder das PDI-Gen eines Stamms der methylotrophen Hefe Candida boidinii kloniert und die Nucleotidsequenz des Gens demonstriert wie auch die Aminosäuresequenz der PDI. Weiterhin haben die Erfinder durch Koexpression des Peroxidasegens, abgeleitet von einem filamentösen Pilz in dem Stamm der methylotrophen Hefe, transformiert mit dem PDI-Gen, die sezernierte Menge der Peroxidase erfolgreich um ungefähr das 10-fache erhöht und die vorliegende Erfindung bewirkt.
So stellt die vorliegende Erfindung Proteine wie in den Ansprüchen definiert bereit, mit einer Proteindisulfidisomerasereaktivität. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Gen bereit, kodierend die PDI, einen Vektor, umfassend das Gen und einen Wirt, transformiert mit dem Vektor, wie auch ein Verfahren für eine Sekretion des gewünschten Proteins in großen Mengen, durch Koexpression des Gens für das gewünschte Protein in dem transformierten Hefewirt.
KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Abbildung, die eine Restriktionsenzmykarte des 6,2 kb-DNA-Fragments darstellt, enthaltend das PDI1-Gen von Candida boidinii, die Region, für die die Nucleotidsequenz bestimmt wurde und die Position und Richtung des PDI1-Gens.
2 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer Southern-Hybridisierung darstellt, demonstrierend die Gegenwart des PDI-Gens in C. boidinii.
3(a) ist eine Abbildung, die die Konstruktion des Expressionsvektors pNPO3 des ARP-Gens darstellt und (b) ist eine Abbildung, die die Konstruktion des Expressionsvektors pNRPD des PDI-Gens darstellt.
4 ist eine Abbildung, die das Verfahren zur Konstruktion des Expressionsvektors pNRPD für das PDI1-Gen darstellt.
5 ist ein schematisches Diagramm, das den Zustand darstellt, worin das ARP-Gen in die genomische DNA des BPO17-Stamms integriert wurde und eine Abbildung, die das Ergebnis einer Southern-Hybridisierung darstellt, die dies bestätigt.
6 ist ein schematisches Diagramm, das den Zustand darstellt, worin das PDI1-Gen in die genomische DNA des BPP1-Stamms integriert wurde und eine Abbildung, die das Ergebnis einer Southern-Hybridisierung darstellt, die dies bestätigt.
7 ist eine Abbildung, die das Ergebnis einer Northern-Analyse darstellt, worin die Menge des exprimierten PDI1-Gens analysiert wurde.
8 ist eine Abbildung, die die ARP-Aktivität in der Kulturflüssigkeit von jedem kultivierten BPO17-Stamm, BPP1-stamm und BUL-Stamm darstellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail unten erklärt.
Zunächst wurde die Sequenz Cys-Gly-His-Cys, die in den PDI's von einer Vielzahl von Quellen als aktives Zentrum der Austauschreaktion von Disulfidbindungen konserviert ist an zwei Stellen in der Aminosäuresequenz der PDI angetroffen, die von Saccharomyces cerevisiae abstammt. Basierend auf der Aminosäuresequenz der PDI von S. cerevisiae, umfassend diese Sequenz, wurden verschiedene Primer für die PCR unter Referenz auf die Häufigkeit der Verwendung von Kodons von dem Stamm der methylotrophen Hefe entworfen. Unter Verwendung dieser Primer wurden PCR-Reaktionen unter Verwendung der genomischen DNA des Stamms der methylotrophen Hefe als Matrize durchgeführt und die Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Nucleotidsequenz für das PCR-Reaktionsprodukt das so erhalten wurde, wurde als analog zu der Aminosäuresequenz der PDI von S. cerevisiae bestätigt.
Die genomische DNA eines Stamm einer methylotrophen Hefe wird vollständig mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und auf einer Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Unter Verwendung der oben erwähnten PCR-Produkte als Sonde wird eine Southern-Hybridisierung durchgeführt, um das Restriktionsenzym anzutreffen, das das kleinste DNA-Fragment ergibt, das die gesamte Region des PDI-Gens enthält. Unter Verwendung der genomischen DNA des Stamms der methylotrophen Hefe, der vollständig mit dem Restriktionsenzym verdaut wurde, wird eine genomische Bibliothek erzeugt, die dann einer Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung des oben erwähnten PCR-Produkts als Sonde unterzogen wird um Klone zu selektieren, die das PDI-Gen aufweisen.
