DE10029194A1 - L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton - Google Patents
L-Pantolacton-Hydrolase und ein Verfahren zur Herstellung von D-PantolactonInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton aufweisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die für diese Proteine codieren, Nukleinsäurekonstrukte, Vectoren, genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die eine
enzymatische Aktivität zur Hydrolyse von L-Pantolacton auf
weisen. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren, die
für diese Proteine codieren, Nucleinsäurekonstrukte, Vectoren,
genetisch veränderte Mikroorganismen sowie ein Verfahren zur
Herstellung von D-Pantolacton.
D-Pantolacton ist eine Vorstufe in der chemischen Synthese bzw.
Biosynthese von Pantothensäure, Panthenol und Pantethein und
deren Derivate. Diese werden als Vitaminzusätze in der mensch
lichen Ernährung, im Tierfutter, in der Medizin beispielsweise
für die Wundheilung und in der Kosmetik beispielsweise in der
Haarkosmetik eingesetzt. Wirtschaftliche Verfahren zur Synthese
von enantiomerenreinem D-Pantolacton sind daher von großer
Bedeutung. Neben den seit langem ausgeübten chemischen Verfahren
zur Herstellung von D-Pantolacton wurden in jüngerer Zeit auch
verschiedene biotechnologische Verfahren bearbeitet. Eine Über
sicht über Pantolacton und seine chemische Synthese ist Ullmann's
Encyclopedia of Industrial Chemistry (Vol. A27, 1996, VCH Ver
lagsgesellschaft mbH, 69451 Weinheim, Seite 559-566) zu ent
nehmen.
Für die biotechnologische Synthese von Pantolacton wurden ver
schiedenen Synthesestrategien verfolgt.
Eine Racematspaltung durch selektive Hydrolyse von O-Acetyl-Pantolacton
mittels Lipasen oder Esterasen wird von Glänzer
et al. (1988, Enzyme Microb. Technol. 10, 689-690) beschrieben.
Eine derartige Racematspaltung wird in den Schutzrechten
DE 40 05 150 und EP-A-0 507 278 beansprucht. Die erreichbare
Enantiomerenreinheit ist für eine technische Nutzung bei diesem
Verfahren ungenügend.
Von Degussa wird die Herstellung von Pantolacton mit dem Enzym
Oxinitrilase ausgehend von Hydroxypivalaldehyd und Blausäure
über optisch reines Hydroxypivalaldehydcyanhydrin beschrieben
(DE 41 26 580, EP-A-0 528 256, DE 41 39 987). In dieser
Reaktion sind theoretisch 100% Ausbeute zu erreichen. Nach
teil dieser Reaktion ist der hohe Enzymbedarf (äquimolare Mengen
Enzym: Substrat) sowie die relativ geringe Enantiomerenreinheit
des Produkts (max. 82% ee).
In JP 47019745 wird die Synthese von D-Pantolacton mit Hilfe
von Arthrobacter, Brevibacterium, Bacillus oder Corynebacterium
beschrieben. In der Reaktion setzen die genannten Organismen
racemisches Pantolacton zu D-Pantolacton um, in dem sie das
L-Pantolacton verstoffwechseln. Nachteil dieses Verfahren ist,
daß die Hälfte des Edukts verstoffwechselt wird und damit ver
loren ist.
Mitsubishi Chemical Ind. und Ube Ind. haben Verfahren zur
Herstellung von D-Pantolacton aus D,L-Pantolacton beansprucht
(JP 6067320, JP 62294092, JP 62294096, JP 57152895). In
diesen Verfahren werden L-Pantolacton-Hydrolasen aus den Hefen
Rhodothorula, Sporidiobolus und Sterigmatomyces beschrieben. Aus
heutiger Sicht (siehe Yamada & Shimizu, Ann. N.Y. Acad. Sci. 672
[1992] in Enzyme Eng. XI, Clark et al., 372-386; Chimia, 47,
1993: 5-10, JP 62187426; JP 61293384; JP 61293386; Angew. Chem.
Int. Ed. Engl. 27, 1988: 622-642, Chemical Aspects of Enzyme
Biotechnology, eds. T. O. Baldwin et al., Plenum Press, New York,
1990: 151-163) bestätigt durch eigene Arbeiten scheint die di
rekte Hydrolyse des L-Pantolactons in diesen Hefen jedoch
zweifelhaft. Die Reaktion verläuft vielmehr über das Ketopanto
lacton, das durch die Ketopantoat-Oxidoreduktasen zum L-Panto
lacton umgesetzt wird. In eigenen Arbeiten konnte das Ketopanto
lacton als Zwischenstufe nachgewiesen werden, das heißt es er
folgt keine direkte Hydrolyse zum L-Pantolacton. Nachteil dieses
Verfahrens ist die geringe Pantolacton-Konzentration, die im Ver
fahren umgesetzt werden kann.
Diese Reaktion über Ketopantolacton- und Ketopantoat-Oxido
reduktasen wurde auch für Bakterien beschrieben (z. B. Yamada
& Shimizu, s. o.; Shimizu et al., 1988, J. Biol. Chem. 263,
12077-12084, Kataoka et al. 1992, Eur. J. Biochem. 204, 799-806).
Entsprechende Verfahren zur enantioselektiven Synthese von
D-Pantolacton aus D,L-Pantolacton via Ketopantolacton und Keto
pantoat haben zwar den Vorteil einer hohen Ausbeute (theoretisch
100%, 90,5% erreicht mit Rhodococcus s. u.), sind jedoch wegen
des Cofaktorbedarfs (NADH oder NADPH), der Zufütterung eines
Energiesubstrates (Glucose), der niedrigen Raum-Zeit-Ausbeute
und der geringen Endkonzentrationen (18,2-72 g/l D-Pantolacton)
nicht wirtschaftlich. Desweiteren ist ein solches Verfahren
dadurch benachteiligt, daß die beiden beteiligten Enzyme i.d.R.
verschiedene Optima für die Umsatzbedingungen aufweisen, ein
Problem, das bei Verwendung eines einzigen (hydrolytischen)
Enzyms entfällt.
Die Firma Fuji in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis von Yamada
an der Kyoto Universität hat ein Verfahren zur enzymatischen
Racematspaltung mit Hilfe einer pilzlichen D-Pantolacton-Hydro
lase (JP 09308-497, JP 11056356, EP-B-0 436 730, EP-B-0 504 421,
EP-A-0 794 251, WO 92/06182, WO 97/10341, US 5,275,949,
US 5,372,940) entwickelt. Das Enzym läßt sich beispielsweise aus
den Pilzen Cylindrocarpon tonkinense, Gibberella fujikuroi und
Fusarium oxysporum isolieren. Die D-Pantolacton-Hydrolase ist ein
glycosyliertes Enzym, das aus einem 125 kDa Homodimer besteht und
Ca2+-abhängig ist (Ann. N.Y. Acad. Sci. 1996, 799: 650-658, Enzyme
Engineering). Das Enzym wird durch Cd2+, Hg2+, Cu2+ und EDTA
inhibiert (US 5,372,940). Die Reinigung der D-Pantolacton-Hydrolase
wurde von Shimizu et al. beschrieben. Das gereinigte
Enzym zeigt gegenüber einer Reihe von Lactonen speziell gegenüber
Zuckerlactonen eine Hydrolaseaktivität (Eur. J. Biochem., 209,
1992: 383-390). Seine Sequenz zeigt schwache Homologien zur
Gluconolactonase aus Zymomonas mobilis (28,9%), der humanen und
Ratten-Paraoxonase (25,3%) und der Strictosidin Synthase aus
Catharanthus roseus (15,9%; EP-A-0 794 251, Kobayashi et al.
1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12787-12792). Von Kataoko
et al. wird eine starke Abhängigkeit der erzielten Enantiomeren
reinheit des Produkts vom Umsatz bei unterschiedlichen pH-Werten
(Enzym. Microbiol. Technol. 19: 307-310, 1996 und Appl. Micro
biol. Biotechnol. 1995, 44: 333-338) beschrieben. Bei pH-Werten,
die nahe oder über pH 7 liegen, werden geringere Enantiomeren
reinheiten erzielt, da die spontane chemische Hydrolyse des
L-Pantolactons bei höheren pH-Werten immer stärker wird und so
die Enantiomerenreinheit des Produkts herabsetzt. Als optimaler
pH-Wert für die Herstellung möglichst enantiomerenreinen D-Panto
lactons wird pH 5 angegeben. Die Reaktionsgeschwindigkeit des
Enzyms ist bei diesem pH jedoch erheblich verlangsamt. Um
optisch reines Produkt zu erhalten, ist nach Extraktion eine
anschließende Kristallisation erforderlich (Yamada, H. Chimia 47,
1993: 5-10).
Von Nachteil bei den oben genannten Prozessen ist, daß sie häufig
nur zu Produkten mit einer geringen optischen Reinheit führen
und/oder daß sie nur mit geringen Raum-Zeit-Ausbeuten ablaufen.
Dies führt zu wirtschaftlich unattraktiven Prozessen. Nach wie
vor besteht deshalb ein großer Bedarf nach einem einfachen, wirt
schaftlichen biotechnologischen Verfahren zur Herstellung von
D-Pantolacton, das die oben genannten Nachteile nicht aufweist.
