DE69233263T2

DE69233263T2 - Nukleotidsequenzen und gegen cycloheximid resistente proteine

Info

Publication number: DE69233263T2
Application number: DE69233263T
Authority: DE
Inventors: Pierre Dehoux; Julian Davies
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1992-07-15
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2012-07-16
Also published as: ATE255638T1; US5830997A; FI940036A0; US5958687A; FI940036A; US5641674A; DK0594771T3; WO1993002201A1; FR2679253B1; EP0594771B1; JPH06509229A; EP0594771A1; FI120358B; FR2679253A1; AU669483B2; ES2211859T3; AU2387892A; DE69233263D1

Description

Die Erfindung betrifft Nukleotidsequenzen, welche fähig sind, Resistenz gegen Cycloheximid zu verleihen, Resistenzproteine gegen Cycloheximid und deren Verwendung als Selektionsmarker, beispielsweise um den Transfer von Nukleinsäuren zu kontrollieren.
Die Erfinder haben tatsächlich nach Selektionsmarkern gesucht, welche geeignet sind, um den Transfer von Nukleinsäuren bei Eukaryoten zu kontrollieren, nach Markern, die wirksamer sein sollten als die gewöhnlich eingesetzten Marker, welche von prokaryotischen Organismen stammen. Es ist beispielsweise bekannt, dass die gewöhnlich eingesetzten Marker (Geneticin G-418, Hygromycin und Bleomycin) von Resistenzgenen, welche aus Prokaryoten isoliert worden sind, stammen und im allgemeinen wenig wirksam sind, insbesondere bei Pilzen. Diese Probleme nötigten die Forscher dazu, sehr hohe Antibiotika-Konzentrationen einzusetzen, was Probleme hinsichtlich Toxizität und Herstellungskosten hervorrief. Demzufolge wurden andere Selektionsmaßnahme oder -mittel eingesetzt, beispielsweise die Selektion durch Methotrexat, die Selektion durch Auxotrophie u. s. w. Indessen sind diese Selektionsmaßnahmen oder -mittel nicht allgemein anwendbar. Es besteht folglich ein Bedarf für die Herstellung von Systemen, welche für den Einsatz eines wirksameren und/oder stärkeren Markers als die bis heute bekannten Marker und bei weniger kostspieligen Herstellungskosten angepasst sind.
Cycloheximid könnte einen potentiell interessanten Marker bilden, um beispielsweise den Transfer von heterologer Nukleinsäure bei Eukaryoten nachzuweisen. Mit diesem Ziel müssen die Eukaryoten, die man auf kontrollierbare Weise dank eines Nachweistests bezüglich der Resistenz gegen Cycloheximid zu modifizieren trachtet, resistent gegen dieses Antibiotikum unter zufriedenstellenden Bedingungen gemacht werden, um eine zuverlässige Kontrolle des Transfers von heterologer Nukleinsäure, welcher entweder zu Forschungszwecken oder mit dem Ziel einer industriellen Ausnutzung ausgeführt wird, sicherzustellen.
Cycloheximid ist ein Antibiotikum, welches die Proteinsynthese hemmt, indem es an die ribosomale Untereinheit 60S bindet, wie dies STOCKLEIN et al. (1980, Curr. Genetics 1, 177–183) beschrieben haben.
Natürlicherweise gegen Cycloheximid resistente eukaryotische Organismen sind selten; bis zum heutigen Tage sind Beobachtungen, welche sich auf die Resistenzmechanismen beziehen, bei einer Mutante eines natürlicherweise gegenüber Cycloheximid empfindlichen Organismus, der Mutante cyh2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae beschrieben worden. In diesem Zusammenhang wird das Resistenzphänomen durch eine Modifikation des ribosomalen Proteins L29 verursacht (STOCKLEIN et al., 1980).
Diese mutierten zellulären Organismen sind im allgemeinen gegenüber niedrigen Cycloheximid-Konzentrationen (in der Größenordnung von 5–10 μg/ml) resistent.
Andere Autoren (TAKAGI et al. in dem U.S.-Patent 4,857,460) haben über Ergebnisse, welche sich auf die Untersuchung der Resistenz gegen Cycloheximid bei einer anderen Hefe, Candida maltosa, beziehen, berichtet. Wie präsentieren eine DNA-Sequenz, welche die Resistenz gegen Cycloheximid bei C. maltosa bewirkt. Indessen wurde in dieser Sequenz keinerlei Gen, keinerlei offenes Leseraster identifiziert. In anderen Worten gibt das U.S.-Patent 4,857,460 keine Charakterisierungselemente eines Gens, Elemente, die dazu hätten führen können, Modalitäten für dessen Verwendung, beispielsweise um von Candida maltosa verschiedene Eukaryoten auf reproduzierbare Weise zu gegen Cycloheximid resistenten Stämmen zu transformieren, zu definieren, an.
Die Erfinder interessieren sich für die Hefe Kluyveromyces lactis (K. lactis) und haben die Tatsache nachgewiesen, dass die Resistenz gegen Cycloheximid bei K. lactis von der Expression eines besonderen Gens abhängt. Sie haben auch die Tatsache ermittelt, dass an dem Resistenzniveau dieser Hefe gegenüber diesem Antibiotikum andere Elemente, welche verbunden sind mit der Anwesenheit von besonderer DNA, welche eine Rolle als Kofaktor (oder als Kofaktor (en) fungierende Sequenz (en)) spielt, beteiligt sind.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsweise der Erfindung ist die erhaltene Resistenz für Cycloheximid spezifisch, indem die transformierten, gegen dieses Antibiotikum resistenten Wirte (cyc^R-Transformanten) gegenüber mehreren klassischen Inhibitoren der ribosomalen Funktionen (Cryptopleurin, Blasticidin, Trichodermin, Anisomycin, Hygromycin) empfindlich sind.
Die Erfinder haben folglich aus K. lactis eine Nukleinsäuresequenz mit einer Größe von etwa 5,2 kb gewonnen, die fähig ist, einem durch diese Sequenz transformierten zellulären Wirt ein Resistenzniveau zu verleihen, welches ausreichend hoch ist für die Herstellung eines Selektionssystems anhand der Resistenz gegen dieses Antibiotikum, wobei diese Resistenz sich bei einer Cycloheximid-Konzentration über 1 mg/ml manifestieren kann.
