JP2000189160A - Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造法 - Google Patents
Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造法Info
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- JP2000189160A JP2000189160A JP10373248A JP37324898A JP2000189160A JP 2000189160 A JP2000189160 A JP 2000189160A JP 10373248 A JP10373248 A JP 10373248A JP 37324898 A JP37324898 A JP 37324898A JP 2000189160 A JP2000189160 A JP 2000189160A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 キャッサバ（Cassava, Manihot esculen
ta) 由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.
37)をコードする遺伝子を酵母染色体組込み型発現ベク
ターへ組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換された
ピキア(Pichia)に属する酵母を培地に培養し、培養物か
らS-ヒドロキシニトリルリアーゼを得ることを特徴とす
る、S-ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子工学的手法によりS-
ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産させ
ることができる。
ta) 由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.
37)をコードする遺伝子を酵母染色体組込み型発現ベク
ターへ組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換された
ピキア(Pichia)に属する酵母を培地に培養し、培養物か
らS-ヒドロキシニトリルリアーゼを得ることを特徴とす
る、S-ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。 【効果】 本発明によれば、遺伝子工学的手法によりS-
ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産させ
ることができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組
込んだ組換え酵母菌によるS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの製造方法に関する。
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を組
込んだ組換え酵母菌によるS-ヒドロキシニトリルリアー
ゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリル
リアーゼ(EC 4.1.2.37)は芳香族および／または脂肪族
のカルボニル化合物と青酸とから光学活性なS-シアノヒ
ドリンを合成するために有効な酵素である。本酵素を用
いた光学活性シアノヒドリンの合成は、種々の光学活性
中間体を合成する上で極めて有用である。しかしなが
ら、本酵素はキャッサバの組織に微量含まれるに過ぎ
ず、工業的に利用することは困難であった。これまで、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼをコー
ドする遺伝子を組込んだ組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を
培養することによって該酵素を製造した例が知られてい
る（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35, 437-439, 1996 、Bio
technol. Bioeng. 53, 332-338, 1997）。しかし、大腸
菌を宿主とする方法では、生産性が高くないこと、酵素
生産のための培養に高価な抗生物質や誘導基質を培地に
添加することが必要であるなどの弊害があり、安価に効
率よく該酵素を生産することは困難であった。
リアーゼ(EC 4.1.2.37)は芳香族および／または脂肪族
のカルボニル化合物と青酸とから光学活性なS-シアノヒ
ドリンを合成するために有効な酵素である。本酵素を用
いた光学活性シアノヒドリンの合成は、種々の光学活性
中間体を合成する上で極めて有用である。しかしなが
ら、本酵素はキャッサバの組織に微量含まれるに過ぎ
ず、工業的に利用することは困難であった。これまで、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼをコー
ドする遺伝子を組込んだ組換え体ＤＮＡを含む大腸菌を
培養することによって該酵素を製造した例が知られてい
る（Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35, 437-439, 1996 、Bio
