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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist eine Promotorsequenz von 3-Phosphoglyceratkinase-Gen-1
von Milchsäure
produzierendem Pilz Rhizopus oryzae und ein Verfahren zum Exprimieren
eines interessierenden Gens in Pilzspezies.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Gattung Rhizopus ist vielseitig bei der Produktion von Biokatalysatoren,
wie Glucoamylase und Lipase, und Chemikalien, die L-(+)-Milchsäure, Fumarsäure und
Ethanol einschließen.
Rhizopus gehört
zu der Ordnung Mucorales, die sich in der Klasse Zygomycetes des
Zweigs der Amastigomycota befindet. Rhizopus oryzae (ATCC 9363)
ist der beste Milchsäureproduzent,
den man in der Gattung Rhizopus findet, während Rhizopus delemar und
Rhizopus niveus signifikante Mengen extracellulärer Lipase produzieren können.
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Zudem
kann R. oryzae auch große
Mengen an Glucoamylase in der Feststoffkultur zur Stärkehydrolyse
sekretieren. Daher kann R. oryzae potentiell ein Wirt zur Veredelung
der Milchsäureproduktion
sowie der Fremdproteinproduktion sein.
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In
der aktuellen Literatur stehen jedoch sehr begrenzte Informationen über Genklone
sowie Genregulierungselemente (Promotoren) für R. oryzae zur Verfügung. Weniger
als neun Genklon- und partielle Gensequenzen werden für R. oryzae
angegeben, dazu gehören
Glucoamylase, ribosomale Gene und Asparginproteinasegene.
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Die
Fähigkeit,
Fadenpilze genetisch zu verändern,
hängt größtenteils.
davon ab, wie erfolgreich die Transformationsverfahren und Genexpressionssysteme
entwickelt werden können.
Für Fadenpilze
sind Transformationsverfahren entwickelt worden, insbesondere für Aspergillus
nidulans und Neurospora crassa einschließlich anderer wie Aspergillus
niger, Aspergillus oryzae, Penicillium nalgiovense. Um die Transkription oder
Expression eines interessierenden Gens effektiv zu lenken, sind
starke genregulierende Elemente oder Promotoren erforderlich. Diese
Promotoren können
aus den stromaufwärts
gelegenen Sequenzen stark exprimierender Genklone isoliert werden.
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Phosphoglyceratkinase-Gen
ist eines der hoch exprimierten Gene, das sich in Hefe und Fadenpilzen findet.
Dieses Gen kodiert einen Teil der am häufigsten vorkommenden mRNA
in den Hefezellen, die bis zu 5 % der gesamten zellulären Proteinexpression
ausmachen. Nach der Entdeckung und Charakterisierung des Saccharomyces
cerevisae-Gens wurden auch andere Phosphoglyceratkinase-Gene aus
verschiedenen Pilzspezies isoliert, wie Penicillum chrysogenum und
Rhizopus niveus, wobei Phosphoglyceratkinase-Gen von S. cerevisiae
als homologe Gensonde verwendet wurde. Es wurden jedoch nur wenige
Phosphoglyceratkinase-Gen-Promotoren isoliert und charakterisiert,
die unter anderem aus S. cerevisiae, Trichoderma reesei und R. niveus
waren.
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Um
R. oryzae genetisch zu verändern,
entweder zum Zweck der Modifizierung des metabolischen Stoffwechselwegs,
zum Beitragen notwendiger Merkmale wie Säuretoleranz und zur Aufwertung
der Milchsäureproduktion,
oder zur Herstellung interessierender Biokatalysatoren, sind immer
hohe Niveaus der mRNA-Expression erwünscht. Es besteht daher ein
Bedarf an Isolierung starker Promotorsequenzen von R. oryzae und zum
Design/zur Entwicklung von Expressionsvektoren, die den isolierten
Phosphoglyceratkinase-Gen-Promotor beherbergen.