Innerhalb dieser Nukleinsäuresequenz haben die Erfinder ein besonderes Gen identifiziert und charakterisiert, welches ein Protein kodiert, dessen Anwesenheit sich als notwendig erweist, um das Resistenz-Phänomen bei K. lactis zu induzieren.
Dieses besondere Gen kodiert ein ribosomales Protein, welches für die Resistenz gegenüber einer Cycloheximid-Konzentration der Größenordnung von 100 μg/ml verantwortlich ist. Die vollständige Resistenz gegen dieses Antibiotikum erfordert bei K. lactis nicht nur die Anwesenheit dieser Resistenz induzierenden Sequenz, sondern ferner die Anwesenheit von ergänzenden DNA-Elementen, welche in der Nukleinsäuresequenz von 5,2 kb, welche durch die Erfinder bestimmt wurde und nachfolgend beschrieben wird, enthalten sind. Diese zusätzlichen Elemente spielen die Rolle von Kofaktoren.
Die vorliegende Anmeldung hat folglich Nukleotidsequenzen wie auch ein Protein zum Gegenstand, welche in der Lage sind, einem zellulären eukaryotischen Wirt, welcher natürlicherweise gegenüber diesem Antibiotikum empfindlich ist oder gegenüber einem niedrigen Konzentrationsniveau dieses Antibiotikums resistent ist (auch bezeichnet als auf niedrigem Niveau resistenter Organismus), Resistenz gegen Cycloheximid zu verleihen. Diese erste Art von Protein kann in der Folge durch den Ausdruck „Resistenzprotein" bezeichnet werden.
Die Erfindung zielt auch auf eine Nukleinsäuresequenz, welche ein Gen umfasst, welches das oben beschriebene Resistenzprotein bei K. lactis kodiert, wie auch auf Sequenzen, die die Anwesenheit von Kofaktoren, welche an dem Niveau der durch das oben genannte Protein verliehenen Resistenz beteiligt sind, bestimmen, ab.
Sie betrifft gleichfalls das das Resistenzprotein kodierende Gen und die verschiedenen Nukleinsäurefragmente, welche die Anwesenheit der Kofaktoren bestimmen.
Sie zielt auch auf Vektoren zur Klonierung und/oder Expression dieser Nukleotidsequenzen wie auch durch diese Vektoren transformierte zelluläre eukaryotische Wirte ab.
Ein erstes erfindungsgemäßes Protein oder Resistenzprotein gegen Cycloheximid ist ein Protein, dessen Anwesenheit erforderlich und ausreichend ist, um einem natürlicherweise gegenüber Cycloheximid empfindlichen Wirt Resistenz gegen dieses Antibiotikum zu verleihen. Es ist dadurch gekennzeichnet, dass es der folgenden Aminosäureverknüpfung oder -sequenz A entspricht oder dass es die Gesamtheit oder einen Teil dieser Verknüpfung oder Sequenz A umfasst, welcher) gegebenenfalls modifiziert ist, sobald das gebildete Protein einem rekombinanten eukaryotischen Wirt, welcher durch die dieses Protein kodierende Nukleotidsequenz transformiert ist, unter Bedingungen, die dessen Produktion erlauben, Resistenz gegen Cycloheximid verleiht.
SEQUENZ A:
Die Eigenschaft dieses Proteins, Resistenz gegen Cycloheximid zu verleihen, kann ausgewertet werden, wenn es in einem bestimmten zellulären eukaryotischen Wirt, welcher natürlicherweise gegenüber Cycloheximid in einer Konzentration über einem Schwellenwert, welcher abhängig von der Natur des Wirts festgelegt ist, empfindlich ist, produziert wird und dadurch, dass es erlaubt, bei diesem Wirt eine Resistenz zu erhalten gegenüber einer Konzentration, die etwa 5- bis 15-fach höher, vorzugsweise etwa 10-fach höher bezogen auf die Cycloheximid-Konzentration, welche die natürliche Empfindlichkeit bei diesem Wirt verleiht, ist.
Insbesondere bei den Hefen ist die Erhöhung des Resistenzniveaus ungefähr 10-fach, bei S. cerevisiae ja sogar 100-fach bezogen auf das bei dem Wildstamm beobachtete Niveau.
Als Beispiel ist nachfolgend die Größenordnung der natürlichen Empfindlichkeit gegenüber Cycloheximid von verschiedenen Organismen angegeben:
S. cerevisiae-Hefen: 1 μg/ml
Höhere eukaryotische Zellen: 1 μg/ml
Tabakpflanzen: 10 μg/ml
Allgemein manifestiert sich die natürliche Empfindlichkeit eines bestimmten Organismus, sobald die Anwesenheit von Cycloheximid in dem Kulturmedium das Wachstum und die Vermehrung des Organismus hemmt.
Wenn in diesem Text auf einen gegenüber Cycloheximid empfindlichen eukaryotischen Wirt Bezug genommen wird, muss diese Bezugnahme so interpretiert werden, dass sie einen jeglichen eukaryotischen Organismus bezeichnet, welcher der obigen Definition, welche die Resistenz gegen Cycloheximid betrifft, entspricht.
Ein erfindungsgemäßes Resistenzprotein gegen Cycloheximid kann ferner dadurch gekennzeichnet werden, dass es kodiert wird durch die folgende Nukleotidsequenz I, durch einen Teil der Sequenz I oder durch eine bezogen auf I modifizierte Sequenz, sobald das durch diesen Sequenzteil oder diese modifizierte Sequenz kodierte Protein in der Lage ist, eine Resistenz gegen eine Cycloheximid-Konzentration, welche wenigstens gleich 100 μg/ml ist, zu verleihen, wenn er bzw. sie in einen eukaryotischen Wirt, beispielsweise in die Hefe Saccharomyces cerevisiae, unter Bedingungen, welche dessen bzw. deren Expression erlauben, eingeführt wird.
Seuqenz I
Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Nukleinsäuresequenz, welche die Sequenz umfasst, welche das Resistenzprotein gegen Cycloheximid bei K. lactis kodiert, wobei diese Sequenz dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einer der folgenden Definitionen entspricht:

(a) es handelt sich um eine Nukleinsäuresequenz von K. lactis von etwa 5,2 kb, die fähig ist, bei K. lactis oder bei K. cerevisiae eine Resistenz gegen Cycloheximid in einer Konzentration höher als 1 mg/ml zu verleihen, und die in der 3 definierten Restriktionsstellen umfasst; die verschiedenen Stellen befinden sich jeweils an den folgenden Positionen:
(b) es handelt sich um eine Nukleinsäuresequenz von etwa 5,2 kb, die die Nukleotidverknüpfung I umfasst oder mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung I unter Bedingungen hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C) hybridisiert und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen eine Cycloheximid-Konzentration höher als 100 μg/ml, vorzugsweise höher als 1 mg/ml zu verleihen;
(c) es handelt sich um eine Nukleinsäuresequenz von etwa 5,2 kb, die in der folgenden Nukleotidverknüpfung II enthalten ist oder mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung II unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen eine Cycloheximid-Konzentration höher als 100 μg/ml, vorzugsweise höher als 1 mg/ml zu verleihen;
(d) es handelt sich um die Nukleinsäuresequenz, welche die Sequenz von Nukleotiden, die zwischen den Positionen 9 und 2763 der Verknüpfung II liegt, umfasst, oder eine Sequenz, welche mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung II unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen eine Cycloheximid-Konzentration höher als 100 μg/ml, vorzugsweise höher als 1 mg/ml zu verleihen.

Wenn eine Nukleinsäuresequenz, die einer der oben angegebenen Definitionen entspricht, in eine Hefe, wie S. cerevisiae, eingeführt wird, verleiht sie dieser Hefe eine Resistenz gegen Cycloheximid in einer Konzentration höher als 100 μg/ml, wobei diese Resistenz sich vorteilhafterweise für eine Cycloheximid-Konzentration höher als 1 mg/ml manifestiert.
SEQUENZ II:
SEQUENZ II (Fortsetzung):
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung entsprechen die beiden unter den Punkten (b) und (c) oben definierten DNA-Sequenzen außerdem der in der 3 angegebenen Restriktionskarte.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird die oben beschriebene Nukleinsäuresequenz aus dem mit dem Plasmid Ye23/31 rekombinierten Stamm E. coli DH5α, welcher bei der CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Paris, Frankreich) am 02. Juli 1991 unter der Nummer I-1121 hinterlegt worden ist, extrahiert.
Man nennt hier eine „komplementäre Sequenz" einer gegebenen Nukleinsäuresequenz eine bezogen auf eine gegebene Sequenz inverse und komplementäre Sequenz. Der Begriff „invers" berücksichtigt die Wiederherstellung der 5'-3'-Orientierung der Nukleinsäure, die auch aufgrund der Natur der Nukleotide, die diese enthält, zu einer gegebenen Sequenz komplementär ist.
Die Nukleinsäuresequenz von 5,2 kb umfasst außer der das sogenannte Resistenzprotein kodierenden Sequenz, welche oben beschrieben worden ist, die DNA, die man mit dem Begriff „Kofaktor" bezeichnen kann, die das Resistenzniveau bzw. die Höhe der Resistenz gegen Cycloheximid bei K. lactis und bei einem durch diese Sequenz transformierten zellulären Wirt bestimmt. Diese Kofaktor-DNA ist in der Sequenz II enthalten.
Die Erfindung betrifft folglich gleichfalls die folgenden DNA-Fragmente, welche in der oben beschriebenen Sequenz von 5,2 kb enthalten sind:
das Fragment BamHI(5') – PvuII(3') von etwa 2,3 kb
das Fragment PvuII(5') – SaII(3') von etwa 3 kb.
Die Erzielung einer Resistenz gegen Cycloheximid bei einem gegebenen zellulären Wirt in einer bestimmten Höhe kann realisiert werden, indem dieser Wirt mit einer Nukleinsäure, welche das Resistenzprotein gegen Cycloheximid kodiert, und mit einem DNA-Kofaktor-Fragment, welches in der Sequenz von 5,2 kb angrenzend oder nicht-angrenzend an die obige Nukleinsäure vorhanden ist, transformiert wird, wobei die Einführung dieses Fragments in den Wirt direkt mit der Bedeutung oder Höhe der festgestellten Resistenz korreliert ist. Eine Ausführungsweise der Transformation eines zellulären Wirts wird auf den folgenden Seiten beschrieben.
Das Resistenzprotein kann durch Lyse der Zellen von K. lactis gemäß den in „The Yeasts" (zweite Auflage durch A. H. Rose und J. S. Harrison, Band 4: 504–505) beschriebenen Schritten isoliert werden.
Die Reinigung kann auch anhand von Affinität mittels gegen die Sequenz A erzeugten Antikörpern erfolgen. In diesem Falle führt man eine Überexpression des ribosomalen Proteins aus, das dann gemäß den klassischen Techniken auf einem Polyacrylamidgel gereinigt wird. Die Bande mit dem zu dem Protein der Sequenz A entsprechenden Molekulargewicht wird entnommen. Diese Bande ist die hauptsächlich vorhandene Bande, denn sie resultiert aus der Überexpression des Proteins. Dieses wird einer Reaktion mit den oben beschriebenen Antikörpern, welche gemäß den klassischen Techniken produziert worden sind, wobei es sich insbesondere um monoklonale Antikörper handelt, unterzogen.
Die Erfindung zielt auch auf die Sequenz ORF A, welche die Nukleinsäure I enthält, ab, wobei ORF A seinerseits zwischen den Nukleotiden an den Positionen 1 und 1560 der Verknüpfung II enthalten ist, wobei es sich versteht, dass die zwischen den Nukleotiden 633 und 1222 enthaltene Sequenz einem Intron V entspricht. Die ORF A-Sequenz umfasst zwei Exons, wobei das eine durch die zwischen den Nukleotiden 629 und 632 gelegenen Nukleotide ATGG gebildet wird, das andere Exon durch die Sequenz zwischen den Nukleotiden 1223 und 1539 gebildet wird.
Die Nukleotidverknüpfung zwischen den Nukleotiden 1 und 1539 umfasst außer der Sequenz ORF A den Promotor des Gens.
Andere im Rahmen der Erfindung besonders interessante Nukleotidsequenzen sind die folgenden Sequenzen:

– die Nukleotidverknüpfung ORF A als solche oder eine jegliche Nukleotidverknüpfung, welche mit der zu ORF A komplementären Sequenz unter den folgenden Bedingungen: 60°C, 2 × SSC, 5 × Denhart, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml Lachssperma-DNA, hybridisiert,
– die kodierende Sequenz I (oder Exonphase), welche in der Nukleinsäure ORF A, welche das Resistenzprotein bei Kluyveromyces lactis kodiert, enthalten ist und zwischen den Nukleotiden 629 und 1539, welche eine Sequenz von zwei Exons bilden, von denen das eine zwischen den Nukleotiden 629 und 632 und das andere zwischen den Nukleotiden 1223 und 1539 liegt, enthalten ist,
– die Sequenz IV, welche die Nukleotide 1561 und 2740 umfasst und der Verknüpfung entspricht, welche zwischen den Nukleotiden 1540 und 2763 liegt, die als Kofaktor bezeichnet wird und fähig ist, die durch das Resistenzprotein verliehene Resistenz gegen Cycloheximid zu erhöhen,
– die Intronphase V von ORF A,
– die Nukleotidverknüpfung III, welche durch die Nukleotide 1 und 628, spezieller 8 und 628 begrenzt wird, die die Regulationselemente der Expression von ORF A und insbesondere die Transkriptionspromotorregion der Sequenz ORF A enthält; dieser Promotor enthält insbesondere regulatorische Regionen der Promotoren von Proteinen, welche für die Ribosome charakteristisch sind, Regionen vom Typ „UAS_RPG", wie von W. H. Mager (Biochem. Biophys. Acta (1988) 949: 1–15) beschrieben. Diese sogenannten ribosomalen Proteine werden in den Kern der Zelle, die diese produziert, importiert, wo sie zu Ribosomen zusammengebaut werden;
– die zwischen den Nukleotiden 1561 und 2740 enthaltene Sequenz IV, welche als Kofaktor bezeichnet wird und fähig ist, die durch das Resistenzprotein verliehene Resistenz gegen Cycloheximid zu erhöhen.

Die Erfindung hat auch rekombinante Vektoren insbesondere für die Klonierung und/oder die Expression der Proteine, deren Eigenschaften bzw. Merkmale zuvor angegeben worden sind, zum Gegenstand.
Diese Expressionsvektoren sind gekennzeichnet durch den Einbau einer unter den Vorangegangenen ausgewählten Nukleotidsequenz an einer von deren für deren Replikation nicht essentiellen Stellen unter der Kontrolle der für deren Expression in einem ausgewählten zellulären eukaryotischen Wirt erforderlichen Regulationselemente, wobei diese Regulationselemente insbesondere einen Promotor, welcher gegebenenfalls induzierbar ist, und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen.
Ein solcher Vektor kann eine Nukleotidsequenz, welche ein Protein, welches als Resistenzprotein gegen Cycloheximid bezeichnet wird, kodiert, allein oder in Kombination mit einer als Kofaktor fungierenden Nukleotidsequenz, welche der zuvor angegebenen Definition entspricht, umfassen.
Die Erfindung zielt außerdem auf Vektoren ab, welche den obigen Definitionen entsprechen, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie außerdem eine bestimmte heterologe Nukleinsäu re enthalten, beispielsweise eine Nukleinsäure, welche ein Protein von pharmazeutischem oder industriellem Interesse kodiert, wobei diese Nukleinsäure unter der Kontrolle von Regulationselementen, die für deren Expression in dem Wirt erforderlich sind, steht, wobei diese Elemente mit den Sequenzen, welche die Transkription der Nukleotidsequenzen, welche an der Resistenz gegen Cycloheximid beteiligt sind, kontrollieren, zusammenfallen können.
Das erfindungsgemäße Resistenzsystem erlaubt vorteilhafterweise, die Insertion von heterologen Sequenzen, wie jener des menschlichen Serumalbumins, des Hepatitis B-Oberflächenantigens, in Hinblick auf deren Expression in einem eukaryotischen Wirt zu kontrollieren.
Als Beispiel kann man Vektoren vom Typ eines replikativen Plasmids, integrative Vektoren, wie pSVL (Pharmacia), einsetzen. Ein solcher Vektor kann beispielsweise die das der Sequenz A entsprechende Protein kodierende Nukleotidsequenz, welcher ihr Intron fehlt, enthalten.
Es ist für die Ausführung der Erfindung allgemein interessant, Vektoren mit hoher Kopienzahl (Multicopy-Plasmide) einzusetzen, insbesondere wenn die transformierten Zellen eukaryotische Zellen sind.
Gemäß der Erfindung bevorzugte Vektoren sind Vektoren, die für die Expression in Hefen insbesondere von industriellem Interesse, die man mit einem Resistenzmarker zu markieren wünscht, beispielsweise wenn man über keinen Auxotrophie-Marker verfügt, angepasst sind, wobei eine besondere Hefe Pichia pastoris oder S. pombe ist, oder Vektoren, welche für die Expression in einer tierischen Zelle eines höheren Eukaryoten angepasst sind, beispielsweise das Baculovirus, oder ferner Vektoren, die für die Expression in einer pflanzlichen Zelle, wie den Tabakpflanzen, angepasst sind. Es können beispielsweise Affenzellen oder Zellen von Mäusen transformiert werden.
Ein im Rahmen der Erfindung besonders vorteilhafter Vektor ist das Plasmid Ye23/31, mit welchem der bei der CNCM am 02. Juli 1991 unter der Nummer I-1121 hinterlegte E. coli-Stamm DHSa transformiert ist.
Die Erfindung zielt außerdem auf eine eukaryotische Zelle ab, welche dadurch gekennzeichnet ist, das sie durch einen Vektor, welcher den obigen Charakteristiken entspricht, transformiert ist, und insbesondere dadurch, dass es sich um eine Hefezelle, beispielsweise Pichia pastoris, eine tierische Zelle eines höheren Eukaryoten, beispielsweise eine Insektenzelle oder eine Säugetier-, insbesondere Mäuse- oder Affenzelle, eine menschliche Zelle oder ferner eine pflanzliche Zelle handelt.
Eine solche rekombinante Zelle kann durch alle Verfahren zur Insertion von heterologen Sequenzen, die geläufigerweise für die Herstellung von rekombinanten zellulären Wirten eingesetzt werden, erhalten werden. Man kann insbesondere die von M. Becker, L. Garente in Method in Enzymology (1991, Band 194: 182–187) beschriebene Elektroporationstechnik anwenden.
Man kann gleichfalls auf die Techniken zurückgreifen, die in der Patentanmeldung WO 84/02913 zu dem Thema der Insertion in pflanzliche Zellen von bezogen auf die Nukleinsäuresequenzen, welche in solchen Zellen natürlicherweise enthalten sind, heterologen Nukleotidsequenzen beschrieben werden.
Als eine Anwendungsmöglichkeit können die zuvor beschriebenen Resistenzproteine in einem Selektionssystem eingesetzt werden, das in spezifischer Weise auf einen Marker vom Typ Cycloheximid reagiert, um die Einführung oder Aufnahme einer heterologen Sequenz in einen eukaryotischen Wirt, welche Sequenz man in diesem Wirt zu exprimieren wünscht, zu kontrollieren. Die Selektion wird dann umso einfacher sein, wenn die Resistenz mittels einer hohen Konzentration von Antibiotikum verifiziert werden kann, wobei diese Resistenz dann aus der Assoziation des obigen Resistenzproteins mit einem zuvor definierten Kofaktor resultiert.
Es ist im Rahmen der Erfindung besonders interessant, Proteine herzustellen, welche erlauben, eine Resistenz gegen eine Konzentration von etwa 100 μg/ml, ja sogar 1 mg/ml Cycloheximid zu erhalten. Es ist außerdem in bestimmten Fällen sehr vorteilhaft, Resistenzproteine gegebenenfalls in Assoziation mit einem Kofaktor, welcher zu einer Resistenz bei einer Konzentration von etwa 1 mg/ml Cycloheximid führt, zu erhalten.
Die Erfindung zielt außerdem auf ein Verfahren zur Kontrolle des Vorhandenseins einer heterologen Nukleinsäure in einem zellulären Wirt ab, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