technol. Bioeng. 53, 332-338, 1997）。しかし、大腸
菌を宿主とする方法では、生産性が高くないこと、酵素
生産のための培養に高価な抗生物質や誘導基質を培地に
添加することが必要であるなどの弊害があり、安価に効
率よく該酵素を生産することは困難であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、遺伝
子工学的手法によりS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効
率よく大量に生産させることを目的とする。
子工学的手法によりS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効
率よく大量に生産させることを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を発
現する宿主として酵母を選択することにより、大腸菌よ
りも大量にS-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産させる
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、キャッサバ由来の
S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を発
現する宿主として酵母を選択することにより、大腸菌よ
りも大量にS-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産させる
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、キャッサバ(Cassav
a, Manihot esculenta)由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼ(EC 4.1.2.37)をコードする遺伝子を酵母染色体
組込み型発現ベクターへ組込んだ組換え体ＤＮＡによっ
て形質転換されたピチア(Pichia)属に属する酵母を培地
に培養し、培養物からS-ヒドロキシニトリルリアーゼを
得ることを特徴とする、S-ヒドロキシニトリルリアーゼ
の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
a, Manihot esculenta)由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼ(EC 4.1.2.37)をコードする遺伝子を酵母染色体
組込み型発現ベクターへ組込んだ組換え体ＤＮＡによっ
て形質転換されたピチア(Pichia)属に属する酵母を培地
に培養し、培養物からS-ヒドロキシニトリルリアーゼを
得ることを特徴とする、S-ヒドロキシニトリルリアーゼ
の製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明においては、まず、高発現
を目的とするキャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼをコードする遺伝子のクローニングを行なう。該
酵素の遺伝子配列は公知であり、文献に公開されている
Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) 。キャ
ッサバの葉より該酵素遺伝子のmRNAを含む全mRNAを抽出
し、定法に従ってcDNAを合成する。公知のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼcDNA配列情報をもとに設計したプライ
マーを使い、PCRによって該酵素をコードする遺伝子を
増幅する。
を目的とするキャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリ
アーゼをコードする遺伝子のクローニングを行なう。該
酵素の遺伝子配列は公知であり、文献に公開されている
Arch. Biochem. Biophys. 311, 496-502, 1994) 。キャ
ッサバの葉より該酵素遺伝子のmRNAを含む全mRNAを抽出
し、定法に従ってcDNAを合成する。公知のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼcDNA配列情報をもとに設計したプライ
マーを使い、PCRによって該酵素をコードする遺伝子を
増幅する。
【０００７】次に、上記操作によって得た該酵素遺伝子
を組換え酵母菌体で発現させるために、該酵素遺伝子の
上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿
入して発現カセットを構築し、これを発現ベクターに導
入する。あるいは、該酵素遺伝子を導入する発現ベクタ
ーに、転写プロモーターとターミネーターが既に存在す
る場合は、発現カセットを構築することなく、その転写
プロモーターとターミネーターを利用してその間に該酵
素酵素遺伝子のみを導入すればよい。いずれの場合であ
っても、発現ベクター中に発現カセットを複数個存在さ
せてもよい。
を組換え酵母菌体で発現させるために、該酵素遺伝子の
上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿
入して発現カセットを構築し、これを発現ベクターに導
入する。あるいは、該酵素遺伝子を導入する発現ベクタ
ーに、転写プロモーターとターミネーターが既に存在す
