FI120358B

FI120358B - Eristettyjä nukleotidisekvenssejä ja sykloheksimidiresistenssejä proteiineja

Info

Publication number: FI120358B
Application number: FI940036A
Authority: FI
Inventors: Pierre Dehoux; Julian Davies
Original assignee: Pasteur Institut
Priority date: 1991-07-15
Filing date: 1994-01-04
Publication date: 2009-09-30
Also published as: AU669483B2; AU2387892A; US5641674A; FR2679253B1; ATE255638T1; EP0594771B1; EP0594771A1; JPH06509229A; DE69233263D1; US5958687A; DE69233263T2; DK0594771T3; FR2679253A1; US5830997A; FI940036A0; WO1993002201A1; ES2211859T3; FI940036A

Description

ERISTETTYJÄ NUKLEOTIDISEKVENSSEJÄ JA SYKLOHEKSIMIDI-RESISTENSSEJÄ PROTEIINEJA

Keksintö liittyy eristettyihin nukleotidise-5 kvensseihin, jotka kykenevät aiheuttamaan resistenssin sykloheksimidille, sykloheksimidiresistenssiproteiinei-hin sekä niiden käyttöön valintamarkkereina, esim. nukleiinihapon siirron (transfer) toteamiseksi.

Keksijät ovat keskittäneet tutkimuksensa valin-10 tamarkkereiden saamiseen, jotka valintamarkkerit soveltuvat eukaryooteissa tapahtuvan nukleiinihapposiirron toteamiseen ja jotka ovat tehokkaampia kuin yleisesti käytetyt markkerit, jotka on saatu prokaryoottisista organismeista. Tiedetään esimerkiksi, että tavallisesti 15 käytetyt markkerit (genetisiini G-418, hygromysiini ja bleomysiini) on saatu resistenssigeeneistä, jotka on eristetty prokaryooteista, ja ne ovat yleensä melko tehottomia, erityisesti sienissä. Mainituista ongelmista johtuen tutkijoiden on täytynyt käyttää erittäin korkei-20 ta antibioottipitoisuuksia, mikä tuo mukanaan tok-sisuusongelmia ja lisää valmistuskustannuksia. Tästä syystä on käytetty muita valinta-aineita. Valikointi on esim. suoritettu metotekstraattiin, auksotrofiaan, jne. perustuen. Näitä valinta-aineita ei kuitenkaan voida 25 käyttää yleisesti. Siten esiintyy tarvetta kehittää järjestelmiä, joissa voidaan käyttää tehokkaampia ja/tai voimakkaampia markkereita kuin tähän mennessä tunnetut markkerit ja joilla saavutetaan alhaisemmat valmistuskustannukset .

30 Sykloheksimidi voisi toimia potentiaalisesti käyttökelpoisena markkerina, jolla voidaan todeta esim. heterologisen nukleiinihapon siirto eukarioottiin. Tätä käyttötarkoitusta varten eukaryoottien, jotka halutaan modifioida kontrolloidusti käyttäen testiä, jolla tode-35 taan resistenttisyys sykloheksimidille, täytyy olla resistenttejä tälle antibiootille tyydyttävissä olosuhteissa heterologisen nukeleiinihapon siirron toteamisek- 2 si luotettavasti. Siirto voi olla tehty joko tutkimustarkoitusta tai teollista tarkoitusta varten.

Sykloheksimidi on antibiootti, joka estää proteiinisynteesiä sitomalla 60S ribosomaalista alayksik-5 köä, kuten on kuvattu julkaisussa Stocklein et ai. (1980, Curr. Genetics 1, 177-183).

Eukaryoottisia organismeja, jotka olisivat luonnostaan resistenttejä sykloheksimidille, on vähän; tähän mennessä resistenssimekansimiin liittyviä havain-10 toja on kuvattu luonnostaan sykloheksimidille herkän organismin mutantin yhteydessä, joka mutantti on Saccha-romyces cerevisiae hiivan cyh2 mutantti. Tässä yhteydessä resistenssi-ilmiö on aikaansaatu modifioimalla ribosomaalista proteiinia L29 (Stocklein et ai., 1980).

15 Nämä mutanttisellulaaariorganismit ovat taval lisesti resistenttejä alhaisille sykloheksimidipitoi-suuksille (luokkaa 5-10 μρ/ιηΐ) .

Eräät toiset asiantuntijat (Takagi et ai, patenttijulkaisu US 4 857 460) ovat raportoineet tuloksis-20 ta, jotka on saatu tutkimuksista, joissa on tutkittu toisen hiivan, Candida maltosa, resistenttisyyttä sykloheksimidille. He tuovat esiin DNA sekvenssin, joka aiheuttaa resistenssin C. maltosalle sykoheksimidiä vastaan. Tästä sekvenssistä ei oltu kuitenkaan identifioitu gee-25 niä eikä avointa lukuraamia (open reading frame). Toisin sanoin, julkaisussa US 4 857 460 ei ole esitetty ele menttejä, joilla geeni voidaan karakterisoida, eikä elementtejä, joiden perusteella pystytään määrittämään sen käyttöolosuhteet, esim. transformoimaan toisinnetta-30 vasti Candida maltosasta poikkeavia eukaryootteja kannoiksi, jotka ovat resistenttejä sykloheksimidille.

Keksijät ovat tutkineet Kluyveromyces lactis (K. lactis) hiivaa ja osoittaneet, että sykloheksimidi-resistenssi K.lactisissa riippuu spesifisen geenin il-35 mentymisestä. He ovat myös havainneet, että tämän hiivan resistenssitaso ko. antibiootille on yhteydessä toisiin elementteihin, jotka ovat yhteydessä spesifisen DNA:n 3 esiintymisen kanssa, jolla DNA:11a on kofaktorin osa (tai kofaktorisekvenssi).

Keksinnön erään edullisen sovellutuksen mukaan saatu resistenssi on spesifinen sykloheksimidille, 5 transformoidut isännät, jotka ovat resistettejä tälle antibiootille (cycR) , ovat herkkiä useille klassisille ribosomaalisten toimintojen estäjille (kryptopleurin, blastisidiini, trichodermiini, anisomysiini, hygromysii-ni) .

10 Siten keksijät löysivät K. lactisista n. 5.2 kb nukleiinihapposekvenssin, joka kykenee aiheuttamaan tällä sekvenssillä transformoidulle isäntäsolulle resis-tenssitason, joka on riittävän korkea valikointijärjes-telmän aikaansaamiseksi, joka perustuu resistenssiin 15 tälle antibiootille. Tämä resistenssi ilmentyy syklohek-simidipitoisuudessa yli 1 mg/ml.

Tästä nukleiinihapposekvenssistä keksijät ovat identifioineet ja karakterisoineet spesifisen geenin, joka koodaa proteiinia, jonka läsnäolo on osoittautunut 20 välttämättömäksi resistenssi-ilmiön indusoimiseksi K.

lactisissa.

Tämä spesifinen geeni koodaa ribosomaalista proteiinia, joka aikaansaa resistenssin sykloheksimidi-pitoisuudelle n. 100 μρ/ιηΐ. K-lactisissa täydellisen 25 resistenssin saavuttamiseksi ko. antibioottia vastaan tarvitaan tämän resistenssin indusoivan sekvenssin läsnäolon lisäksi myös eräiden muiden DNA elementtien läsnäolo, jotka DNA elementit sisältyvät keksijöiden määrittämään ja myöhemmin kuvattavaan 5.2 kb nukleiinihap-30 posekvenssiin. Näillä lisäelementeillä on kofaktoreiden osa.

Siten esillä olevan keksinnön kohteena on nuk-leotidihapposekvenssejä sekä proteiini, jotka kykenevät aiheuttamaan sykloheksimidiresistenssin eukaryootti-35 isäntäsolulle, joka on luonnostaan herkkä tälle antibi ootille tai resistentti tämän antibiootin alhaiselle pitoisuudelle (käytetään myös nimitystä, alhaiselle 4 tasolle resistentti organismi, low-level resistant organism) . Tästä ensimmäisestä proteiinityypistä käytetään myöhemmin ilmaisua "resistenssiproteiini".

Keksinnön kohteena on myös nukleiinihappose-5 kvenssi, joka sisältää geenin, joka koodaa edellä kuvattua resistenttiä proteiinia K.lactisissa, sekä sekvenssejä, jotka määräävät kofaktoreiden läsnäolon, joilla kofaktoreilla on osuutta edellä mainitun proteiinin aiheuttamaan resistenssitasoon.

10 Geeni koodaa resistenssiproteiinia ja erillisiä nukleiinihapposekvenssejä, jotka määräävät kofaktoreiden läsnäolon.

Keksinnön kohteena on edelleen kloonaus- ja/tai ilmentymisvektoreita näitä nukleotidisekvenssejä varten 15 sekä eukaryootti-isäntäsoluja, jotka on transformoitu näillä vektoreilla.

Keksinnön mukainen ensimmäinen proteiini, tai sykloheksimidiresistenssiproteiini, on proteiini, jonka läsnäolo on välttämätön ja riittävä aiheuttamaan syklo-20 heksimidiresitenssin isäntäsolulle, joka on sille luon nostaan herkkä. Sille on tunnusomaista, että se vastaa seuraavaa aminohapposekvenssiä A tai se sisältää kokonaan tai osaksi sekvenssin A, ja se voi olla mahdollisesti modifioitu, siten, että näin tuotettu proteiini 25 aiheuttaa sykloheksimidiresistenssin rekombinanttieuka- ryootti-isännälle, joka on transformoitu nukleotidise-kvenssillä, joka koodaa tätä proteiinia sen tuoton mahdollistavissa olosuhteissa.

SEK^KtiSSI A

5 M «Ϊ «* ** f -*H| >* >* i?

j— *»4 ·—I

M» >. η μ c

«Η Λ H

'e* x 4J ^ S* 5 S X £ S * a - oi * ® 2. 5, g· « 3 u -<

o. CJ &4 J3H

J2 5L β> -π 2* e* 01 O' s, s >* i xi ,3 <h e o» >. M M « >·

„2" n jC >. *H

*5, S 5 o o» 5L .3 «5 «Ξ o i? « o» o· ^ 2, * ^ * a-* -* 1/1 o' »-* «£ ^ »s, M "·* > »7 <7 i; I; »» >» *-* *-« *Λ —4·-« 2 ί n £ ^ S' o* «-* O'** * m O.

u * ® 2 3 #- »-4 jC * "2 £ « Q. -* Ό » ·* i* « >.

-4 O' s* *"* cr» »-» w Ίί 2 ΕΓ >* * 5 g a *j « > u n c c *» 2< £ χ; cp o* ·-» * °

Ot m « Γ 2 % >· 5 5 5 5 o.

