JPS6248385A - シクロヘキシミド耐性遺伝子、その製造方法、該遺伝子を含む組み換えベクタ−及び該遺伝子を含む形質転換体 - Google Patents

シクロヘキシミド耐性遺伝子、その製造方法、該遺伝子を含む組み換えベクタ−及び該遺伝子を含む形質転換体

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JPS6248385A
JPS6248385A JP60188291A JP18829185A JPS6248385A JP S6248385 A JPS6248385 A JP S6248385A JP 60188291 A JP60188291 A JP 60188291A JP 18829185 A JP18829185 A JP 18829185A JP S6248385 A JPS6248385 A JP S6248385A
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Japan
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cycloheximide
gene
mold
resistant
transformant
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Masamichi Takagi
正道 高木
Keiji Yano
矢野　圭司
Ichiro Shibuya
一郎 渋谷
Minoru Morikawa
森川　実
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Nikka Whisky Distilling Co Ltd
Original Assignee
NIKKA UISUKII KK
Nikka Whisky Distilling Co Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はシクロヘキシミドにより蛋白合成が阻害されな
い性質を賦与するシクロヘキシミド耐性遺伝ｆ、その製
造方法、該耐性遺伝子を含む組換えベクター及び該耐性
遺伝子を含む形質転換体に関するものである。
［従来の技術］ シクロヘキシミドが種々の真核生物に対して６０Ｓ（沈
降定数）リポゾームのサブユニー／　）蛋白に結合して
蛋白合成を阻害する抗生物質であることは知られている
。
一方、リポ、シームのシクロヘキシミド感受性を変える
突然変異は今日までにいくつかの真核生物で報告されて
いる。
サツカロマイセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は野性株ではシクロ
へキシミド感受性であるが、いくつかのシクロへキシミ
ド耐性変異株が分離されでいる。この場合、リポゾーム
蛋白をコードしている構造遺伝子の変化がシクロヘキシ
ミド耐性に起因していることが知られており、その１つ
にｃｙｈ２変異（パルター　ステックライムとボルフガ
ング　ピエペルスベルグのカレント　ジェネティクス（
Ｗａｉｔｅｒ　　ＳＬｏｃｋｌｅｉｍａｎｄ　　Ｗｏｌ
ｆｇａｎｇ　　Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　　Ｇｅｎｅｔ　１ｃｓ）。
１．１７７〜１８０　（１９８０））がある。
また、タルイベロマイセス　フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃａｓ　　ｆｒａｇｉｌｔｓ）という酵母は野
性株そのものがシクロへキシミド耐性であるが、この場
合にもリポゾーム蛋白がシクロヘキシミドに対して非感
性であることが証明されている。
これらのデータは、アダッテーパンビアとディピース（
Ａｄｏｕｔｔｅ−Ｐａｎｖｉｅｒａｎｄ　　Ｄａｖｉｅ
ｓ）によって議論された薬剤の膜透過の変化による耐性
獲得以外に、リポゾームの蛋白をコードしているいくつ
かの遺伝子の構造がシクロヘキシミド感受性を決定して
いることを示唆している。
［発明が解決しようとする問題点］ そこで、リポゾーム蛋白をシクロヘキシミド耐性とし、
シクロヘキシミドによる蛋白合成の阻害がない機能を賦
午する遺伝子が要！されている。