Dieses Verfahren sollte ausgehend von der bestehenden chemischen
Synthese einen einfachen Zugang zu D-Pantolacton in hohen Aus
beuten und Enantiomerenreinheiten ermöglichen, so daß keine
weitere Aufreinigung des Produkts mehr erforderlich ist.
Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches, wirtschaftliches
Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton zur Verfügung zu
stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäure
sequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit L-Pantolacton-Hydrola
seaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dar gestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäurese quenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dar gestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
- d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.
Diese L-Pantolacton-Hydrolasen lassen sich in Organismen vorteil
haft Mikroorganismen wie Bakterien finden. Das Enzym bzw. die
Enzyme besitzen eine hohe enzymatische Aktivität zur hydro
lytischen Umwandlung von L-Pantolacton in L-Pantoinsäure.
Diese L-Pantolacton-Hydrolasen setzen D-Pantolacton nicht um,
so daß die Organismen, Extrakte oder gereinigte Enzyme sowie
entsprechende rekombinante Stämme bzw. Proteine zur Herstellung
von enantiomerenreinem D-Pantolacton verwendet werden können.
Unter Derivaten der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz mit der
Sequenz SEQ ID NO: 1 sind beispielsweise Allelvarianten zu ver
stehen, die mindestens 50% Homologie auf der abgeleiteten Amino
säureebene, bevorzugt mindestens 60% Homologie, besonders bevor
zugt 70%, ganz besonders bevorzugt mindestens 80% Homologie
aufweisen. Die Homologie wurde entweder nach der Methode von
Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 1970: 443-453) oder Smith
& Waterman (Adv. Appl. Math., 2, 1981: 482-489) bestimmt. Über
Teilbereiche der Sequenzen können die Homologien vorteilhaft
höher liegen. Die von SEQ ID NO: 1 abgeleitete Aminosäuresequenz
ist SEQ ID NO: 2 zu entnehmen. Allelvarianten umfassen ins
besondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion
oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1
dargestellten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische
Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine nicht wesent
lich reduziert sein sollte. Unter Enzymen mit einer nicht wesent
lich reduzierten enzymatischen Aktivität sind Enzyme zu
verstehen, die eine enzymatische Aktivität von mindestens 20%, be
vorzugt 50%, besonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt
90% aufweisen. Die Erfindung betrifft damit auch Aminosäure
sequenzen, die durch die oben dargestellte Gruppe von Nuklein
säuresequenzen kodiert werden. Vorteilhaft betrifft die Erfindung
Aminosäuresequenzen, die durch die Sequenz SEQ ID NO: 1 kodiert
werden.
Unter funktionellen Äquivalenten der unter (a) bis (c)
genannten Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die für
Enzyme kodieren, die L-Pantolacton zur entsprechenden Säure
hydrolysieren und die mindestens 20%, bevorzugt 50%, besonders
bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt 90% der Aktivität der
unter SEQ ID NO: 2 genannten Sequenz aufweisen, nicht durch EDTA
(1 mM-Lösung) gehemmt werden und zwischen pH 4 bis 10 stabil
sind. Diese funktionellen Äquivalente weisen außerdem vorteilhaft
ein pH-Optimum zwischen pH 7 und 8 auf und ein Temperaturoptimum
zwischen 70°C und 80°C.
Weiterhin sind unter Derivate auch Homologe der SEQ ID NO: 1
beispielsweise pilzliche oder bakterielle Homologe, verkürzte
Sequenzen, Einzelstrang-DNA oder RNA der codierenden und
nicht-codierenden DNA-Sequenz zu verstehen. Homologe der SEQ ID NO: 1
besitzen auf DNA-Ebene eine Homologie von mindestens 50%, bevor
zugt von mindestens 60%, besonders bevorzugt von mindestens
70%, ganz besonders bevorzugt von mindestens 80% über den
gesamten in SEQ ID NO: 1 angegebenen DNA-Bereich.
Außerdem sind unter Homologe der SEQ ID NO: 1 Derivate wie bei
spielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Die Promotoren, die
den angegebenen Nukleotidsequenzen vorgeschalten sind, können
durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en)
und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktio
nalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des
weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz
in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere
Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.
Unter Derivaten sind auch Varianten zu verstehen, deren Nukleo
tidsequenz im Bereich von -1 bis -200 vor dem Startcodon oder
0 bis 1000 Basenpaare nach dem Stopcodon so verändert wurden,
daß die Genexpression und/oder die Proteinexpression verändert,
bevorzugt erhöht wird.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen lassen sich
prinzipiell aus allen Organismen identifizieren und isolieren.
Vorteilhaft läßt sich die SEQ ID NO: 1 oder seine Homologen aus
Pilzen, Hefen oder Bakterien isolieren. Als Bakterien seien
gram-negative und gram-positive Bakterien genannt. Bevorzugt werden
die erfindungsgemäßen Nukleinsäure(n) [der Plural und Singular
sollen für die Anmeldung gleichbedeutend sein] aus gram-negativen
Bakterien vorteilhaft aus α-Proteobacterien, β-Proteobacterien
oder γ-Proteobacterien, besonders bevorzugt aus Bakterien der
Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae oder Rhizobiaceae,
ganz besonders bevorzugt aus Bakterien der Gattung Agrobacterium,
Pseudomonas oder Burkholderia über dem Fachmann bekannte Methoden
isoliert. Als vorteilhaft geeignete Pilze seien die Gattungen
Beauveria oder Psilocybe genannt. Vorteilhafte Hefen sind bei
spielsweise in der Gattung Apiotrichum zu finden.
SEQ ID No: 1 oder seine Derivate, Homologen oder Teile dieser
Sequenzen lassen sich beispielsweise mit üblichen Hybridi
sierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Pilzen oder
Bakterien isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter
Standardbedingungen mit den erfindungsgemäßen Sequenzen. Zur
Hybridisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide der
konservierten Bereiche beispielsweise aus dem aktiven Zentrum,
die über Vergleiche mit der D-Pantolacton-Hydrolase in dem Fach
mann bekannter Weise ermittelt werden können (ein solcher Bereich
ist beispielsweise das sog. HTGT-Motiv), verwendet. Es können
aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet
werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure Oligonukleotid,
längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem
welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung ver
wendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen
beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca.
10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein
säure Temperaturen zwischen 20 und 70°C in einer wäßrigen Puffer
lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M
NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in
Gegenwart von 50% Formamid. Vorteilhafterweise liegen die
Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 2,0 × SSC und
Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 70°C, bevorzugt zwischen etwa
50°C bis 70°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs
bedingungen vorteilhaft bei 2,0 × SSC und Temperaturen zwischen
etwa 20°C bis 60°C, bevorzugt zwischen etwa 35°C bis 60°C. Diese
angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft
kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit ein
er Länge von ca. 1000 Nukleotiden und einem G- + C-Gehalt von
50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen
für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der
Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning",
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich
nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von
der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G- +
C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann
der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al.
(eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids
Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni
versity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular
Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University
Press, Oxford.
Unter dem erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukt sind die
L-Pantolacton-Hydrolasegene mit Sequenz SEQ ID No: 1 und seine
Derivate und Homologen zu verstehen, die mit einem oder mehreren
Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Gen
expression funktionell verknüpft wurden. Beispielsweise handelt
es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen, an die
Induktoren oder Repressoren binden, und so die Expression der
Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations
sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den
eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls
genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation
ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das
Nukleinsäurekonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein,
das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor
die Sequenz SEQ ID No: 1 oder seine Homologen inseriert und
der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht ent
fernt. Stattdessen wird die natürliche Regulationssequenz so
mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression
gesteigert wird. Das Nukleinsäurekonstrukt kann außerdem vor
teilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer
Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die
eine erhöhte Expression der Nucleinsäuresequenz ermöglichen. Auch
am 3'-Ende der DNA-Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte
Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente
oder Terminatoren. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können
in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im
Konstrukt können noch weitere Marker wie Antibiotikaresistenzen
oder Auxotrophien komplementierende Gene gegebenenfalls zur
Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Ver
fahren sind beispielsweise in Promotoren wie aphII (Tn5)-, trc-,
cos-, tac-, trp-, lacPAI, rha, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-,
lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder
λ-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen
Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulations
sequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren
wie in den konstitutiven oder induzierbaren Streptomyces-Promotoren
aphI, ermE, melC, tipA, mcrAB, gylCAB, veg, SPO1, amy
und SPO2, in den Hefe- oder Pilzpromotoren AOX1, GAL1, ADC1, MFα,
AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. In diesem Zusammen
hang sind auch die Promotoren der Pyruvatdecarboxylase und der
Methanoloxidase aus beispielsweise Hansenula vorteilhaft. Es
können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet
werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirts
organismus vorteilhafterweise in einen Vektor wie beispielsweise
einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, das
eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Diese
Vektoren stellen eine weitere Ausgestaltung der Erfindung dar.
Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pBluescript,
pBAD, pQE (His-tag System), pICIC223-3, pLG338, pACYC184, pBR322,
pUC18, pGEM7Z, pKK223-3, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2,
pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III113-B1, λgt11 oder pBdCI
oder broad-host-range Plasmide wie pBBR1MCS oder pRK293, in
Streptomyces und anderen Actinomyceten pIJ101, pIJ364, pMVS301,
pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in
Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder
pBB116, in Hefen 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder
in Pflanzen pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die
genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen
Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und
können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels
P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985
ISBN 0 444 904018) entnommen werden.
Vorteilhafterweise enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur
Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3'
und/oder 5' Terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung
der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen
oder Genen für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression
der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann bei
spielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst
nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder daß es
sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei
vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv
beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung
der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der
Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptions
signale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich,
indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das
erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt oder die erfindungsgemäße
Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhafterweise in Form
einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und
über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des
Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus
einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem
Nukleinsäurekonstrukt oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure
bestehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine L-Pantolacton-Hydrolase,
gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:
- a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
- b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
- c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
- d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
- e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA.
Diese L-Pantolacton-Hydrolase kann im erfindungsgemäßen Verfahren
als freies oder immobilisiertes Enzym verwendet werden.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist
es vorteilhaft die Nukleinsäuresequenzen entsprechend der im
Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern.
Der "codon usage" läßt sich anhand von Computerauswertungen
anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht
ermitteln.
Die Expression der erfindungsgemäßen Gene und der von diesen
Genen kodierten Proteine in einem Wirtsorganismus beinhaltet in
der Regel einen Streß für diese Organismen. Durch gleichzeitige
Expression dieser Gene in Gegenwart mindestens eines Gens, das
für ein sogenanntes Streßprotein kodiert oder in Gegenwart einer
Kombination dieser Gene, können die erfindungsgemäßen Nuklein
säuren vorteilhaft in den erfindungsgemäßen Wirtsorganismen
exprimiert werden. Streßproteine, auch Hitzeschockproteine
(= HSP) oder molekulare Chaperone (engl. Anstandsdame oder
Gouvernante) genannt, gehören zu den in der Evolution sowohl in
Pro- als auch in Eukaryonten am besten konservierten Proteine und
sind universell bei allen Organismen zu finden. Ihre Unterteilung
erfolgt nach dem Molekulargewicht in Kilodalton, z. B. HSP60, 70,
90 usw. Diese Streßproteine verdanken ihre Bezeichnung ihrer
Eigenschaft durch Streßbedingungen wie zu niedriger Glukose
spiegel, Hitzeschock, Alkohol, UV-Licht, oxidative Reagenzien
etc. induzierbar zu sein.
Viele Streßproteine und konstitutiv gebildete verwandte Proteine
sind für die korrekte Faltung, Zusammenlagerung, Stabilisierung
und den Transport von Proteinen essentiell. Durch die Koex
pression der erfindungsgemäßen Proteine in Gegenwart mindestens
eines Streßproteins können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren
vorteilhaft exprimiert werden. Eine gegebenenfalls vorkommende
Proteinaggregation der Hydrolasen kann so vorteilhaft verhindert
werden. Dabei binden die Streßproteine an hydrophobe Teile der
Proteine und verhindern so eine falsche Faltung der Proteine bzw.
ermöglichen die korrekte Faltung. Bereits aggregierte oder dena
turierte Proteine werden wieder dissoziiert und richtig gefaltet.
Häufig treten diese Streßproteine bei der Ausübung ihrer Funktion
in Kooperation mit anderen Proteinen sogenannten Helferproteinen
(= cohort-Proteinen) man spricht deshalb von sogenannten Chaperon-Maschinen,
die die vorteilhafte Wirkung bei der Expression der
erfindungsgemäßen Gene haben (Frydaman et al., Nature, 370, 1994:
111-117). Die Wirkung dieser Chaperon-Maschinen kann unter ATP-
Verbrauch erfolgen (= "Hauptchaperon-Maschinen") oder ohne ATP-Verbrauch
(= "Junior-Chaperone"). Vorteilhafte Chaperone oder
Hitzeschockproteine sind beispielsweise die eukaryontischen Gene
HSP17,5, HSP22, HSP25, HSP27, HSP60, HSP70, HSP90, TRiC,
UBI1, 2, 3, 4 oder ihre prokaryontischen Homologen wie HtpG,
DnaK, DnaJ, GroES, GroEL, HtrC, ClpB, GrpE etc. Bevorzugte
Chaperone sind GroES, GroEL, HtpG, DnaK, DnaJ, HSP70 oder
HSP27.
Vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in Gegen
wart mindestens eines Streßproteins exprimiert, dabei können die
Gene unter gemeinsamer Kontrolle eines Promoters liegen oder von
getrennten Promotoren gelesen werden. Dementsprechend kann ihre
Expression durch Zugabe einer oder mehrerer Induktorsubstanzen
gleichzeitig oder zu getrennten Zeitpunkten induziert werden. Die
Nukleinsäuren können auf einem Vektor liegen oder auf getrennten
Vektoren. Es ist auch möglich die Streßproteine des Wirts
organismus über eine genetische Manipulation so zu verändern,
daß sie überexprimiert werden.
Auch alternative Methoden zur Erhöhung des nativen Enzymanteils
wie die Anzucht der Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße
Protein synthetisieren, bei niedrigen Temperaturen oder die
Renaturierung durch Anwendung hoher Drücke (vorteilhaft 1 bis
2 kbar) auf Suspensionen des erfindungsgemäßen Proteins (mit oder
ohne Zusatz denaturierender Agenzien, beispielsweise
Guanidin-Hydrochlorid) können vorteilhaft sein.
Als rekombinante Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße
Nukleinsäure oder das Nukleinsäurekonstrukt kommen prinzipiell
alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage.
Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen
wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden
gram-positive oder gram-negative Bakterien, bevorzugt Bakterien
der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae,
Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, Hefen wie Pichia, Saccharo
myces oder Hansenula oder Pilze wie Beauveria oder Psilocybe
besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudo
monas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agro
bacterium oder Rhodococcus verwendet. Ganz besonders bevorzugt
ist die Gattung und Art Escherichia coli. Weitere vorteilhafte
Bakterien sind darüberhinaus in der Gruppe der α-Proteobacterien,
β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien zu finden.
Der Wirtsorganismus oder die Wirtsorganismen gemäß der Erfindung
enthalten dabei vorzugsweise mindestens eine der in dieser
Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Nukleinsäu
rekonstrukte oder Vektoren, die für L-Pantolacton-Hydrolasen
kodieren.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Organismen werden
je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen
bzw. gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem
flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von
Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen
Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat,
Spurenelemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenen
falls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C,
bevorzugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung ange
zogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen
Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert
werden oder nicht. Die Anzucht kann batch Weise, semi batch Weise
oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der
Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier
lich nach gefüttert werden. Gleiches gilt für Induktoren wie bei
spielsweise Isopropythiogalactosid, (IPTG), Lactose, Arabinose,
Rhamnose und Antibiotika bzw. Temperatur-Shifts, die je nach
verwendetem Promotor die Expression des erfindungsgemäßen Gens
anschalten. Das racemische Pantolacton kann direkt zur Anzucht
gegeben werden oder vorteilhaft nach Anzucht. Die Enzyme können
nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den
Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion
verwendet werden.
Die Wirtsorganismen enthalten vorteilhaft 0,5 U/g BTM (= Bio
trockenmasse) L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität, bevorzugt 4 U/g
BTM, besonders bevorzugt 20 bis 150 U/g BTM, ganz besonders
bevorzugt 40 bis 600 U/g BTM.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorteilhaft bei einer
Temperatur zwischen 0°C bis 95°C, bevorzugt zwischen 10°C bis
85°C, besonders bevorzugt zwischen 15°C bis 75°C durchgeführt.
Der pH-Wert im erfindungsgemäßen Verfahren wird vorteilhaft
zwischen pH 4 und 12, bevorzugt zwischen pH 6 und 9, besonders
bevorzugt zwischen pH 6 und 8, ganz besonders bevorzugt zwischen
pH 6,5 und 7,5 gehalten.
Unter racemischen Pantolacton im erfindungsgemäßen Verfahren ist
Pantolacton zu verstehen, das aus einem 50 : 50 Gemisch der beiden
Enantiomere oder aus einem beliebigen anderen Gemisch mit einer
Anreicherung eines der beiden Enantiomere im Gemisch besteht.
Unter enantiomerenreinen bzw. chiralen Pantolacton (D- oder
L-Enantiomer) sind im erfindungsgemäßen Verfahren Enantiomere zu
verstehen, die eine Enantiomerenanreicherung zeigen. Bevorzugt
werden im Verfahren Enantiomerenreinheiten von mindestens 70% ee,
bevorzugt von min. 80% ee, besonders bevorzugt von min. 90% ee,
ganz besonders bevorzugt min. 98% ee erreicht.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können wachsende Zellen ver
wendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, Nuklein
säurekonstrukte oder Vektoren enthalten. Auch ruhende oder aufge
schlossene Zellen können verwendet werden. Unter aufgeschlossenen
Zellen sind beispielsweise Zellen zu verstehen, die über eine
Behandlung mit beispielsweise Lösungsmitteln durchlässig gemacht
worden sind, oder Zellen die über eine Enzymbehandlung, über eine
mechanische Behandlung (z. B. French Press oder Ultraschall) oder
über eine sonstige Methode aufgebrochen wurden. Die so erhaltenen
Rohextrakte sind für das erfindungsgemäße Verfahren vorteil
haft geeignet. Auch gereinigte oder angereinigte Enzyme können
für das Verfahren verwendet werden. Ebenfalls geeignet sind
immobilisierte Mikroorganismen oder Enzyme, die vorteilhaft in
der Reaktion Anwendung finden können.