O -* O' £ 2 w M (8 Μ Λ > *6 *J -4 O' « 0. * « =}

Si?5f«“ = » Si S, S J5 S ΐ ϊ * " C O' .5 S 5 a*·» «ο ό ®oo o* *-· O' _ ^ o* « *-« £ £ 2* χν£> 10 r-t —* —* Ol O' 6 Tämän proteiinin kykyä aiheuttaa sykloheksimi-diresistenssi voidaan arvioida sen tuotosta spesifisessä eukaryootti-isännässä, joka on luonnostaan herkkä syklo-heksimidille isännän luonteen funktiona määritettyä 5 kynnyspitoisuutta korkeammissa pitoisuuksissa, ja sen aiheuttamasta resistenssin muodostumisesta isännässä pitoisuudessa, joka on n. 5-15 kertaa suurempi, ja edullisesti n. 10 kertaa suurempi, kuin sykloheksimidi-pitoisuus, joka aikaansaa luonnostaan tämän isännän 10 herkistymisen.

Hiivoissa, erityisesti S.cerevisiaessa, tämä resistenssitason lisäys on n. 10-kertainen, jopa 100-kertainen - 1000-kertainen kuin villeillä kannoilla havaittu taso.

15 Esimerkkeinä annetaan eri organismien syklohek- simidille luontaisen herkkyysasteen suuruusluokista: Hiivat, S. cerevisiae: 1 μρΛηΙ Korkeammat eukaryoottiset solut: 1 μρ/ιηΐ Tupakkakasvit: 10 μ9/ιη1.

20 Yleisesti, tietyn organismin luontainen herk kyys spesifiselle organismille ilmentyy heti, kun syklo-heksimidin läsnäolo viljelmäväliaineessa estää organismin kasvua ja monistumista.

Kun tässä tekstissä viitataan sykloheksimidille 25 herkkään isäntään, tällä viitataan mihin tahansa euka-ryoottiseen organismiin, joka täyttää edellä esitetyn määritelmän sykloheksimidin suhteen.

Keksinnön mukainen sykloheksimidiresistenssi-proteiini voidaan karakterisoida myös siten, että sen 30 koodi sisältyy seuraavaan nukleotidisekvenssiin I, sitä koodaa osa sekvenssiä I tai modifioitu sekvenssi I edellyttäen, että osasekvenssin tai tällaisen modifioidun sekvenssin koodaama proteiini kykenee aiheuttamaan resistenssin sykloheksimidipitoisuudelle ainakin 100 35 μg/ml, kun sekvenssi on viety eukaryootti-isäntään, esim. Saccharomyces cerevisiae hiivaan, olosuhteissa, jotka mahdollistavat sen ilmentymisen.

7

Sekvenssi I

AT GGTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAAGGCTTCC TTGTACGCTC AAGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTGGTTTCGG TGGTCAAACC AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTGAG ATTGGAATGT ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTG G CT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT GGTGAAAAGA AGCAAAAGGG TCAAGCTTTG CAATTCTGA

5 Keksinnön kohteena on myös nukleiinihappose- kvenssi, joka sisältää K. lactisissa sykloheksimidi-resistenssiproteiinia koodaavan sekvenssin ja jolle on tunnusomaista, että se täyttää jonkin seuraavista määritelmistä : 10 (a) se on K. lactisin n. 5.2 kb nukleiinihap-posekvenssi, joka kykenee aiheuttamaan K.lactisissa tai S. cerevisiaessa sykloheksimidiresistenssin konsentraa-tiolle yli 1 mg/ml ja sisältää kuvassa 3 määritellyt 15 restriktiokohdat. Kohdat sijaitsevat seuraavissa paikoissa :

Sau3A: 0, Stul: +300 bp, PvuII: +600 bp, BglUI: +900 bp, BstXI: +1200 bp, PvuII: +2300, PstI: +2400 bp, PstI: +3000 bp, EcoRI: +3200 bp, Hindlll: +3300 bp, EcoRI: 20 +3700 bp, Hindlll: +4500 bp, Hindlll: +4540 bp, Sali: +5100 bp; (b) se on n. 5.2 kb nukleiinihapposekvenssi, joka sisältää nukleotidisekvenssin I tai hybridoituu sekvenssille I komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin 25 ankarissa olosuhteissa (conditions of high stringency) (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, lämpötila 65°C) ja kykenee aiheuttamaan K.lactisissa resistenssin sykloheksimidipitoi-suudelle yli 100 μρ/ιηΐ, edullisesti yli 1 mg/ml; (c) se on n. 5.2 kb nukleiinihapposekvenssi, 30 jolla on seuraava nukleotidisekvenssi II tai joka hybri- disoituu sekvenssin kanssa, joka on komplementaarinen 8 sekvenssille II, hyvin ankarissa olosuhteissa, ja kykenee aiheuttamaan K.lactisissa resistenssin sykloheksimi-dipitoisuudelle yli 100 μ9/ιη1, ja edullisesti yli 1 mg/ml; 5 (d) se on nukleiinihapposekvenssi, joka sisäl tää nukleotidisekvenssin, joka sijaitsee sekvenssin II paikkojen 9 ja 2763 välissä, tai sekvenssin, joka hybri-doituu sekvenssille II komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa, ja kykenee aiheut-10 tamaan K. lactisissa resistenssin sykloheksimidipitoi-suudelle yli 100 μρ/ιηΐ, ja edullisesti yli 1 mg/ml. Kun jonkin edellä esitetyistä määrittelyistä täyttävä nukleiinihapposekvenssi viedään hiivaan, kuten S.cerevisiae, se aiheuttaa tälle hiivalle resistenssin sykloheksimidi-15 pitoisuutta yli 100 μg/ml vastaan ilmentymisen tapahtuessa edullisesti sykloheksimidipitoisuudessa yli 1 mg/ml.

SEKVENSSI II: 9 ooooooooo

rt«rteO©O©OOO©OOOrvaD*rOV0csCB«rO

_ , , MfuiintfUtJtJiCtfClUCJÄUi H? H U U H H

gaEyeBSssasccasBBgaKetsgs _aHa8§§Bssasayggs^sbagasg^

rtiiOoBBoHHHlcOOHE-iHHÄUI-iUHHÄ; U

ΛίίΙπη^υυΗ<ϋΗ<<ΟΒ(5ϋΗΗϋ^^υΰϋ tEfc52’*roMt5«sioH<C50£“#HHH<2<<C3E_<i"''C| _^u<uuu5u5§<<<h^<houuohho ^Hnnu£uu<u<3<<H2ouHu2<uc< ^ίΐΗΗΗο©ΟΟΗΟΟ<ΟΟΗΛΗΛυ<ΟΗυΗ ÄHHUUUe^«H<«H-C<00©2H0<UH0 Λ-»·ίίΐι-ι{ΊΜ©06-ιΟΗ<<Ηαθ<<<<ϋ<<^ΗΟΗ 2ηΝϋΗΰΗϋ<<0(5ϋΗΗΗ2ϋϋ<ϋϋ<<ϋ< £s£s££§ö£i:sBssg8t;?;ssags:§a -llsiysssBsssssigasgöaösii

t2<lHOHOO<UOHHO<HOO<H<HHOO

uu<uhooh2<8ohhhoou<hoou<h η£Η5ΕΕ28υ<<ίΗ<ϋ<υϋΗ<Ηΰ<ϋ«:ϋ atsssotiuHasasHboiioSgaaasas -E§§8BE§S§S8gsssBs3s£sasi£ 6S§§8828cS§B38B8B3Sgesa8§ 8SJShh8Shhhohh<ooo<o<<u2<u Ε2^2ΒΗΗΗΗϋ<Ηυ<Ηί8ϋϋ^<ϋ<5^ om£ä©Su8^h-<h*<<©2hoooe-i<5<<

SgSS§lS§BaB8BSsSSgagB8gSs sgassasBBSSsasEBKtsssBsssa ^«m2h^<ooh<<2hh<uäS6-.<h<oo 3ho<ouuh<ouuu<<hhwu<2o2h< OOOHO<aöHOO<HO<OOH<ggHOOH< ^SE888£h£«<«hhhhSSo5£hS8oho ί?π£(?μυ»ίδ<υ<<2<Η<υ<<ϋ<ϋυ2υ fSHhEHh<UHHHSR0C<Kil5<H<<<0 SSiuuoiHMuSHgSpuieiJgggg BSgBSSBGgaSgBaSgöBBggjggjg ίΝβϊοΐΝΟΟνΟ'βΜβΊ'Ο'βΝβνΟ'βΛβν “22Nπmv“^ftvo^β^^βmσ^00r^f^ι(Nnn-^ SEKVENSSI II (jatk.) 10 e-srt£!DC30000 0'C3000000000000rsi

J£SSrie®»e*O^^HrMfMfn^pvinin«>r>-r-CD0D

HHHrtrtHHHNMtMMC\NNNNNNiN(Nf\N

huh<hhu<huuoo<o<opp<ou o !2fcdr><<<U0UUHU0H0U<H<0<H ® ?3ir^<HUOOHOOOO<HUO<<<U<0 0<H<HUU<U<H<OHU<UUUp<U ^HOOH<HUHUHOO<UUOHpUOU

^ 8 ϋ H H < < U ί U < < ϋ U S U H U H U ϋ c<^<hl><o<ucu<<huuho<ä<u .n f 1 f ) t£_ t£_ «tf 2 O O E-1 < < O<<O<O<O<<

0<<OUHU<0<OHO<0<OOUOOO

J_ ri r, )£i£tfUiiHHt3HUU<0<<UHUU O

HHUUHOOOHUUOHHHU<HU<Up m

HHH0U<H<H<HH<O<H<5H!i«^H

H<0<OHH<OHHOH<UUU<ppr-<p υίΗυοδΗ2ϋυΗϋΗ<ϋ<ϋϋ{ί<υϋ __ iu<HU<HUis<ouHyyyuu<<<u

r, g** t* < H<<<<<<P

f_HHHU<<H<<oo<pouo<uo<< 2hH<<<0H<00<U0UU<UH<U0

iiiUOUHHHUHHUHiiUUOHU'it-'i O

<H<HO<HH<<<H<UUU<05U<H V

t9OH<<HH0<<U<<0HU0O5f"'PP

H<<HH<HHU3<OHH<U5<<OHH

tJ<H00<0HH0<0<0<H<UppHH

hhO<UHHUOH<<<<U<UH5^^P — h<h<oo<<ohu<hohuho<<h< <ΗΗΗ<ϋΗ<<<ϋϋ<ϋ<<<<^^

tC oHUH<<<UHO<OOHHUp5PyP

UH<H<H<UH<<<O<<O<H<<<<

OHUH<H<HHOUUOUHHHUUUOU O HHH<OO<<HO<<HUOHOOOOHU H

MOH0<<U0H00<<<<00<pUU< U<UO<OHU<OOOUH<pHpOH<0 0<H<UHOHUO<HHHOO<p<ppp §SSSSiSS<i<u<o<uuuuuH<c <HH<HHHUOHHHO<HH<HOp<p