る場合は、発現カセットを構築することなく、その転写
プロモーターとターミネーターを利用してその間に該酵
素酵素遺伝子のみを導入すればよい。いずれの場合であ
っても、発現ベクター中に発現カセットを複数個存在さ
せてもよい。
【０００８】発現カセット中のプロモーターおよびター
ミネーターは、形質転換する宿主として用いるピチア属
のメタノール資化性酵母内において、メタノール炭素源
下で発現促進されるプロモーターおよび最大限の遺伝子
発現を得るために効率的な転写終結が可能とするもので
あるターミネータであればよいが、具体的には、プロモ
ーターとしてはAOX1プロモーター、ターミネーターとし
てはAOX1ターミネーターが好ましい。
ミネーターは、形質転換する宿主として用いるピチア属
のメタノール資化性酵母内において、メタノール炭素源
下で発現促進されるプロモーターおよび最大限の遺伝子
発現を得るために効率的な転写終結が可能とするもので
あるターミネータであればよいが、具体的には、プロモ
ーターとしてはAOX1プロモーター、ターミネーターとし
てはAOX1ターミネーターが好ましい。
【０００９】上記のプロモーターは、天然型プロモータ
ーの塩基配列からなるＤＮＡのほか、該塩基配列におい
て１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加した塩基配
列からなり、かつプロモーター活性を保持するＤＮＡで
あってもよい。塩基の欠失、置換若しくは付加は、出願
前周知の常套的な技術、例えば部位特異的変異誘発法に
より実施することができる。
ーの塩基配列からなるＤＮＡのほか、該塩基配列におい
て１若しくは数個の塩基が欠失、置換、付加した塩基配
列からなり、かつプロモーター活性を保持するＤＮＡで
あってもよい。塩基の欠失、置換若しくは付加は、出願
前周知の常套的な技術、例えば部位特異的変異誘発法に
より実施することができる。
【００１０】本発明においては、発現ベクターとして酵
母染色体組込み型発現ベクターを使用する。酵母染色体
組込み型プラスミドベクター（yeast integration plas
mid vector) とは、酵母染色体と相同な配列（通常、選
択マーカー遺伝子配列）をもつが、酵母菌体内ではプラ
スミドとしては増殖できず、ベクター上の酵母染色体と
相同な配列と酵母染色体遺伝子との間で相同組換えが起
こり、染色体内部に組込まれたときにのみ酵母細胞内に
保持される。組込まれた遺伝子は選択マーカー遺伝子の
発現が必須な生育環境下でなくとも、安定に保持される
ことが知られている。
母染色体組込み型発現ベクターを使用する。酵母染色体
組込み型プラスミドベクター（yeast integration plas
mid vector) とは、酵母染色体と相同な配列（通常、選
択マーカー遺伝子配列）をもつが、酵母菌体内ではプラ
スミドとしては増殖できず、ベクター上の酵母染色体と
相同な配列と酵母染色体遺伝子との間で相同組換えが起
こり、染色体内部に組込まれたときにのみ酵母細胞内に
保持される。組込まれた遺伝子は選択マーカー遺伝子の
発現が必須な生育環境下でなくとも、安定に保持される
ことが知られている。
【００１１】本発明において使用する酵母染色体組込み
型発現ベクターは、それに挿入したキャッサバ由来のS-
ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を酵母
染色体中に組み込むことのできるものであれば特に制限
はない。例えば、ピチア属のメタノール資化性酵母染色
体に組込む場合は、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815などが挙
げられるが、これらに限定はされない。
型発現ベクターは、それに挿入したキャッサバ由来のS-
ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子を酵母
染色体中に組み込むことのできるものであれば特に制限
はない。例えば、ピチア属のメタノール資化性酵母染色
体に組込む場合は、pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815などが挙
げられるが、これらに限定はされない。
【００１２】上記の酵母染色体組込み型発現ベクター
は、組換え大腸菌でのサブクローニングを行なえる様、
大腸菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が
好ましく、またアンピシリン耐性遺伝子など選択マーカ
ー遺伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベ
クターは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬
剤耐性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺
伝子を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、HIS4、
kanrなどが挙げられる これらはあくまで例示であり、
遺伝子の導入に用いる宿主のピチア株の遺伝子型に応じ
て選択されるべきものである。
は、組換え大腸菌でのサブクローニングを行なえる様、
大腸菌体内部で増殖できるシャトルベクターである方が
好ましく、またアンピシリン耐性遺伝子など選択マーカ
ー遺伝子を含むものがさらに好ましい。また、該発現ベ