Ein Plasmid wird aus dem selektierten Klon extrahiert und einer Southern-Hybridisierung unterzogen um zu bestätigen, dass das Plasmid die Sequenz des oben erwähnten PCR-Produkts enthält. Weiterhin wird eine Restriktionskarte der inserierten Fragmente dieses Plasmids erzeugt und basierend hierauf wird ein Subklonieren durchgeführt, um das kleinste DNA-Fragment, enthaltend das PDI-Gen, zu erhalten. Die Nucleotidsequenz des erhaltenen DNA-Fragments wird bestimmt und die Aminosäuresequenz der PDI, abgeleitet von dem Stamm einer methylotrophen Hefe wird analysiert.
Das so erhaltene von dem Stamm der methylotrophen Hefe abgeleitete PDI-Gen kann hoch in dem Stamm der methylotrophen Hefe zur Herstellung der PDI exprimiert werden. Als Expressionsvektor für das PDI-Gen können bekannte Vektoren verwendet werden und als Expressionsvektor für den Stamm der methylotrophen Hefe Candida boidinii können pNOTe1 oder pTRex, wie beschrieben in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-344895, verwendet werden. Als Transformationsverfahren für den Stamm der methylotrophen Hefe und Verfahren zum Erhalt eines Transformanten, worin ein Fremdgen in die chromosomale DNA integriert wurde, kann ein bekanntes Verfahren (Sakai, Y. et al. (1991), J. Bacteriol. 173:7458-7463) verwendet werden. Weiterhin kann die sezernierte Menge des gewünschten sekretorischen Proteins durch Koexpression des PDI-Gens, abstammend von dem Stamm der methylotrophen Hefe mit dem Gen des gewünschten sekretorischen Proteins in dem Stamm der methylotrophen Hefe erhöht werden.
Obwohl die PDI, abgeleitet von dem Stamm der methylotrophen Hefe die ER-Rückhaltesignalsequenz Arg-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 9) aufweist, die sich unterscheidet von His-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 3), abgeleitet von einer Saccharomyces-Hefe, gibt es keine Zweifel, dass die Zellen von C. boidinii die erstere Sequenz erkennen, die ihre eigene ist und die PDI wird durch das ER zurückgehalten, um ihre Funktion voll zu erfüllen. Als für die Expression der PDI verwendete Expressionsvektoren können diejenigen verwendet werden, worin auxotrophe Marker, wie die oben erwähnten pNOTe1 und pTRex durch die Gene ersetzt wurden, die sich von denjenigen unterscheiden, die für den Expressionsvektor des gewünschten Proteins verwendet wurden. Weiterhin wird eine Transformation durch das oben beschriebene Verfahren möglich, indem dem Wirtsstamm der methylotrophen Hefe eine Auxotrophie verliehen wird, korrespondierend zu den beiden Markern des Expressionsvektors. Als Verfahren zur Verleihung einer Auxotrophie an den Stamm einer methylotrophen Hefe kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden (Sakai, Y. et al. (1991), J. Bacteriol. 173:7458-7463).
BEISPIELE
Die Erfindung wird besser unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verstanden werden; diese Beispiele sollen jedoch die Erfindung illustrieren und nicht als den Umfang der Erfindung begrenzend konstruiert werden.
BEISPIEL 1
Von Candida boidinii Stamm S2 (Tani, Y., et al. (1985) Agric. Biol. Chem. 49:2699-2706) wurde das PDI-Gen erhalten und seine Nucleotidsequenz wurde bestimmt. Nebenbei gesagt wurde dieser Stamm als Candida boidinii SAM1958 bezeichnet und als internationale Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag am 25.02.1992 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, 305, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3766 hinterlegt.
(1) Amplifikation durch PCR
Zwei Sequenzen wurden als Aminosäuresequenzen in der PDI von S. cerevisiae bemerkt, unter Bezug auf Cys-Gly-His-Cys (SEQ ID NO: 4), eine Sequenz, die in der PDI von verschiedenem Ursprung als aktives Zentrum der Disulfidbindungs-Austauschreaktion konserviert ist:
Pro-Trp-Cys-Gly-His-Cys-Lys (SEQ ID NO: 5) (Aminsäuren Nr. 59 bis 65 der Aminosäuresequenz der PDI einer Saccharomyces-Hefe),
Tyr-Ala-Pro-Trp-Cys-Gly-His (SEQ ID NO: 6) (Aminosäuren Nr. 402 bis 408 der Aminosäuresequenz der PDI einer Saccharomyces-Hefe).