– die Transformation des zellulären Wirts mit einem Expressionsvektor, der in Stellen, die nicht essentiell für seine Replikation sind, die heterologe Nukleinsäure einerseits, eine ein Resistenz protein kodierende Nukleotidsequenz andererseits und gegebenenfalls eine als Kofaktor fungierende Nukleotidsequenz unter der Kontrolle der für die Expression dieser Sequenzen in dem gewählten zellulären Wirt erforderlichen Regulationselemente umfasst,
– die Kultivierung des so transformierten zellulären Wirts,
– das Inkontaktbringen des Wirts mit einer bestimmten Cycloheximidkonzentration und den Nachweis der Resistenz des Wirts gegenüber diesem Antibiotikum.

Die Erfindung hat auch ein Verfahren zur Gewinnung von Zellen, welche Resistenz gegen Cycloheximid exprimieren, wie in den vorangegangenen Seiten beschrieben, zum Gegenstand, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

– Transformation eines gegebenen zellulären Wirts durch eine Nukleinsäuresequenz der Erfindung, welche vorab in ein Plasmid des Wirts insertiert worden ist, unter Bedingungen, welche die Expression der oben genannten Nukleinsäuresequenz erlauben;
– Kultivierung der transformierten Zellen (Transformanten) in einem kompletten Medium, welches eine sehr niedrige Cycloheximid-Konzentration, vorzugsweise unter 2 μg/ml, enthält;
– Gewinnung der bei einer Cycloheximid-Konzentration über 1 bis 10 μg/ml resistenten Stämme.

Handelt es sich beispielweise um Hefen, werden die oben beschriebenen Schritte unter den folgenden Bedingungen ausgeführt:

– die Kultivierung der Transformanten erfolgt bei einer Temperatur zwischen etwa 29°C und etwa 30°C, vorzugsweise 30°C, in Gegenwart einer Cycloheximid-Konzentration unter 2 μg/ml während 12 bis 36 h,
– die ausgehend von dieser Kultur ausgewählten Stämme sind jene, die bei einer Kultivierung in Gegenwart von 100 μg/ml Cycloheximid erhalten bleiben,
– das komplette Kulturmedium enthält 10 g/l Hefeextrakt („yeast extract"), 20 g/l Bacto-Pepton und 20 g/l Glucose.