クターは、組換え酵母を作成した際に、栄養要求性や薬
剤耐性によって酵母クローンを選抜できる、マーカー遺
伝子を含む。マーカー遺伝子としては、例えば、HIS4、
kanrなどが挙げられる これらはあくまで例示であり、
遺伝子の導入に用いる宿主のピチア株の遺伝子型に応じ
て選択されるべきものである。
【００１３】本発明において、宿主とする酵母は、ピチ
ア属のメタノール資化性酵母を用いるが、前記酵母染色
体組込み型発現ベクターを導入した後、安定に該ベクタ
ーを保持することができるものであれば、特に制限され
ない。ピチア属のメタノール資化性酵母としては、Pich
ia pastoris KM71株、GS115株などを挙げることができ
る。さらに該宿主酵母は、半数体(haploid) または２倍
体（diploid)のいずれの株でも用いることができる。
ア属のメタノール資化性酵母を用いるが、前記酵母染色
体組込み型発現ベクターを導入した後、安定に該ベクタ
ーを保持することができるものであれば、特に制限され
ない。ピチア属のメタノール資化性酵母としては、Pich
ia pastoris KM71株、GS115株などを挙げることができ
る。さらに該宿主酵母は、半数体(haploid) または２倍
体（diploid)のいずれの株でも用いることができる。
【００１４】キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリア
ーゼをコードする遺伝子を組込んだ染色体組込み型発現
ベクターを上記宿主に組込んで、目的とするS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼ生産能を持つ組換え酵母を得るに
は、定法の形質転換法によって行えばよい。
ーゼをコードする遺伝子を組込んだ染色体組込み型発現
ベクターを上記宿主に組込んで、目的とするS-ヒドロキ
シニトリルリアーゼ生産能を持つ組換え酵母を得るに
は、定法の形質転換法によって行えばよい。
【００１５】得られた組換え酵母を培地に培養すれば、
S-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産することができ
る。本発明における染色体組込み型発現ベクターにて形
質転換した酵母を培養する場合は、組換え酵母中の該酵
素遺伝子は安定に保持されるので、宿主酵母菌の生育に
適した培地を適宜選択して用いればよく、特定の栄養源
の制限、抗生物質の添加は特に必要はない。ｐＨは４〜
７に調節するのが適当である。
S-ヒドロキシニトリルリアーゼを生産することができ
る。本発明における染色体組込み型発現ベクターにて形
質転換した酵母を培養する場合は、組換え酵母中の該酵
素遺伝子は安定に保持されるので、宿主酵母菌の生育に
適した培地を適宜選択して用いればよく、特定の栄養源
の制限、抗生物質の添加は特に必要はない。ｐＨは４〜
７に調節するのが適当である。
【００１６】また、プロモーターの種類により、酵素生
産を誘導させる必要がある場合には、それに応じた誘導
基質を培地に加えることが好ましい。例えば、プロモー
ターの発現が特定炭素源によって促進あるいは阻害され
る場合には、その場合に応じて適宜炭素源を選択する必
要がある。本発明に好適なプロモーターであるＡＯＸ１
プロモーターによって酵素遺伝子の発現が制御されてい
る場合には、グリセロールやラフィノースは発現に影響
を与えないが、グルコースは発現を抑制・阻害するもの
で添加することは好ましくない。また、メタノールの添
加によって発現が顕著に促進されるので、酵素遺伝子を
効率よく発現させ、酵素を大量に生産するためには培養
液にメタノールを添加することが好ましい。
産を誘導させる必要がある場合には、それに応じた誘導
基質を培地に加えることが好ましい。例えば、プロモー
ターの発現が特定炭素源によって促進あるいは阻害され
る場合には、その場合に応じて適宜炭素源を選択する必
要がある。本発明に好適なプロモーターであるＡＯＸ１
プロモーターによって酵素遺伝子の発現が制御されてい
る場合には、グリセロールやラフィノースは発現に影響
を与えないが、グルコースは発現を抑制・阻害するもの
で添加することは好ましくない。また、メタノールの添
加によって発現が顕著に促進されるので、酵素遺伝子を
効率よく発現させ、酵素を大量に生産するためには培養
液にメタノールを添加することが好ましい。
【００１７】培養は、例えば、25〜35℃で、数時間〜３
日間、増殖が定常期に達するまで行う。このようにして
培養した組換え酵母菌の菌体内には著量のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼが生産される。培養終了後、培養物よ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。すなわち細胞壁
溶解酵素（ザイモリアーゼなど）を作用させて溶菌させ
る用法、超音波破砕処理、ガラスビーズなどを共存させ
て破砕処理する方法、界面活性剤などで抽出する方法、
自己消化させる方法、凍結融解法などがある。次いで、
ろ過または遠心分離などにより不溶物を除去することに
より、S-ヒドロキシニトリルリアーゼを含有する粗酵素
液を得ることができる。
日間、増殖が定常期に達するまで行う。このようにして
培養した組換え酵母菌の菌体内には著量のS-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼが生産される。培養終了後、培養物よ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを採取するには、通常
