JP4489298B2

JP4489298B2 - ニトリラーゼまたはニトリラーゼに対する遺伝子を含有する微生物の助けをかりてニトリルからキラルなカルボン酸を製造する方法

Info

Publication number: JP4489298B2
Application number: JP2000577288A
Authority: JP
Inventors: レス−ロッシュケ，マリオン; フリエドリッチ，トーマス; ハウエル，ベルナハルド; マテス，ラルフ; エンゲルス，ディルク
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1999-10-13
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2019-10-13
Also published as: NO327857B1; ATE349517T1; DK1123386T3; HUP0104802A2; KR100715744B1; DE59914102D1; HUP0104802A3; EP1123386A1; CN1331743A; KR20010085938A; HU228092B1; CZ302494B6; CZ20011382A3; ID29136A; NO20011912D0; CA2347521A1; EP1123386B1; AU765480B2; NO20011912L; WO2000023577A1

Description

【０００１】
本発明は、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列、該核酸配列を含有する核酸構築物、および該核酸配列または核酸構築物を含有するベクターに関する。本発明はまた、該核酸配列によりコードされたアミノ酸配列に関し、更に、該核酸配列、該核酸構築物、または該核酸配列もしくは該核酸構築物を含有するベクターを含んでなる微生物に関する。
【０００２】
本発明は更に、ラセミ体ニトリルからキラルなカルボン酸を調製する方法に関する。
【０００３】
キラルなカルボン酸は、有機化学合成に必要な化合物である。それらは、多数の医薬活性成分または作物保護用活性成分の出発原料である。キラルなカルボン酸は、例えば、ジアステレオマー塩を介する古典的なラセミ体分割に使用することができる。従って、R-(-)-またはS-(-)-マンデル酸は、例えば、ラセミ体アミンのラセミ体分割に利用される。このほか、R-(-)-マンデル酸は、半合成抗生物質および多数の農業製品を合成するための中間体として使用される。
【０００４】
キラルなカルボン酸を得るための多種多様な合成経路が文献中に開示されている。それにより、例えば、光学活性なアミノ酸は、発酵法により工業的に得られる。この方法には、各アミノ酸ごとに特有の方法を開発しなければならないという欠点がある。このため、できる限り広範囲にわたる様々な化合物を調製することができるように、化学的または酵素的方法が使用される。化学的方法の欠点は、立体中心を、通常、複雑で、多段階で、広く適用できない合成により構築しなければならないことである。
【０００５】
キラルなカルボン酸の酵素的合成については、いくつかの特許または特許出願に見出しうる。WO92/05275には、生体物質の存在下におけるエナンチオマーα-ヒドロキシ-α-アルキル-またはα-アルキルカルボン酸の合成についての記載がある。EP-B-0 348 901には、アルカリゲニス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudonomas)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属sp.KO-2-4株、アシネトバクター(Acinetobacter)属、バシラス(Bacillus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ローデコッカス(Rhodococcus)属およびカンジダ(Candida)属の微生物を用いて光学活性α-置換有機酸を調製する方法が特許請求されている。微生物を用いるL-α-アミノ酸の調製については、EP-B-0 332 379に特許請求されている。
【０００６】
種々の微生物、例えば、アルカリゲニス(Alcaligenes)属、アウレバクテリウム(Aureobacterium)属、シュードモナス(Pseudonomas)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アシネトバクター(Acinetobacter)属、カセオバクター(Caseobacter)属、バシラス(Bacillus)属、マイコバクテリウム(Mycobacterium)属、ローデコッカス(Rhodococcus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、ノカルジア(Nocardia)属、バリオボラクス(Variovorax)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属およびカンジダ(Candida)属の微生物を用いるか、または酵素を用いるα-ヒドロキシカルボン酸の調製、特に、光学活性な乳酸またはマンデル酸の調製については、EP-A-0 348 901またはそのUS対応特許US 5,283,193、EP-A-0 449 648、EP-B-0 473 328、EP-B-0 527 553またはそのUS対応特許US 5,296,373、EP-A-0 610 048、EP-A-0 610 049、EP-A 0 666 320またはWO97/32030の特許に記載されている。