Werden für das erfindungsgemäße Verfahren freie Organismen oder
Enzyme verwendet, so werden diese vor der Extraktion zweck
mäßigerweise abgetrennt beispielsweise über eine Filtration
oder Zentrifugation. Dies ist bei Verwendung von immobilisierten
Organismen oder Enzymen vorteilhaft nicht notwendig, kann aber
auch erfolgen.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten D-Pantolacton
läßt sich vorteilhaft aus der wäßrigen Reaktionslösung über
Extraktion oder Kristallisation oder vorteilhaft über Extraktion
und Kristallisation gewinnen. Hierzu wird die wäßrige Reaktions
lösung mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert. Die
Extraktion kann zur Erhöhung der Ausbeute mehrfach wiederholt
werden. Vorteilhaft wird die Lösung vor Extraktion auf ca. 0°C
bis 10°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wird vor dem Herunterkühlen
oder danach vorteilhaft auf ca. pH 6,0 bis pH 7,0 neutralisiert,
um die freie Säure in das Salz zu überführen, so daß sie unter
den Reaktionsbedingungen nicht extrahiert werden kann. Für die
Neutralisation wird beispielsweise Bicarbonat oder eine andere
Base wie NaOH oder KOH genommen. Als organische Lösungsmittel
können prinzipiell alle Lösungsmittel verwendet werden, die mit
Wasser gegebenenfalls nach Zugabe von Salzen eine Phasengrenze
zeigen und in die das Lacton aus der wäßrigen Phase übergehen
kann. Vorteilhafte Lösungsmittel sind Lösungsmittel, die nur
wenig Wasser aufnehmen, so daß nur wenig Säure in das Lösungs
mittel übergeht wie Toluol, Methylenchlorid, Butylacetat, Diiso
propylether, Benzol, Methyltertiärbutylether, Methylisobutyl
keton, Diethylketon oder Essigester.
Nach Einengen der organischen Phase können die Produkte in der
Regel in guten chemischen Reinheiten, das heißt größer 90%
chemische Reinheit, gewonnen werden. Nach Extraktion kann die
organische Phase mit dem Produkt aber auch nur zum Teil eingeengt
werden und das Produkt auskristallisiert werden. Dazu wird die
Lösung vorteilhaft auf eine Temperatur von 0°C bis 10°C abgekühlt.
Die Kristallisation kann auch direkt aus der organischen Lösung
oder aus einer wäßrigen Lösung erfolgen. Das auskristallisierte
Produkt kann nochmals im gleichen oder in einem anderen Lösungs
mittel zur erneuten Kristallisation aufgenommen werden und noch
mals kristallisiert werden. Durch die anschließende vorteilhafte
mindestens einmalige Kristallisation kann die Enantiomerenrein
heit des Produktes falls erforderlich weiter gesteigert werden.
Vorteilhaft kann jedoch das entstandene D-Pantolacton direkt als
organische Lösung ohne Kristallisation verwendet werden.
Das in wäßriger Lösung verbliebene L-Enantiomer kann durch An
säuren beispielsweise mit Schwefelsäure zum Lacton geschlossen
werden und anschließend wie oben beschrieben extrahiert werden.
Zur Lactonisierung wird die Lösung vorteilhaft erwärmt. Das
gewonnene L-Lacton kann nach Abziehen des Lösungsmittels in der
Schmelze mit katalytischen Mengen (ca. 1 bis 5% Mol-%) einer Base
wie NaOH, Na-Pantoat oder Na-Methylat racemisiert und rückgeführt
werden. Durch die vorteilhafte Racemisierung und Rückführung des
unerwünschten Enantiomers kann im erfindungsgemäßen Verfahren
eine theoretische Ausbeute von 98% erreicht werden.
Bei den genannten Aufarbeitungsarten läßt sich das Produkt des
erfindungsgemäßen Verfahrens in Ausbeuten von 60 bis 100%, be
vorzugt von 80 bis 100%, besonders bevorzugt von 90 bis 100%
bezogen auf das für die Reaktion eingesetzte racemische Panto
lacton isolieren. Das isoliert Produkt zeichnet sich durch eine
hohe chemische Reinheit von < 90%, bevorzugt < 95% besonders
bevorzugt von < 98% aus. Weiterhin haben die Produkt eine hohe
Enantiomerenreinheit, die vorteilhaft falls erforderlich durch
die Kristallisation weiter gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann batchweise, semi-batchweise
oder kontinuierlich betrieben werden.
Die so gewonnenen Produkte eignen sich als Ausgangsmaterial für
die Synthese von Panthenol, Pantethein und deren Derivate. Diese
Stoffe und das erhaltene enantiomerenreine Pantolacton können in
Kombination miteinander oder allein zur Herstellung von Pharmaka,
Nahrungsmittel, Tierfutter oder Kosmetika verwendet werden.
Die nachstehenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung.
Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere der in Tabelle 1a, 1b
angegebenen Stämme) wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium
(z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3%
NaCl) angezogen, geerntet, in Puffer gewaschen und resuspendiert
(5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM
D,L-Pantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die
Konzentrationen an D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure
durch GC- bzw. HPLC-Analyse bestimmt (Tab. 1a). Alternativ wurde
die Umsetzung über Nacht unter Titration mit 4 M NaOH durchge
führt (4 ml Zellsuspension, 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM Tris/HCl
pH 7,0 ad 20 ml dest. Aqua; Tab. 1b). Alle Stämme der Tabelle 1
hydrolysierten das racemische Pantolacton zu L-Pantoinsäure.
Der ee-Wert bei hohem Umsatz (<45%) und damit die Enantio
selektivität E des Enzyms wurde nach Straathof und Jongejan,
Enzyme & Microbiol. Technology 21: 559-571, 1997 bestimmt.
Burkholderia caryophylli Lu681 (oder andere Stämme aus Tab. 1)
wurden 1 bis 3 Tage in 25 ml Komplexmedium (z. B. HFP = 1%
Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl) angezogen,
geerntet, in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen und resus
pendiert (5 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0) und 3 h bei 30°C mit 50 mM
Ketopantolacton inkubiert. Nach Abtrennung der Zellen wurden die
Konzentrationen an Ketopantolacton, Ketopantoinsäure, D,L-Panto
lacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt
(Tab. 1a). Alle aufgeführten Stämme außer Beauveria amorpha
Lu7953 vermochten die aus Ketopantolacton durch spontane Hydro
lyse entstehende Ketopantoinsäure zu Pantoinsäure zu reduzieren.
Da bei allen Stämmen jedoch D- Pantoinsäure anstelle des unter
Beispiel 1 beschriebenen L-Pantoinsäure gebildet wurde, kann die
Umsetzung von Pantolacton zu L-Pantoinsäure nicht durch einen
Oxidations-Reduktionsprozeß (über Ketopantolacton und Ketopanto
insäure) entstehen. Es wurde auch im dialysierten Rohextrakt von
Lu681 oder Lu5351 und bei Einsatz der gereinigten Enzyme aus
Lu681 und Lu5351 keine Abhängigkeit der L-Pantolacton-Hydrolyse
von Cofaktoren festgestellt. Die enzymatische Aktivität läßt
sich damit auf ein hydrolytisches Enzym zurückführen.
Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 200 ml Komplexmedium
(z. B. GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt)
angezogen (OD600 = 6,7, BTM = 2,97 g/l), geerntet und gewaschen.
10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-
Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei
30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h
und 19,5 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse
bestimmt (3 h: c = 45%, ee = 95%; 19, 5 h: c = 59%, ee = 89%
bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit
ee-Werten von 73% bzw. 100%.
Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 200 ml Komplexmedium
(z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3%
NaCl) angezogen (OD600 = 11,5, BTM = 2,90 g/l), geerntet und
gewaschen. 10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit
50 mM D,L-Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen
20 ml) bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert.
Nach 3 h und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch
HPLC-Analyse bestimmt (3 h: c = 20%, ee = 93%; 19,4 h: c = 53%,
ee = 94% bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht
D-Pantolacton mit ee-Werten von 21% bzw. 100%.
Pseudomonas diminuta Lu683 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B.
GYP = 1% D-Glucose, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt)
angezogen (OD600 = 7,3, BTM = 3,78 g/l), geerntet und gewaschen.
10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-
Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei
30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7.0 inkubiert. Nach 3 h
und 19,3 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse
bestimmt (3 h: c = 48%, ee = 97%; 19, 4 h: c = 69%, ee = 79%
bzgl. L-Pantoinsäure). Letzteres entspricht D-Pantolacton mit
ee-Werten von 82% bzw. 100%.
Apiotrichum humicola Lu3215 wurde in 200 ml Komplexmedium (z. B.
HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl)
angezogen (OD600 = 18,5, BTM = 7,34 g/l), geerntet und gewaschen.