Unter Bezugnahme auf die Frequenz der C. boidinii Kodons wurde ein Oligonucleotid mit der folgenden Nucleotidsequenz, korrespondierend zu der Aminosäuresequenz, synthetisiert:
D.h. als Sinnprimer wurde die folgende 5'-CCGGAATTC CCT(A) TGG TGT(C) GGT(A) CAT(C) TGT(C) AA-3' (SEQ ID NO: 7),
und als Antisinnprimer die folgende 5'-CGCGGATCC TG A(T)CC A(G)CA CCA A(T)GG A(G/T)GC A(G)T-3' (SEQ ID NO: 8)
synthetisiert. Diese Oligonucleotide weisen an ihrem 5'-Ende die Sequenz auf, die EcoRI bzw. BamHI erkennt. Sie sind außerdem so entworfen, dass eine EcoRI-Stelle am 5'-Ende und eine BamHI-Stelle am 3'-Ende der DNA-Fragmente, amplifiziert durch diese beiden Primer, gebildet wird.
Wenn die PCR-Reaktion unter Verwendung genomischer DNA von C. boidinii als Matrize und den obigen beiden Oligonucleotiden als Primer durchgeführt wurde, wurde ein amplifiziertes DNA-Fragment mit ungefähr 1 kb beobachtet. Das amplifizierte Fragment wurde gewonnen und ein DNA-Fragment mit ungefähr 250 bp, erhalten durch Verdau des Fragments mit einem Restriktionsenzym EcoRI wurde in den EcoRI-verdauten pBluescript II SK⁺ inseriert. Die Analyse der Nucleotidsequenz des inserierten Fragments ergab eine Nucleotidsequenz, die einer Aminosäuresequenz mit hoher Homologie zu der Aminosäuresequenz der PDI von S. cerevisiae kodierte und daher wurde geschlossen, dass dieses DNA-Fragment ein Teil des PDI-Gens von C. boidinii war.
(2) Southern-Hybridisierungsanalyse der genomischen DNA
Genomische DNA wurde aus Bakterienzellen von dem Candida boidinii Stamm S2 isoliert. Als Isolationsverfahren für die DNA wird ein Verfahren von Cryer (Cryer, D.R. et al. (1975) Meth. Cell. Biol. 12: 39-44) erwähnt. Die genomische DNA des Candida boidinii Stamms S2 wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten und dann auf einem 0,7%igen Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt. Die aufgetrennte DNA wurde auf eine Nylonmembran übertragen und dort immobilisiert (hergestellt von Amersham). Ein 250 bp-DNA-Fragment, enthaltend das oben erwähnte PDI-Gen wurde mit 32P markiert, wobei das Random-Primer-Kit (hergestellt von Amersham) verwendet wurde.
Das markierte DNA-Fragment wurde zu einer 5 × SSC – 1 % SDS – 1 × Denhardt-Lösung zugefügt, um eine Hybridisierungslösung herzustellen. Diese Hybridisierungslösung wurde der DNA-immobilisierten Nylonmembran zugefügt und in einer Plastiktasche verkapselt. Nachdem die verkapselte Plastiktasche 16 Stunden bei 65°C inkubiert worden war, wurde die Nylonmembran aus der Plastiktasche entfernt und in einer 2 × SSC – 0,1 %igen SDS-Lösung bei Raumtemperatur gewaschen. Darauf folgend wurde die Nylonmembran in einer 0,2 × SSC – 0,1 % SDS-Lösung inkubiert und nach Ersatz der Lösung durch eine neue wurde die Inkubation bei 65°C für 30 Minuten wiederholt. Nach einem Waschen der Membran in 2 × SSC wurde sie luftgetrocknet und einer Autoradiografie unterzogen. Als kleinstes DNA-Fragment, das mit der oben erwähnten 250 bp-Sonde hybridisierte, wurde ein XbaI-Fragment mit ungefähr 6,2 kb angetroffen, wie in 2 dargestellt.
(3) Klonierung des PDI-Gens durch Kolonie-Hybridisierung
Die genomische DNA des Candida boidinii Stamms S2 wurde vollständig mit einem Restriktionsenzym XbaI verdaut und durch eine 0,7 %ige Agarosegelelektrophorese fraktioniert. Die Agarose bei ungefähr 6,2 kb wurde ausgeschnitten und das DNA-Fragment unter Verwendung einer DNA-Zelle (hergestellt von Daiichi Kagaku) wiedergewonnen. Die gewonnene DNA wurde in XbaI-verdauten pBluescript II SK⁺ inseriert und der Escherichia coli Stamm JM109 wurde transformiert, um die genomische Bibliothek des Candida boidinii Stamms S2 herzustellen.