［問題点を解決するための手段］ 上記要望に対し、本発明によれば、 ＣＴＡＧＡＧＣＡＣＡ　　　ＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＡＡ
ＣＧＴＴＡＴＴＡ　　　ＣＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴ
ＧＡＡＴＴＧ　　　ＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧ
ＴＴＴＡ　　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＡＡＡＡＣＡ
ＴＡ　　　ＡＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＧＴＧＡＣ
ＡＡＡＡＡＡＡＴＧＴＡＣＧＴＴＴＡＴＣＴ　　　ＡＣ
ＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＧＴＡＡ　　　ＡＧＡＡ
ＡＡＣＣＣＡＴＡＣＡＣＡＣＡＣＡ　　　ＣＡＣＣＣＣ
ＣＧＣＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴ　　　ＡＴＡＡＡＴＡＡ
ＡＣＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴ　　　ＣＣＡＡＡＴＴＴＴＴ
ＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　　　ＡＴＴＣＣＣＣＣＴＴＴＴ
ＴＣＴＴＴＴＡＧ　　　ＡＡＡＡＧＡＴＴＣＣＴＴＡＡ
ＴＴＴＧＴＧ　　　ＣＡＴＴＡＣＴＴＴＣＴＧＡＴＴＴ
ＴＧＣＴ　　　ＡＧＡＣＴＧＡＴＡＣＴＡＴＧＧＧＴＡ
ＣＧ　　　ＴＡＡＴＴＧＡＡＴＣＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣ
ＴＧＡＣＧＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＣＴ　　　ＡＡ
ＣＣＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＡＴ　　　ＴＣＣＡ
ＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴ　　　ＡＴＴＧＴＡ
ＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＴＧＴ　　　ＣＧＴＡＡＡＣＡ
ＴＡＣＧＡＴＴＣＡＣＡＡ　　　ＧＧＴＧＡＣＴＣＡＡ
ＴＡＣＡＡＡＴＣＡＧ　　　ＧＴＡＧＡＧＣＴＴＣＣＴ
ＴＡＴＴＴＧＣＴ　　　ＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＡＡＧ
ＡＴＡＣＧＡ　　　ＴＡＧＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＧＧ
ＴＡＴＧ　　　ＧＴＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＡＧ
ＴＴ　　　ＴＴＣＣＡＴＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣ
ＧＡＣＴＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡ　　　ＡＧ
ＴＴＧＧＡＡＴＧＴＡＣＴＧＴＴＴＧＴ　　　ＡＡＡＡ
ＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＧ
ＡＴＧＴＡＡＡＣＡＴＡ　　　ＴＴＧＡＡＴＴＧＧＧＴ
ＧＧＴＧＡＡＡＡＡ　　　ＡＡＡＣＡＡＡＡＡＧＧＴＣ
ＡＡＧＣＡＴＴ　　　ＡＣＡＧＴＴＣＴＡＧＧＴＡＣＡ
ＴＧＴＴＧ　　　ＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＴ
ＣＣＣＣＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡ　　
　ＣＡＡＡＡＣＴＡＧＴＴＴＴＧＴＡＧＡＴＴ　　　Ｇ
ＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＡＴＧ　　　ＴＧＴ
ＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴ　　　ＧＣＡＧＡ
ＴＴＡＣＡＣＡＣＧＴＣＡＡＡＡ　　　ＡＡＡＴＧＡＴ
ＴＡＡＡＣＡＣＡＣ：ＡＣＧＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＣＴＴＴＣＣＴ　　　ＴＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴ
ＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＣＣＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＧ
ＡＡ　　　ＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣ
ＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣＴＡＴＴＡＣＡＴＡ　　　ＴＣ
ＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＴＴＴＡＡＣＡＴ　　　ＴＴＣＡ
ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡＡＣＴＡ　　　ＡＣＡＴＴＣ
ＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＣＡＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴ
ＡＴＣＴＴＴＡＴＴ　　　ＣＴＡＧＣＡＴＣＴＡＣＡＣ
ＣＣＡＴＡＡＡ　　　ＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＴＣ
ＡＣＴＡＣＡＡＣＣＡＴＴＣ：ＣＴＣＡＴＡＴＣＡＴＴ
Ｔ　　　ＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＣＴＴ　
　　ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＴＣＡＡＡＧＴ　　　
ＴＴＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＡＧＡＴＡＡＴＧ　　　ＡＡ
ＣＴＴＴＧＡＴＣで表わされるシクロヘキシミド耐性遺
伝子が提供される。
さらに、末完１９１によれば、前記１′！！基配列で表
わされるシクロへキンミド耐性遺伝ｆの製造方法。
該遺伝ｆを含む組換えベクター、形質転換体、さらには
該遺伝子を有するキャンディダ　マルｈ　−サが提供さ
れる。
本発明のシクロヘキシミド耐性遺伝子、それを含む組換
えベクター及び該耐性遺伝子を含む形質転換体は例えば
次のように作製することができる。
まず、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母
菌を例えばＭＹ培地に培養する。
所定鈴間経過後、前記酵母菌からシクロへキンミド酎性
逍伝子を〃１限酵素ＸｂａＩ及び５ａｕ３Ａ［によって
切り出す。
この遺伝子断片をＴ４−ＤＮＡ連結酵素によりプラスミ
ドＹＥｐ１３に挿入して新規な組換えベクターを作製し
た。この新規な組換えベクターをヒンネン等らのプロト
プラスト形質転換法（ヒンネン、ヒックス、フィフクの
プロシーディングオブ　ナシ目ナル　アカデミ−オブ　
サイエンス、アメリカ合衆国（Ｈｉｎｎｅｎ、Ａ、。
Ｈｒｃｋｓ、Ｊ、Ｂ、　　、Ｆｉｎｋ、Ｇ、Ｒ，。
たは伊藤らのリチウム金属形質転換法（伊藤、福Ｕ］、
材用、来月のジャーナル　／ヘタテリオロジー（Ｉｔｏ
、Ｈ，、Ｆｕｋｕｄａ、Ｙ、。
Ｍｕｒａｔａ、Ａ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
）１５３．１６５　（１９８３））などの公知の方法に
よってシクロヘキシミドに対して非耐性の菌体に移入し
形質転換体を作製する。
ここで用いられる酵母菌はキャンディダ属に属するもの
であればよく、例えば、キャンディダマルトーサ（Ｃａ
ｎｃｔｆｄａ　　ＭａｌｔｏＳａ）ＩＡＭ１２２４７や
ＩＡＭ１２２４８等、キャンディダ　ギリアモンディ（
ＣａｎｄｉｄａＧｉ　Ｉ　ｌｅｒｍｏｎｄｉ　１）ＩＦ
ＯＯ５６Ｂ等が挙げられる。
酵母菌からシクロヘキシミド耐性遺伝子を取り出す工程