10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM D,L-
Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml) bei
30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach 3 h
und 19,4 h wurden der Umsatz c und der ee-Wert durch HPLC-Analyse
bestimmt (3 h: c = 55%, ee = 79% bzgl. L-Pantoinsäure).
Letzteres entspricht D-Pantolacton mit ee-Werten von 84%.
Burkholderia caryophylli Lu681 wurde in 14 l Komplexmedium
(HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% NaCl)
bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, aufgeschlossen
und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 200 U) aus dem Rohextrakt
gereinigt. Dazu wurden die Zellen (1128 g Feuchtmasse) zunächst
durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer
(1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert. Endvolumen 3 l.
Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett
Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit.
Diese Zellsuspension (3,2 l) wurde 2 mal bei 1500 bar im
Z04 Microfluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml
Puffer gespült. Die vereinigten Volumina (4 l) wurden einer er
sten Fällung mit 200 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen
(Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natron
lauge auf pH 7,0 gehalten. Der Niederschlag wurde 30 Minuten
bei 6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (3,1 l) wurde mit
200 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung (pH 7,5) versetzt. Durch die
Zugabe sank der pH auf 5,0 ab. Es bildete sich ein Niederschlag,
der wiederum bei 6000 U/min (20 Minuten, Sorvall) abzentrifugiert
wurde. Der Überstand (3,4 l) wurde auf pH 7,0 zurücktitriert.
Anschließend wurden 989 g Ammoniumsulfat (entsprechend einer
50%igen Sättigung) zugegeben und 10 Minuten gerührt. Die Trübung
wurde 20 Minuten bei 6000 Upm abzentrifugiert. Der erhaltene
Überstand (3,7 l) wurde geteilt: 1,2 l wurden in einer Phenyl
sepharose Chromatographie eingesetzt.
Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe
25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natrium
phosphatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im
Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4)
eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% Puffer-B
nach 120 Minuten erreicht und für 40 Minuten gehalten. Aktive
Fraktionen wurden gesammelt und vereinigt (250 ml).
Nach Verdünnung auf <7 mS/cm wurden diese 3 l durch Chromato
graphie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm, 430 ml,
Fast Flow, Pharmacia) gereinigt. Die Säule wurde mit 1 l Puffer A
(20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen (10 ml/min)). Der
Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl) wurde linear auf
100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere 40 Minuten bei
linear 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt
und vereinigt (118 ml). Dieses Volumen wurde konzentriert (10 kD
Omega-Membran) und gegen 5 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0 dialysiert;
Endvolumen 21 ml. 6 ml dieses Volumens wurden auf eine Waters Q
HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquilibriert mit Puffer A
(20 mM Mes, pH 6,0) und dann entwickelt mit einem Gradienten (1%
pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M NaCl). Aktive
Fraktionen wurden vereinigt (3,7 ml) und zwei mal gegen 2 l 10 mM
Tris/HCl pH 7,0 dialysiert. Das Dialysat trübte sich ein und
wurde daher abzentrifugiert (4 ml).
Dieses Material wurde dann durch Chromatographie an Mono P
(Pharmacia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt. Die
Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine Aceton
fällung bei -20 Grad Celsius konzentriert.
Die Pellets wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT
aufgenommen und auf ein SDS-Gel gegeben (Tris/Glycin Gel 12%,
Fa. Novex ca. 2,5 h 125 V, 50 mA, Laemmli, U. K., 1970, Nature,
227: 680-685). Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach der Trennung
durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert und ausgeschnitten.
Hierzu wurde das Gel kurz in TBS-Puffer (= 50 mM Tris, 100 mM
NaCl, pH 7,4) geschwenkt und dann mit 50 ml TBS + 50 ml
α-Naphthylacetat-Lösung (Sigma N-8505, 0,4 g/l in 10% Aceton)
10 min. vorinkubiert. Anschließend wurden 50 ml Fast Red
TR-Lösung (Sigma F-8764, 1 g/l) zugegeben und das Gel weiter bei RT
(= ca. 23°C) geschwenkt. Die L-Pantolacton-Hydrolase war als rot
braun gefärbte Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von
ca. 36 kDa zu erkennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gel
stücken wurde durch Trypsin verdaut und die Peptide sequenziert.
Das Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei
Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 3 und 4) erhalten.
Agrobacterium radiobacter Lu5351 wurde in 14 l Komplexmedium
(z. B. HFP = 1% Pepton, 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,3%
NaCl) bis OD600 = 10 (3 g/l BTM) angezogen, geerntet, auf
geschlossen und die L-Pantolacton-Hydrolase (ca. 60 U) aus dem
Rohextrakt gereinigt (Tab. 2). Dazu wurden die Zellen (400 g
Feuchtmasse) von Agrobacterium radiobacter (Lu5351) zunächst
durch eine Behandlung mit einem Ultra-Turrax Stab im Puffer
(1,8 l, 20 mM Tris/HCl, pH 7,4) resuspendiert (Endvolumen 2,2 l).
Diese Lösung wurde dann auf einer Glasnutsche durch ein Bett
Glaskugeln (0,1 bis 0,2 mm, 200 ml) von groben Partikeln befreit.
Diese Zellsuspension wurde 2mal bei 1500 bar im Z04 Micro
fluidizer homogenisiert. Das Gerät wurde mit 500 ml Puffer
gespült. Die vereinigten Volumina (2,7 l) wurden einer ersten
Fällung mit 135 ml einer 1 M Manganchlorid-Lösung unterzogen
(Endkonzentration 50 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Natron
lauge auf pH 7,0 gehalten und der Niederschlag 30 min bei
6000 U/min abzentrifugiert. Der Überstand (2,6 l) wurde mit
575 ml einer 0,2 M EDTA-Lösung versetzt und der pH erneut
kontrolliert. Zu diesen 3,15 l wurden 711 g Ammoniumsulfat
(entsprechend einer 40%igen Sättigung) gegeben und 10 Minuten
gerührt. Die Trübung wurde 30 min bei 6000 Upm abzentrifugiert.
Der erhaltene Überstand (3,3 l) wurde in einer Phenylsepharose
Chromatographie eingesetzt.
Die Phenyl-Sepharose Säule (Pharmacia, Durchmesser 5 cm, Höhe
25 cm, Volumen 490 ml) wurde mit 1 l Puffer A (20 mM Natrium
phosphatpuffer, pH 7,4, 40% Ammoniumsulfat) gewaschen und im
Gradienten mit Puffer B (20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4)
eluiert. Bei einem Fluß von 10 ml/min wurden 100% B nach 120 min
erreicht und für 40 min gehalten. Aktive Fraktionen wurden ge
sammelt und vereinigt (350 ml, 20,9 mS).
Nach Verdünnung auf 7 mS/cm (3,1 l Endvolumen) wurde eine
Chromatographie an Q-Sepharose (Durchmesser 5 cm, Höhe 25 cm,
430 ml, Fast Flow, Pharmacia) durchgeführt. Die Säule wurde
mit 1 l Puffer A (20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,4 gewaschen
(10 ml/min)). Der Gradient mit Puffer B (Puffer A mit 1 M NaCl)
wurde auf 100% B in 120 Minuten gebracht und für weitere
40 Minuten bei 100% gehalten. Die aktiven Fraktionen wurden
gesammelt und vereinigt (134 ml). Dieses Volumen wurde konzen
triert (10 kD Omega-Membran) und gegen 3 l 10 mM Tris/HCl pH 7,0
dialysiert (Endvolumen 19 ml). 6 ml dieses Volumens wurden auf
eine Waters Q HR8 aufgetragen. Die Säule wurde zuvor äquili
briert mit Puffer A (20 mM Mes, pH 6,0) und entwickelt mit einem
Gradienten (1% pro Minute) nach Puffer B (wie Puffer A mit 0,5 M
NaCl). Aktive Fraktionen wurden vereinigt (12,5 ml) und gegen 5 l
10 mM Natriumacetatpuffer pH 5,0 dialysiert. Das Dialysat trübte
sich ein und wurde daher abzentrifugiert.
Der Überstand wurde dann durch Chromatographie an Mono P (Pharma
cia, Durchmesser 0,5 cm, Volumen 5 ml) getrennt.
Die Mono-P Fraktionen wurden in 0,2 ml Portionen durch eine
Acetonfällung bei -20 Grad Celsius konzentriert. Die Pellets
wurden dann in 0,005 ml SDS-Probenpuffer ohne DTT aufgenommen und
auf ein SDS-Gel gegeben. Die L-Pantolacton-Hydrolase wurde nach
der Trennung durch eine Aktivitätsfärbung identifiziert (siehe
Beispiel 4) und ausgeschnitten. Sie war als rotbraun gefärbte
Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 36 kDa zu er
kennen. Das Protein in den ausgeschnittenen Gelstücken wurde
durch Trypsin verdaut und die Peptide wurden sequenziert. Das
Restgel wurde mit Coomassie Blau angefärbt. Es wurden zwei
Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 5 und 6) erhalten. Die Sequenzierung
von SEQ ID NO: 5 ergab eine Unklarheit bei der ersten Aminosäure
der Sequenz. Das in Position 1 wiedergegebene Tyrosin kann auch
ein Leucin sein die Sequenz war hier nicht eindeutig.