Bi5E?5u<ÖHhH2S<<HOUL)<UO

R£uhShhShSSSBuhhhuSS<uhS

o<HOHHH<HHO<o5pouoppoo< <«c<H<U<UHOUUH<H<U5P52fHf!;f1 llieSi§|sasasöaös|sgggy-

Sggsssclsasösgigggggsgö gsKöassoSiöiSySSSoDössys C<<H<<HU05HH<HUH50<<HHH0 U<UHHUUHH<OH<<<U<<UU<5<»-' <O<HHO<HUUUOUO<HUUO<U<<

<UUU<OU<<OHHUHHHHH<p<pU

<H<UHU<H<UOU<<UHO<O<HHH OHUHHt3HHHHHUUH<<HH<<<<U ti »5 HHOH<HUHOUHHU<<HUU<PP 5HHU<UH<<UHÖUHgU<H<<H<< OHHHOUO<<<H<HOHHO<UO<UO

ovefNCDTOvefxCD^oveojiDerovDrxeD^e-o^iN

ihinWi'fir-CDO^o^OHHCNiNfnvvintnvPr-r-®

^r-l^-lr-tHi-tHHHtNiNiNCNCSfSiNrMCNOiiNfVfNtN

11

Keksinnön erään edullisen sovellutuksen mukaisesti edellä kohdissa (b) ja (c) määritellyt kaksi DNA sekvenssiä vastaavat lisäksi kuvassa 3 esitettyä re-striktiokarttaa.

5 Keksinnön erään toisen edullisen sovellutuksen mukaan edellä kuvattu nukleiinihapposekvenssi uutetaan E.coli kannasta DH5CC, joka on rekombinoitu plasmidilla Ye23/31 ja talletettu CNCM-laitokseen (Collection Na-tionale de Culture de Microorganismes), Pariisi, Ranska 10 2.7.1991 numerolla 1-1121.

Tässä yhteydessä "komplementaarinen sekvenssi" annetulle nukleiinihapposekvenssille sanotaan olevan käänteinen ja komplementaarinen sekvenssi annetulle sekvenssille. Termi "käänteinen" ottaa huomioon nukle-15 iinihapon 5' - 3' orientaation palauttamisen, joka on myös komplementaarinen annetulle emässekvenssille sen sisältämien nukelotidien luonteen mukaisesti.

5.2 kb nukleiinihapposekvenssi sisältää edellä kuvattua resistenssiproteiinia koodavan sekvenssin li-20 saksi DNA:ta, josta voidaan käyttää nimitystä "kofakto-ri" ja joka määrää sykloheksimidiresistenssin tason K.lactisissa ja tällä sekvenssillä transformoidussa isäntäsolussa. Tämä kofaktori DNA sisältyy sekvenssiin II.

25 Keksintö tuo siten esiin seuraavat DNA fragmen tit, jotka sisältyvät edellä kuvattuun 5.2 kb sekvenssiin : n. 2.3 kb BamHI(5') - PvuII (3') fragmentti n. 3 kb PvuII (5') - Sali (3') fragmentti.

30 Määrätyn tasoinen sykloheksimidiresistenssin tuotto annetussa isäntäsolussa voidaan saavuttaa transformoimalla tämä isäntä sykloheksimidiresistenssiprote-iinia koodaavalla nukleiinihapolla ja kofaktori DNA fragmentilla, joka on läsnä 5.2 kb sekvenssissä vierek-35 käisesti tai ei-vierekkäisesti edellä mainittuun nukleiinihappoon nähden. Tämän fragmentin viennillä isäntään on suora yhteys havaitun resistenssitason kanssa. Seu- 12 raavilla sivuilla kuvataan eräs sovellutus isäntäsolun transformoimisesta.

Resistenssiproteiini voidaan eristää suorittamalla K. lactis solujen lyysi teoksessa, "The Yeasts" 5 (toinen painos, A.H. Rose ja J.S. Harrison, voi. 4: 504 - 505), esitettyjen vaiheiden mukaisesti.

Puhdistus voidaan suorittaa myös affiniteetin avulla käyttämällä sekvenssi A:ta vastaan kohdistettuja vasta-aineita. Tässä tapauksessa tuotetaan ribosomaali-10 sen proteiinin yli-ilmentyminen, jonka jälkeen proteiini puhdistetaan polyakryyliamidigeelillä standardimenetelmien mukaisesti. Sekvenssi A proteiinia vastaava mole-kyylipainojuova poistetaan. Tämä juova on pääjuova, sillä se saadaan proteiinin yli-ilmentymisen tuloksena. 15 Sen annetaan reagoida vasta-aineiden kanssa, erityisesti edellä kuvattujen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka vasta-aineet on valmistettu standardimenetelmien mukaisesti.

Keksinnön kohteena on edelleen ORF A sekvenssi, 20 joka sisältää nukleiinihapon I, ORF A sisältyessä itse sekvenssin II nukleotidien paikkojen 1 ja 1560 väliin, jolloin ymmärretään, että sekvenssi, joka on nukleotidien 633 ja 1222 välissä vastaa intronia V. ORF A sekvenssi sisältää kaksi eksonia, joista toinen on muodostunut 25 nukleotideistä ATGG, jotka sijaitsevat nukleotidien 629 ja 632 välissä, toisen eksonin muodostuessa sekvenssistä, joka on nukleotidien 1223 ja 1539 välissä.

Nukleotidien 1 ja 1539 välissä oleva sekvenssi sisältää ORF A sekvenssin lisäksi promoottorin geeniä 30 varten.

Esillä olevan keksinnön piiriin kuuluvia muita erityisen edullisia nukleotidisekvenssejä ovat lisäksi seuraavat sekvenssit: - nukleotidisekvenssi ORF A sellaisenaan, tai mikä ta- 35 hansa nukleotidiketju, joka hybridisoituu ORF A:lie komplementaarisen sekvenssin kanssa seuraavissa olosuhteissa: 60°C, 2 x SSC, 5 x Denhart, 0.1 % SDS, 0.1 mg/ml 13 lohen sperman DNA, - ORF A nukleotidihapon sisältämä koodaava sekvenssi I (tai eksoni), joka koodaa resistenssiproteiinia Kluyve-romyces lactisissa ja on nukleotidien 629 ja 1539 välis- 5 sä, joka muodostaa kahden eksonin sekvenssin, joista toinen on nukleotidien 629 ja 632 välissä ja toinen nukleotidien 1223 ja 1539 välissä, - sekvenssi IV, joka käsittää nukleotidit 1561 ja 2740 ja joka vastaa ns. kofaktorisekvenssiä, joka sijaitsee 10 nukleotidien 1540 ja 2763 välissä ja kykenee lisäämään resistenssiproteiinin aiheuttamaa sykloheksimidiresis-tenssiä, - ORF A:n introni V, - nukleotidisekvenssi III, jota rajaa nukleotidit 1 ja 15 628, sekä erityisesti 8 ja 628, ja joka sisältää sääte- lyelementit ORF A ilmentymistä varten ja erityisesti promoottorialueen ORF A sekvenssin transkriptiota varten; tämä promoottori sisältää erityisesti ribosomeille tunnusomaisia proteiineja varten tarkoitettujen promoot-2 0 toreiden säätelyalueet, "UASRPG" tyyppiset alueet, kuten on kuvattu W.H. Magerin julkaisussa (Biochem. Biophys. Acta (1988) 94 9: 1-15). Nämä ns. ribosomaaliset proteiinit tuodaan niitä tuottavan solun tumaan, jossa ne kootaan ribosomeiksi, 25 - ns. kofaktorisekvenssi IV, joka on nukleotidien 1561 ja 2740 välissä ja joka kykenee lisäämään resitenssipro-teiinin aiheuttamaa resistenssiä sykloheksimidille.

Keksinnön kohteena on edelleen rekombinantti-vektorit erityisesti edellä karakterisoitujen proteiini-30 en kloonaamista ja/tai ilmentämistä varten.

Ilmentymisvektoreille on tunnusomaista, että niiden erääseen replikaation kannalta epäolennaiseen kohtaan on liittynyt nukleotidisekvenssi, joka valitaan joistakin edellä mainituista ja joka on sen ilmentämi-35 seen valitussa eukaryootti-isäntäsolussa tarvittavien säätelyelementtien kontrollin alaisena. Nämä säätelyele-mentit sisältävät edullisesti valinnaisesti indusoituvan 14 promoottorin ja transkription terminaatiosekvenssin.

Tällainen vektori voi sisältää nukleotidise-kvenssin, joka koodaa proteiinia, jota kutsutaan syklo-heksimidiresistenssiproteiiniksi, yksin tai yhdessä 5 kofaktorinukleotidisekvenssin kanssa, joka täyttää edellä esitetyn määritelmän.

Lisäksi, keksinnön kohteena on vektoreita, jotka vastaavat edellä esitettyjä määritelmiä ja joille on tunnusomaista, että ne sisältävät lisäksi spesifisen 10 heterologisen nukleiinihapon, esim. nukleiinihapon, joka koodaa teollisesti tai farmaseuttisesti hyödyllistä proteiinia, tämän nukleiinihapon ollessa sen isännässä ilmentämiseen tarvittavien säätelyelementtien kontrollin alaisena. Nämä säätelyelementit voivat olla mahdollises-15 ti fuusioitu sellaisten sekvenssien kanssa, jotka kontrolloivat sykloheksimidiresistenssiin yhteydessä olevien nukleotidisekvenssien transkriptiota.

Keksinnön mukainen resistenssijärjestelmän ansiosta voidaan edullisesti todeta heterologisten sek-20 venssien, kuten ihmisen seerumialbumiinin, hepatiittivirus B pinta-antigeenin, insertio niiden ilmentymisestä eukaryootti-isännässä.

Esimerkkinä mainittakoon, että on mahdollista käyttää replikoituvan plasmidin tyyppisiä vektoreita, 25 integroituvia vektoreita, kuten pSVL (Pharmacia). Tällainen vektori voi esim. sisältää nukleotidisekvenssin, joka koodaa proteiinia, joka vastaa sekvenssi A:ta ilman sen intronia.