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KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liefert den Fund des Promotorklons von Phosphoglyceratkinase-Gen-1
eines Milchsäure
produzierenden Fadenpilzstammes, Rhizopus oryzae. Der isolierte
Promotor kann Genexpression unter verschiedenen Kohlenhydratbedingungen
konstitutiv regeln. Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Design
für einen
Integrationsvektor für
die Transformation eines Fremdgens in Rhizopus oryzae.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine graphische Darstellung eines inversen PCR-Verfahrens zur Promotorklonisolierung.
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2 ist
eine Grafik eines Umkehr-Gelbilds von PCR-Klonen von R. oryzae Phosphoglyceratkinase-1-Promotor.
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3 ist
eine Grafik, die die Sequenz eines Phosphoglyceratkinase-1-Promotors
von R. oryzae, SEQ ID. Nr. 7 illustriert.
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4 ist
eine Grafik, die den homologen Vergleich von Phosphoglyceratkinase-1-Promotorsequenzen zwischen
R. oryzae, SEQ ID Nr. 9, und R. niveus, SEQ ID Nr. 8, illustriert.
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5 ist
eine Grafik, die die Expression von Phosphoglyceratkinase-1-Gen
unter verschiedenen Bedingungen illustriert.
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6 ist
eine Grafik, die eine Plasmidvektor-pGA2128-Konstruktion illustriert.
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7 ist
eine Grafik, die eine Plasmidvektor-pGA2130-Konstruktion für die Transformation
von R. oryzae illustriert.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORM(EN)
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Die
vorliegende Erfindung präsentiert
einen Promotor, der in einem Pilzstamm, R. oryzae, gefunden worden
ist, der ein Milchsäure
produzierender Organismus ist. Der gefundene Promotor ist mit dem
3-Phosphoglyceratkinase-Gen-1- (pgk1)-Promotor verwandt. Der isolierte Promotorklon,
SEQ ID Nr. 7, hat eine Länge von
1257 Basenpaaren vor dem pgk1-Genausgangscodon. Die vorliegende
Erfindung zeigt auch, dass der pgk1-Promotor von R. oryzae ein konstitutiver
Promotor ist, der pgk1-Genexpression in verschiedenen Medien regulieren
kann, die Stärke,
Glucose, Mannose, Galactose, Xylose beziehungsweise Arabinose enthalten.
Außerdem
hat das Gen 1 von R. oryzae eine reife Transkriptionsgröße von etwa
2,0 kb, basierend auf Northern Blot-Analyse. Dies unterscheidet
sich von dem hergeleiteten offenen Leserahmen von 1251 Basenpaaren
von pgk1-Gen, das in R. niveus gefunden wurde. Verglichen mit der
bekannten stromaufwärts
gelegenen pgk1-Gensequenz, SEQ ID Nr. 8 von 1 bis 555 Basenpaaren,
hat die pgk1-Promotorsequenz, SEQ ID Nr. 9, von R. oryzae von 701
bis 1254 Basenpaaren einen signifikante Unterschied von 34 Basenpaaren.
Zudem hat der pgk1-Promotor
von R. oryzae eine wichtige TATA-Box (TAATA), die sich stromaufwärts von
ATG bei 1187 bp befindet, während
das pgk1-Gen von R. niveus diese TATA-Box an dieser Position nicht
aufweist. Diese Erfindung präsentiert
des Weiteren ein Design eines Transformationsvektors für den Pilzstamm,
R. oryzae, der den nativen pgk1-Promotor zur Regulierung des Antibiotika-
(Blasticidin)-Resistenzgens von Aspergillus terreus in R. oryzae
verwendet. Dieser Vektor kann potentiell als chromosomaler Integrationsvektor
für andere Fremdgenexpression
in R. oryzae verwendet werden.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung
des pgk1-Promotors von R. oryzae zur Regulierung der Fremdgenexpression
in anderen Pilzspezies und Pflanzen.