0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten
Enzyme aus Lu681 oder Lu5351 wurden in 150 mM Pipes pH 6,8 mit
verschiedenen Estern und Lactonen inkubiert. Nach 0, 1 und 20 h
wurden Proben gezogen, die Reaktion durch Zentrifugation durch
eine 10 kDa-Filtermembran gestoppt und die Konzentration des
Substrates sowie der korrespondierenden Säure durch HPLC-Analyse
bestimmt. Die Aktivität ist in den Tabellen 3a und 3b im Ver
gleich zur Aktivität mit L-Pantolacton angegeben.
Für das Lipasesubstrat 1,2-O-Dilauryl-rac-glycero-3-glutar
säure-resorufinester wurde für das Lu681-Enzym ein optischer
Test in der Mikrotiterplatte durchgeführt (Boehringer Mannheim,
modifiziert). 60 bis 482 U/l Enzym wurden in 45 mM KH2PO4 pH 6,8
mit 0,18 g/l Resorufinester (2 g/l in Dioxan + 2% SDS + 10% H2O)
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion E wurde nach 2 min
und 82 min bei 572 nm gemessen. Tab. 3c zeigt die Extinktions
differenz und die daraus berechnete Lipase-Aktivität, die ca.
0,05% von der L-Pantolacton-Hydrolase-Aktivität beträgt.
0,1 U/ml einer Phenylsepharose-Wertpeakfraktion der angereinigten
Proteine aus Lu681 oder Lu5351 wurden 5 min mit verschiedenen
Effektorsubstanzen in 150 mM Pipes (pH 7.0) vorinkubiert. Der
Assay wurde durch Zugabe von 150 mM L-Pantolacton gestartet (1 h
30°C) und durch Zentrifugation durch eine 10 kDa-Filtermembran
gestoppt. Anschließend wurden die Konzentrationen an D,L-, D-,
und L-Pantoinsäure durch HPLC-Analyse bestimmt. Die Tabellen 4a
und 4b zeigen die Aktivität im Vergleich zur Probe ohne Zusatz
einer Effektorsubstanz. Insgesamt sind die gereinigten Enzyme
aus Lu681 und Lu5351 unempfindlich (<85% Restaktivität) gegen
chelatisierende Substanzen, SH-Reagenzien, Protease-Inhibitoren,
Detergenzien (Ausnahme: Lu5351 mit 74%-Restaktivität in 1% SDS)
und verschiedene Kationen.
Eine signifikante Aktivierung (+20%) ist allenfalls mit
HgCl2 festzustellen (133/170%). Desweiteren wurde für die
rekombinante 681-Lactonase (E. coli-Zellen, s. Bsp. 8ff.) eine
kompetitive Hemmung durch D-Pantolacton nachgewiesen.
Genomische DNA aus Burkholderia caryophylli Lu681 wurde iso
liert (Qiagen, Hilden), mit EcoRI verdaut und in mit EcoRI ge
schnittenen und dephosphorylierten pBluescriptKS+-Vektor ligiert
(Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 1989).
Das Ligationsgemisch wurde gemäß Instruktion der Fa. Stratagene
(LaJolla, Calif.) in E. coli XL1Blue transformiert. Die
Tansformanten wurden auf LB-Platten mit Ampicillin (100 µg/ml)
IPTG (= Isopropyl-β-thiogalactosid, 0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l)
ausplattiert und über Nacht bei 30 oder 37°C inkubiert. Die
weißen Kolonien wurden gepickt auf LB-Platten mit Ampicillin
(100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) und wiederum über
Nacht inkubiert. Anschließend wurde durch Filterabklatsch mit
sterilen Nitrocellulosefiltern eine Kopie dieser Masterplatte
auf LB-Ampicillin- (100 mg/ml) IPTG-Platten angelegt. Der Filter
wurde nach Inkubation über Nacht auf dieser Platte (s. o.) einem
Aktivitätstest mit 150 mM L-Pantolacton, 0,1% Nitrazingelb und
10 mM Tris/HCL pH 7,0 unterzogen (3 h-ÜN 30°C). Ein Klon mit Gelb
färbung (XL1Blue pKS+681) wurde isoliert.
Aus E. coli XL1Blue pKS+681 wurde die Plasmid-DNA gemäß
Instruktion der Fa. Qiagen (Hilden) isoliert und mit den
Restriktionsenzymen EcoRI, BamHI, PstI und HindIII einzeln bzw.
im Doppelverdau geschnitten. Die fragmentierte DNA wurde durch
Agarose-Gelelektrophorese im 0,8%igen Agarosegel analysiert.
Aus den erhaltenen Fragmentgrößen resultiert die in Fig. 3
abgebildete Restriktionskarte des 7,5 kB-Insert. Es wurde voll
ständig sequenziert (Sanger et al. 1977) und enthält u. a. die
Nukleotidsequenz ID NO: 1. Die abgeleitete Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) wiederum enthält die Peptide YGIEGLNNLEAL und
AKEDANSTIEAED (SEQ ID NO: 3 und 4), die nach tryptischem Verdau
der gereinigten und geblotteten L-Pantolacton-Hydrolase aus
Burkholderia caryophylli Lu681 und Agrobacterium radiobacter
Lu5351 gefunden wurden (siehe Beispiel 4 und 5).
Datenbankabgleiche (Genbank, EMBL, SwissProt Stand 7.5.99,
[Sptrembel] bzw. 5.1.99 [PIR]) der Nukleotid- und der abge
leiteten Aminosäuresequenz ergaben lediglich eine geringe Homo
logie zu einer Gruppe hypothetischer Proteine und zu bestimmten
Tetracyclin-Cyclasen aus Streptomyceten (Tab. 5). Insbesondere
das Motiv mit der Consensus-Sequenz HTGTHVDAP ist in allen
Proteinen hochkonserviert. Außerdem wurde eine Homologie von 48%
(38% identische Aminosäuren) zur Isatin-Hydrolase aus Pseudomonas
putida WW2 gefunden (WO 94/09175), die ebenfalls das genannte
Sequenzmotiv enthält. Da keine Homologie zu anderen Lactonasen,
Esterasen oder Lipasen gefunden wurde, handelt es sich bei den
gefundenen L-Pantolacton-Hydrolasen um eine neue Klasse von
Enzymen. Die Sequenzvergleiche lassen eine entfernt verwandte
phylogenetische Familie vermuten, zu der auch die benannten
hypothetischen Proteine und Tetracyclin-Cyclasen sowie die
Isatin-Hydrolase gehören.
Eine volle Impföse E. coli XL1Blue pKS+681 wurde nach Wachstum
(ÜN = über Nacht, 37°C) auf einer LB-Platte mit Ampicillin
(100 µg/ml), IPTG (0,2 mM) und X-Gal (80 mg/l) in 0,5 ml Tris-HCl
pH 7,0 und 50 mM D,L-Pantolacton resuspendiert (OD600 = 2,5).
Als Vergleich diente eine entsprechende E. coli XL1Blue
pBluescriptKS+-Probe (OD600 = 2,5). Nach 1 h wurden die Zellen ab
zentrifugiert und D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure
durch HPLC-Analyse bestimmt. Tab. 6a zeigt Aktivitäten und
ee-Werte der verschiedenen Proben. Die Suspension besaß eine
Aktivität von ≧90 U/L. In Flüssigkultur-Ansätzen (vgl. Beispiel
12) war jedoch keine signifikante Aktivität zu erkennen.
Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1 wurden die Oligo
nukleotide 5'-CCGGAATTCATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA
(P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli
fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden
Bedingungen: 20 mM Tris/HCl pH 8,8, 2 mM MgSO4, 10 mM KCl, 10 mM
(NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP,
0,96 µg/ml pKS+681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25 U/ml Pfu-Polymerase
(Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt:
1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene
PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit EcoRI und HindIII geschnitten und
in mit EcoRI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten
pKK223-3 (Pharmacia, Freiburg) ligiert. Das Ligationsgemisch
wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene,
LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al.
1990, Gene 96: 23-28). Die Tansformanten wurden auf LB-Amp-Platten
ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser Transformati
onsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filterabklatsch und ein
anschließender Aktivitätstest durchgeführt, bei welchem ca. 100
intensiv gelbe Klone identifiziert wurden. Zehn wurden durch
Minipräparation und Restriktionsverdau (EcoRI-HindIII, EcoRI-HindIII-BamHI)
der Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Mole
cular Cloning: A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das
in Fig. 4 abgebildete Plasmid pKK681.
E. coli XL1Blue pKK681 wurde in 30 ml LB-Medium mit Ampicillin
(100 µg/ml) und IPTG (0,5 mM) über Nacht bei 37°C angezogen,
geerntet und in Tris-HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen
und resuspendiert (3 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,0). 0,25 ml der
Suspension wurden mit 150 mM L-Pantolacton, 150 mM Pipes pH 7,0
ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h bei 30°C inkubiert. Daneben
wurden 0,25 ml der Suspension mit 50 mM D,L-Pantolacton, 50 mM
Tris pH 7,0 ad 0,5 ml A. dest. versetzt und 3 h inkubiert.