Yleensä, keksinnön toteutuksen kannalta on 30 hyödyllistä käyttää monikopioisia vektoreita etenkin, kun transformoidut solut ovat eukaryoottisia soluja.

Edullisia keksinnön mukaisia vektoreita ovat vektorit, jotka soveltuvat ilmennettäväksi hiivoissa, jotka ovat teollisesti merkittäviä ja jotka halutaan 35 leimata resistenssimarkkerilla esim. silloin, kun ei voida käyttää auksotrofista markkeria, jolloin eräänä erityisenä hiivana mainittakoon Pichia pastoris tai 15 pombe, tai vektorit, jotka soveltuvat ilmennettäväksi korkeimmissa eukaryoottisissa eläinsoluissa, esim. bacu-loviruksessa, tai vektorit, jotka soveltuvat ilmennettäväksi kasvisolussa, kuten tupakkakasvissa. Siten voidaan 5 transformoida apinan tai hiiren soluja.

Eräs erityisen edullinen keksinnön piiriin kuuluva vektori on plasmidi Ye23/31, joka transformoi E.coli kannan DH5CC ja joka on talletettu CNCM laitokseen 2.7.1991 talletusnumerolla 1-1121.

10 Edelleen, keksinnön kohteena on eukaryoottinen solu, jolle on tunnusomaista, että se transformoidaan vektorilla, joka vastaa ominaisuuksiltaan edellä esitettyä, ja erityisesti että se on hiivasolu, esim. Pichia pastoris, korkeampi eukaryoottinen eläinsolu, esim. 15 hyönteissolu tai nisäkkään solu, erityisesti hiiren tai apinan solu, ihmisen solu, tai myös kasvisolu.

Tällainen rekombinattisolu voidaan saada millä tahansa heterologisten sekvenssien insertiomenetelmällä, joka tunnetaan yleisesti rekombinanttiisäntäsolun val-20 mistuksen yhteydestä. Voidaan erityisesti käyttää elekt-roporaatiomenetelmää, joka on kuvattu julkaisussa, M. Becker, L. Garente, Methods in Enzymology (1991 voi 194: 182-187) .

On mahdollista käyttää myös menetelmävaiheita, 25 joita on kuvattu julkaisussa WO 84/02913, niiltä osin, joissa on kuvattu kasvisolujen insertio nukleotidise-kvensseillä, jotka ovat heterologisia tällaisten solujen luonnostaan sisältämiin nukleotidihappoihin nähden.

Eräänä käyttösovellutuksena mainittakoon, että 30 edellä kuvattuja resistenssiproteiineja voidaan käyttää valikointijärjestelmissä, jotka vastaavat spesifisesti sykoheksimidityyppisiä markkereita, toteamaan isän-täsolussa ilmentymään halutun heterologisen sekvenssin vienti eukaryoottiseen isäntään. Valikointi on helpom-35 paa, mikäli resistenssi voidaan osoittaa suurella anti-bioottipitoisuudella, jolloin tämä resistenssi johtuu edellä mainitun resistenssiproteiinin ja aikasemmin 16 määritellyn kofaktorin yhteistoiminnasta.

Keksinnön puitteissa on erityisen edullista valmistaa proteiineja, jotka mahdollistavat reistenssin saavuttamisen sykloheksimidipitoisuudessa n. 100 μρ/πιΐ, 5 j opa 1 mg/ml.

Edelleen, keksintö liittyy menetelmään, jolla voidaan todeta heterologisen nukleiinihapon esiintyminen isäntäsolussa, jolloin menetelmään kuuluu vaiheet: - isäntäsolun transformointi ilmentymisvektorilla, joka 10 sisältää eräänä sen replikaatiolle epäoleellisista kohdista toisaalta heterologisen nukleiinihapon, toisaalta resistenssiproteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin, ja valinnaisesti kofaktorinukleotidisekvenssin säätelyele-menttien kontrollin alaisena, jotka säätelyelementit 15 ovat välttämättömiä näiden sekvenssien ilmentymiselle valitussa isäntäsolussa, - näin transformoidun isäntäsolun viljely, - isännän saattaminen kosketuksiin tietyn sykoheksimidi-pitoisuuden kanssa ja tälle antibiootille resistentin 20 isännän toteaminen.

Soluja, jotka solut ilmentävät edellä esitettyä sykloheksimidiresistenssiä, saadaan menetelmällä, jolle on tunnusomaista seuraavat vaiheet: - annetun isäntäsolun transformointi keksinnön mukaisel-25 la nukleiinihapposekvenssillä, joka on insertoitu etukäteen isäntäplasmidiin mainitun nukleiinihapposekvenssin ilmentymisen sallivissa olosuhteissa, transformoitujen solujen (transfromanttien) viljely täydellisessä väliaineessa, joka sisältää hyvin alhaisen 30 sykloheksimidipitoisuuden, edullisesti alle 2 μρ/ιηΐ; - resistenttien kantojen talteenotto sykloheksimidipitoisuudessa yli 1-10 μρ/ιηΐ.

Esimerkkinä mainittakoon, että edellä esitetyt vaiheet voidaan suorittaa hiivojen osalta suraavissa 35 olosuhteissa: - transformanttien viljely suoritetaan lämpötilassa n. 29 - 30 °C, edullisesti 30 °C, sykloheksimidipitoisuudes- 17 sa alle 2 μg/ml, 12 - 36 h ajan, - tästä viljelmästä valitut kannat ovat kantoja, jotka ovat resistenttejä viljelmiä 100 μg/ml sykloheksimidipi-toisuudessa, 5 - täydellinen kasvuväliaine sisältää 10 g/1 hiivauutet- ta, 20 g/1 Bacto peptonia ja 20 g/1 glukoosia.

Edellä mainittu transformanttien viljelyvaihe suoritetaan edullisesti 12 - 18 h, 30 °C sen jälkeen, kun ne on transformoitu täydellisessä nesteväliaineessa 10 alirajoittavissa (sub-limiting) pitoisuuksissa (1 μg/1) . Tämä pitoisuus voidaan sovittaa kannan toiminnan ja käytetyn hiivalajin mukaan.

Eukaryoottisolujen, esim. (hiiren) LTK-solujen, tapauksessa kasvuväliaine voi olla Dulbecco-väliaine, 15 jota on täydennetty 10 % vastasyntyneen vasikan seerumilla ja fungisidisellä antibiootilla.

Rekombinanttikloonit valitaan mentelmien mukaisesti, jotka on kuvattu julkaisussa, Delpeyroux et ai., Journal of Virology (joulukuu 1990 voi _64 (12) : 6090- 20 6100).

Yhteenvetona, solut kotransfektoidaan 10-kertaisella rekombinanttiplasmidimäärällä antibiootti-resistenssigeenin G418 sisältävään vektoriin nähden (Colbere-Garapin F. et ai. 1981, J. Mol. Biol. 150: 1-25 14) . Kolmen viikon kuluttua resistentit kloonit saate taan kasvuväliaineeseen, jota on täydennetty sykloheksi-midillä pitoisuudessa 1-10 μρ/ιηΐ.

Kun soluisäntä on S. cerevisae, plasmidi, joka sisältää keksinnön mukaisen nukleotidisekvenssin, voi 30 olla episomaalinen monikopioinen plasmidi YEp plasmidi-perheestä, esim. S. cerevisiaen 2 μ plasmidi, tai episomaalinen monikopioinen plasmidi Ye 23/31.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavien esimerkkien ja kuvien avulla.

Kuva 1: kloonausvektori, joka sisältää K.lactisin syklo-heksimidiresistenssin aiheuttavan n. 5.2 kb DNA fragmen- 35 18 tin

Konstruoitiin sykloheksimidin useille mg/ml pitoisuuksille resistentin K.lactis kannan 2359-152 genomikirjasto. Tämä kirjasto konstruoidaan sukkulavek-5 torissa (a shuttle vector) E.coli/S. cerevisiae: pEMBL

Ye 23 (Baldari et ai. 1985 Gene 35: 27-32, kuva 1).

K.lactisin kromosomaalinen DNA digestoitiin osaksi entsyymillä Sau3A ja sitten se fraktioitiin sukroosigra-dientilla. Fraktiot, jotka sisälsivät kooltaan välille 4 10 - 9 kb sijoittuvan DNA:n, otettiin talteen ja DNA liga- toitiin vektoriin YE 23, joka oli aikasemmin leikattu ja defosforyloitu betagalaktosidaasigeenissä sijaitsevasta BamHI kohdasta. Tämä ligaatioseos mahdollisti E.coli kannan XL1 transformoinnin. Rekombinanttitransformantit 15 valikoitiin väliaineessa, joka mahdollistaa betagalak-tosidaasigeenin insertion visualisoinnin. Näin valikoitiin 23000 rekombinantti E.coli kloonia. Viidenkymmenen kloonin plasmidin restriktioanalyysin avulla kyettiin arvioimaan K.lactisin DNA insertion keskimääräiseksi 20 kooksi 5 kb, mikä antaa 99.5 % todennäköisyyden spesifisen geenin saamiselle.

E.coli kanta XL1 (kannan on kehittänyt Stratagene-yhtiö) : endAl, hsdR17 (rk“, mk+) , supE44, thi~^“, recAl,

25 gyrA96, relAl, Ä(lac), F, proAB, laciq Z M15, TnlO

(tetr) S. cerevisiae kanta OLI: a, leu2-3, leu 2-112, his3-ll, his3-15, ura3-251, ura3-273 30

Kuva 2: K.lactisin DNA:n sekvenssifragmentti, joka aiheuttaa sykloheksimidiresistenssin (sekvenssi II)

Kuva 3: K.lactisin 5.2 kb DNA fragmentin, joka insertoi-35 tiin vektorin Ye 23 (C. Baldari et ai., Gene (1985) 35:27) BamHI kohtaan, restriktiokartta.

19

Sekvensoitu Sal-PvuII fragmentti (2.8 kb) sisältää ri-bosomaalisen proteiinin. Eri kohdat sijaitsevat vast, seuraavissa kohdissa: Sau3A: 0, Stul: +300 bp, PvuII: + 600 bp, BglUI: +900 bp, BstXI: +1200 bp, PvuII: +2300, 5 PstI: +2400 bp, PstI: +3000 bp, EcoRI: +3200 bp, Hin-dlll: +3300 bp, EcoRI: +3700 bp, Hindlll: +4500 bp,

Hindlll: +4540 bp, Sali: +5100 bp.

Kuva 4: Proteiini, joka aiheuttaa sykloheksimidiresis- 10 tenssin ja joka on K.lactis DNA:n koodaama.