【０００７】
これらの方法の欠点は、往々にして低い光学純度を有する生成物しか得られないこと、および／または、低い空時収率でしか進行しないことである。これが原因で、経済的には魅力のない方法になっている。スルフィット、ジスルフィット、ジチオニット、ヒポホスフットまたはホスフィットのような物質を添加することによって(EP-A 0 486 289を参照されたい)、またはα-ヒドロキシニトリルに対する耐性の増大した微生物を使用することによって(WO97/32030を参照されたい)生産性を増加させる試みを行った場合でさえ、生産性の増加はごく僅かである。
【０００８】
本発明の目的は、光学活性なキラルなカルボン酸を調製するための、容易で、費用効率が高く、広く適用可能で、しかも上記の欠点をもたない方法を開発することである。
【０００９】
我々は、この目的が、一般式I

で表されるキラルなカルボン酸を調製するための本発明に係る方法によって達成されることを見いだした。この方法には、
一般式II

で表されるラセミ体ニトリルを、
a) 配列番号1に示される配列を有する核酸配列、
b) 配列番号1に示される核酸配列から遺伝暗号の縮重の結果として誘導される核酸配列、
c) 配列番号1に示される核酸配列の誘導体であって、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつアミノ酸レベルで少なくとも80%の相同性を有して該ポリペプチドの酵素作用の低下が無視できるほどである、誘導体、
からなる群より選ばれる核酸配列によりコードされたアミノ酸配列の存在下で、または上記の群に属する核酸配列もしくは上記の群に属する核酸を1個以上の調節シグナルに連結させた核酸構築物のいずれかを含んでなる増殖状態にあるか、休眠状態にあるか、または破壊された状態にある、微生物の存在下で、変換することが含まれ、1時間にタンパク質1mgあたり少なくとも25mmolのニトリルまたは1時間に乾燥重量1gあたり少なくとも25mmolのニトリルがキラルなカルボン酸に変換される。但し、式IおよびII中の置換基および変数は、次の意味：
*は、光学活性中心であり、
R¹、R²、R³、は、互いに独立して、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、置換もしくは無置換のアリール、ヘテロアリール、OR⁴またはNR⁴R⁵であり、但し、基R¹、R²およびR³は必ず異なっており、
R⁴は、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、C₁〜C₁₀-アルキルカルボニル、C₂〜C₁₀-アルケニルカルボニル、アリール、アリールカルボニル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールカルボニルであり、
R⁵は、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、アリールまたはヘテロアリールである、
を有する。
【００１０】
式IおよびIIで表される化合物中のR¹、R²、R³は、互いに独立して、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、置換もしくは無置換のアリール、ヘテロアリール、OR⁴またはNR⁴R⁵であり、但し、基R¹、R²およびR³は必ず異なっている。
【００１１】
アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニルまたはn-デシルのような、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル鎖が挙げられる。メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、i-プロピルまたはi-ブチルが好ましい。
【００１２】
アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、2-メチルプロペニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-メチル-1-ブテニル、2-メチル-1-ブテニル、3-メチル-1-ブテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-メチル-3-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、1,2-ジメチル-1-プロペニル、1,2-ジメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、1-メチル-1-ペンテニル、2-メチル-1-ペンテニル、3-メチル-1-ペンテニル、4-メチル-1-ペンテニル、1-メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、1-メチル-3-ペンテニル、2-メチル-3-ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、2-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-3-ブテニル、1,2-ジメチル-1-ブテニル、1,2-ジメチル-2-ブテニル、1,2-ジメチル-3-ブテニル、1,3-ジメチル-1-ブテニル、1,3-ジメチル-2-ブテニル、1,3-ジメチル-3-ブテニル、2,2-ジメチル-3-ブテニル、2,3-ジメチル-1-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-3-ブテニル、3,3-ジメチル-1-ブテニル、3,3-ジメチル-2-ブテニル、1-エチル-1-ブテニル、1-エチル-2-ブテニル、1-エチル-3-ブテニル、2-エチル-1-ブテニル、2-エチル-2-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル、1-エチル-2-メチル-1-プロペニル、1-エチル-2-メチル-2-プロペニル、1-ヘプテニル、2-ヘプテニル、3-ヘプテニル、4-ヘプテニル、5-ヘプテニル、6-ヘプテニル、1-オクテニル、2-オクテニル、3-オ