Weiterhin wurden 2 ml der Suspension mit 300 mM D,L-Pantolacton,
50 mM Tris pH 6,8 ad 20 ml Aqua dest. versetzt und unter
Titration mit 4 M NaOH auf pH 6,8 3 h inkubiert. Nach 1 h und
nach 3 h wurden Proben entnommen, die Zellen abgetrennt und
der Überstand auf D,L-Pantolacton, D,L-, D-, und L-Pantoinsäure
untersucht. Tab. 6b zeigt Aktivitäten und ee-Werte der ver
schiedenen Proben. Die Über-Nacht-Kultur (1 × konzentriert)
besitzt somit eine Aktivität von 90 bis 150 U/l.
Bei Induktion von E. coli XL1Blue pKK681 in der
frühexponentiellen Wachstumsphase (OD600 = 0,6, + 0,5 mM IPTG)
besitzen die entsprechenden Zellen nach 5 h Inkubation bei
37°C in der spätexponentiellen Phase (OD600 = 4,1) eine
Aktivität von ca. 480 U/l.
Anhand der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 wurden die Oligo
nukleotide 5'-CAGGATGCCATATGTGCAACAACTGC (P1) und 5'-CCCAAGCTTCAGACCAGGGCCAGAA
(P2) abgeleitet als Primer für eine PCR-Ampli
fikation des L-Pantolacton-Hydrolase-Gens unter den folgenden
Bedingungen: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 2 mM MgSO4, 10 mM KCl,
10 mM (NH4)2SO4, 0,1% Triton X-100, 0,1 mg/ml BSA, 25 mM je dNTP,
0,96 µg/ml pKS+681, je 2,2 µg/ml P1 und P2, 25 U/ml Pfu-Polymerase
(Stratagene, LaJolla, Calif.); die PCR-Parameter waren wie folgt:
1 min 95°C, 1 min 55°C, 2,5 min 72°C, 30 Cyclen. Das erhaltene
PCR-Produkt (0,8 kB) wurde mit NdeI und HindIII geschnitten und
in mit NdeI und HindIII geschnittenen und dephosphorylierten
pDHE19 (Prof. Mattes, Stuttgart) ligiert. Das Ligationsgemisch
wurde in E. coli XL1 Blue bzw. TG1 transformiert (Stratagene,
LaJolla, Calif.; DSMZ, Braunschweig, DSMZ-Nr. 6056, Inoue et al.
1990, Gene 96: 23-28). Die Transformanten wurden auf LB-Ampicillin-Platten
ausplattiert und über Nacht inkubiert. Von dieser
Transformationsplatte wurden analog zu Beispiel 8 ein Filte
rabklatsch auf LB-Ampicillin-(100 µg/ml)Rhamnose-(2 g/l) Platten
(LB = Luria Broth) und ein anschließender Aktivitätstest durch
geführt, bei welchem ca. 100 intensiv gelbe Klone identifiziert
wurden. Zehn wurden durch Minipräparation und Restriktionsverdau
(NdeI-HindIII, NdeI-HindIII-BamHI) sowie Sequenzanalyse der
Plasmid-DNA analysiert (Maniatis, T., Molecular Cloning:
A labaratory manual, 1989). Sie enthielten das in Fig. 5
abgebildete Plasmid pDHE681.
E. coli TG1 pDHE681 wurde in 14 l Minimalmedium mit 40 g/l
Glycerin und 2,5 g/l Rhamnose 6 bis 7 h bei 37°C angezogen,
geerntet und in Tris/HCl-Puffer (50 mM, pH 7,0) gewaschen
und ad 1,4 l Puffer resuspendiert. Die Aktivität der einfach
konzentrierten Zellsuspension betrug im Standardassay (150 mM
Pipes pH 7,0, 150 mM L-Pantolacton, 1 h 30°C) 680 bis 2700 U/l
bzw. 60 bis 160 g/BTM.
10 ml der 10fach konzentrierten Suspension wurden mit 50 mM
D,L-Pantolacton in 50 mM Tris/HCl pH 7,0 (Ansatzvolumen 20 ml)
bei 30°C unter Titration mit 4 M NaOH auf pH 7,0 inkubiert. Nach
0,4 h und 3 h wurden der Umsatz und der ee-Wert durch HPLC-
Analyse bestimmt (0,4 h: c = 48%, ee = 92%; 3 h: c = 58%,
ee = 72% bzgl. L-Pantoinsäure). Dies entspricht D-Pantolacton
mit ee-Werten von 84% bzw. 100%.
3 g D,L-Pantolacton wurden in 10 ml H2O gelöst und mit 4 M NaOH
auf pH 6,5 titriert. Nach Zugabe von 5 bis 10 ml Zellsuspension
E. coli TG1 pDHE681 (Beispiel 14) und Auffüllen ad 20 ml mit H2O
wurde die Reaktion bei 30°C unter Titration auf pH 6,8 15 bis
22 h inkubiert. Wahlweise wurden nochmals 0 bis 2 ml Zell
suspension zugesetzt und weitere 3 h inkubiert bzw. 3 × 5 ml
Zellsuspension zugesetzt und weitere 90 h inkubiert. Fig. 6
zeigt den Verlauf anhand des NaOH-Verbrauches. Je nach Umsatz und
Inkubationszeit wurden ee-Werte für D-Pantolacton von 71 bis 97%
erzielt. Anschließend wurden die Zellen aus den 22 ml-Ansätzen
abzentrifugiert und mit 5 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,0 gewaschen und
die Überstände vereinigt (20 bis 25 ml) und 3 × mit einem Volumen
Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde nach Zugabe
von 10 g Na2SO4 (wasserfrei) 1 h bei Raumtemperatur getrocknet.
Der Niederschlag wurde abfiltriert, 1 × mit Ethylacetat gewaschen
und das Filtrat 3 h bei 40°C einrotiert. Der viskose Rückstand
wurde ausgewogen und durch HPLC, GC, GC-MS sowie H-NMR analysiert
(Tab. 7). Er enthielt reines D-Pantolacton (ee 71 bis 87% nach
50 bis 52% Umsatz).
Die wäßrige Phase (21 ml; Na-L-Pantoat) wurde mit ca. 5 ml 3 M
H2SO4 auf pH 1 gestellt, 15 min bei 80°C erhitzt und mit 8 g
wasserfreiem Na2SO4 versetzt. Das erhaltene L-Pantolacton wurde
analog 3 × mit einem Volumen Ethylacetat extrahiert, mit Na2SO4
getrocknet und einrotiert. Zur Rückführung in die Hydrolyse kann
die L-Pantolacton-Schmelze durch Erhitzen nach NaOH-Zugabe in
Gegenwart von geringen Mengen Na-L-Pantoat racemisiert werden
(3 h 180°C).
L-Pantolacton-Hydrolase wurde direkt aus Fermenterbrühe von
E. coli (TG1 pDHE681 bzw. bevorzugt Stämme, die Chaperone wie
z. B. GroEL co-exprimieren) durch Zellaufschluß (2 × 1000 bar im
Microfluidizer), Zelltrümmerabtrennung (20 min 9000 g bei 10°C),
10-fache Konzentration über eine Cross-Flow-Filtration (Hämoflow
F60, Fresenius, Membran mit Ausschluß von ca. 10 kDa) und Hitze
fällung (20 min 60°C, 20 min RT-10°C, Zentrifugation) gewonnen
und auf eine spezifische Aktivität von ca. 3000 U/g Protein
angereichert. Dieses 10 × Homogenat besaß eine Aktivität von
63-100 000 U/l und eine Proteinkonzentration von 20-30 g/l.
Die Racematspaltungen von 2,3 M D,L-Pantolacton (30% w/v) mit
hitzegefälltem Homogenat (16000 U/l, 6 g/l Protein) wurden bei
30°C unter Titration mit 4 bis 10 M NaOH (pH 7,5) mit leichter
Pufferung (6 bis 20 mM NaHCO3) im 0,75 bis 1,0 l batch-Ansatz
durchgeführt. Nach Inkubation über Nacht wurde das Enzym durch
Cross-Flow-Filtration (Hämoflow F40, Fresenius, Membran mit
Ausschluß von ca. 10 kDa) des Ansatzes von der Produkt-haltigen
Lösung getrennt, 1 bis 2 × mit VE-Wasser gewaschen und
konzentriert. Anschließend wurde das Enzym erneut unter den
obigen Bedingungen eingesetzt. Der Standzeitversuch zeigte eine
Verdopplung der für einen ee-Wert von <90% (D-PL) notwendigen
Verweilzeit von 12 auf 24 h nach 6d (Fig. 7). Die Aktivitäts
verluste sollten sich durch Verwendung größerer Volumina (z. B.
10-l-Ansatz für die F40-Kartusche) reduzieren lassen.
Die Aufarbeitung von Racematspaltungsansätzen mit Homogenat
(50,8% Umsatz, 92,5% ee) erfolgte durch Extraktion mit 5 × 1 Vol.
MTBE. Es wurden 43% D-Pantolacton mit 91,4% ee und 98,2%
Reinheit (GCint.St.; bezogen auf 100% Racemat). Nach Erhitzen
(65°C/15 min) mit Schwefelsäure (konz., 25 ml) und abermaliger
Extraktion mit MTBE (5 × 1 Vol) wurden 53% L-Pantolacton mit
62,3% ee und 98,2% Reinheit (GCint.St.) erhalten. Verun
reinigungen durch Protein oder DNA waren mit Standardverfahren
nicht erkennbar.