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Zum
klaren und prägnanten
Verständnis
der Beschreibung und Ansprüche
einschließlich
der Reichweite, die diesen Begriffen beigemessen wird, werden die
folgenden Definitionen gegeben:
PROMOTOR: Die Expression eines
Gens wird durch einen Promotor gelenkt, der eine DNA-Sequenz ist
und sich in dem 5'-Bereich eines Gens
befindet. Ein Pilzpromotor ist eine Promotorsequenz, die die Transkription eines
Gens in Pilzzellen lenkt.
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KONSTITUTIVER
PROMOTOR: Die Geschwindigkeit der Gentranskription wird bei diesem
Promotor nicht durch ein Induktionsmittel reguliert, das eine chemische
Verbindung oder ein Kohlehydrat sein kann.
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INDUZIERBARER
PROMOTOR: Ein Induktionsmittel reguliert die Geschwindigkeit der
Gentranskription unter diesem Promotor
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PLASMIDVEKTOR:
Ein DNA-Plasmidvektor enthält
ein Replikon oder einen Replikationsursprung, der die Plasmid-DNA
in dem ursprünglichen
Wirtsorganismus autonom replizieren kann.
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Ein
Plasmidvektor kann auch sowohl als Kloniervektor für die DNA-Manipulation
in einem bakteriellen Wirt als auch als Shuttle-Plasmidvektor für interessierende
DNA-Expression in einer anderen Wirtszelle dienen.
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KLONPLASMIDVEKTOR:
Klonvektoren enthalten typischerweise eine oder eine kleine Anzahl
an Restriktionsendonukleoaseerkennungsstellen, in die interessierende
DNA-Sequenzen zu DNA-Manipulationszwecken insertiert werden können.
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Klonvektoren
enthalten auch ein Markergen, das zur Identifizierung und Selektion
von Zellen geeignet ist, die mit dem Klonvektor transformiert sind.
Zu Markergenen gehören in
der Regel Gene, die Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz
liefern.
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SHUTTLE-PLASMIDVEKTOR:
Shuttle-Plasmidvektoren sind Plasmidvektoren, die zwei Replikons enthalten,
von denen eines Plasmidvektor in einer bakteriellen Wirtszelle zur
DNA-Manipulation
repliziert und das andere Plasmidvektor in einer anderen Wirtszelle
zur Genexpression repliziert. Der Shuttle-Plasmidvektor enthält in der
Regel zwei selektierbare Markergene, von denen eines üblicherweise
ein Ampicillin-Resistenzgen oder Tetracyclin-Resistenz ist, das
zur Selektion von Zellen verwendet wird, die während der DNA-Manipulation mit
dem Vektor transformiert worden sind, und das andere ist üblicherweise
ein antifungales Antibiotika-Resistenzgen,
das zur Selektion von Expressionswirtszellen verwendet wird, die
mit dem Vektor transformiert worden sind. Ein Shuttle-Plasmidvektor
kann auch ein Expressionsvektor sein und enthält normalerweise eine Expressionscassette
(Promotor//mehrere Klonierungsstellen//Transkriptionsterminator),
in die ein interessierendes Gen insertiert werden kann.
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CHROMOSOMALER
INTEGRATIONSVEKTOR: Ein chromosomaler Integrationsvektor ist ein
Plasmidvektor, der die gesamte Plasmid-DNA oder einen Teil der interessierenden
DNA in die chromosomale DNA der Zelle integrieren kann. Die chromosomale
Integration erfolgt durch Rekombination eines homologen DNA-Fragments
in das Zellchromosom durch effiziente DNA-Reparaturmechanismen während der
Pilztransformation.
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Ein
chromosomaler Integrationsvektor kann auch ein Expressionsvektor
sein und enthält
normalerweise eine Expressionscassette (Promotor//mehrere Klonierungsstellen//Transkriptionsterminator),
in die ein interessierendes Gen zur Genexpression oder Promotorcharakterisierung
insertiert werden kann.