ESIMERKIT

I- K.lactisin sykloheksimidiresistenssin aiheuttavan 15 DNA fragmentin kloonaus I.1) K.lactis kirjaston konstruointi S. cerevisiaessa

Muodostettiin K.lactis kannan 2359-152 (Weso-lowski et ai., 1982, Curr. Genetics _5: 191-197) genomi-20 kirjasto, joka oli resistentti sykloheksimidin useiden mg/ml pitoisuuksille. Tämä kirjasto konstruoitiin sukku-lavektorissa E.coli / S. cerevisiae: pEMBL YE 23 (Balda-ri et ai., 1985, Gene V5: 27-32) (kuva 1) . K. lactisin kromosomaalinen DNA digestoitiin osaksi entsyymillä 25 Sau3A, jonka jälkeen se fraktioitiin sukroosigradientil-la. Fraktiot, jotka sisälsivät kokovälille 4 - 9 kb sijoittuvan DNA:n, otettiin talteen ja ligatoitiin vektoriin YE 23, joka oli aikaisemmin leikattu ja defosfo-ryloitu BamHI kohdassa, joka sijaitsee betagalakt-30 rosidaasigeenissä. Tämä ligaatioseos mahdollisti E.coli XL1 kannan (Bullock et ai., 1987, Biotechniques 5, 376- 379) transformoimisen. Rekombinanttitransformantit valikoitiin väliaineessa, joka mahdollistaa betagalak-tosidaasigeenin insertion visualisoimisen. Siten vali-35 koitiin 23000 rekombinantti E.coli kloonia. Viidenkymmenen kloonin plasmidin restriktioanalyysin avulla kyettiin arvioimaan K.lactisin DNA insertion keskimääräisek- 20 si kooksi 5 kb, mikä antaa 99.5 % todennäköisyyden spesifisen geenin saamiselle.

1.2) S. cerevisiaen transformointi ja sykloheksimidi-5 resistenttien transfomanttien tuotto S. cerevisiae kanta OLI (Boy-Marcotte et ai., 1982, Gene 20: 433-440), joka on herkkä sykloheksimidil-le pitoisuuksille alle 1 μς/ιηΐ, transformoitiin kirjastosta uutetulla DNA:11a. Ensimmäisessä vaiheessa trans-10 formantit seulottiin urasiiliprototrofiän suhteen, mikä mahdollisti transformanttien kokonaismäärän arvioimisen. Toisessa vaiheessa näille transformanteille suoritettiin alaviljely (to subculture) väliaineessa, joka sisälsi sykloheksimidiä kahtena pitoisuutena: 10 ja 100 μρ/ιηΐ.

15 Saatiin 3500 URA+ transformanttia, joista 7 oli resistenttejä sykloheksimidipitoisuuksille yli 100 μg/ml. Analyysin jälkeen kävi ilmi, että jäljellä olevista 7 kloonista 6 oli integroinut genomiinsa K.lactisista saadun DNA:n. Kuitenkin, seitsemännessä transformantissa 20 resitenssiominaisuus säilyi Ye 23/31 plasmidilla, joka oli saatu pEMBLYe23 vektorista. Tämä transformantti on resistentti erittäin suurille, yli 1 mg/ml, sykloheksimidipitoisuuksille. Sykloheksimidiresistenssin aiheuttava DNA fragmentti on n. 5.2 kb.

25 Edelleen, transformanteilla, jotka ovat integ roineet K.lactis DNA fragmentin genomiinsa, resistenssi-ilmiö säilyy diploidissa, heterotsygootissa tälle mark-kerille. "Sykloheksimidireistenssi" on siten dominantti ominaisuus.

30 1.3) Sykloheksimidiresistenssistä vastaava proteiini Tämä koko fragmentti insertoitiin pBluescript phagemid vektoreihin (Stratagene). Erilaiset yksisuuntaiset deleetiot konstruoitiin entsyymiliitos-ExoIII/Sl 35 avulla. Yksisäikeisen DNA:n sekvensointi suoritettiin Sangerin mentelmällä käyttäen universaaleja primereita tai sekvenssistä itsestään laboratoriossa syntetisoituja 21 primereita.

Näin saatu sekvenssitragmentti on esitetty kuvassa 2. Se sisältää erityisesti avoimen lukuraamin ORF A (an open reading frame).

5 ORF A: Tämä avoin lukuraami on 32 0 bp pitkä (kuva 2) ja se sisältää 590 bp intronin. Tämä introni sijaitsee geenin 5' päässä ATG:n jälkeen ensimmäisen emäksen jäl-10 keen. Eksonin koodaama proteiini sisältää 150 aminohappoa (kuva 4). EMBL ja GENEBANK tietopankkien avulla suoritettu homologien tutkiminen osoitti, että ORF A: 11a on 75 % homologia aminohappotasolla rotan ribosomaalisen proteiinin L36a kanssa (Gallagher et ai., 1988, DNA 1_: 15 269-273) ja 74 % homologia ihmisen ribosomaalisen proteiinin kanssa (Davies et ai., 1986, Gene 45: 183-191), joka on itsessään homologinen S. cerevisiaen ribosomaalisen proteiinin rp44 (käytetään myös nimitystä L41) kanssa (ITOH, 1978 FEBS Lett. 96: 399-402) .

20 Tämä sekvenssi riittää aiheuttamaan korkean sykloheksimidiresistenssitason, kuitenkin, tämä taso on alhaisempi kuin on havaittu transformanteilla, jotka sisältävät ensin mainitun 5.2 kb fragmentin.

25 1.4) Avoimen lukuraamin A ilmentyminen

Haluttiin määrittää, missä määrin ns. resis-tenssiproteiini on vastuussa sykloheksimidiresistenssi-ilmiöstä. Sama S.cerevisiae kanta transformoitiin samoissa olosuhteissa ainoastaan ORF A sisältävän vektorin 30 kanssa. ORF A sisältävät transformantit ovat resistenttejä sykloheksimidille. Kuitenkin, havaittu resistenssi-taso (100 μρ/ιηΐ) on n. kymmenen kertaa alhaisempi kuin taso, joka saavutetaan yhdistettäessä ORF A kofaktori DNA: n kanssa, joka sisältyy koko 5.2 kb fragmenttiin 35 (1000 μg/ml). Toisaalta, ORF A sekvenssin deleetio joh taa resistenssin häviämiseen.

22 Päätelmät:

Geeni, joka vastaa sykloheksimidiresistenssi-ilmiöstä, eristettiin K.lactisin DNA fragmentista. Tämä järjestelmä koostuu ribosomaalisesta proteiinista (ORF 5 A), joka on hyvin läheisesti analoginen ihmisen L36a ja rotan ribosomaalisten proteiinien kanssa sekä S. cere-visiaen rp44:n (tai L41) kanssa. Tämä proteiini on välttämätön resistenssi-ilmiön aikaansaamisessa, mutta se ei riitä aiheuttamaan täydellistä resistenssiä antibiootille) le. K.lactisin kloonatussa 5.2 kb fragmentissa sijaitsevan kofaktorin länäolo on välttämätön resistenssin aiheuttamiseksi K.lactisissa n. 1 mg/ml tasolla.

Claims

1. Eristetty K. lactisin nukleiinihapposekvenssi, joka on n. 5.2 kb ja joka kykenee aiheuttamaan 5 lactisille ja S. cerevisiaelle resistenssin sykloheksi-midiä, joka on pitoisuudessa yli 1 mg/ml, vastaan ja, edelleen, joka sisältää restriktiokohdat: Sau3A: 0, Stul: +300 bp, PvuII: +600 bp, BglUI: +900 bp, BstXI: +1200 bp, PvuII: +2300 bp, PstI: +2400 bp, PstI: +3000 10 bp, EcoRI: +3200 bp, Hindlll: +3300 bp, EcoRI: +3700 bp, Hindlll: +4500 bp, Hindlll: +4540 bp, Sali: +5100 bp.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen n. 5.2 kb nukleiinihapposekvenssi, joka sisältää nukleotidise-kvenssin I:

3 S 5 o o. £ 5 5 5 | ^ e D» O* ^ _ m >* 5» 3 5, >* m mm »m li _ min O***· MW o» M t « >.M >, M O* M ® **^ a«L mm* M Irt MM M l**· Ä s 5*5? W M oir, «m O. u « « ? * f * O. ^ -C M 0 >, H * S σι " -* 2* >. « ® ^ M ^ ? s u « « * > « l. e c ä O’ J? £ M M >, £ *