* NaOH-Daten vom 6. Tag nicht verfügbar. 50,4% Umsatz, 89,8% ee
bei 1390 min (23,17 h).
Proben vom 7. Tag nicht verfügbar, daher keine analytischen Daten.
L-Pantolacton-Hydrolase wurde wie in Beispiel 16 isoliert und an
verschiedene Trägermaterialien wie das kommerziell erhältliche
EupergitC (Röhm GmbH, Darmstadt) oder Deloxan DAPIII (Degussa,
Frankfurt) gebunden.
Eupergit ist ein durch Epoxidgruppen aktiviertes Trägermaterial.
Das Protein wird dadurch hauptsächlich an Aminogruppen kovalent
fixiert.
Homogenat wurde zunächst durch Hitzebehandlung einer Fällung
unterzogen. 1,1 l Homogenat wurden zu Mengen von je 550 ml für
30 Minuten bei 60°C inkubiert und dann für 20 Minuten auf Eis zur
Abkühlung gestellt. Diese Lösung wurde zentrifugiert (1 Stunde
8000 U/min GS3 Rotor), um denaturiertes Protein abzutrennen. Der
Überstand wurde dann auf einer Hämoflow F40 Kartusche konzen
triert und in einen 20 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, umgepuffert. Die
Menge Protein pro g Eupergit kann frei gewählt werden. In dem
folgenden Beispiel wurden 7,2 g Protein in 270 ml Puffer mit
30 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 verdünnt und mit 17,5 g
festem NaCl eingesalzt. Die hohe Salzmenge fördert die Bindung
des Proteins an den Träger. Der pH wurde auf genau pH 6,8 ein
gestellt und zu dieser Lösung wurden dann 15 g trockenes Eupergit
gegeben. Die Lösung wurde für 17 Stunden bei Raumtemperatur
bewegt. Das Reaktionsgemisch wurde dann auf einer Glasnutsche
abgesaugt und der Träger mit Wasser gewaschen. Das feuchte
Material wog ca. 60 g. Die Aufbewahrung erfolgte in einem 10 mM
Phosphatpuffer, pH 7,5.
Deloxan ist ein mit Aminogruppen modifiziertes Silikat. Diese
Aminogruppen können mit Glutardialdehyd unter Bildung einer
Schiff'schen Base aktiviert werden. Der überschüssige Aldehyd
wird dann weggewaschen und das Protein zum aktivierten Träger
hinzugegeben. Die freien Aminogruppen des Proteins reagieren
unter Bildung einer zweiten Schiff'schen Base mit dem noch freien
Aldehyd des gebundenen Glutardialdehyds. Dieses so immobilisierte
Protein ist bereits einsetzbar. Die Schiff'sche Base neigt jedoch
zur Hydrolyse, so daß das Protein langsam vom Träger in wäßriger
Lösung abblutet. Dies kann durch Reduktion mit Natriumborhydrid
vermieden werden. Dabei wird die Schiff'sche Base in ein
sekundäres Amin umgewandelt. Vorraussetzung dafür ist die
Stabilität des Enzyms gegen eine Reduktion mit Natriumborhydrid.
Hitzefällung des Homogenats wie bei der Immobilisierung auf
EupergitC.
140 g Deloxan DAPIII wurde mit Wasser, dann mit 1,5 l 0,1 M
Natriumphosphatpuffer, pH 6, und 1,5 l 0,1 M Natriumphosphat
puffer, pH 7,5, gewaschen und resuspendiert. Dazu wurden 560 ml
einer 2,5%igen Glutardialdehydlösung (pH 7,5 korrigiert im
gleichen Puffer) gegeben und für 3 bis 4 Stunden reagiert. Der
Träger wurde orangerot. Danach wurde der aktivierte Träger mit
6 l Wasser gewaschen und in 1 l Natriumphosphatpuffer (pH 7,5)
resuspendiert.
Zu 40 g aktiviertem Deloxan wurden z. B. 10 000 U (ca. 2,7 g
Protein) L-Pantolacton-Hydrolase gegeben. Das Protein wurde mit
dem aktivierten Träger für 18 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Lösung wurde über eine Glasnutsche vom Träger
getrennt. Der Träger wurde mehrfach mit Wasser und dann mit 1 l
0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2 und 1 M NaCl gewaschen. Die Hälfte
des Trägers wurde entnommen (ohne Reduktion). Die andere Hälfte
wurde wieder mit Wasser gewaschen und dann in 0,1 M Natriumborat
puffer, pH 7,2, gegeben.
Zu dem in 80 ml Boratpuffer resuspendierten Träger wurden 0,4 g
Natriumborhydrid gegeben (0,5%) und 3 Stunden bei Raumtemperatur
bewegt. Dabei wurde das Trägermaterial wieder hellgelb. Der
Träger wurde über eine Glasnutsche abgesaugt und mit 400 ml
Boratpuffer gewaschen. Danach wurde der Träger mit 1 l Wasser
gewaschen und dann in 20 mM Phosphatpuffer aufgenommen.
Zur Racematspaltung von 2,3 M D,L-Pantolacton (30% w/v) mit
Immobilisaten wurden diese unter Titration mit 10 M NaOH (pH 7,5)
in 10 mM NaHCO3 in 40-ml-Ansätzen bei 30°C gerührt, bis der
ee-Wert für D-Pantolacton bei ca. 90% lag (25 bis 60 h). Der
Biokatalysator wurde nach jedem Batch durch Filtration (Absaugen
des Reaktionsansatzes durch einen HPLC-Laufmittel-Filter) vom
Produkt getrennt und ggf. 3 × Waschen (VE-Wasser) zurückgewonnen.
Die nachfolgenden Abbildungen zeigen die NaOH-Kurven der
Standzeit-Versuche im gerührten Ansatz.
Claims (20)
1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit
L-Pantolacton-Hydrolaseaktivität codiert, ausgewählt aus der
Gruppe:
- a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz,
- b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäuresequenz ableiten,
- c) Derivate der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäure sequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 50% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist
- d) funktionelle Äquivalente der unter (a) bis (c) genannten Sequenzen.
2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz
gemäß Anspruch 1.
3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in
SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz.
4. Nukleinsäurekonstrukt enthaltend eine Nukleinsäuresequenz
gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem
oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.
5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1
oder ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 4.
6. Mikroorganismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäure
sequenz gemäß Anspruch 1, mindestens ein Nukleinsäure
konstrukt gemäß Anspruch 4 oder einen Vektor gemäß
Anspruch 5.
7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein gram-negatives
Bakterium handelt.
8. Mikroorganismus nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn
zeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein
Bakterium aus der Gruppe der α-Proteobacterien,
β-Proteobacterien oder γ-Proteobacterien handelt.
9. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um ein
Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae, Pseudo
monadaceae oder Rhizobiaceae handelt.
10. Mikroorganismus nach den Ansprüchen 6 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mikroorganismus um
ein Bakterium der Gattungen Agrobacterium, Pseudomonas,
Burkholderia, Salmonella oder Escherichia handelt.
11. L-Pantolacton-Hydrolase, gekennzeichnet durch die folgenden
Eigenschaften:
- a) Umsetzung von L-Pantolacton zur entsprechenden Säure,
- b) pH-Stabilität: L-Pantolacton-Hydrolase ist stabil in einem pH-Bereich von 4 bis 10
- c) pH-Optimum: 7,2 bis 7,6
- d) Temperaturoptimum: ca. 70°C bis 75°C
- e) keine Hemmung der Aktivität durch EDTA.
12. Verfahren zur Herstellung von D-Pantolacton, dadurch
gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Reaktionsschritte
umfaßt:
- a) Umsetzung racemischen Pantolactons in Gegenwart einer L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch 11 oder einer L-Pantolacton-Hydrolase mit einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 oder einem Mikroorganismus gemäß Anspruch 6 zu D-Pantolacton und L-Pantoinsäure
- b) Abtrennung des D-Pantolactons.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die unter Reaktionsschritt (b) erhaltene L-Pantoinsäure
racemisiert und in Reaktionsschritt (a) rückgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart
einer immobilisierten L-Pantolacton-Hydrolase gemäß Anspruch
11 oder einer immobilisierten L-Pantolactonhydrolase mit
einer Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 2 durchgeführt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,
daß die Umsetzung des racemischen Pantolactons in Gegenwart
eines wachsenden, ruhenden oder aufgeschlossenen Mikro
organismus gemäß Anspruch 6 durchgeführt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 15, dadurch gekennzeichnet,
daß der Mikroorganismus immobilisiert ist.
17. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 16, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Verfahren in wäßriger Reaktionslösung bei
einem pH zwischen 4 bis 12 durchgeführt wird.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 17, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Verfahren bei einer Temperatur zwischen 0°C
bis 95°C durchgeführt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet,
daß das D-Pantolacton über Extraktion abgetrennt wird.
20. Verfahren nach den Ansprüchen 12 bis 18, dadurch gekennzeich
net, daß das D-Pantolacton eine optische Reinheit von minde
stens 90% ee besitzt.
Priority Applications (18)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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