Die Bibliothek wurde durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung des oben erwähnten 250 bp-DNA-Fragments als Sonde zum Erhalt positiver Klone einem Screening unterzogen. Die Hybridisierungsbedingungen waren dieselben wie diejenigen für die oben erwähnte Southern-Hybridisierung. Das Plasmid wurde aus den positiven Klonen gewonnen, um eine Restriktionsenzymkarte der inserierten DNA-Fragmente zu erzeugen. Die so erzeugte Restriktionsenzymkarte ist in 1 dargestellt. Es wurde ein Subklonieren basierend auf der Restriktionsenzymkarte durchgeführt und das DNA-Fragment, enthaltend das PDI-Gen, wurde auf ungefähr 2 kb eingegrenzt (auf der linken Seite in 1), und erstreckte sich von XbaI zu SalI.
(4) Bestimmung der Nucleotidsequenz
Die Nucleotidsequenz des obigen DNA-Fragments mit ungefähr 2 kb von XbaI bis SalI wurde bestimmt. Das DNA-Fragment wurde in den Phagen M13 in beide Richtungen kloniert, um jede der doppelsträngigen DNA's (RF) herzustellen. Diese doppelsträngigen DNA's ließ man mit Escherichia coli Exonuclease II reagieren, um eine doppelsträngige DNA herzustellen, worin eine Deletion in einer Richtung eingeführt worden war. Ein Herstellungsverfahren für ein Plasmid mit einer Ein-Richtungsdeletionsinsertion unter Verwendung von Exonuclease III wurde im Detail auf den Seiten 289 bis 305 in "Zoku Seikagaku Jikken Kouza (Sequel to the Series of Biochemistry Experiments), Bd. 1, Idenshi Kenkyuuhou (Methods for Studying Genes) II" beschrieben.
Jede der doppelsträngigen DNA's, worin die Deletion in einer Richtung inseriert wurde, erhalten durch das obige Verfahren, wurde in den E. coli Stamm JM109 transformiert, um einen Phagenklon herzustellen, worin die Deletion in einer Richtung inseriert war. Von jedem Phagenklon wurde eine doppelsträngige DNA hergestellt, für die der Grad der Deletion durch das Spaltungsmuster durch Restriktionsenzyme untersucht wurde und dann wurden einzelsträngige Phagen-DNA's aus geeigneten Klonen hergestellt. Unter Verwendung dieser einzelsträngigen Phagen-DNA's als Matrize wurde die Nucleotidsequenz durch das Dideoxyverfahren (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463) bestimmt. Durch Ligation der Nucleotidsequenz von jedem Klon wurde die Nucleotidsequenz von 2,0 kb, sich erstreckend von der XbaI-Stelle bis direkt vor der SalI-Stelle in 2 bestimmt.
SEQ ID NO: 1 zeigt die Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz der von der Nucleotidsequenz abgeleiteten PDI. Die PDI von C. boidinii besteht demnach aus 531 Aminosäuren, kodiert durch die Nucleotidsequenz von Base Nr. 367 bis 1959 der Nucleotidsequenz, wie dargestellt in SEQ ID NO: 1 und wurde als PDI1-Gen bezeichnet. Die Aminosäuresequenz von PDI1 hat eine Homologie von 45 % zu der PDI, die von S. cerevisiae abstammt und 22 % zu der menschlichen PDI. Wenn analoge Aminosäuren mitbetrachtet wurden, betrug die Homologie 64 % zu der PDI von S. cerevisiae und 49 % zu der menschlichen PDI.
Die Sequenz, die in der PDI von verschiedenem Ursprung als aktives Zentrum der Disulfidbindungs-Austauschreaktion der PDI konserviert wurde, d.h., Cys-Gly-His-Cys (SEQ ID NO: 4) fand sich an zwei Stellen: die Aminosäuresequenz von Aminosäuren 61 bis 64 und die von Aminsäuren 408 bis 411 der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1. Weiterhin war die ER-Rückhaltesignalsequenz, die am C-Ende vorlag, Arg-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 9), was sich von der PDI von S. cerevisiae, His-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 3) oder Lys-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 2), die in der PDI von Säugern weit verbreitet auftritt, unterschied.
Das Maß der Aktivität der Proteindisulfidisomerase kann durch Untersuchung der beschleunigenden Wirkung auf die Wiederanordnung einer in Unordnung gebrachten Ribonuclease A (RNase A) durchgeführt werden, die durch ein Verfahren umfassend eine Reduktion, Denaturierung und Reoxidation hergestellt wurde. Der Grad der Wiederanordnung der Ribonuclease A wird unter Verwendung des Grads der Erholung der enzymatischen Aktivität als Index quantifiziert (japanische ungeprüfte Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 6-38771).