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen n. 5.2 kb nukleiinihapposekvenssi, joka sisältää nukleotidise-kvenssin II : ooooooooo οοοοβοοοοβοοοβο<Νβ»ο«2·βνο (-.«»•e-iMn OO0<000<<000<0< H^HUUHH 2^2m22;£u<<UUOUOHH<0<HOUUOO βΜΜ5()ΗυΗΰΗϋυΗΗΰ<Ηϋθυυ·υ^<Ηΰ «Μί<£ΗϋδΗϋ<ΗΗ H<(5 Η 0·Η<<<ϋ<<Η ^*M <UOHUH<<0<U<H < U < H < U U U H ”” fi fi n 5 < UHH < OH O U < < H O < U O H U HU < ^HrfnuuO<O<<<O0O<H<O<O<OH< UUUUUU<UHU<5<<OUH<UHOH<UHU <<UUUUUHHH2UUHHHH<UHUHH<U OHU<UUHUUUH<U<<UU<<U<<UUUH 2S-m£^uhhh<<hhhuuuh<hhhuu<h tr>H<HU<UUH<UH<<UHUUHHUHHUUU »n$2ciMUH<<<H<<HHHHH<HUOHH< Hh5<uho<oh<uuhhhh<<<<uhhu — HHU<UUUUUUU<<<HH<HUUUUHHU JIm OMU<HU<<<<UH<<<U<<<<UH< UHUUUHUU<U<U<<H<UUHU<<UU< ^uhUHUUUUHUU<UUH<H<U<UHUH <HHUUUHH<H<OH<<UUU<HU<UHU sssssssssssssHnyssssssssss SS£iSS8§£Eecssssecasasssa <2<ϋ0Η<0<ΗΗΟΗ<«<0<«Ηθυ<ϋ« — 2S20PU<HH<<HO<SO5<UO<O5<5 »Sti^HU UHU<HH<UU<U<U<<<<<<< h2®HUHUU<OUHHU<HUU<H<HHUU uuh<OH<U<UUU<HUU<<UHUHUUH UU<UHUUH<<UUHHHUUU<HUUU<H ot-irf^UUUU<HUHHU<<U<<<HHUUHH 2:?r>5uUMOOHO<HOHH<0<HHH<<OU ΗϋίπΗ<θυ <<<H<U<UUH<HU<U<U 5S<UUUUHUHUHUUHHHH<HUUHUU <UU<UHUH<<<HHUUHU<U<<<<<H _5ShhHHUU<HU<<<<U<<<H<UH<H HOOUU<UUUHHU<<<HHHH<H<<H< HHHUUUUHHUUU<UUUU<<<H<UU< U<<UHUHUHH<HUUHUHUHUUU<UU UU<HHUUHHHUHH<UUU<U<<U<<U ouo<HO<<uH<H<<yu<u<u<yuu<u #nj *2“ h mj ^ π {*4 ^ t1* H U < H U < H < U U O < < U < < < 2HHU<HUU<H<H<<H<HHHH<UUUU ohh<U<UU<H'<H<<U<HUUUH<<<< muS<<UUUUUUUU<<H<<UUUU<<< — HH<HO<HUH<HUHUU<<U<<HUHUU So5S<uuhhh<hu<huhhu<h<u<u u2h<<<UUU<UU<UHUHU0UH<0U< ^Uh2h<<UUH<<<HH<U<HH5H<UU UHU<UUUH<UUUU<<HHUU<<U<H< <-»f5 UMU<UOHUO<HO<UUH<UOHUUH< 2mUUUUUHUUHUU<UH<HHUUHOHHH UHHHHHUU<H<HU<UHHUHUHHU<H «ftJMUHU0<0<U<<<<H<U<0<OO<U — UMMHHH<UHHHUHUU<H<U<H<<<U n MMUUU<HH<U<HH<UU<<<<OHUH mo2m<HHH<O<0HO0UUUUHO00O0 u8uuuuuuu<<uu<u<uhh<h<h<h UUHUHHOUUHHH<UUUHUH<<<H << HHtvinwin'e'ir'feoO'OOrtWNnnv f-H w4 ψ—i (H #< *< •"i ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΓΜ £^aD<yov£>cs©<rovpcNCO^ovDrvcD^ovecN^ LniD^r-fflOO^Oi-HiHCNiNim^rxrininvpr-r-CDro HHHHHHrtHNMNN(N(MNN(Nf\NN(NCM(\ MUH<HHU<HUUUU<U<UUU<UU O ££u<<<uuuuhuuhuu<h<R<^ * H<H<HUU<U<H<UHU<UUUU<U <huuh<huhuhuu<uuuhuuuu !£huuhh<<u<u<<uu<uhuhuu <<H<HU<U<U<U<<HUUHU<<U uuu<<<5uuh<<u<<u<u<u<< U<<UUHU<U<UHU<U<UUUUUU HUU<<<U<HHUHUU<U<<UHUU © HHUUHUUUHUUUHHHU<HU<UU m HHHUU<H<H<HH<U<H<<U<<U H<U<UHH<UHHUH<UUU<UUr-jU U<HUUUH<UUHUH<U<UU<<UU HUUH<H<<U<HU<U<U<<UU<U < U<HU<HUU<UUHUUUUU<<<U H<HHHU<<UUU<<<H<<<<<<U HHHH U<<H<<UU<UUUU<UU<< SHH<<<UH<UU<UUUU<UH<UU U<U<UHHHUHHUH<UUUHU<U< o <H<HU<HH<<<H<UUU<U<U<H <r UUH<<HHU<<U<<UHUUU<HUU H<<HH<HHUU<UHH<U<<<UHH U<HUU<UHHU<U<U<H<UUUHH HHU<UHHUUH<<<<U<UH<<<U — H<H<UU<<UHU<HUHUHU<<H< <HHH<UH<<<UU<U<<<<UUUH <UHUH<<<UHU<UUHHUU<UUU UH<H<H<UH<<<U<<U<H<<<< UHUH<H<HHUUUUUHHHUUUUU O HHH<UU<<HU<<HUC3HUUUUHU Π HHUH<UH<<H<<UHUHU<<<UH HUHU5<UUHUU<<<<UU<UUU< U<UU<UHU<UUUUH<UHUUH<U SgsgasssaassesBgsBSgas HHUHHUU<UHHH<H<<HUUU<UU RmohhhhShIISSBuhhhuSSsohS oShuhhh2hhu2u<uuuououu< <<<H<U<UHUUUH<H<U<UUH<H isSsS^ssasasöaBssssBbs- iggSSici^söBöSBsasGSBö gr:eba5SoHo8uS52uSu8£SH£ <<<H<<HUU<HH<HUH<U<<HHHO <U<HHU<HUUUUUU<HUUU<U<< <UUU<UU<<UHHUHHHHH<U<UU <<H<H<UUH<U<UU<<UUUUHUU <H<UHU<H<UUU<<UHU<U<HHH- OHuhhuhhhhhuuh<<hh<<<<u HUHHUH<HUHUUHHU<<HUU<UU UHHU<UH<<UHUUHHU<H<<H<< 0I_HHUUU<<<H<HUHHU<UU<UO O'Cf^O^O'DfvevO'^rMOO’OVOtNe^O'eiN uiin®vDr>®0D®®o»-i»-4f>jcvfn-wvinin®r»r'® Hr)(HHHrtrtrtrt(N{NNfS(NNNMNNMNNN tai joka hybridoituu sekvenssille II komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) ja kykenee aiheuttamaan K. lacti-sissa resistenssin syklohesimidipitoisuudelle yli 100 5 μρ/πιΐ, ja edullisesti yli 1 mg/ml.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen nukle-iinihapposekvenssi, joka sisältää nukleotidisekvenssin, joka sijaitsee sekvenssin II: ooooooooo OOOOOOOOOOOOOOOfSOD«rOVfl(Ne<rO nrfuhn[?UU<OÖ(3i<<UUU<U< H? H U U H H S?nE?£<<<o2<UUOUOHH<0<HUOOOO 'fiHMSuHOHOHOUHHO<HOOUUOH<HO Η^£:ΗυυΗυ<<<ΗΗ<Η0Η0ΗΗυΗ2<0 f*Mifii*HOOHU<HHH2oHUH<<<0<<H ^ίίϋϋΗϋΜ<δ<ϋ<Η< ϋ<Η<ϋϋϋΗ ""nnuu<UHH<l5BUl)<<EHU<UUB(Jhp< ^u<uuuo<u<<<ooo<h2o<o<oh< !«ni5n(iU<UHU<2<UUHi<UHUH<t3HO ^<ooouohhh2ouhhhh<uhuhh<u m <· n O HOUOH<O<<OO<<U<<OOOH ^H<HO<OUH<UH<<OHOOHHOHHyOO ΕίίέυΗθ2θΗ<0ΟΗΗΗΗ<2<<ϋΗΗϋ — ££ηίϋυυθΟϋϋ<<<ΗΗ<ΗΟΟΟΟΗΗΟ ^mm£u!S:HO<<<2oH<<<0<<<<OH< UhUUUHUUsUi0<<Hii0t)H(j2<l30< Si UMUHOOOOHUO<O0H<H<O<UHOH <hhoouhh<h<0h<<oou2ho<uho ,-v,*· m m m MUOHOH<<HUO<<<U<<HHUH 2πΗημ^Ηυ<<ΟϋΰΗΗΗ<υυ<υυ<<ΰ< rfrfMU0O0OHHHH<H<OHHU<u2<<U 22MMHHOUHHUOH<UUUU<<<UO<< 22iruOH<O<HHUH<<<U<<HOU<00 _2SSÖHU<HH<<H022u<2oy<y2<< c2:?2m O M00<UOHHO<HUO<H<HHUO MUH<UH<02U00<H0U<<0H0H0OH OU<OHOOH<<OOHHHOOO<HOOO<H <->ϊ-ι^·<υθθυ<ΗϋΗΗΟ<<υ<<<ΗΗΟΟΗΗ ^M«<MH<OO<<<H<<3ÄUOH<HO20<O UH<UUUOHOHUHOOHHHH<HOOHOO <UO<UHOH<<<HHOOHO<U<<<<<H — huhhHH0U<H0<<<<0<<<H<0H<H HUUOU<OOOHHO<<<HHHH<H<<H< HHHUUU0HH000<0000<<<H<00< 0<<OHOHUHH<HOOHUHOHOO. O < O O OU<HHOOHHHUHH<000<U<<0<<0 OOU<HU<<UH<H<<UO<U<U<000<y S<HO<UHHHHO<Hy<H<000<<0<<< ^MMOj£HOO<h2 H <<H<HHHH<OOOO UHH<0<UU<H<H<<0<H0U0H<<<< HO<<<UOUOOUOO<<H<<UOOO<<< — HH<HU<HOH<HOHOO<<O<<HOHOO Suu<<UOHHH<HO<HUHHO<H<Q<0 U<H<<<UUO<00<OHOHOOOH<OU< <OH<H<<OOH<<<HH<O<HH<H<OO 0H0<0U0H<000U<<HH00<<0<H< SK8S8088tib8SB8oSS£fi8§Eu8ES gSSoSuSSi*BSSSSHic8«uS58iu -ohhhhh<ohhhohoo<h<o<h<<<o HO<H<HHH<0<QHOOOUUyHOOOOO O000UUUUO<<00< O <UHH<H<H<H UUHUHHOUOHHH^OÖOHOHhäCH. «NilvOtflNetOyiNffl-iOVIMClvOUlNOv iJIlfvnrn^-xyirj^vor-r-CDmaiOOr-irvfNinri^T' OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOfN» Spy®CO«(N©^Otf)fN®,rOV£,N®,!:0W(N,r inU)V0r~CDO30^o^O*-^<^-ttNfSin^"^'tr>1J^Vl^,r^r~®® HHriHHHHrt(M(N(NMNNNNfMtMCMtNNNM HUH<HHU<HUUU0<0<U00<0a O 5hU<<<UUU UHUUHOU<H<U<H vd H<h<huu<u<h<ohu<uuuo2o <£HCJUH^CHUHUHC)C?^UUUHOOUC> t'5#£UO<0<<U<0<HUH<0<<U<0 “" rfÄH<H0<0<3<5<^HUUH0<<0 ηηυί<ί<ϋ3Η<<ϋ3<ϋ<ϋ<ϋ<< U<<0UHU<U<0HU<1U<UUUUUU huu<<<u<hhohuu<u<<H^HH S HHUUHUOOHUUUHHHU<HU<UO m HHHUU<H<H<HH<0<H<^^J^·?^^ H<U<UHH<OHHOH<OUO<OOr*U u2huooh<uuhuh<o<oo<<uo £u<hu<huo<uohuuuuu<<<u Η<ΗΕ^Ηϋ<<ϋϋϋ<<<Η<<<<<<ϋ hhhhu<<h<<uu<uuuu<uu<< 2Ρί-<<<<υΗ<υϋ<υυου<υΗ<υο rn^!t9iCOHHHUHHOH<UOOHU<U< O <h<ho<hh<<<h<uuu<u<u<h <= uoh<<hho<<u<<uhuuu<hou m<<HH<HHUO<OHH<U<<<U^^ hho<uhhuoh<<2<u<uh<<<o — r,^i»<,£fnO<<UHO<HOHUHO<<H< <UHUH<<<UH0<UOHHUU<OUU UH<H<H<UH<<<O<<O<H<<<< 0HUH<H<HH0UUOUHHHUUUOU O HHH<OU<<HO<<HUOHOUOOHU m hhoh<uh<<h<<ohoho<<<oh HUHO<<UOHOO<<<<OU<UUU< U<UU<OHU<OOOUH<OHOUH<U SSH<UHOHUO<HHHpU<OgpOg SH<H<<H<<<U<U<UpUUUH<0 HH<HHHUUHHHO<HH<H00<0 UH<HH<<<<OH<<OH0OH<<OOH H H O H H O U < UHHHiHiÄHUUUtfUU qHH<O<U<<<HHUH<O0HggUy<O ÖHUHHHH<H<<<ÖUHHHU<<*iUt-;r* u<H0HHH<HH0<u<oou0uuoq< *£J£<h<u<uhouuh<h<u<0Uh<h isgslpisasasösyslögcgg- Ö8i5SSisisa§8b8Bg||ägSBB SBBSS5ESBsBSSSSSS58SSiiii *£<<Η<<Η00<ΗΗ<ΗΟΗ<Ο<<ΗΗΗΟ <U<HHO<HUUU0U0<HOUÖ<U<< <UUO<OU<<OHHUHHHHH<U<0U mC^H^Ni^UUH^U^U ytftflSUUyHUU <H<OHU<H<U0U<<OH0<O<HHH — N[3HHUH<HUHt)U^HUÄi(HyyiUU 0HHO<UH<<UH0UHHU<H<<H<< ΰΗΗΗΰϋϋ22<Β<ΗϋΗΗϋ<ϋΰ<υΰ OtfNCDvOONOVOVONCDVOtfNOVOON infltfttMscDCiftOHHNNnwinintff'f'e HptHHmr4rtHH(N{SNtNNNNNNMNNWN paikkojen 9 ja 2763 välissä tai joka hybridoituu sekvenssille II komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) , ja kykenee aiheuttamaan K.lactisissa resistenssin syklohek-5 simidipitoisuudelle yli 100 μρ/ιηΐ, edullisesti yli 1 mg/ml.