は次の通りである。
培養菌体より、全ＤＮＡを抽出、精製後、適当な制限酵
素、例えば５ａｕ３ＡＩを用いて小断片に分解後、ベク
ター　プラスミド’ＹＥｐ１３に連結し、ジーン　ライ
ブラリーを作製する。
そして、このジーン　ライブラリーで酵母サツカロマイ
セス　セレビシェを形質転換させ、シクロヘキシミドを
含む培地で３０℃培養を行い、数［１後コロニーを形成
したものを分離する。再びシフａへキシミドを含む培地
にて培養後、菌体よりプラスミドを抽出する。
次いで、得られたプラスミドを適当な制限酵素例えば５
ａｕ３ＡＩ及びＸｂａｌにテ９Ｊ断し、キャンディダｆ
ｆｌ　ｍ由来のシクロヘキシミド耐性遺伝子を分離する
。
次いで、このシクロヘキシミド耐性遺伝子をプラスミド
に組み込み、組換えベクターを作製するには、制限酵素
を用いてベクターを切断し、シクロへキシミド耐性遺伝
子をＴ４−ＤＮＡ連結酵素を用いて連結する。
本発明の新規なシクロヘキシミド耐性遺伝子の塩基配列
の決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）？のＭ１３ファージ
を用いた公知のグイデオキシ法によって行った。（サン
ガー、ニツクレン及びコールソンのプロシーディング　
オブ　ナショナルアカデミ−オブ　サイエンス、アメリ
カ合衆国（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ。
ａｎｄ　　Ｃｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７４゜５４６
３〜５４６７　（１９７７））、（メシングのエンジモ
ロジ一方法−組換えＤＮＡ、パート２０〜７８（１９８
３）） シクロへキシミド耐性遺伝子の適用例、応用例としては
次のものが考えられる。
酵母菌で用いられるプラスミドベクターにシクロヘキシ
ミド耐性遺伝子を組み込む、このベクターを非耐性菌（
例、サツカロマイセス　セレビシェ）に移入し、シクロ
へキシミドを加えた培地で生長してくる株を選抜すれば
、それは耐性株である。
今、シクロヘキシミド耐性遺伝子を含むベクターに他の
有用物質の遺伝子を組み込む、そして、Ｌ述と同様にし
てシクロヘキシミド耐性株を分離すると、それは４１用
物質の生産能を有するものである。
［実施例］ 次に、本発明を実施例に基いて更に詳細に説明する。
［実施例１］ キャンディダ　マルトーサＩＡＭ１２２４７の増殖がシ
クロヘキシミド（ｃｙＨ）１４加により阻害され、一定
時間後に回復する様子を第１図に示す。
キャンディダ　マルトーサＩＡＭ１２２４７はＬ字管で
次に示す合成培地中で３０℃で振とう培養した。
合成培地組成（ｌ立あたり） ＮＨａＣｌ　　　　　　　　　２　、５　ｇＫＨ２ＰＯ
４２１、Ｏｇ Ｎａ２　ＨＰＯ４φ　１２Ｈ２０６、ＯｇＭｇＳＯａ・
７Ｈ２００、２ｇ Ｍａｉｌ　　　　　　　　　　　　　　０　　、　１　
　ｇ酵母エキス　　　　　ｏ、Ｉｇ ＦｅＳＯａ　　　　　　　　　　　　　５　　、　　Ｏ
ｍ　ｇＺｎＣ１２０，５ｇ ＣａＣＩ？ｌ　　、　　Ｏｍ　ｇ ＣａＣｈ　　　　　　　　　　　　　０．５ｍｇＮａ２
）ｌａＯａ　　　　　　　　　　　　０　．５　ｍ　ｇ
ＣｕＳＯ４１，０ｍｇ グルコース　　　　１０．０ｇ ｐＨ５、９ 成長曲線は波長６６０ｎｍでの吸光度変化により自動的
に記録された。尚、各曲線はそれぞれ曲線Ｉ　Ｃ−）ニ
ジクロヘキシミド無添加１　（＋）　　：矢印の時間テ
ア　００　ｐＬｇ　／　ｍ　ｌのシクロヘキシミドを添
加 ２　（−）　　：　２５　＃Ｌｇ／ｍ見のシクロヘキシ
ミドを添加 ２（＋）：２５ルｇ／ｍ交のシクロヘキシミドを添加し
て増殖させ、矢印 の時間に７ｏｏｇｇ／ｍ交シク ロヘキシミドをさらに添°加 ３　　　　ニア００ｇｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを添
加 の場合を示す。
［実施例２］ キャンディダ　マルトーサＩＡＭ１２２４７のシクロヘ
キシミド非耐性及び耐性株のシクロへキシミド存在下に
おけるポリ（ｐｏｌｙ）Ｕ蛋白合成ｆ距を検討した。
シクロヘキシミド耐性株はＭＹ培地（１文あたり酵母エ
キス３ｇ、麦汁３ｇ、バクトペプトン５ｇ）に５０　ｇ
ｇ／ｍｌのシクロへキシミドを添加して生長させること