Durch Messung der PDI-Aktivität durch das oben erwähnte Verfahren wurde bestätigt, dass der Stamm des methylotrophen Hefetransformanten, enthaltend das obige DNA-Fragment, eine höhere Proteindisulfidisomeraseaktivität aufwies als der nicht-transformierte Stamm der methylotrophen Hefe als Kontrolle, wie dargestellt in 1.
BEISPIEL 2
SEKRETION DES GEWÜNSCHTEN HETEROLOGEN PROTEINS
Es wurde bestätigt, dass die sezernierte ARP-Menge durch Koexpression des PDI1-Gens, abstammend von dem Stamm der methylotrophen Hefe C. boidinii und des Peroxidasegens (ARP), abgeleitet von dem filamentösen Pilz Arthromyces ramosus erhöht ist. pNOTe1 wurde als Expressionsvektor verwendet und der ARP-Expressionsvektor pNOTe1ARP wurde in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-344895 offenbart. Durch Austausch des auxotrophen Markers (URA3) von pNOTe1 gegen das Leu2-Gen, abgeleitet von C. boidinii kann ein Expressionsvektor mit einem auxotrophen Marker erzeugt werden, der sich von pNOTe1 unterscheidet. Es ist auch möglich eine Transformation durch die beiden oben beschriebenen Expressionsvektoren zu bewirken, indem dem Stamm der methylotrophen Hefe eine Auxotrophee, korrespondierend zu den Markern dieser zwei Expressionsvektoren verliehen wird. Als Verfahren zur Verleihung einer Auxotrophie an den Stamm einer methylotrophen Hefe kann ein bekanntes Verfahren (Sakai, Y. et al. (1991) J. Bacteriol. 173:7458-7463) verwendet werden.
(1) Konstruktion von Expressionsvektoren
Ein 1,1 kb-EcoRI-DNA-Fragment, enthaltend das ARP-Gen, wurde aus dem Plasmid pNOTe1ARP ausgeschnitten und dann in die NotI-Stelle von pNOTe1 inseriert, um das Plasmid pNPO3, wie dargestellt in 3(a) zu erzeugen.
Zum Zweck der Expression des PDI1-Gens wurde ein Expressionsvektor, der das LEU2-Gen als auxotrophen Marker enthielt, und die ribosomale DNA (rDNA) von C. boidinii als Rekombinationsstelle bei einem Verfahren, wie dargestellt in 4, erzeugt. Zunächst wurde pNOTe1 mit EcoRI und HindIII gespalten und dann wurde ein 2,0 kb-DNA-Fragment, enthaltend den Promotor und Terminator des Alkoholoxidasegens (AOD1) von C. boidinii ausgeschnitten und in die EcoRI-HindIII-Stelle von pUC19 inseriert, um das Plasmid pNOT46 zu erzeugen. Ein DNA-Fragment, enthaltend rDNA, die von C. boidinii abstammte, wurde durch das PCR-Verfahren erhalten und wurde dann in die HindIII-Stelle von pNOT46 inseriert, um pNOT46R zu erzeugen. Das Plasmid pCLEU321 (Sakai, Y. et al. (1992) J. Bacteriol. 174:5988-5993), enthaltend das LEU2-Gen von C. boidinii wurde mit EcoRI verdaut und ein DNA-Fragment, enthaltend ein 3,2 kb-LEU2-Gen, wurde mit glatten Enden versehen. Nachdem das mit glatten Enden versehene 3,2 kb-DNA-Fragment mit NdeI verdaut worden war, wurde es in das mit glatten Enden versehene Plasmid pNOT46R zur Erzeugung von pNL1 inseriert.
Um die obigen Expressionsvektoren zu integrieren, wurde eine NotI-Stelle an beiden Enden des PDI-Gens durch das PCR-Verfahren erzeugt. Als Sinn-Primer wurde
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAAAATGARGTTAACTAATTTCAAA-3' (SEQ ID NO: 10)
und als Antisinn-Primer wurde
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTATAATTCATCACGAACATCA-3' (SEQ ID NO: 11) synthetisiert. Am 5'-Ende dieser beiden Oligonucleotide gab es eine Sequenz, die von NotI erkannt wurde, so dass eine NotI-Stelle direkt vor dem Initiationskodon und direkt nach dem Terminationskodon des PDI1-Gens in einem DNA-Fragment, amplifiziert unter Verwendung dieser Primer, eingeführt werden kann. Unter Verwendung der genomischen DNA von C. boidinii als Matrize und der obigen beiden Primer als Primer, wurde eine PCR-Reaktion durchgeführt und das amplifizierte 1,6 kb-DNA-Fragment wurde mit NotI verdaut, was in die NotI-Stelle des Plasmids pBluescript II SK⁺ inseriert wurde, um pSKPD zu erzeugen. Ein durch Verdau von pSKPD mit NotI erhaltenes 1,6 kb-DNA-Fragment wurde in die NotI-Stelle des obigen pNL1 inseriert, um pNRPD zu erzeugen, wie dargestellt in 3(b).