の酵素採取手段を用いることができる。すなわち細胞壁
溶解酵素（ザイモリアーゼなど）を作用させて溶菌させ
る用法、超音波破砕処理、ガラスビーズなどを共存させ
て破砕処理する方法、界面活性剤などで抽出する方法、
自己消化させる方法、凍結融解法などがある。次いで、
ろ過または遠心分離などにより不溶物を除去することに
より、S-ヒドロキシニトリルリアーゼを含有する粗酵素
液を得ることができる。
【００１８】上記の粗酵素液から、S-ヒドロキシニトリ
ルリアーゼをさらに精製するには、通常のタンパク質精
製法を使用することができる。具体的には、硫安分画
法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理
法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動法などが、単独または適
宜組み合わせて用いられる。
ルリアーゼをさらに精製するには、通常のタンパク質精
製法を使用することができる。具体的には、硫安分画
法、有機溶媒沈澱法、イオン交換体などによる吸着処理
法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティー
クロマトグラフィー、電気泳動法などが、単独または適
宜組み合わせて用いられる。
【００１９】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 キャッサバ組織からのcDNAの調製および
キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の
調製 キャッサバの葉を材料として、全mRNAの抽出を行なっ
た。回収したmRNAを鋳型として、cDNA合成を行ない、キ
ャッサバのcDNAライブラリーを作った。文献(Arch. Bio
chem. Biophys. 311, 496-502, 1994) より入手した、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
の配列情報（配列番号１）を参考にして、下記PCRプラ
イマーを合成した。 センスプライマー：GGG GGA TCC ACC ATG GTA ACT GCA
CAT TTT GTT CTG ATTC （配列番号１） アンチセンスプライマー：GGG TAC GTA TCA AGC ATA TG
C ATC AGC C （配列番号２）
が、本発明はこれに限定されるものではない。 〔実施例１〕 キャッサバ組織からのcDNAの調製および
キャッサバ由来S-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の
調製 キャッサバの葉を材料として、全mRNAの抽出を行なっ
た。回収したmRNAを鋳型として、cDNA合成を行ない、キ
ャッサバのcDNAライブラリーを作った。文献(Arch. Bio
chem. Biophys. 311, 496-502, 1994) より入手した、
キャッサバ由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子
の配列情報（配列番号１）を参考にして、下記PCRプラ
イマーを合成した。 センスプライマー：GGG GGA TCC ACC ATG GTA ACT GCA
CAT TTT GTT CTG ATTC （配列番号１） アンチセンスプライマー：GGG TAC GTA TCA AGC ATA TG
C ATC AGC C （配列番号２）
【００２０】これらのプライマーを使い、上記のcDNAを
鋳型としてPCR（95℃, 0.5 分、55℃, 0.5 分、72℃, 1
分；計35サイクル）を行なったところ、S-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子
を獲得した。遺伝子配列の解析を行なったところ、文献
に示されている配列と一致した。
鋳型としてPCR（95℃, 0.5 分、55℃, 0.5 分、72℃, 1
分；計35サイクル）を行なったところ、S-ヒドロキシ
ニトリルリアーゼをコードする遺伝子に相当する遺伝子
を獲得した。遺伝子配列の解析を行なったところ、文献
に示されている配列と一致した。
【００２１】〔実施例２〕 酵素遺伝子組換え酵母菌に
よる発現 実施例１で取得した、S-ヒドロキシニトリルリアーゼの
ｃＤＮＡを、Invitrogen製ピチア用発現ベクターpPIC3.
5Kのマルチクローニングサイトに挿入し、pPIC3.5K-cas
プラスミド（酵母染色体組込み型発現ベクター）を調製
した。このプラスミドのHis4配列の中ほどを制限酵素で
切断して直鎖状にした組換えDNAを使い、Pichia pastor
is KM71株およびGS115株を宿主として、それぞれ形質転
換を行なった。得られた転換体を抗生物質G418耐性によ
って選抜し、より高い耐性を持つクローンを得た。上記
操作によって取得した形質転換体をBMMY培地 [酵母エキ
ス 1% 、ペプトン2%、1Mリン酸緩衝液(pH6.0) 10% 、Ye
ast Nitrogen Base 1.34% 、ビオチン 4×10-5% 、メタ
ノール 1%]で培養したものの酵素活性を以下のようにし
て測定した。
よる発現 実施例１で取得した、S-ヒドロキシニトリルリアーゼの
ｃＤＮＡを、Invitrogen製ピチア用発現ベクターpPIC3.