Der Kultivierungsschritt der Transformanten, der oben diskutiert wird, wird vorzugsweise während einer Dauer von 12 bis 18 h bei 30°C nach einer Transformation in einem kompletten flüssigen Medium bei sub-limitierenden Konzentrationen (1 μg/ml) ausgeführt. Diese Konzentration kann abhängig von dem eingesetzten Hefestamm und der eingesetzten Hefespezies angepasst werden.
Für eukaryotische Zellen, wie beispielsweise die LTK^–-Zellen (von der Maus), kann das Kulturmedium ein Dulbecco-Medium sein, welches durch 10% Serum von neugeborenen Kälbern und durch ein fungizides Antibiotikum modifiziert worden ist.
Die rekombinanten Klone werden gemäß der von Delpeyroux, F., et al. im Journal of Virology (Dez. 1990, Band 64 (12): 6090–6100) beschriebenen Technik ausgewählt oder selektiert.
Zusammengefasst, werden die Zellen mit 10-mal mehr rekombinantem Plasmid als Vektor, welcher das Resistenzgen gegen das Antibiotikum G418 enthält, (Colbere – Garapin, F., et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1–14) cotransfiziert. Nach drei Wochen werden die gegen G418 resistenten Klone in ein Kulturmedium, welchem Cycloheximid in einer Konzentration von 1 bis 10 μg/ml hinzugesetzt worden ist, überführt.
Wenn der zelluläre Wirt S. cerevisiae ist, kann das Plasmid, welches die Nukleotidsequenz der Erfindung enthält, ein episomales Plasmid mit hoher Kopienzahl aus der Familie der YEp-Plasmide, beispielsweise das Plasmid 2 μ von S. cerevisiae oder das episomale Plasmid mit hoher Kopienzahl Ye 23/31 sein.
Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus den Beispielen und den Figuren, die folgen, hervor.
1: Klonierungsvektor, welcher das DNA-Fragment von K lactis von etwa 5,2 kb, welches Resistenz gegen Cycloheximid verursacht, enthält.
Es wurde eine genomische Bank des Stamms K. lactis 2359-152, welcher gegen mehrere mg/ml Cycloheximid resistent ist, konstruiert. Diese Bank wird in einem E. coli/S. cerevisiae-Shuttle-Vektor: pEMBL Ye 23 (Baldari et al., 1985, Gene 35: 27–32, 1) realisiert. Die chromosomale DNA von K. lactis wurde partiell durch das Enzym Sau3A verdaut, dann auf einem Sucrose-Gradienten fraktioniert. Die eine DNA mit einer Größe zwischen 4 und 9 kb enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und die DNA in den zuvor an der in dem Gen der β-Galactosidase gelegenen BamHI-Stelle geschnittenen und dephosphorylierten Vektor Ye 23 ligiert. Diese Ligationsmischung hat erlaubt, den Stamm E. coli XL1 zu transformieren, und die rekombinanten Transformanten wurden auf einem Medium, welches erlaubte, eine Insertion in das β-Galactosidasegen sichtbar zu machen, selektiert. Auf diese Weise wurden 23000 Klone von rekombinanten E. coli selektiert. Die Analyse der Plasmide von fünfzig Klonen durch Re striktion erlaubte es, die mittlere Größe des DNA-Inserts von K. lactis zu 5 kb abzuschätzen, was eine Wahrscheinlichkeit, ein spezielles Gen zu erhalten, von 99,5% ergibt.
E. coli-Stamm XL1 (von der Firma Stratagene entwickelter Stamm): endA1, hsdR17 (rk^–, mk⁺), supE44, thi^–, λ^–, recA1, gyrA96, relA1, Δ(lac), F', proAB, laciq ZΔM15, Tn10 (tet^r,
S. cerevisiae-Stamm OL1: α, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, ura3-251, ura3-273.
2: Sequenziertes Fragment der DNA von K. lactis, welche Resistenz gegen Cycloheximid verursacht (Sequenz II)
3: Restriktionskarte des DNA-Fragments von 5,2 kb von K lactis, das in die BamHI-Stelle des Vektors Ye 23 (C. Baldari et al., Gene (1985) 35:27) insertiert worden ist
Das sequenzierte SaII-PvuII-Fragment (2,8 kb) enthält das ribosomale Protein. Die verschiedenen Stellen befinden sich jeweils an den folgenden Positionen:
4: Resistenz gegen Cycloheximid verleihendes Protein, welches durch die DNA von K. lactis kodiert wird
BEISPIELE
I – Klonierung des DNA-Fragments von K lactis, welches die Resistenz gegen Cycloheximid verursacht
I.1) Konstruktion einer K. lactis-Bank in S cerevisiae
Es wurde eine genomische Bank des Stamms K. lactis 2359-152 (WESOLOWSKI et al., 1982, Curr. Genetics 5: 191–197), welcher gegen Konzentrationen von mehreren mg/ml Cycloheximid resistent war, konstruiert. Diese Bank wurde in einem E. coli/S. cerevisiae-Shuttle-Vektor: pEMBL Ye 23 (BALDARI et al., 1985, Gene 35: 27–32) realisiert (1). Die chromosomale DNA von K. lactis wurde partiell durch das Enzym Sau3A verdaut, dann auf einem Sucrose-Gradienten fraktioniert. Die eine DNA mit einer Größe zwischen 4 und 9 kb enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und in den zuvor an der in dem β-Galactosidasegen gelegenen BamHI-Stelle geschnittenen und dephosphorylierten Vektor Ye 23 ligiert. Diese Ligationsmischung hat erlaubt, den E. coli-Stamm XL1 (BULLOCK et al., 1987, Biotechniques 5, 376–379) zu transformieren, und die rekombinanten Transformanten wurden auf einem Medium, welches es erlaubte, eine Insertion in das Gen der β-Galactosidase sichtbar zu machen, selektiert. Es wurden 23000 Klone von rekombinanten E. coli selektiert. Die Analyse der Plasmide von fünfzig Klonen durch Restriktion hat erlaubt, die mittlere Größe des DNA-Inserts von K. lactis auf 5,2 kb abzuschätzen, was eine Wahrscheinlichkeit, ein spezielles Gen zu erhalten, von 99,5% ergibt.
I.2) Transformation von S. cerevisiae und Gewinnung von gegen Cycloheximid resistenten Zellen
Der Stanzen OL1 von S. cerevisiae (BOY-MARCOTTE et al., 1982, Gene 20: 433–440), welcher gegenüber Konzentrationen unter 1 μg/ml Cycloheximid empfindlich ist, wurde mit aus der Bank extrahierter DNA transformiert. Zunächst wurden die Transformanten auf Uracil-Prototrophie gescreent, was es erlaubte, die gesamte Menge von Transformanten auszuwerten. Als nächstes haben wir diese Transformanten auf ein Medium, welches Cycloheximid in zwei Konzentrationen: 10 bzw. 100 μg/ml, enthielt, durch Replikation überführt. Es wurden 35000 URA+-Transformanten erhalten, von denen 7 gegen Konzentrationen über 100 μg/ml Cycloheximid resistent sind. Nach der Analyse erweist sich, das unter den 7 übrigbleibenden Klonen 6 die von K. lactis stammende DNA in ihr Genom integriert haben. Bei der siebten Transformante war der Resistenzcharakter indessen auf dem Plasmid Ye 23/31, welches von dem Vektor pEMBLYe23 abgeleitet worden war, verblieben. Diese Transformante ist gegenüber sehr hohen Cycloheximid-Konzentrationen, welche 1 mg/ml überschreiten, resistent. Das DNA-Fragment, welches die Resistenz gegen Cycloheximid verursacht, ist ungefähr 5,2 kb.
Andererseits bleibt bei den Transformanten, die das DNA-Fragment von K. lactis in ihr Genom integriert haben, das Resistenzphänomen bei einem diploiden Heterozygoten für diesen Marker erhalten. Der „Cycloheximid-resistente" Charakter ist folglich dominant.
I.3) Für die Resistenz gegen Cycloheximid verantwortliches Protein
Die Gesamtheit dieses Fragments wurde in pBluescript-Phagemidvektoren (Stratagene) insertiert. Es wurden mit Hilfe des Enzympaars ExoIII/S1 verschiedene gerichtete Deletionen ausgeführt. Die Sequenzierung der einzelsträngigen DNA erfolgte mit Hilfe der Sanger-Technik unter Verwendung von universellen Primern oder von Primern, welche im Labor ausgehend von der Sequenz selbst synthetisiert worden waren.
Ein Fragment der so erhaltenen Sequenz ist in 2 gezeigt. Sie enthält insbesondere ein offenes Leseraster ORF A.
ORF A-Region:
Diese Leseraster-Region ist 320 bp lang (2) und sie weist ein Intron von 590 bp auf. Dieses Intron befindet sich am 5'-Ende des Gens, nach der ersten Base nach dem ATG. Das durch das Exon kodierte Protein umfasst 150 Aminosäuren (4). Die Homologierecherche mit Hilfe der EMBL- und GENEBANK-Datenbanken zeigt, dass das ORF A auf der Ebene der Aminosäuren zu 75% zu dem ribosomalen Protein L36a der Ratte (GALLAGHER et al., 1988, DNA 7: 269–273) homolog ist und zu 74% homolog ist zu einem menschlichen ribosomalen Protein (DAVIES et al., 1986, Gene 45: 183–191), das seinerseits homolog ist zu dem ribosomalen Protein rp44 (auch bezeichnet als L41) von S. cerevisiae (ITOH, 1978, FEBS Lett. 96: 399–402).
Diese Sequenz ist ausreichend, um ein erhöhtes Resistenzniveau gegenüber Cycloheximid hervorzurufen; indessen ist dieses Niveau niedriger als jenes, das bei den Transformanten, welche das anfängliche Fragment von 5,2 kb aufweisen, beobachtet wird.
I.4) Expression des Leserasters A:
Um zu bestimmen, in welchem Maße das sogenannte Resistenzprotein für das Phänomen der Resistenz gegen Cycloheximid verantwortlich ist, wurde der gleiche Stamm von S. cerevisiae unter den gleichen Bedingungen mit einem Vektor, welcher einzig das ORF A enthielt, transformiert. Die Transformanten, die das ORF A aufweisen, sind gegen Cycloheximid resistent. Indessen ist das beobachtete Resistenzniveau (100 μg/ml) etwa 10-mal niedriger als jenes, welches beobachtet wird, wenn ORF A mit der Kofaktor-DNA, welche in dem vollständigen Fragment von 5,2 kb enthalten ist, assoziiert ist (1000 μg/ml). Im Gegenzug bringt die Deletion der ORF A-Sequenz die Aufhebung der Resistenz mit sich.
Schlussfolgerungen:
Es wurde ein für das Phänomen der Resistenz gegen Cycloheximid verantwortliches Gen auf einem DNA-Fragment von K. lactis isoliert. Dieses System umfasst ein ribosomales Protein (ORF A), welches sehr stark analog zu den ribosomalen Proteinen L36a vom Menschen und von der Ratte sowie dem rp44 (oder L41) von S. cerevisiae ist. Dieses Protein ist erforderlich, um das Resistenzphänomen hervorzurufen, aber nicht ausreichend, um eine vollständige Resistenz gegenüber dem Antibiotikum zu erhalten. Es ist die Anwesenheit eines auf dem klonierten Fragment von 5,2 kb von K. lactis lokalisierten Kofaktors erforderlich, um eine Resistenz in einer Höhe von etwa 1 mg/ml bei K. lactis zu erhalten.