によって得られた。非耐性株はＭＹ培地のみで生長させ
た。
両者の酵母菌体を乳化培地（８，５％マンニトール、２
　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ−アセテート、３０ｍＭヘベスｌＩｌ
衝液、ｐＨ７，４，２ｍＭジチオスレイトール、１００
ｍＭＫ−アセテート）に１ｇ湿重發／１．２５ｍＭにな
るように懸濁し、３〜４ｇのガラスピーズ（直径０．４
５〜０．５ｍｍ）で１分間、３回激しく振りながら、酵
母菌体を破砕する。
この粗酵素液をｌｏｏｏｒｐｍ、２分間遠心した後、上
清液を更に３０．ＯＯＯＸｇ、２０分間遠心し、上清液
を得る。得られた上清液は０゜５ｍＭＡＴＰ存在下で２
０℃、１０分間保温し、内在性ｍＲＮＡを分解し、その
後セファデックスＧ−２５（ファーマシ７社、スウェー
デン）（２ｍＭ　　Ｍｇ−アセテート、３０ｍＭヘペス
緩衝液、ｐＨ７，４，２ｍＭジチオスレイトール、１０
０ｍＭＫ−アセテートで平衡化したもの）でリポゾーム
画分を溶出した。
このリポゾーム画分を用いて、次に示す反応溶液、反応
温度でポリＵによるポリペプチド（ポリフェニルアラニ
ン）合成能がシクロヘキシミドで阻害される様子を測定
した。結果を第２図に示す０反応溶液（１００終見） ３８．０ｍＭ　　へペス緩衝液、ｐＨ７，４２，５ｍＭ
　　Ｍｇ−アセテート ２２０．０ｍＭ　　Ｋ−アセテート ２．７ｍＭ　　ジチオスレイトール −０，５ｍＭ　　ＡＴＰ Ｏ，１ｍＭ　ＧＴＰ ２０．０ｍＭ　　クレアチンリン酸 ２０、ＯＪＪ、ｇ　　クレアチンキナーゼ２．０ｍＭ　
　グルコース−６−リン酸Ｌ２５．Ｏ蓼ｇ　ポリＵ ２ユニツトＣ０Ｄ２６０）　　リポゾーム画分１終Ｃｉ
　　　［ｌＧ］　フェニルアラニン（５０４ｍＣｉ／ｍ
ｍｏ　ｌ） 反応温度　２０℃ 反応中に１０ｔｔ、ｌづつ取り出し、熱酸不溶画分にく
る放射能の驕を測定した。
図中、［争→］はシクロへキシミド耐性菌による蛋白合
成能、［０−０１はシクロへキシミド非耐性菌による蛋
白合成能を示す。
［実施例３］ シクロヘキンミド耐性キャンディグ　マルト−サＩＡＭ
１２２４７のリポゾームが変化したために耐性になった
ことを示す実験である。
七ファデックスＧ−２５を用いて得られたりポゾーム画
分（実施例２を参照）を０．８％トリトｙＸ−１００．
！＝０．７５Ｍ　　ＫＣＩで処理した後、２０．ＯＯＯ
ｒｐｍ、２０分間遠心し、その１清液をさらに３０．Ｏ
ＯＯｒｐｍ、４．５時間遠心し、沈殿画分（リポゾーム
）を実験に用いた。
蛋白合成させるのに必要な可溶画分（リポゾーム以外）
を次の方法で調製した。すなわち、粗解液１５０ｍ交に
７．５ｇ硫安を加え一晩放置した後、１３．ＯＯＯｒｐ
ｍ、３０分間遠心する。沈殿物を回収し、緩衝液（ｌｏ
ｍＭ）　リス−塩酸、　ｐＨ７、６、１０ｍＭ　　Ｍｇ
　ＣＩ２．　ｌ　０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１
０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール）に溶かし、同じ緩衝液に
対して透析した。
試料液（Ｓ−１００画分）はグリセロールを加えて２５
％とし、−８０℃で保存した。調製されたりポゾーム及
びＳ−１００画分を用いて次の方法で蛋白合成能を測定
した。結果を第３図−及び表−１に示す。
反応溶液（１００島文） ５０．０ｍＭ　　　　ト　リ　ス　−　月１酸　、　　
ｐＨ７、６４０，０ｍＭ　　ＫＣｌ ８．０ｍＭＭｇ−アセテート ５．０ｍＭ　　ホスホエノールピルビン酸１．４ｍＭ　
　ＡＴＰ ０．１７ｍＭ　　ＧＴＰ ５．０ｍＭ２−メルカプトエタノール １．０ｍＭ　　スペルミジン ０．５ｍＭ　　ジチオスレイトール ２．５％（Ｖ／Ｖ）　　グリセロール １００〜１２５鉢ｇ　ポリＵ １ユニツト（ＯＩ）＋６ｏ）　　酵母ｔ　ＲＮＡ１ユニ
ツト（００２６０）　　リポゾーム０．１ユニツト（Ｏ
Ｄ２ａｏ）Ｓ−Ｚｏｏ画分ｌ鉢Ｃｉ　　　［＋’Ｃ］　
フェニルアラニン反応温度　　３０℃ 反応組子後２０ル文を取り出し、熱酸不溶画分の放射能
を測定した。
（Ｉ）非耐性サツカロマイセス　セレビシェＡＨ２２株
から調製した５−ｔｏｏ画分を用いて非耐性及び耐性の
りポゾームを用いた結果は第３図に、 （Ｉｌ）キャンｆイダ　マルトーサＩＡＭ１２２４７か