5Kのマルチクローニングサイトに挿入し、pPIC3.5K-cas
プラスミド（酵母染色体組込み型発現ベクター）を調製
した。このプラスミドのHis4配列の中ほどを制限酵素で
切断して直鎖状にした組換えDNAを使い、Pichia pastor
is KM71株およびGS115株を宿主として、それぞれ形質転
換を行なった。得られた転換体を抗生物質G418耐性によ
って選抜し、より高い耐性を持つクローンを得た。上記
操作によって取得した形質転換体をBMMY培地 [酵母エキ
ス 1% 、ペプトン2%、1Mリン酸緩衝液(pH6.0) 10% 、Ye
ast Nitrogen Base 1.34% 、ビオチン 4×10-5% 、メタ
ノール 1%]で培養したものの酵素活性を以下のようにし
て測定した。
【００２２】まず、組換え菌培養液1ml を遠心分離し、
菌体を回収し、これに0.5mm径のガラスビーズを0.1ml
添加し、液体窒素で凍結した。次いで、0.15Mクエン酸
ナトリウム緩衝液（pH5）を0.2ml 添加し、攪拌によっ
て菌体破砕をした。菌体破砕液を遠心分離することによ
って上澄み液を得た。この上澄み液を酵素活性測定に用
いた。活性値は、DL-マンデロニトリルを基質として、
基質が酵素によって分解されてベンズアルデヒドを生成
する際の吸光度変化を249.6nmの波長で測定することに
よって算出し、１分間に基質1 μmol を分解する活性を
1 unitとした。培養液1ml 当たりのS-ヒドロキシニトリ
ルリアーゼ活性は、KM-71 株に組込んで得た組換え菌株
では6.25unit/ml(比活性は2.77unit/mg protein)、GS-1
15株に組込んで得た組換え菌株では4.96unit/ml(比活性
は1.23unit/mg protein)であった。
菌体を回収し、これに0.5mm径のガラスビーズを0.1ml
添加し、液体窒素で凍結した。次いで、0.15Mクエン酸
ナトリウム緩衝液（pH5）を0.2ml 添加し、攪拌によっ
て菌体破砕をした。菌体破砕液を遠心分離することによ
って上澄み液を得た。この上澄み液を酵素活性測定に用
いた。活性値は、DL-マンデロニトリルを基質として、
基質が酵素によって分解されてベンズアルデヒドを生成
する際の吸光度変化を249.6nmの波長で測定することに
よって算出し、１分間に基質1 μmol を分解する活性を
1 unitとした。培養液1ml 当たりのS-ヒドロキシニトリ
ルリアーゼ活性は、KM-71 株に組込んで得た組換え菌株
では6.25unit/ml(比活性は2.77unit/mg protein)、GS-1
15株に組込んで得た組換え菌株では4.96unit/ml(比活性
は1.23unit/mg protein)であった。
【００２３】〔比較例１〕 酵素遺伝子組換え大腸菌に
よる発現 下記のプライマーを用いる以外は、実施例１と同様にし
て、S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子
に相当する遺伝子を獲得した。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT G （配列番号３） アンチセンスプライマー：TAG GAG CTG CAG GCT TCA AG
C ATA TGC ATC （配列番号４）
よる発現 下記のプライマーを用いる以外は、実施例１と同様にし
て、S-ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子
に相当する遺伝子を獲得した。 センスプライマー：GGG GAA TTC ATG GTA ACT GCA CAT
TTT G （配列番号３） アンチセンスプライマー：TAG GAG CTG CAG GCT TCA AG
C ATA TGC ATC （配列番号４）
【００２４】上記遺伝子を、大腸菌用ベクターpKK223-3
（ファルマシア製）のマルチクローニングサイトのBamH
I サイトとPstIサイトの間に導入して組換えベクターを
調製した。このベクタープラスミドを大腸菌へ組込むこ
とにより、組換え大腸菌を得た。この組換え菌を誘導基
質として1mM IPTG、抗生物質としてアンピシリン0.1ｇ/
Lを含むＬＢ培地で培養して得た培養液の酵素活性は0.9
64unit/ml（比活性は0.545unit/mg protein)であった。
（ファルマシア製）のマルチクローニングサイトのBamH
I サイトとPstIサイトの間に導入して組換えベクターを
調製した。このベクタープラスミドを大腸菌へ組込むこ
とにより、組換え大腸菌を得た。この組換え菌を誘導基
質として1mM IPTG、抗生物質としてアンピシリン0.1ｇ/
Lを含むＬＢ培地で培養して得た培養液の酵素活性は0.9
64unit/ml（比活性は0.545unit/mg protein)であった。
【００２５】
【発明の効果】本発明によれば、遺伝子工学的手法によ
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産
させることができる。
りS-ヒドロキシニトリルリアーゼを効率よく大量に生産
させることができる。
【００２６】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> NIPPON SHOKUBAI CO., LTD. <120> Expression sytem for S-hydroxynitryllyase gene <130> P98-0669 <160> 4 <170> Patent in Ver. 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 GGGGGATCCA CCATGGTAAC TGCACATTTT GTTCTGATTC 40 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 GGGTACGTAT CAAGCATATG CATCAGCC 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 GGGGAATTCA TGGTAACTGC ACATTTTG 28 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 TAGGAGCTGC AGGCTTCAAG CATATGCATC 30