Claims

Nukleinsäuresequenz von K. lactis von etwa 5,2 kb, die fähig ist, bei K. lactis oder bei S. cerevisiae eine Resistenz gegen Cycloheximid in einer Konzentration höher als 1 mg/ml zu verleihen und die Restriktionsstellen umfasst: Sau3A: 0, StuI: +300 bp, PvuII : +600 bp, BgIII: +900 bp, BstXI: +1200 bp, PvuII: +2300 bp, PstI: +2400 bp, PstI: +3000 bp, EcoRI: +3200 bp, HindIII: +3300 bp, EcoRI: +3700 bp, HindIII: +4500 bp, HindIII: +4540 bp, SalI: +5100 bp.
Nukleinsäuresequenz von etwa 5,2 kb nach Anspruch 1, die die folgende Nukleotidverknüpfung I umfasst: Sequenz I
oder mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung I unter Bedingungen hoher Stringenz (0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C) hybridisiert, und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen Cycloheximid in einer Konzentration höher als 100 μg/ml zu verleihen, vorzugsweise höher als 1 mg/ml.
Nukleinsäuresequenz von etwa 5,2 kb nach Anspruch 1 oder 2, die die folgende Nukleotidverknüpfung II umfasst:

oder mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung II unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen eine Konzentration von Cycloheximid höher als 100 μg/ml, vorzugsweise höher als 1 mg/ml, zu verleihen. 5
Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 2, die die Nukleotidsequenz umfasst, die zwischen den Positionen 9 und 2763 der folgenden Verknüpfung II liegt:

oder eine Sequenz, die mit der komplementären Sequenz der Verknüpfung II unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert und fähig ist, bei K. lactis eine Resistenz gegen eine Konzentration von Cycloheximid höher als 100 μg/ml, vorzugsweise höher als 1 mg/ml, zu verleihen.
Nukleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgehend von dem Stamm E. coli DHSa erhalten ist, der mit dem Plasmid Ye 23/31 transformiert wurde, das bei der CNCM am 2. Juli 1991 unter der Nummer I-1121 hinterlegt wurde.
Nukleotidsequenz, dadurch gekennzeichnet, dass sie die ganze oder einen Teil der folgenden Sequenz II enthält:

oder dass sie aus der Sequenz II besteht, oder dass sie unter Bedingungen hoher Stringenz mit der komplementären Sequenz zu II hybridisiert, wobei die so gebildete Nukleotidsequenz wenigstens eine der folgenden Eigenschaften besitzt: – sie kodiert für ein Resistenzprotein gegen Cycloheximid und/oder – sie kodiert für eine Aminosäureverknüpfung, die geeignet ist, von Antikörpern erkannt zu werden, die gegen das Resistenzprotein gegen Cycloheximid mit der folgenden Sequenz A gerichtet sind: SEQUENZ A:
und/oder – sie reguliert die Expression der für ein Protein nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 kodierenden Sequenz in Kluyveromyces lactis.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleotidverknüpfung ORF A enthält, die die Nukleotide 1 bis 1560 der in der 2 dargestellten Verknüpfung umfasst, oder dadurch, dass sie mit der komplementären Sequenz zu ORF A unter stringenten Bedingungen hybridisiert.
Nukleotidsequenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende kodierende Sequenz I von ORF A enthält: Sequenz I
Nukleotidsequenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Nukleotidverknüpfung III enthält, die die Nukleotide 1 bis 628 der in der 2 dargestellten Verknüpfung oder die in der besagten Nukleotidverknüpfung III enthaltene Promotorregion der Transkription der Sequenz ORF A umfasst.
Kofaktor, der geeignet ist, die Resistenz gegen Cycloheximid zu erhöhen, die von einem Protein verliehen wird, das von einer Nukleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 7 oder 8 kodiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Nukleinsäuresequenz enthalten ist, die zwischen den Nukleotiden 1561 bis 2740 der Verknüpfung enthalten ist, die in 2 dargestellt ist, wobei er es erlaubt, bei einem eukaryontischen Wirt, der mittels Einfügens dieser Nukleinsäuresequenz und der für ein Resistenzprotein kodierenden Nukleotidsequenz verändert ist, unter Bedingungen, die die Produktion dieser Proteine erlauben, eine Höhe der Resistenz gegen Cycloheximid höher als 100 μg/ml zu erreichen.
Resistenzprotein gegen Cycloheximid, dadaurch gekennzeichnet, dass es aus der folgenden Aminosäureverknüpfung A besteht: SEQUENZ A:
oder dass es die gesamte oder einen Teil dieser gegebenenfalls veränderten Verknüpfung A umfasst, wobei das gebildete Protein einem rekombinanten eukaryontischen Wirt, der mit der für dieses Protein kodierenden Nukleotidsequenz transformiert wurde, unter Bedingungen, die seine Produktion erlauben, eine Resistenz gegen eine Konzentration höher oder gleich 100 μg/ml Cycloheximid verleiht.
Resistenzprotein gegen Cycloheximid, dadurch gekennzeichnet, dass es von der folgenden Nukleotidsequenz I kodiert ist: Sequenz I
von einem Teil der Sequenz I oder von einer im Vergleich zu I veränderten Sequenz, wobei das von diesem Teil der Sequenz oder von dieser veränderten Sequenz kodierte Protein, wenn es in einen eukaryontischen Wirt eingeführt wird, unter Bedingungen, die seine Expression erlauben, fähig ist, eine Resistenz gegen eine Konzentration höher oder gleich 100 μg/ml Cycloheximid zu verleihen.
Protein, das von einer Nukleinssäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 kodiert ist, wie sie ausgehend von Kluyveromyces lactis erhalten wird.
Rekombinanter Vektor, insbesondere für die Klonierung und/oder die Expression, insbesondere vom Plasmid-Typ, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens eine Nukleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 umfasst, die sich unter der Kontrolle von Regulationselementen befindet, die erforderlich für ihre Expression in einem ausgewählten eukaryontischen Wirt sind, wobei diese Regulationselemente einen gegebenenfalls induzierbaren Promotor und eine Transkriptionstemlinationssequenz umfassen.
Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Vektor, der an die Expression in solchen Hefen wie Pichia pastoris angepasst ist oder um einen an die Expression in einer tierischen Zelle angepassten Vektor handelt, beispielsweise das Baculovirus, oder um einen an die Expression in einer pflanzlichen Zelle angepassten Vektor.
Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass er außerdem eine bestimmte Nukleinsäure enthält, deren Expression in einem ausgewählten eukaryontischen Wirt man untersucht, wobei diese Nukleinsäure sich unter der Kontrolle von für ihre Expression in dem Wirt erforderlichen Regulationselementen befindet.
Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure sich unter der Kontrolle von Regulationselementen befindet, die die Transkription der Nukleotidsequenzen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 kontrollieren.
Eukaryontische Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17 transformiert ist und insbesondere dadurch, dass es sich um eine Hefezelle handelt, beispielsweise Pichia pastoris, um eine tierische Zelle, beispielsweise um eine Insektenzelle oder um eine Säugetier-, insbesondere eine Mäuse- oder Affenzelle, um eine menschliche Zelle oder auch eine pflanzliche Zelle.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass er in dem Stamm E. coli DHSa enthalten ist, der bei der CNCM am 2. Juli 1991 unter der Nummer I-1121 hinterlegt wurde.
Verwendung eines Vektors nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 17 in einem Selektionssystem, das in spezifischer Weise auf einen Marker vom Typ Cycloheximid reagiert, in einem eukaryontischen Wirt, insbesondere, um bei diesem Wirt die Aufnahme einer bestimmten heterologen Nukleinsäure zu kontrollieren.
Verfahren zur Kontrolle des Vorhandenseins einer heterologen Nukleinsäure in einem zellulären Wirt, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: – die Transformation des zellulären Wirts mit einem Expressionsvektor, der in Stellen, die nicht essentiell für seine Replikation sind, die heterologe Nukleinsäure umfasst, eine Nukleotidsequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, unter der Kontrolle der erforderlichen Regulationselemente für die Expression dieser Sequenzen in dem ausgewählten zellulären Wirt, – die Kultivierung des so transformierten zellulären Wirts, – das Inkontaktbringen des Wirts mit einer bestimmten Cycloheximidkonzentration und den Nachweis der Resistenz des Wirts gegenüber diesem Antibiotikum.