(2) Erzeugung einer transformierten Hefe
Unter Verwendung der beiden oben in (1) erwähnten Expressionsvektoren wurde ein Transformant des Stammes der methylotrophen Hefe C. boidinii erzeugt. Der als Wirt verwendete bakterielle Stamm ist C. boidinii BUL (ura3, leu2), worin das LEU2-Gen des C. boidinii Stamms TK62 (ura3) (offenbart in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-344895) zerstört wurde.
Das LEU2-Gen von C. boidinii wurde von Sakai et al. (Sakai, Y. et al. (1992) J. Bacteriol 174:5988-5993) offenbart. Das Transformationsverfahren von C. boidinii wurde in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 5-344895 offenbart.
Zunächst wurde ein Transformant des ARP-Gens erzeugt. Nachdem der ARP-Expressionsvektor pNPO3 durch Verdau mit BamHI linearisiert wurde, wurde der C. boidinii Stamm BUL (ura3, leu2) transformiert und die Transformanten wurden unter Verwendung von Ura3+ selektiert. Wie in 5A) und B) dargestellt, war in einem der selektierten Transformanten, dem BP017-Stamm die gesamte Region von pNPO3, enthaltend das ARP-Gen, in die ura3-Stelle durch homologe Rekombination der ura3-Stelle auf der chromosomalen DNA des Wirts-Hefe-BUL-Stamms und der URA3-Stelle im Expressionsvektor pNPO3 integriert. Dies wurde durch die Tatsache bestätigt, dass, wie in 5C) dargestellt, bei der Verwendung einer Sonde eines 3,3 kb-BamHI-SalI-DNA-Fragments durchgeführten Southern-Hybridisierung, das die gesamte Region des URA3-Gens enthielt, nachdem die genomische DNA des Wirts-BUL-Stamms und des Transformanten BPO17-Stamms mit BglII verdaut worden waren, eine 5,5 kb-hybridisierende Bande in dem BUL-Stamm und eine 14,4 kb-hybridisierende Bande in dem BPO17-Stamm beobachtet wurden.
Als nächstes wurde unter Verwendung des Wirts C. boidinii Stamms BPO17 (leu2), der mit dem oben erwähnten ARP-Gen transformiert worden war, ein Transformant des PDI1-Gens erzeugt. Nachdem der PDI1-Expressionsvektor pNRPD durch Verdau mit ApaI linearisiert worden war, wurde der BPO17 (leu2) -Stramm transformiert und der BPP1-Stamm wurde nach Selektion mit Leu+ erhalten. In dem BPP1-Stamm wurde, wie dargestellt in 6A), B) die gesamte Region von pNRPD, enthaltend das PDI1-Gen, in die rDNA-Stelle durch homologe Rekombination der rDNA-Stelle auf der chromosomalen DNA der Wirts-Hefe BPO17-Stamm und der rDNA-Stelle im Expressionsvektor pNPO3 integriert. Die Integration des PDI1-Gens in die chromosomale DNA wurde durch die Tatsache bestätigt, dass, wie dargestellt in 6C), bei der Southern-Hybridisierung, durchgeführt unter Verwendung einer Sonde eines 1,6 kb-DNR-Fragments, enthaltend das PDI1-Gen, erhalten durch Verdau von pSKPD mit NotI, nachdem die genomische DNA des BUL-Stamms, des Wirts-BPO17-Stamms und des Transformanten BPP1-Stamms mit HindIII verdaut worden waren, eine Bande, abstammend von der Region, enthaltend ein 12,6 kb inneres PDI1-Gen von dem BUL-Stamm und dem BPO17-Stamm und eine 6,1 kb-Bande, abstammend von dem Expressionsvektor pNRPD zusätzlich zu der obigen 12,6 kb-Bande von dem BPP1-Stamm beobachtet wurden.