クテニル、4-オクテニル、5-オクテニル、6-オクテニル、7-オクテニル、ノネニルまたはデセニルのような、分枝状または非分枝状C₂〜C₁₀-アルケニル鎖が挙げられる。エテニル、プロペニル、ブテニルまたはペンテニルが好ましい。
【００１３】
アリール基としては、環または環系中に6〜20個の炭素原子を含有する置換および無置換アリール基が挙げられる。後者には、互いに縮合した芳香環あるいはアルキル鎖、アルキルカルボニル鎖、アルケニル鎖もしくはアルケニルカルボニル鎖、カルボニル、酸素または窒素によって連結された芳香環が含まれていてもよい。また、アリール基は、適切な場合には、C₁〜C₁₀-アルキル鎖、C₃〜C₈-アルケニル鎖、C₃〜C₆-アルキニル鎖またはC₃〜C₈-シクロアルキル鎖を介して基本骨格に連結されていてもよい。フェニルまたはナフチルが好ましい。
【００１４】
ヘテロアリールとしては、N、OまたはSのようなヘテロ原子を1個以上含有していてもよく、かつ適切な場合には、C₁〜C₁₀-アルキル鎖、C₃〜C₈-アルケニル鎖またはC₃〜C₈-シクロアルキル鎖を介して基本骨格に連結されていてもよい複素芳香族の3〜7員環を1個以上有する置換もしくは無置換の単一もしくは縮合芳香環系が挙げられる。このタイプのヘテロアリール基の例は、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピリジン、キノリン、イソキノリン、アクリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、フェナジン、プリンまたはプテリジンである。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介してまたは環もしくは環系中の種々の炭素原子を介してあるいは置換基を介して、基本骨格に連結されていてもよい。ピリジン、イミダゾール、ピリミジン、プリン、ピラジンまたはキノリンが好ましい。
【００１５】
上記のR¹、R²またはR³基に対する好適な置換基は、例えば、次のような1個以上の置換基、すなわち、フッ素、塩素もしくは臭素のようなハロゲン、チオ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニルまたは他の芳香族、あるいは他の飽和もしくは不飽和非芳香族の環または環系である。好ましいものとしては、メチル、エチル、プロピルもしくはブチルのごときC₁〜C₆-アルキルなどのアルキル基、フェニルなどのアリール、塩素、フッ素もしくは臭素のようなハロゲン、ヒドロキシまたはアミノが挙げられる。
【００１６】
OR⁴またはNR⁴R⁵基中のR⁴は、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、C₁〜C₁₀-アルキルカルボニル、C₂〜C₁₀-アルケニルカルボニル、アリール、アリールカルボニル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールカルボニルである。
【００１７】
アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチルエチル、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニルまたはn-デシルのような置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル鎖が挙げられる。メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、i-プロピルまたはi-ブチルが好ましい。
【００１８】
アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、2-メチルプロペニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-ペンテニル、4-ペンテニル、1-メチル-1-ブテニル、2-メチル-1-ブテニル、3-メチル-1-ブテニル、1-メチル-2-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、3-メチル-2-ブテニル、1-メチル-3-ブテニル、2-メチル-3-ブテニル、3-メチル-3-ブテニル、1,1-ジメチル-2-プロペニル、1,2-ジメチル-1-プロペニル、1,2-ジメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-プロペニル、1-エチル-2-プロペニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、4-ヘキセニル、5-ヘキセニル、1-メチル-1-ペンテニル、2-メチル-1-ペンテニル、3-メチル-1-ペンテニル、4-メチル-1-ペンテニル、1-メチル-2-ペンテニル、2-メチル-2-ペンテニル、3-メチル-2-ペンテニル、4-メチル-2-ペンテニル、1-メチル-3-ペンテニル、2-メチル-3-ペンテニル、3-メチル-3-ペンテニル、4-メチル-3-ペンテニル、1-メチル-4-ペンテニル、2-メチル-4-ペンテニル、3-メチル-4-ペンテニル、4-メチル-4-ペンテニル、1,1-ジメチル-2-ブテニル、1,1-ジメチル-3-ブテニル、1,2-ジメチル-1-ブテニル、1,2-ジメチル-2-ブテニル、1,2-ジメチル-3-ブテニル、1,3-ジメチル-1-ブテニル、1,3-ジメチル-2-ブテニル、1,3-ジメチル-3-ブテニル、2,2-ジメチル-3-ブテニル、2,3-ジメチル-1-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-3-ブテニル、3,3-ジメチル-1-ブテニル、3,3-ジメチル-2-ブテニル、1-エチル-1-ブテニル、1-エチル-2-ブテニル、1-エチル-3-ブテニル、2-エチル-1-ブテニル、2-エチル-2-ブテニル、2-エチル-3-ブテニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニル、1-エチル-2-メチル-1-プロペニル、1-エチル-2-メチル-2-プロペニル、1-ヘプテニル、2-ヘプテニル、3-ヘプテニル、4-ヘプテニル、5-ヘプテニル、6-ヘプテニル、1-オクテニル、2-オクテニル、3-オ
クテニル、4-オクテニル、5-オクテニル、6-オクテニル、7-オクテニル、ノネニルまたはデセニルのような分枝状もしくは非分枝状C₂〜C₁₀-アルケニル鎖が挙げられる。エテニル、プロペニル、ブテニルまたはペンテニルが好ましい。
【００１９】
アルキルカルボニル基としては、例えば、メチルカルボニル、エチルカルボニル、n-プロピルカルボニル、1-メチルエチルカルボニル、n-ブチルカルボニル、1-メチルプロピルカルボニル、2-メチルプロピルカルボニル、1,1-ジメチルエチルカルボニル、n-ペンチルカルボニル、1-メチルブチルカルボニル、2-メチルブチルカルボニル、3-メチルブチルカルボニル、2,2-ジメチルプロピルカルボニル、1-エチルプロピルカルボニル、n-ヘキシルカルボニル、1,1-ジメチルプロピルカルボニル、1,2-ジメチルプロピルカルボニル、1-メチルペンチルカルボニル、2-メチルペンチルカルボニル、3-メチルペンチルカルボニル、4-メチルペンチルカルボニル、1,1-ジメチルブチルカルボニル、1,2-ジメチルブチルカルボニル、1,3-ジメチルブチルカルボニル、2,2-ジメチルブチルカルボニル、2,3-ジメチルブチルカルボニル、3,3-ジメチルブチルカルボニル、1-エチルブチルカルボニル、2-エチルブチルカルボニル、1,1,2-トリメチルプロピルカルボニル、1,2,2-トリメチルプロピルカルボニル、1-エチル-1-メチルプロピルカルボニル、1-エチル-2-メチルプロピルカルボニル、n-ヘプチルカルボニル、n-オクチルカルボニル、n-ノニルカルボニルまたはn-デシルカルボニルのような置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキルカルボニル鎖が挙げられる。メチルカルボニル、エチルカルボニル、n-プロピルカルボニル、n-ブチルカルボニル、i-プロピルカルボニルまたはi-ブチルカルボニルが好ましい。
【００２０】
アルケニルカルボニル基としては、例えば、エテニルカルボニル、プロペニルカルボニル、1-ブテニルカルボニル、2-ブテニルカルボニル、3-ブテニルカルボニル、2-メチルプロペニルカルボニル、1-ペンテニルカルボニル、2-ペンテニルカルボニル、3-ペンテニルカルボニル、4-ペンテニルカルボニル、1-メチル-1-ブテニルカルボニル、2-メチル-1-ブテニルカルボニル、3-メチル-1-ブテニルカルボニル、1-メチル-2-ブテニルカルボニル、2-メチル-2-ブテニルカルボニル、3-メチル-2-ブテニルカルボニル、1-メチル-3-ブテニルカルボニル、2-メチル-3-ブテニルカルボニル、3-メチル-3-ブテニルカルボニル、1,1-ジメチル-2-プロペニルカルボニル、1,2-ジメチル-1-プロペニルカルボニル、1,2-ジメチル-2-プロペニルカルボニル、1-エチル-1-プロペニルカルボニル、1-エチル-2-プロペニルカルボニル、1-ヘキセニルカルボニル、2-ヘキセニルカルボニル、3-ヘキセニルカルボニル、4-ヘキセニルカルボニル、5-ヘキセニルカルボニル、1-メチル-1-ペンテニルカルボニル、2-メチル-1-ペンテニルカルボニル、3-メチル-1-ペンテニルカルボニル、4-メチル-1-ペンテニルカルボニル、1-メチル-2-ペンテニルカルボニル、2-メチル-2-ペンテニルカルボニル、3-メチル-2-ペンテニルカルボニル、4-メチル-2-ペンテニルカルボニル、1-メチル-3-ペンテニルカルボニル、2-メチル-3-ペンテニルカルボニル、3-メチル-3-ペンテニルカルボニル、4-メチル-3-ペンテニルカルボニル、1-メチル-4-ペンテニルカルボニル、2-メチル-4-ペンテニルカルボニル、3-メチル-4-ペンテニルカルボニル、4-メチル-4-ペンテニルカルボニル、1,1-ジメチル-2-ブテニルカルボニル、1,1-ジメチル-3-ブテニルカルボニル、1,2-ジメチル-1-ブテニルカルボニル、1,2-ジメチル-2-ブテニルカルボニル、1,2-ジメチル-3-ブテニルカルボニル、1,3-ジメチル-1-ブテニルカルボニル、1,3-ジメチル-2-ブテニルカルボニル、1,3-ジメチル-3-ブテニルカルボニル、2,2-ジメチル-3-ブテニルカルボニル、2,3-ジメチル-1-ブテニルカルボニル、2,3-ジメチル-2-ブテニルカルボニル、2,3-ジメチル-3-ブテニルカルボニル、3,3-ジメチル-1-ブテニルカルボニル、3,3-ジメチル-2-ブテニルカルボニル、1-エチル-1-ブテニルカルボニル、1-エチル-2-ブテニルカルボニル、1-エチル-3-ブテニルカルボニル、2-エチル-1-ブテニルカルボニル、2-エチル-2-ブテニルカルボニル、2-エチル-3-ブテニルカルボニル、1,1,2-トリメチル-2-プロペニルカルボニル、1-エチル-1-メチル-2-プロペニルカルボニル、1-エチル-2-メチル-1-プロペニルカルボニル、1-エチル-2-メチル-2-プロペニルカルボニル、1-ヘプテニルカルボニル、2-ヘプテニルカルボニル、3-ヘプテニルカルボニル、4-ヘプテニルカルボニル、5-ヘプテニルカルボニル、6-ヘプテニルカルボニル、1-オクテニルカルボニル、2-オクテニルカルボニル、3-オクテニルカルボニル、4-オクテニルカルボニル、5-オクテニルカルボニル、6-オクテニルカルボニル、7-オクテニルカルボニル、ノネニルカルボニルまたはデセニルカルボニルのような分枝状もしくは非分枝状C₂〜C₁₀-アルケニルカルボニル鎖が挙げられる。エテニルカルボニル、プロペニルカルボニル、ブテニルカルボニルまたはペンテニルカルボニルが好ましい。
【００２１】
アリール基としては、環または環系中に6〜20個の炭素原子を含有する置換および無置換アリール基が挙げられる。後者には、互いに縮合した芳香環あるいはアルキル鎖、アルキルカルボニル鎖、アルケニル鎖もしくはアルケニルカルボニル鎖、カルボニル、酸素または窒素を介して連結された芳香環が含まれていてもよい。また、アリール基は、適切な場合には、C₁〜C₁₀-アルキル鎖、C₃〜C₈-アルケニル鎖、C₃〜C₆-アルキニル鎖またはC₃〜C₈-シクロアルキル鎖を介して基本骨格に連結されていてもよい。フェニルまたはナフチルが好ましい。
【００２２】
アリールカルボニル基としては、環または環系中に6〜20個の炭素原子を含有する置換および無置換アリールカルボニル基が挙げられる。後者には、互いに縮合した芳香環あるいはアルキル鎖、アルキルカルボニル鎖、アルケニル鎖もしくはアルケニルカルボニル鎖、カルボニル、酸素または窒素を介して連結された芳香環が含まれていてもよい。フェニルカルボニルまたはナフチルカルボニルが好ましい。
【００２３】
ヘテロアリールとしては、N、OまたはSのようなヘテロ原子を1個以上含有していてもよくかつ適切な場合にはC₁〜C₁₀-アルキル鎖、C₃〜C₈-アルケニル鎖またはC₃〜C₈-シクロアルキル鎖を介して基本骨格に連結されていてもよい複素芳香族の3〜7員環を1個以上有する置換もしくは無置換の単一もしくは縮合芳香環系が挙げられる。このタイプのヘテロアリール基の例は、ピラゾール、イミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピリジン、キノリン、イソキノリン、アクリジン、ピリミジン、ピリダジン、ピラジン、フェナジン、プリンまたはプテリジンである。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介してまたは環もしくは環系中の種々の炭素原子を介してあるいは置換基を介して、基本骨格に連結されていてもよい。ヘテロアリールカルボニル基とは、カルボニル基を介して基本骨格に連結された複素芳香族基を意味する。ピリジン、イミダゾール、ピリミジン、プリン、ピラジンまたはキノリンが好ましい。
【００２４】
上記のR⁴基に対する好適な置換基は、例えば、次のような1個以上の置換基、すなわち、フッ素、塩素もしくは臭素のようなハロゲン、チオ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニルあるいは他の芳香族または他の飽和もしくは不飽和非芳香族の環または環系である。好ましいものとしては、メチル、エチル、プロピルもしくはブチルなどのC₁〜C₆-アルキルのようなアルキル基、塩素、フッ素もしくは臭素のようなハロゲン、ヒドロキシまたはアミノが挙げられる。
【００２５】
R⁴基は、好ましくは水素である。
【００２６】
NR⁴R⁵基中のR⁵は、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、アリールまたはヘテロアリールである。但し、アルキル基、アルケニル基、アリール基およびヘテロアリール基は、上記の意味を有する。好ましいものとしては、水素またはメチル、エチルもしくはプロピルなどのC₁〜C₁₀-アルキルが挙げられる。
【００２７】
上記のR⁵基に対する好適な置換基は、例えば、次のような1個以上の置換基、すなわち、フッ素、塩素もしくは臭素のようなハロゲン、チオ、ニトロ、アミノ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルキニルあるいは他の芳香族または他の飽和もしくは不飽和非芳香族の環または環系である。好ましいものとしては、メチル、エチル、プロピルまたはブチルのようなC₁〜C₆-アルキルなどのアルキル基、フェニルなどのアリール、塩素、フッ素もしくは臭素のようなハロゲン、ヒドロキシまたはアミノが挙げられる。
【００２８】
更に、2個の隣接するR⁴またはR⁵置換基が一緒になって、環中に5〜6個の原子を有するもう一つの置換もしくは無置換の芳香環、飽和環もしくは部分飽和環を形成することも可能である。この環には、O、NまたはSのようなヘテロ原子が1個以上含まれていてもよい。
【００２９】
有利には、式IおよびII中のR¹、R²またはR³置換基のうちの一つは、フェニルなどのアリールである。更に好ましくは、式IおよびII中のR¹、R²またはR³置換基のうちの一つはヒドロキシであり、一つは水素またはメチルである。