5 O' O' * * ° M M « * « ^ >· 5 5 5 h e. o ·* g* £ g M g. > * u -· 04 M £* S* £ M φ * >> S f * * e « £ £ % * SS?5" g* q* iö* c ^ ^ *2 i M Wr*# H H —40 >h o*^ . Γ- - "j 0>M «M MM >» M M* ^ fV Q3 >,V .CO M ^ «M M IM MOI "v «f, Viri O , ΧΌ «JM ·β M MIM i-»M O' tai että proteiini sisältää kokonaan tai osaksi tämän sekvenssin A, tai sekvenssin, jota koodaa nukleotidise-kvenssi, joka hybridoituu sekvenssille II komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa 5 (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) , edellyttäen, että tällai nen proteiini aiheuttaa rekombinanttieukaryootti-isännälle resistenssin sykloheksimidipitoisuutta yli tai sama kuin 100 μg/ml vastaan, joka isäntä on transformoitu tällaista proteiinia koodaavalla nukleotidisekvens-10 sillä proteiinin tuoton mahdollistavissa olosuhteissa.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että se saadaan E. coli kannasta DH50C, joka on transformoitu 10 plasmidilla Ye 23/31 ja talletettu CNCM laitokseen 2.7.1991 talletusnumerolla 1-1121.

6. Eristetty nukleotidisekvenssi, tunnettu siitä, että nukleotidisekvenssi sisältää kokonaan tai osaksi sekvenssin II: ooooooooo rteöoooooooooooof^e^ovefscD^o rt«ff-«f-iOU00<C30U<<000<0<Hl£-«UUE-<H 2MS£tfÄ<U<<UUOUOHH<U<HOUUOO UuSuHUHOHOOHHOgHOCgpO-OHJHO ΗΜ^^ΗυϋΗυ<Ε-·ΗΗ<ϋΗϋΗ<<<υ<<Η ^rfi^UOHUH<<5*CU<H*CU<H<OUOH ?nHMM2u<UHU<<<UUi-'<UHUH<OHC3 <<ϋΟΟΟϋΗΗΗ2θϋΗΗΗΗ<ϋΗΟΕ-ιΗ< U oPiU«e:t5UHUUUH<C3<C««CUC<5y<<000|-' itfHU<UUH<UH<<OHOOHHaHHyOU — MMUÄOOUOOCSOtfpaC^CHHÄt-tOUOOf-it^O 2HUO§HUu2a2o<<H<OOHU<<aO< 2uhUHO0OOH"O0*00HiCH<U<0HUH ÄHHUUUHH<H<OH<<UUU<H(5<UhU Λ4ΤΜ&4ίΊΜ13ΟΗΟΗ<<Ηυθ<<<ϋ<<^Η0Η 2npiHht3HU<<l5(SUHHHi2u(J<OU<<U< ^Shuuoouhhhh<h<ohho<u2<<o rf2HHHHUOHHOUH<C3C5UU<<<UO<< ?5ίί25ΰΗΟ<ΗΗ<ΰϋ<ϋ*0<<<<<<< H2*noho82oShho<hoo<h<hhoc f1nSScUH<02uÖO«<HOO<<C>HUHOUH Βϋ<ϋΗΟϋΗ.5ίβ00ΗΗΗ0ϋϋ<Ηϋ0ϋ<Η 25i)2HUhöCHU<HOHH<«i2HHH<<UO ί^2Η2ί60ΟΪ·<3·Η2β<ϋϋΗ<ΗΟ<2ϋ<ϋ t5Mtfl3UUOHOHOHOUHHHH<E-iOUHOO tfl5U<UHCH<<ÄHHUUfjU<U<5jiÄ5H Cpi I 1 u tmi £-4 P-4 n M 2 ri! il tf O ί 2 i H 2 O H <. H ε^ΗυυυοΗΗ00υ2υουο<<<β:Η<οο2 SSSohohuhhähouhohuhoo. o<oy ou2hhuuhhhohh<ocju<u<<u2<o οϋϋ<Ηϋ<<υΗ<Η<<υΰ<ϋ<ϋ<ϋϋϋ<ϋ uhh<S<uo<h~2h2<<j2hoouh<ä<< Η5<ί<δϋϋδϋϋϋϋι2<Η<<ϋϋυϋ2!ϊ< Secj5£iiU0HHH<H0<HOHH02H<0<O tj2H2<<CUUU<oS<3HÖHUUOH<3o< iCl3H2H<<OOH<<2HH< U<HH<H<OC5 Sho2uooh<ouuu<<hhuu<<0<h< e»Ot3HC3<UC2HOO<HO<UUH<UC2HOUH< 2HÖl5C5UC5HUOHUC5<OH<HHt5<5HQHHH rtSHUÖöSSfi5<5HHHHU00eH08uH0 2BBS£8ö£5£SS25SB£8£8£S8iB -gSKSBSSSSSSSSSSSBSSSSSSgS Ηθ<Η<ΗΗΗ<0<ΟΗΟθ8ααυΗΟ0ϋΟ0 UUHUHH(5U(5HHH<(5C30H(5h2<<H. <Λί «NevOViNBceWNevOIONevOtfNBr , ^ pj m frs f*gp «9* |f] V£3 Γ* Γ* CD Q\ CT\ O O H CM CM CO V ♦( ιΗ »H fH ♦"Ι i·^ ^ OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOfN SSSr-SaöcSH^O^^eNfsifn^r-cininvnr-r-aDCD HHHHHHHHtMCNNMfNCMfNNfNNNNtNCSiCV HUH<HHU<HUUUU<0<ypy<UU o <HU<<<UUUUHUUHUU<H<U<H «> no<HUUUHUUUU<HUU<<<U<p O<H<HUU<U<H<UHU<UUUU<0 tfM0UH<HUHUH0O<UUUH0OUU ϋ<ϋϋ<ϋ<<ϋ<ϋ<ΗϋΗ<ϋ<<ϋ<ϋ - 2H0UHH<<U<U<<pp<UHUHOp f n (i m tf 2 O O H O ^ ^ O ^ CP ^ CD ί ί 8<<0UHU<0<0HU<U<U0U0UU t* n o <<<U<HHUHUU<U<<UHUU O HHUUHUOUHUUUHHHC3<HU<UO m f . t_j E_J f »5 f J ijT L< fljT £( jd* £"4 {"M ζ.) iC IH Ä CI) ^ O H<U<UHH<OHHUH<UUU<UUHU. U<HUUUH<UUHUH< O <UU<<UC3 hS5h«CH<<U<HU<U<U<<UU<P — <u<Hu<HOO<uyHyuyyy<<<p H<HHHU<<C3CDU<<<H<<<<<<P HHHHU<<H<<UU<UUUy<Uy<< <HH<<<UH<UC3<UUC3U<UH<UC3 fi<C3<C3HHHUHHUH<UC3C3HU<U< O <H<HC3<HH<<<H<UUU<U<U<H UC3H<<HHCD<<U<<UHUyy<HUU H<<HH<HHUC3<C3HH<U<<<C3^H U<HUU<C3HHU<0<y<H<yUUHH HHC3<UHHUC3H<<<<U<UH<<<U H<H<UU<<UHU<HUHUHU<<H< ,5HHH<UH<<<UU<U<<<<yyp^ <UHUH<<<UHC3<UUHHyy<Uyy UH<H<H<UH<<<C3<<U<H<<<< nMUH<H<HHUUUUUHHHUUUUU O HHH<UU<<HU<<HUUHUUUUHU n HHUH<UH<<H<<UHUHU<<<UH HUHU<<UUHUU<<<<C3U<UCJU< u<UU<UHU<UUUUH<UHUUH<U t3<H<UHUHUU<HHHUU<U<UUU — <H<H<<H<<<U<U<UUUUUH<U <HH<HHHUUHHHU<HH<HUU<U £ H g H H U U <UHHH<H<<HUUU<UU ^ugS£^HäSSSuHSgSiS<uSS U<HUHHH<HHU<U<UUUUyyUU< <2<H<U<UHUUUH<H<U<UUH<H iggsSsss8aias8a85§s|ggg- S g i s ί 1 e f s a I» h 8 3 g s a a e s g § <<<H<<HUU<HH<HUH<U<<HHHO C3<UHHyUHH<UH<<<CJ<<Uy<<<*H <U<HHU<HUUUUUU<HUUy<y<< <UUU<UU<<UHHUHHHHH<U<UU <<H<H<uuH<u<uy<<yuyuHuu <H<UHU<H<UUU<<UHU<U<HHH UHUHHUHHHHHUUH<<HH<<<<U HUHHUH<HUHUUHHU<<HyU<UU UHHU<UH<<UHUUHHU<H<<H<< 0HHHUUO<<<H<HUHHO<UO<UO HHrtHHrtrtHHHrtHHrtHHHHHHHHH OtfNCDvOVNOJvOVDNOVOtfNO^O^N ιηιο«ο»Γ*ωωβ»β\ο*Η»ΗΜθ»ηνν»ηιη\βΗΗβ tai että nukleotidisekvenssillä on sekvenssi II tai että nukleotidisekvenssi hybridoituu sekvenssille II komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) , edellyttäen, että 5 tällaisella nukleotidisekvenssillä on ainakin yksi seu-raavista ominaisuuksista:- se koodaa sykloheksimidi-resistenssiproteiinia ja/tai - se koodaa aminohapposekvenssiä, joka voidaan tunnistaa sykloheksimidiresistenssiproteiinille kohdistetuilla 10 vasta-aineilla, jolla aminohapposekvenssillä on seuraava sekvenssi: SEKVENSSI A * «I «* » * >* >« »i >* H H ^ il >( * Jj ί v H 4 Cl H O» Ä 4J ^ 0» G # * ? « ff* O, * -* 5. ‘ ' S I· y* β H O -I * z* φ h •H !*> 't* mi m ^ 51 ·* ^ m» 3 V) s, 5 ». s Ti _i H ** 6 ®* ^ u M Λ ^ i? ® 5 >» £ S 5 «* »* _ q C 3 S * .2 H iH 9 ,2* β O» e» -* >, >, H H «-· » ^ 5* H H Λ 0*r- -i £ * C* t* %«, >» h >»»-* p* r* S ^ ^ mm* H 1/1 H #HI kl 1^· Λ S ϊ* 0*3 o Oi «m a. m * ® 2 J! #- #4 JC ® Tj 3 <0 0. ^ Λ " " ΐ* e >. ^ H O* > »7» M H *2 ? t, c e «* O' ji g* H ^ ^ 5 0* o» « ° w U M « Γ. 5 > f 2 5 * e. g s S S I I g. > * ** "* 04 , M W *ö ® io i2 *S m h c » £ i S 5 S 1 i J " " _ m C H ^ . H . ^ m h o > D*-e· * *® * ® ^ - «5 g£ JS £S ί w m rn-i —* rv n o > v ,ίί rtv ^ x \o m *-> * -♦ ^ ^ u j a/tai - se säätelee jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukaisen sekvenssin, joka koodaa proteiinia, ilmentymistä Kluyve-romyces lacitsissa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen nukleotidise- kvenssi, tunnettu siitä, että sillä on nukleoti-disekvenssi ORF A, joka käsittää nukleotidit 1 - 1560 kuvan 2 sekvenssissä tai se hybridoituu ORF A: lie komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuh- 10 teissä (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) .

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen nukleotidise-kvenssi, tunnettu siitä, että sillä on ORF A:n koodaava sekvenssi I: Sekvenssi I AT GGTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAAGGCTTCC TTGTACGCTC AAGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTGGTTTCGG TGGTCAAACC AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTGAG ATTGGAATGT ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTGGCT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT GGTGAAAAGA AGCAAAAGGG TCAAGCTTTG CAATTCTGA 15

9. Patenttivaatimuksen 6 mukainen nukleotidise-kvenssi, tunnettu siitä, että sillä on nukleoti-disekvenssi III, joka käsittää nukleotidit 1 - 628 kuvan 2 sekvenssissä tai ORF A sekvenssin transkription pro- 20 moottorialue, joka sisältyy mainittuun nukleotidise-kvenssiin III.

10. Kofaktori, joka kykenee lisäämään syklohek-simidiresistenssiä, jonka on aiheuttanut proteiini, joka on koodattu jonkin patenttivaatimuksista 7 tai 8 mukai- 25 sessa nukleotidisekvenssissä, tunnettu siitä, että se on kuvan 2 sekvenssin nukleotidien 1561 ja 2740 välillä, edellyttäen, että se tuottaa resistenssin syk-loheksimidipitoisuustasolle yli 100 μρ/ιηΐ eukaryootti-sessa isännässä, joka on modifioitu insertoimalla mai- 30 nittu nukleiinihapposekvenssi ja resistenssiproteiinia koodaava nukleiinihapposekvenssi olosuhteissa, jotka mahdollistavat näiden proteiinien tuoton.

11. Sykloheksimidiresistenssiproteiini, tunnettu siitä, että proteiini vastaa aminohap-5 posekvenssiä A: SEKVENSSI A * *i «* » * -H * > j* % 2 «H Hl *“» ** el ^ * [j ζ i 0s Ä 4J O' # et m m ff 5 | 5 > « O» A * — m n ei w >, M *-l >> jjj* y* « -rl O -I — i* C M 3 S ϊ*_ Jj et M M >· ς* S m o* +* o* ·» ” β 3 f» ** jj* M "*4 Ή 6 O' ^ i« V) 5*1

12. Sykloheksimidiresistenssiproteiini, tunnettu siitä, että proteiinia koodaa nukleoti-disekvenssi I, : Sekvenssi I AT GGTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAA G G CTTGC TTGTACGCTC AAGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTGGTTTCGG TGGTCAAACC AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTGAG ATTGGAATGT ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTGGCT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT GGTGAAAAGA AG CAAAAG G G TCAAG CTTTG CAATTCTGA 15 sekvenssin I osa tai sekvenssi, joka hybridoituu sekvenssille I komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) , edellyttäen, että tällainen proteiinia koodaava sekvens-20 sin osa tai sekvenssi, joka hybridoituu sekvenssille I komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C)kykenee aiheuttamaan resistenssin sykloheksimidipitoisuudelle sama tai yli kuin 100 kun se viedään eukaryootti- 25 isäntään sen ilmentymisen mahdollistavissa olosuhteissa.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen proteiini, joka on Kluyveromyces lactisista saatu proteiini .

14. Rekombinanttivektori, joka on erityisesti kloonausta ja/tai ilmentymistä varten ja on erityisesti plasmidin tyyppinen, tunnettu siitä, että se sisältää ainakin yhden patenttivaatimuksista 1-10 mukaisen nukleotidisekvenssin säätelyelementtien kontrollin alaisena, joihin säätelyelementteihin kuuluu 5 promoottori, joka on mahdollisesti indusoitava, sekä transkription terminaatiosekvenssi.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vektori soveltuu ilmennettäväksi hiivoissa, kuten Pichia pastoris, tai vektori 10 soveltuu ilmennettäväksi eläinsolussa, esim. baculovi-rus, tai vektori soveltuu ilmennettäväksi kasvisolussa.

15 Sekvenssi I AT GGTTAACGTT CCAAAGACCA GAAAGACTTA CTGTAAGGGT AAGGAGTGCC GTAAGCACGC CCAACACAAG GTTACCCAAT ACAAGGCTGG TAAGGCTTCC TTGTACGCTC AAGGTAAGAG AAGATATGAC CGTAAACAAT CTGGTTTCGG TGGTCAAACC AAGCAAATTT TCCACAAGAA AGCTAAGACT ACCAAGAAGG TCGTTTTGAG ATTGGAATGT ATGTCCTGTA AGACCAAGAC CCAATTGGCT TTGAAGAGAT GTAAGCACTT CGAATTGGGT GGTGAAAAGA AG CAAAAG G G TCAAG CTTTG CAATTCTGA tai joka hybridoituu sekvenssille I komplementaarisen sekvenssin kanssa hyvin ankarissa olosuhteissa (0.1 x SSC, 0.1 % SDS, 65 °C) , ja kykenee aiheuttamaan K. lac-tisissa resistenssin sykloheksimidipitoisuudelle yli 100 20 μρ/ιηΐ, ja edullisesti yli 1 mg/ml.

16. Jonkin patenttivaatimuksista 14 tai 15 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi spesifisen nukleiinihapon, jota halutaan 15 ilmentää valitussa eukaryoottisessa isännässä ja joka on säätelyelementtien kontrollin alaisena, jotka säätely-elementit ovat välttämättömiä sen ilmentämiseksi isän-täsolussa.

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen vektori, 20 tunnettu siitä, että nukleiinihappoa kontrolloi säätelyelementit, jotka kontrolloivat jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukaisen sekvenssin transkriptiota.

18. Eukaryoottinen solu, tunnettu siitä, että solu on transformoitu jonkin patenttivaatimuk- 25 sista 14-17 mukaisella vektorilla ja on erityisesti hiivasolu, kuten Pichia pastoris, eläinsolu, esim. hyönteisen solu tai nisäkkään solu, erityisesti hiiren tai apinan solu, ihmisen solu, tai kasvisolu.

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen rekombi-30 nanttivektori, tunnettu siitä, että rekombinant- tivektori sisältyy E.coli DH50C kantaan, joka on talletettu CNCM laitokseen 2.7.1991 talletusnumerolla 1-1121.

20. Jonkin patenttivaatimuksista 14-17 mukaisen 35 vektorin käyttö valikointijärjestelmässä, joka perustuu spesifisesti sykoheksimidityyppiseen markkeriin euka-ryootti-isännässä ja on erityisesti tarkoitettu spesifi- sen heterologisen nukleiinihapon tähän isäntään liittymisen toteamiseen.

21. Menetelmä heterologisen nukleiinihapon läsnäolon toteamiseksi isäntäsolussa, tunnettu 5 siitä, että menetelmään kuuluu vaiheet: - isäntäsolun transformaatio ilmentymisvektorilla, joka sisältää eräässä sen replikoitumiselle epäolennaisista kohdista heterologisen nukleiinihapon, jonkin patenttivaatimuksista 1-10 mukaisen nukleotidisekvenssin sää- 10 telyelementtien kontrollin alaisena, jotka säätelyele-mentit ovat välttämättömiä tällaisten sekvenssien ilmentymiselle valitussa isäntäsolussa, - näin transformoidun isäntäsolun viljely, - isännän saattaminen kosketuksiin määrätyssä pitoisuu-15 dessa olevan sykloheksimidin kanssa ja tälle antibiootille resistenssin isännän toteaminen.