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BEISPIEL 1 PCR-Klonen
von Phosphoglyceratkinase-1-Promotor von R. oryzae
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Zur
Isolierung des Phosphoglyceratkinase-1- (pgk1)-Promotors aus R.
oryzae (ATCC 9363) wurde das R. oryzae-Mycel über Nacht in einem Kulturmedium
gezüchtet,
das 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 2 % Kartoffelstärke enthielt.
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Die
Zellen wurden dann geerntet und genome DNA aus der Kultur isoliert
und gereinigt. Zum Ausklonieren des Promotorbereichs wurde das inverse
PCR-Verfahren verwendet, wie in 1 gezeigt
ist, wo P1 der PCR Reverse-Primer 1 ist; P2 PCR der Forwarding-Primer
2 ist; RE Restriktionsenzymstelle ist, die sowohl stromaufwärts von
dem pgk1-Promotor als auch im Inneren des pgk1-Gens gespalten werden
kann; RO Rhizopus oryzae ist. Der PCR-Primer für das inverse PCR wurden basierend
auf dem offenen Leserahmen der pgk1-Gensequenz von Rhizopus niveus
unter der Annahme entworfen, dass das pgk1-Gen von R. oryzae und R.
niveus homolog ist.
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Eine
5'-Endüberhangsequenz
(kursiv) wurde entworfen, um sich Restriktionsenzymstellen (unterstrichen)
wie Xba I und Sph I anzupassen. Die inversen PCR-Primer sind wie
nachfolgend aufgeführt:
Reverse-Primer
PGK1-C-97; SEQ ID Nr. 1:
GC TCT AGA AGG TTG AGG TCG CGA ATA
GAG AGC TTG
Reverse-Primer PGK2-C-98; SEQ ID Nr. 2:
GC
TCT AGA ACG GTA GGA AGA GCT TGA ACG ATA CGA
Forwarding-Primer
PGK3-N-99; SEQ ID Nr. 3:
GAT GCA TGC TCT CAA ACC AGT GGC TGC
TGA GGT TGA
Forwarding-Primer PGK4-N-100; SEQ ID Nr. 4:
GAT
GCA TGC GCC TTT GGT ACT GCT CAC CGT GCT CAC
Forwarding-Primer
PGK5-N-101; SEQ ID Nr. 5:
GAT GCA TGC TGT TAA AGT AAG GTT CTC
TTA TAA
Forwarding-Primer PGK6-N-102; SEQ ID Nr. 6:
GAT
GCA TGC TAT TTG AAT TCG ATG CCT TCT CTA
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Die
genome DNA wurde zuerst mit verschiedenen Restriktionsenzymen einschließlich Bgl
II, EcoR I, Hinc II, Kpn I, Nco I, Sph I und Xmn I verdaut, die
sich im 5'-Bereich
des pgk1-Gens von R. niveus befinden. Nach dem Verdauen wurden die
DNA-Proben gereinigt und mit T4-DNA-Ligase selbstligiert. Tabelle
1 zeigte die Umkehr-PCR-Reaktionsmatrix, die verschiedene Sets von
Reverse-Primer und Forwarding-Primer miteinander paart.
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Tabelle
1. Inverse PCR-Primerpaar-Sets, entsprechend jeder mit Restriktionsenzym
verdauten DNA-Probe zur Isolierung von 3-Phosphoglyceratkinase-2-Promotor
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Die
inversen PCR-Reaktionen wurden basierend auf der in Tabelle 1 beschriebenen
Primer-Paarung durchgeführt.
Nach der PCR-Reaktion wurden die PCR-Produkte durch Elektrophorese
in einem Agarose-Gel getrennt. Die inversen PCR-Ergebnisse sind
in einem Umkehr-Gelbild in 2 gezeigt,
wobei die Bahnnummer jeder inversen PCR-Reaktion in Tabelle 1 entspricht
und Bahn Hλ der
DNA-Größenmarker
ist. Die iso lierten pgk1-Promotorklons werden in dem Gelbild als
dunkle Banden gezeigt. Bahnen 3, 4, 5, 6, 9 und 10 zeigen starke
Banden, die den ligierten DNA-Proben entsprechen, die zuvor durch
EcoR, Hinc II beziehungsweise Nco I gespalten wurden.