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】 キャッサバ(Cassava, Manihot esculent
a)由来のS-ヒドロキシニトリルリアーゼ(EC 4.1.2.37)
をコードする遺伝子を酵母染色体組込み型発現ベクター
へ組込んだ組換え体ＤＮＡによって形質転換されたピチ
ア(Pichia)属に属する酵母を培地に培養し、培養物から
S-ヒドロキシニトリルリアーゼを得ることを特徴とす
る、S-ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。 - 【請求項２】 酵母染色体組込み型発現ベクターが、ピ
チア属(Pichia)属酵母由来のＡＯＸ１（アルコールオキ
シダーゼ) プロモーターの塩基配列からなるＤＮＡ、ま
たは該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、
置換、付加した塩基配列からなり、かつプロモーター活
性を保持するＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１
に記載の製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10373248A JP2000189160A (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造法 |
| DE69928206T DE69928206T2 (de) | 1998-12-28 | 1999-12-22 | Verfahren zur Herstellung von S-Hydroxynitrillyasen |
| EP99310432A EP1016712B1 (en) | 1998-12-28 | 1999-12-22 | Process for producing S-Hydroxynitrile lyase |
| US09/472,146 US6387659B1 (en) | 1998-12-28 | 1999-12-27 | Process for producing S-hydroxynitrile lyase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10373248A JP2000189160A (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000189160A true JP2000189160A (ja) | 2000-07-11 |
Family
ID=18501843
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10373248A Pending JP2000189160A (ja) | 1998-12-28 | 1998-12-28 | Ｓ―ヒドロキシニトリルリア―ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000189160A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006041226A1 (ja) | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| US7214523B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for production of S-hydroxynitrile lyase by use of Escherichia coli |
-
1998
- 1998-12-28 JP JP10373248A patent/JP2000189160A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214523B2 (en) | 2002-12-17 | 2007-05-08 | Nippon Shokubai Co., Ltd. | Method for production of S-hydroxynitrile lyase by use of Escherichia coli |
| WO2006041226A1 (ja) | 2004-10-15 | 2006-04-20 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ |
| EP2243831A1 (en) | 2004-10-15 | 2010-10-27 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved hydroxynitrile lyase |
| EP2267124A1 (en) | 2004-10-15 | 2010-12-29 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Improved hydroxynitrile lyase |
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