【００３０】
本発明に係る方法は、pH4〜11、好ましくはpH4〜9で行うことが有利である。
【００３１】
更に、この方法において、ニトリル0.01〜10重量%または対応するアルデヒドもしくはケトン0.01〜10重量%およびシアン化水素酸0.01〜10重量%を使用することが有利である。該方法は、有利には、過剰のシアン化水素酸を用いて行われる。このため、シアン化水素酸の含有率が、記載の値よりも大きくになることもある。ニトリルにもよるが、種々の量のニトリルを反応に使用することができる。対応するアルデヒドおよびシアン化水素酸と平衡状態にあるニトリル(シアノヒドリン)の場合には、最小量(＝0.01〜5重量%の量)のニトリルを使用することが有利である。なぜなら、アルデヒドは、通常、微生物または酵素に対して毒性をもつからである。同様に、揮発性のニトリルも、0.01〜5重量%の量で利用することが有利である。シアノヒドリンまたはニトリルの量を増加させると、反応が遅くなる。溶剤特性がごくわずかであるかもしくは実質的にまったくないニトリルまたは水性媒質にごく少量しか溶解しないニトリルの場合、上記の量よりも多い量を用いることが有利である。転化率および収率を増大させるために、ラセミ体ニトリルの添加を制御しながら反応を行うことが有利である。生成物は、反応終了後に単離するかまたはバイパスにより連続的に取り出すことが可能である。
【００３２】
上記の適切なアルデヒドまたはケトンとは、アルデヒドまたはケトンとシアン化水素化との反応を行った後でニトリルを形成する化合物を意味する。アルデヒドとシアン化水素化との反応により、アルデヒドおよびシアン化水素化と平衡状態にあるという利点を有するシアノヒドリンが得られる。シアノヒドリンとの平衡状態が形成されるということは、平衡状態であるにもかかわらず、ニトリルの一方のエナンチオマーだけを変換する酵素を用いて理論収率100%を得ることが可能であることを意味する。なぜなら、ラセミ体ニトリルが連続的に供給されるからである。このほかのニトリルの場合にはいずれも、酵素により変換されないニトリル(＝「対象外の」すなわち他方のエナンチオマー)を、理論収率100%に到達できるように化学反応によりラセミ化させて該方法に戻すか、あるいは廃棄するかまたは立体中心を保持した状態で精製および化学的に加水分解することが有利である。
【００３３】
本発明に係る方法は、有利には、0℃〜80℃、好ましくは10℃〜60℃、特に好ましくは15℃〜50℃の温度で行われる。
【００３４】
本発明に係る方法におけるラセミ体ニトリルとは、二つのエナンチオマーの50:50混合物または混合物中の二つのエナンチオマーのうちの一方が多く存在する任意の他の混合物からなるニトリルを意味する。
【００３５】
本発明に係る方法でのキラルなカルボン酸とは、エナンチオマーの富化を呈するカルボン酸を意味する。この方法を実施した場合、エナンチオマー純度が少なくとも90%ee、好ましくは少なくとも95%ee、特に好ましくは少なくとも98%ee、特に非常に好ましくは少なくとも99%eeになることが好ましい。
【００３６】
本発明に係る方法を実施することによって、多数のラセミ体ニトリルをキラルなカルボン酸に変換することが可能である。この方法では、少なくとも25mmolニトリル／h×mgタンパク質または少なくとも25mmolニトリル／h×g微生物乾燥重量、好ましくは少なくとも30mmolニトリル／h×mgタンパク質または少なくとも30mmolニトリル／h×g乾燥重量、特に好ましくは少なくとも40mmolニトリル／h×mgタンパク質または少なくとも40mmolニトリル／h×g乾燥重量、特に非常に好ましくは少なくとも50mmolニトリル／h×mgタンパク質または少なくとも50mmolニトリル／h×g乾燥重量を変換することが可能である。
【００３７】
本発明に係る方法のために本発明に係る核酸、核酸構築物またはベクターを含む増殖状態の細胞を使用することが可能である。休眠状態にある、または破壊された細胞を使用することもできる。破壊された細胞とは、例えば、溶剤などでの処理により透過性を得た細胞、または酵素処理、機械的処理(例えば、フレンチプレスまたは超音波)もしくは任意の他の方法により分解された細胞を意味する。こうして得られる粗抽出物は、本発明に係る方法に好適かつ有利である。精製または部分精製された酵素を該方法に使用することも可能である。固定化された微生物または酵素も同様に好適であり、反応に有利に使用できる。
【００３８】
本発明に係る方法で調製されたキラルなカルボン酸は、有利には、抽出もしくは結晶化によってまたは抽出および結晶化によって水性反応溶液から単離可能である。この目的のために、鉱酸(例えば、HClもしくはH₂SO₄)または有機酸などの酸を用いて有利にはpH値2未満まで水性反応溶液を酸性化し、次に、有機溶剤で抽出する。抽出を数回繰り返すことにより収率を増大させることが可能である。使用しうる有機溶剤は、原理的には、適切な場合には塩を添加した後で水との相境界を呈するすべての溶剤である。有利な溶剤は、トルエン、ベンゼン、ヘキサン、メチルtert-ブチルエーテルまたはエチルアセテートである。
【００３９】
有機相を濃縮した後、通常、良好な化学純度で、すなわち90%を超える化学純度で、生成物を単離することが可能である。しかしながら、抽出後、生成物を含有する有機相を一部のみ濃縮することも可能であり、そして生成物を結晶化することが可能である。この目的のために、有利には、0℃〜10℃の温度まで溶液を冷却する。有機溶液から直接的に結晶化を行うことも可能である。新たに結晶化を行うために同じかまたは異なる溶剤に再び結晶化した生成物を入れて、もう一度、結晶化を行うことも可能である。共晶組成の位置にもよるが、再結晶化を少なくとも1回行うことにより、生成物のエナンチオマー純度を更に高めることができる。