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Die
Größen der
PCR-Klons liegen im Bereich von etwa 1,0 kb bis 3,0 kb.
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BEISPIEL 2 Nukleotidsequenz
von pgk1-Promotorsequenz
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PCR
Produkt Nr. 3 enthält
das meiste der stromaufwärts
gelegenen pgk1-Gensequenz, da das zur Spaltung der genomen DNA verwendete
Restriktionsenzym EcoR I näher
an dem Ausgangscodon ATG lokalisiert als andere Restriktionsenzyme,
Hinc II und Nco I, die der EcoR I Stelle weiter stromabwärts lokalisieren. Der
pgk1-Promotorklon Nr. 3 wurde in einen Vektor pGEM-T (Promega, Madison,
WI, USA) kloniert, um pGA2086 zu bilden. Zur Bestätigung der
DNA-Insertion wurden einzelne Kolonien ausgesucht. Zwei der individuellen
Klone, pGA2086a und pGA2086b, wurden vollständig von beiden Enden sequenziert.
Die überlappende
Sequenz dieser beiden Klons zeigte durch Sequenz-Blasting, dass
sie identisch waren und zu einer Gensequenz gehörten. Die vollständige Nukleotidsequenz
des pgk1-Genpromotors ist in 3 gezeigt;
SEQ ID Nr. 7. Die klonierte pgk1-Promotorsequenz hat eine Länge von
1257 bp. Die mutmaßliche
TATA-Box und CAT-Box sind fett und unterstrichen dargestellt. Es
gibt sechs CAT-Boxen und zwei TATA-Boxen innerhalb von 200 Basenpaaren
stromaufwärts
von dem Ausgangscodon.
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BEISPIEL 3 Homologer Vergleich
der pgk1-Promotorsequenz zwischen R. oryzae und R. niveus
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Um
die Homologie des pgk1-Promotors zwischen R. oryzae und R. niveus
zu vergleichen, wurden zwei Promotorsequenzen aus beiderlei Herkunft
gegeneinander geblasted. Die Vergleichsergebnisse des pgk1-Promotors
sind in 4 gezeigt, wobei ROPK15 die
Promotorsequenz von R. oryzae ist, SEQ ID Nr. 9; RNPGK1 die pgk1-Promotorsequenz
von R. niveus ist, SEQ ID Nr. 8. Die fettgedruckten Buchstaben zeigen den
Unterschied der beiden Sequenzen, und "-" zeigt
fehlende Nukleotide von beiden Sequenzen. ATG ist das mutmaßliche Ausgangscodon
des pgk1-Gens. Die Ergebnisse zeigen, dass es 34 Nukleotide des
pgk1-Promotors von R. oryzae gibt, die sich von dem pgk1-Promotor
von R. niveus unterscheiden.
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Innerhalb
der 200 Basenpaare stromaufwärts
von ATG hat der pgk1-Promotor von R. oryzae zwei TATA-Boxen, während derjenige
von R. niveus nur eine TATA-Box aufweist. R. niveus weist die TATA-Box
bei dem Basenpaar 1187 nicht auf, wie in 4 zu sehen
ist. Aus diesen Ergebnissen wird gefolgert, dass die pgk1-Promotorsequenzen
von R. oryzae mit denjenigen nicht identisch sind, die aus R. niveus
isoliert wurden, obwohl sie in hohem Maße homolog sind.
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BEISPIEL 4 Expressionsmuster
von pgk1-Gen in R. oryzae
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Um
die Regulierungsmuster des pgk-Promotors zu testen, wurde R. oryzae
in unterschiedlichen Kulturmedien gezüchtet, die Glucose, Stärke, Xylose,
Mannose, Galactose beziehungsweise Arabinose enthielten. Die Gesamt-RNA
wurde aus der Biomasse des Mycels mit einem RNeasy Maxi-Kit (QUIAGEN
Inc., Valencia, CA, USA) isoliert. Gesamt-RNA-Proben (50 μg pro Bahn)
wurden in 1,3 % Formaldehyd-Agarose-Gel getrennt und auf Zeta-Probe
Membran (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) kapillargeblottet,
die dann bei 80 °C
in einem Vakuumofen zwei Stunden gebacken wurde. Northern Blot wurden
mit einer α32P-dCTP-markierten pgk1-Gensonde hybridisiert.
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Die
Northern Blot-Analyseergebnisse sind in 5 gezeigt,
wo Bahn 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Gesamt-RNA-Proben sind, die aus R. oryzae-Kulturen
hergestellt wurden, die in dem Medium mit Glukose, Kartoffelstärke, Xylose,
Mannose, Galactose beziehungsweise Arabinose gezüchtet wurden. Der Northern
Blot zeigt, dass das Phosphoglyceratkinase 1-Gen eine reife RNA-Größe von etwa
2 kb hat, die sich von dem angegebenen offenen Leserahmen (1,25
kb) des R. niveus-pgk1-Gens
unterscheidet, wodurch gezeigt wird, dass sich das pgk1-Gen von
R. oryzae von demjenigen von R. niveus unterscheidet. Das pgk1-Gen
von R. oryzae exprimiert unter allen getesteten Bedingungen, was
zeigt, dass der pgk1-Promotor
ein konstitutiver Promotor ist. Die starke Expression wurde in dem
Medium erhalten, das Galactose, Glukose und Xylose enthielt, gefolgt
von Arabinose, Mannose und Kartoffelstärke.
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BEISPIEL 5 Transformationsvektordesign
für R.
oryzae
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Zur
Entwicklung eines Transformationsvektorsystems für die Fremdgenexpression in
R. oryzae wurde der folgende Vektor entworfen. Ein Blasticidin-Resistenzgen
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde zuerst durch PCR auskloniert
und in pGEM-T-Vektor kloniert (Promega, Madison, WI, USA), um EcoR
I am 5'-Ende des
Gens und Not I-Stelle am 3'-Ende
zu adaptieren, wodurch ein Plasmidvektor pGA2125 gebildet wird.
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Das
Blasticidin-Gen wurde nachfolgend wie in 6 in einen
Vektor pRG1 kloniert, wodurch Plasmid pGA2128 gebildet wurde. Der
Plasmidvektor pRG2130 zur Genexpression und – integration in R. oryzae
wurde dann konstruiert und ist in 7 gezeigt,
wobei AmR: Ampicillin-Resistenzgen; bsd: Antibiotika-Blasticidin-Resistenzgen;
ori: Col E1 Ursprung; T: Pilztranskriptionsterminator TAOX1;
pk P: R. oryzae pgk1-Promotor und
URA3: Oritidin-5'-phosphatdecarboxylase-Gen
aus Pichia pastoris. Das selektierbare Markergen versieht R. oryzae
mit Resistenz gegen Antibiotika, Blasticidin.
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Andere
Antibiotika-Resistenzgene, wie Sulfanilamid- und Gentamycin-Resistenzgene
können
das Blasticidin-selektierbare Markergen ersetzen. Das selektierbare
Markergen wurde unter der Steuerung des pgk1-Promotors von R. oryzae
positioniert, und ein Pilztranskriptionsterminator, T
AOX1,
beendet die Transkription. Zudem können ein heterogenes oder homogenes
URA3-Gen oder andere native Gensequenzen als Integrationselemente
für die
chromosomale Geninsertion verwendet werden. Die pgk1-Promotorsequenz
kann auch potentiell als chromosomale Integrationselemente dienen.
Chromosomale Integrationsvektoren bauen das gewünschte Gen in Zellchromosom
ein, basierend auf dem zu Grunde liegenden Prinzip, dass linearisierte Plasmid-DNA-Fragmente
effektiv während
Pilztransformation durch Rekombination mit homologen DNA-Restriktionsfragmenten
repariert werden. Sequenzlisting