ら；調製した５−ｔｏｏ画分及び耐性キャンディダ　マ
ルトーサＩＡＭ１２２４７から調製した５−ｔｏｏ画分
及びリポゾームを用いた結果は表−１に、 それぞれ示す。
（以下余白） 表−１ またここでＣＹＨ・・・シクロへキシミド［実施例４］ シクロへキシミド耐性遺伝子を含むプラスミドを用いて
、サツカロマイセス　セレビシェを形質転換させた実験
例を示す。
本実験例では、２種類のプラスミドＹＥｐ１３びＹＲｐ
７を用いた。
まず、プラスミドベクターＹＥｐ１３を制限酵素Ｂａ■
ＨＩで切断し、シクロヘキシミド耐性遺伝ｒ−を７４−
ＤＮＡ連結酵素にて連結し、プラスミドＹＥｐ　−ＣＹ
Ｈを作製した。
本プラスミドを酵母サツカロマイセス　セレヒシエＡＨ
２２株（交。、１−）にヒンネン等の方法を用いて、形
質転換を行い、１．２Ｍンルビトールを含む栄養寒天培
地（ＹＰＤ培＃Ａ：酵母工午ス１％、ポリペプトン２％
、グルコース２％：３％寒天）ＬＯｒｎＪｌ中に埋込ん
だ、３０℃にて１８時間培養後シクロヘキシミドを１０
　ｇ　ｇ　／　ｍ　ｌを含んだ１０ｍ１の栄養寒天培地
を重層し、３０℃にて４〜５日間培養を行った。
培養の結果、いくつかのコロニーが形成された。これら
のコロニーからプラスミドを抽出したところ、ＹＥｐ−
ＣＹＨが回収された。このことから、本シクロヘキンミ
ト耐性遺伝子は゛酵母のＹＰ、ηＩヘクターを用いて、
形質転換時のマーカーとして使用できることが確認され
た。
次に、ベクターＹＲｐ７を、上記と同様にして、制限酵
素Ｂａ層ＨＩで切断し、シクロへキシミド耐性遺伝子を
Ｔ４−ＤＮＡｉｎ結酵素でＹＲｐ７！、ＩＪ　ＩＩｉ部
位に連結し、プラスミドＹＥｐ　−ＣＹＨを作製した０
本プラスミドを酵母サツカロマイセス　セレビシェ０１
３−ＩＡ株（ｔｒｐ−）に伊藤らのリチウム金属形質転
換法で形質転換させた。
そののち、上記と同様のシクロヘキシミドを含む重層法
により培養したところ、コロニーが形成された。これら
のコロニーからプラスミドを抽出し、ＹＲＰ　−ＣＹＨ
が回収できた。
以−ヒのことから、本ンクロへキシミド耐性遺伝子はＹ
Ｒｐ型ベクターを用いて、形質転換時のマーカーとして
利用できることが確認された。
［実施例５］ キャンディダ　ギリアモンデ−ＩＦＯＯ５６６のシクロ
へキシミド耐性が誘導されてくることを示した。
Ｌ字管中でＭＹ培地１０ｍ文で一晩振とぅ培養して十分
増殖させたのち、新しいＭＹ培地１０ｍ１に１％になる
ように植菌し、次に示す条件下で振とう培養した。成長
曲線は波長６６０ｎｍの吸光度変化により記録した。結
果を第４図に示す。
なお、曲線　（１）；無添加 （２）；２５鉢ｇ／ｍ文シクロヘ キシミド添加 を示す。
［実施例６］ キャンディダ　マルトーサＩＡＭ１２２４７の全ＤＮＡ
を制限酵素５ａｕ３ＡＩにて部分分解後。
ベクターＹＥｐ１３を制限酵ＪＢａｍＨＩにて切断した
ものに、Ｔ４−ＤＮＡ連結酵素を用いて連結させた。
これを、Ｍ　ｆＪサツカロマイセス　セレビシェＡＨ２
２株に伊＋Ｆｉ等のリチウム金属形質転換法にて、形質
転換を行った。
形質転換体をシクロへキシミドを含む培地に移稙後、３
０℃培養を行い、数１１後コロニーを形成したものを分
離した０次いで、シクロへキシミド耐性となった株より
、プラスミドＤＮＡを抽出。
このプラスミドをｐ　ＣＹＨと命名した。
また、前記形質転換体をＡＨ２２（ｐＲＩＭ−Ｃ）と名
付けた。
サツカロマイセス　セレビシェＡＨ２２（ｐＲＩＭ−Ｃ
）をＬ字管を用いてロイシンを含む合成培地中で、２Ｆ
１間振とう培りし、部分に成長させる。
次に、菌体懸濁液を新しいＹＰＤ培地に１％だけ植菌し
、次の条件下で培養した。成長は波長６６０ｎｍの吸光
度変化で追跡した。結果を第５図に示す。
曲線　（１）：無添加 （２）；５ＡＬｇ／ｍ文シクロへキシミド添加 （３）：非形質転換体をシクロヘキシミド添加培地で成
長させた場合 を示す。
なお、（２）の条件で、吸光度（ＯＤ６６０　）　＝０
．３のとき、７００ａｇ／ｒｎｌのシクロヘキシミドを
添加しても有αな成長阻害は見出されず、生長を続けた
。
［発明の効果］ 未発明は以にの通り、蛋白合成を阻害する抗生物質であ
るシクロへキシミドに対して、耐性の機走を賦与する遺
伝子と、その製造方法などを提供するので、このａ伝子
を有用物質の遺伝子と共にプラスミドに組み込むことに