【００４０】
しかしながら、酸を用いて有利にはpH2未満まで酸性化した直後に、水性反応溶液からキラルなカルボン酸を結晶化することも可能である。この場合、有利には、加熱により水性溶液を濃縮してその体積を10〜90%、好ましくは20〜80%、特に好ましくは30〜70%減少させる。好ましくは、冷却しながら結晶化を行う。結晶化に用いる温度は0℃〜10℃が好ましい。水性溶液から直接的に結晶化することは、経費の点で好ましい。同様に、抽出および適切な場合にはそれに続く結晶化によりキラルなカルボン酸の仕上げ処理を行うことが好ましい。
【００４１】
これらの好ましいタイプの仕上げ処理を行うことにより、本発明に係る方法における生成物を、反応に利用したニトリルを基準にして60〜100%、好ましくは80〜100%、特に好ましくは90〜100%の収率で単離可能である。単離された生成物は、>90%、好ましくは>95%、特に好ましくは>98%の高い化学純度を有する。更に、生成物は高いエナンチオマー純度を有し、この純度は結晶化により更に高くすることが可能である。
【００４２】
こうして得られる生成物は、薬剤もしくは農薬を調製する有機合成またはラセミ体分割を行うための、出発物質として好適である。
【００４３】
本発明は更に、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列に関する。この核酸配列は、
a) 配列番号1に示される配列を有する核酸配列、
b) 遺伝暗号の縮重の結果として得られる、配列番号1に示される核酸配列由来の核酸配列、
c) 配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、また、アミノ酸レベルで少なくとも95%の相同性を有し、該ポリペプチドの酵素作用の低下が無視できる程度である、配列番号1に示される核酸配列の誘導体、
からなる群より選ばれる。
【００４４】
配列番号1の配列を有する本発明に係る核酸配列の相同体とは、例えば、全配列範囲にわたり誘導されるアミノ酸レベルで少なくとも95%の相同性、好ましくは少なくとも97%の相同性、特に非常に好ましくは少なくとも98%の相同性を有する対立突然変異体を意味する。配列の一部分を形成する領域に対して相同性をより高くすることが可能でありかつ有利である。配列番号1から誘導されるアミノ酸配列は、配列番号2に示される通りである。対立突然変異体には、特にヌクレオチドの欠失、挿入または置換により、配列番号1に示される配列から得られる機能性突然変異体が含まれるが、得られた生物に1種以上の遺伝子を導入した場合、誘導される合成タンパク質の酵素活性の低下は無視できるものでなければならない。従って、本発明はまた、上記の群の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列に関する。本発明は、有利には、配列番号1の配列によりコードされるアミノ酸配列に関する。
【００４５】
また、配列番号1の相同体とは、例えば、真菌性もしくは細菌性相同体、末端切断型配列、一本鎖DNAまたはコードおよび非コードDNA配列のRNAをも意味する。配列番号1の相同体は、配列番号1に示される全DNA領域にわたりDNAレベルで少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、特に非常に好ましくは少なくとも80%の相同性を有する。
【００４６】
更に、配列番号1の相同体とは、例えば、プロモーター変異体のような誘導体をも意味する。記載のヌクレオチド配列の前にあるプロモーターは、1個以上のヌクレオチド交換によって、挿入および／または欠失によって、改変可能であるが、プロモーターの機能または効力に悪影響を及ぼすものであってはならない。このほか、配列を改変することによってプロモーターの効力を増大させたり、更には、異なる種の生物に由来するより高い効力のプロモーターと完全に交換したりすることも可能である。
【００４７】
また、誘導体とは、遺伝子発現および／またはタンパク質発現が変化するように、好ましくは増大するように、開始コドンの上流-1〜-200の領域または停止コドンの下流0〜1000塩基対のヌクレオチド配列が改変された変異体を意味する。
【００４８】
配列番号1またはその相同体は、有利には、当業者に周知の方法により、細菌から、好ましくはグラム陰性細菌から、より好ましくはAlcaligenes属の細菌から、特に好ましくはAlcaligenes属faecalis種の細菌から単離される。
【００４９】
配列番号1またはその相同体あるいはそれらの配列の一部分は、例えば、従来のハイブリダイゼーション法またはPCR法を用いて、他の真菌または細菌から単離可能である。これらのDNA配列は、標準的条件下で本発明の配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、例えば、活性中心の保存される領域の短いオリゴヌクレオチドを用いて行われ、そしてこれらは、他のニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼと比較することにより、当業者に周知の方法で同定可能である。しかしながら、本発明に係る核酸のより長い断片またはその完全な配列をハイブリダイゼーションに使用することも可能である。これらの標準的条件は、使用する核酸オリゴヌクレオチド、より長い断片もしくはその完全な配列に依存して、またはどのタイプの核酸、DNAまたはRNAをハイブリダイゼーションに使用するかに依存して、変わる。この場合、例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA:RNAハイブリッドの融解温度よりも約10℃低い。