(3) Analyse der Transformanten
Es wurde mRNA von dem BPO17-stamm extrahiert, transformiert mit dem ARP-Gen, dem BPP1-Stamm, transformiert mit dem ARP-Gen und dem PDI1-Gen und dem BUL-Stamm, der als Wirt verwendet wurde, und die exprimierte Menge des PDI1-Gens wurde durch Northern-Hybridisierung untersucht. Von den erhaltenen Bakterienzellen aus den obigen drei Stämmen, kultiviert für 48 Stunden bei 30°C in dem YM-Medium mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle (Sakai, Y. et al. (1981) J. Gen. Microbiol. 123:365-396), wurde Gesamt-DNA durch ISOGEN (hergestellt von Nihon Gene K.K.) extrahiert und unter Verwendung des BIOMAG mRNA-Reinigungskits (hergestellt von PerSeptive Diagnostics) gereinigt. Die gereinigte mRNA wurde einer 1,1%igen Agarosegelelektrophorese (enthaltend 20 mM MOPS-Puffer, 1 mM EDTA, 2,2 M Formamid) unterzogen und dann auf die Nylonmembran geblottet. Unter denselben Bedingungen wie bei der Southern-Hybridisierung in Beispiel 1 wurde die Hybridisierung durchgeführt. Die für die Hybridisierung verwendete Sonde war ein 1,6 kb-NotI-DNA-Fragment, abstammend von dem oben erwähnten pSKPD.
Wie in 7 dargestellt, wurde eine starke Expression des PDI1-Gens in dem BPP1-Stamm beobachtet, der mit dem PDI1-Gen transformiert war und eine schwache Expression von wahrscheinlich dem inneren PDI1-Gen wurde bei dem BUL-Stamm und dem BPO17-Stamm beobachtet.
Die obigen drei Bakterienstämme wurden in dem YM-Medium, enthaltend Methanol als einzige Kohlenstoffquelle bei 30°C 48 Stunden kultiviert und dann wurde die PDI-Aktivität in den Bakterienzellen gemessen. Die geernteten Zellen wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, suspendiert und in ein 2 ml Eppendorf-Röhrchen übertragen, wozu ein gleiches Volumen Zirkoniumkügelchen (Durchmesser 0,5 mm) zugefügt wurde. Ein kräftiges Rühren des Röhrchens für 30 Sekunden unter Verwendung des Beads Beader (Modell 3110BYX, Biospec Products) gefolgt von einem Kühlen auf Eis für 30 Sekunden wurde 6-mal wiederholt. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 4°C und 16.000 × g 5 Minuten zentrifugiert und dann wurde die enzymatische Aktivität des Überstands gemessen.
Die Messung der PDI-Aktivität wurde gemäß dem Verfahren von Hillson et al. (Hillson, D.A. et al. (1984) Methods Enzymol. 107:281-294) durchgeführt. So enthält 1 ml der endgültigen Reaktionsmischung 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, 500 μg in Unordnung gebrachte RNase und 0,01 mM Dithiothreitol. Nach einer Inkubation der Reaktionsmischung für 10 Minuten wurden 10 μl als Probe genommen, wozu 3 ml des TKM-Puffers (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM KCl, 5 mM MgCl), enthaltend 0,25 mg Hefe-RNA zugefügt wurden und dann wurde die RNase-Aktivität durch Messung der Absorption bei 260 nm in einer UV-Küvette bei 30°C für 2 Minuten bestimmt. Eine Einheit der enzymatischen Aktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, die die Absorption bei 260 nm pro Minute erhöht.
Wie in Tabelle 1 dargestellt, war die PDI-Aktivität in den Bakterienzellen in dem BPP1-Stamm, transformiert mit dem PDI-Gen, höher als in dem BPO17-Stamm, transformiert nur mit dem ARP-Gen oder dem BUL-Stamm, der als Wirt verwendet wurde, und zwar um einen Faktor von 9 oder mehr. TABELLE 1

* Die Niveaus von BUL und BPO17 lagen unterhalb der Nachweisgrenze

(4) Sekretorische Expression von ARP
Der mit dem ARP-Gen transformierte BPO17-Stamm, der mit sowohl dem ARP-Gen als auch dem PDI1-Gen transformierte BPP1-Stamm und der als Wirt verwendete BUL-Stamm wurden in dem YM-Medium, enthaltend Methanol als einzige Kohlenstoffquelle, kultiviert und die ARP-Aktivität in der Kulturflüssigkeit wurde verglichen. Wie in 8 dargestellt, erreichte die ARP-Aktivität in der Kulturflüssigkeit des BPP1-Stamms, koexprimiert mit dem ARP-Gen und dem PDI1-Gen ein Maximum von 0,024 U/ml nach 84 Stunden Kultivierung. Bei dem BPO17-Stamm, worin nur das ARP-Gen exprimiert wurde, erreichte die ARP-Aktivität in der Kulturflüssigkeit ein Maximum von 0,002 U/ml nach 84 Stunden Kultivierung, während keine ARP-Aktivität in der Kulturflüssigkeit beobachtete wurde, worin der BUL-Stamm als Wirt verwendet wurde. Das Ergebnis zeigte, dass die Koexpression des PDI1-Gens und des ARP-Gens die sezernierte Menge an ARP um ungefähr das 10-fache erhöhte.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, das PDI-Gen des Stamms einer methylotrophen Hefe zu erhalten und das PDI-Enzym durch Expression des Gens in großen Mengen unter Verwendung dieses Stamms einer methylotrophen Hefe zu erhalten. Weiterhin wurde es durch Koexpression des Gens mit dem Gen eines gewünschten sekretorischen Proteins in dem Stamm der methylotrophen Hefe möglich, die Menge, die von dem gewünschten Protein erzeugt wird, drastisch zu erhöhen.
Merke: Die Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, erstreckt sich auf Mutanten oder modifizierte Formen der Nucleotidsequenz und Proteinsequenz von SEQ ID NO: 1, vorausgesetzt, dass sie mit einer Proteindisulfidisomeraseaktivität assoziiert sind, die mindestens die Fähigkeit zur Katalyse einer Bildung/eines Austausches von Proteindisulfidbindungen und eine Lokalisierung im ER beinhaltet.
Ähnlich, betrifft sie die Verwendung von Vektoren, enthaltend solche Mutanten (modifizierte Sequenzen) zur Transformation von Wirten, um ihre PDI-Aktivität insbesondere zur Expression eines rekombinanten (heterologen) Proteins zu erhöhen. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein, das entweder das folgende ist: (a) ein Protein eines Stamms einer methylotrophen Hefe, das eine Proteindisulfidisomeraseaktivität aufweist, wobei das Protein die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist oder das folgende: (b) ein Protein, worin die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 durch Deletion oder Addition von einer oder einigen Aminosäure(n) modifiziert wurde oder durch Substitution mit einer anderen Aminosäure (anderen Aminosäuren) und eine Proteindisulfidisomeraseaktivität aufweist, wobei die Aktivität die Fähigkeit zur Katalyse der Bildung/des Austauschs von Proteindisulfidbindungen beinhaltet und eine Lokalisierung oder einen Rückhalt im endoplasmatischen Retikulum der methylotrophen Hefe.
Protein gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuremotive CGHC und ADEL.
Protein eines Stammes einer methylotrophen Hefe, das die konservierte Region des aktiven Zentrums für die Proteindisulfidisomerase aufweist, umfassend Cys-Gly-His-Cys (SEQ ID NO: 4) und eine endoplasmatische Retikulumsrückhaltssignalsequenz, umfassend Arg-Asp-Glu-Leu (SEQ ID NO: 9), und das eine Proteindisulfidisomeraseaktivität aufweist.
Gen, kodierend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3.
Gen gemäß Anspruch 4, repräsentiert durch die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Vektor, umfassend ein Gen gemäß Anspruch 4 oder 5.
Transformant, erhalten durch Transformation eines Wirts mit einem Vektor gemäß Anspruch 6.
Transformant gemäß Anspruch 7, wobei der Wirt ein Stamm einer methylotrophen Hefe ist.
Transformant gemäß Anspruch 8, wobei der Stamm der methylotrophen Hefe Candida boidinii ist.
Verfahren zur Erzeugung eines Proteins mit einer Proteindisulfidisomeraseaktivität, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Transformanten gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 und dann die Gewinnung des Proteins aus der Kultur umfasst.
Verfahren zur Erzeugung eines Peptids oder eines Proteins, kodiert durch ein heterologes Strukturgen, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Transformanten umfasst, cotransformiert mit einem Vektor gemäß Anspruch 6 und einem Vektor mit einem heterologen Strukturgen und dann Gewinnung eines Expressionsprodukts des heterologen Strukturgens, wobei es sich um das Peptid oder das Protein handelt, aus der Kultur.
Verfahren zur Erzeugung eines Peptids oder eines Proteins, kodiert durch ein heterologes Strukturgen, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Transformanten umfasst, cotransformiert mit einem Vektor, der das rekombinante Gen der Proteindisulfidisomerase einer methylotrophen Hefe enthält und einem Vektor mit einem heterologen Strukturgen und dann Gewinnung eines Expressionsprodukt des heterologen Strukturgens, wobei es sich um das Peptid oder das Protein handelt, aus der Kultur.