より、有用物質の生産プラスミド株を何等支障なく検出
できる。
さらに、この耐性遺伝子を組み込んだベクターが細胞内
に存在するかしないかはシクロへキシミドの添加によっ
て耐性の有無として容易に検出されるのでベクターマー
カーとしても使用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図はキャンｆイタ　マルトーサの増殖に対するシク
ロへヤンミト（ＣＹＨ）添加の影響を２Ｉ（ずグラフ、
第２図はキャンディグ　マルトーサのシクロヘキンミ）
”１４１性株及び非耐性株のＣＹＨ存在ドにおけるポリ
Ｕ蛋白合成能奈示すグラフ、第３図はＣＹＨ酎性耐び非
耐性のキャンディグマルトーサの蛋白合成上を示すグラ
フ、第４図はキャンディグ　ギリアモンディのＣＹＨ耐
性の誘導過程を示すグラフ、第５図は本発明に係るＣＹ
Ｈ耐性遺伝子を含む形質転換体の増殖過程を示すグラフ
である。 特許出願人　ニッカウヰスキー株式会社「−ｂ′５７山
　ＩＩ（、駅　（方式）昭和６０年１２月１２１１ 特、；ｉｊｉ長官　　宇ｒｉ　　道理　殿１　・１へ件
の大小 昭和６０イ１特、、′Ｆ願第１８８２９１　＋＞２　発
明の名称 ／クロヘキンミト耐性逍伝ｆ−１その製造方法、該逍仏
ｒ−を含む組み換えヘクター及び該潰伝ｒ−を含む形質
転換体 ３　補＋Ｅをする者 ・１１ヂ１との関係　特１４出頴人 名称　ニッカウキスギー　株式会社 ４　代理人 住所　　東京都中央区銀座２　ｒｌ’−１１５番３　％
３深谷−大沢ビル３階　ｔｔ　０３（５４３）２６０ｆ
ｉ■５、負１ｊ　＋１日命令のｎ　＋を 昭和６０年１１月６１１ （９，送Ｉ］　昭和６０年１１月２６日）６、補ＩＦの
対象 図面 ７、補正の内容 （１）図面の「第１図」、「第２図」、「第３図」、「
第４図」、［第５図」を別紙添付のものに補正する。 （２）委任状については、１眉、ｆｌｌ　６０年９　Ｊ
−１２４日付の手続補正占において提出済みである。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）【遺伝子配列があります】 で表わされるシクロヘキシミド耐性遺伝子。
  2. （２）下記（イ）（ロ）の工程を含むことを特徴とする 【遺伝子配列があります】 で表わされるシクロヘキシミド耐性遺伝子の製造方法。 （イ）キャンディダ属に属する酵母菌を培地で培養する
    。 （ロ）前記酵母菌からシクロヘキシミド耐性遺伝子を制
    限酵素Ｘｂａ I と制限酵素Ｓａｕ３Ａ I とによって切
    り出す。
  3. （３）【遺伝子配列があります】 で表わされるシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む組換え
    ベクター。
  4. （４）【遺伝子配列があります】 で表わされるシクロヘキシミド耐性遺伝子を含む形質転
    換体。
  5. （５）【遺伝子配列があります】 で表わされるシクロヘキシミド耐性遺伝子を有するキャ
    ンディダマルトーサ。
JP60188291A 1985-08-27 1985-08-27 シクロヘキシミド耐性遺伝子、その製造方法、該遺伝子を含む組み換えベクタ−及び該遺伝子を含む形質転換体 Pending JPS6248385A (ja)

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FR2679253B1 (fr) * 1991-07-15 1994-09-02 Pasteur Institut Proteines de resistance a la cycloheximide. utilisation comme marqueur de selection par exemple pour controler le transfert d'acides nucleiques.
CN112575013B (zh) * 2020-12-24 2022-05-17 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 基因gnatb作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用

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