【００５０】
標準的条件とは、例えば、核酸にもよるが、温度42〜58℃、0.1〜5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2)の濃度を有する水性緩衝溶液中またはこれに加えて50%ホルムアミドの存在下を意味し、具体的には、例えば、42℃、5×SSC中、50%ホルムアミドである。DNA:DNAハイブリッド用のハイブリダイゼーション条件は、有利には、0.1×SSCおよび温度約20℃〜45℃、好ましくは約30℃〜45℃を含む。DNA:RNAハイブリッド用のハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、0.1×SSCおよび温度約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃を含む。ハイブリダイゼーション用として記載したこれらの温度は、例えば、長さ約100ヌクレオチドおよびG+C含量50%を有する核酸に対してホルムアミドの不在下として計算した融解温度である。DNAハイブリダイゼーション用の実験条件は、該当する遺伝学の教科書、具体的には、例えば、Sambrookら, “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989に記載されており、そして、例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの性質またはG+C含量に応じて当業者に周知の式により計算可能である。当業者は、次の教科書：Ausubelら (編), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; HamesおよびHiggins (編), 1985, Nucleic Acids Hybridization; A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編), 1991, Essential Molecular Biology; A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxfordにもハイブリダイゼーションに関する更なる情報を見いだすことができる。
【００５１】
本発明に係る核酸構築物とは、配列番号1の配列およびその相同体のニトリラーゼ遺伝子が、有利には遺伝子発現を増大させる1個以上の調節シグナルに機能的に連結されたものを意味する。これらの調節配列は、例えば、インデューサーまたはリプレッサーが結合することにより核酸の発現を調節する配列である。これらの新規な調節配列のほかに、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の上流に存在する可能性があり、この天然の調節は、しかるべき場合には、天然の調節が機能停止して遺伝子の発現が増大するように遺伝的に改変されたものであってよい。しかしながら、核酸構築物はまた、より単純な構造を有していてもよい。すなわち、配列番号1の配列またはその相同体の上流に追加の調節シグナルが挿入されておらず、しかもその調節を行う天然のプロモーターが除去されていないものであってよい。その代わりに、もはや調節がなされず、遺伝子発現が増大されるように天然の調節配列を突然変異させる。このほか、核酸構築物には、有利には、プロモーターに機能的に連結されていて核酸配列の発現を増大させることのできる1個以上のエンハンサー配列が含まれていてもよい。また、他の調節エレメントまたはターミネーターのような有利な追加配列をDNA配列の3’末端に挿入することも可能である。本発明に係る核酸は、構築物中に1個以上のコピーで存在していてもよい。構築物にはまた、構築物の選択に適している場合、抗生物質抵抗性または栄養要求性補完性遺伝子のような更なるマーカーが含まれていてもよい。
【００５２】
本発明に係る方法に有利な調節配列は、例えば、cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacI^q、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-P_Rまたはλ-P_Lプロモーターのような、有利にはグラム陰性細菌で使用されるプロモーター中に存在する。更に有利な調節配列は、例えば、グラム陽性菌プロモーターamyおよびSOP2中、菌類または酵母プロモーターADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中にある。また、これに関連して有利であるのは、ピルビン酸デカルボキシラーゼおよびハンセヌラ(Hansenula)などに由来するメタノールオキシダーゼのプロモーターである。人工プロモーターを調節に使用することも可能である。
【００５３】
核酸構築物は、有利には、宿主中で遺伝子の最適発現を行うことが可能な、例えばプラスミド、ファージまたは宿主生物中で発現させるために用いられる他のDNAのような、ベクター中に挿入される。これらのベクターを用いると本発明は更に進歩したものになる。好適なプラスミドの例は、大腸菌(E. Coli)では、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III¹¹³-B1、λgt11もしくはpBdCIであり、ストレプトミセス(Streptomyces)では、pIJ101、pIJ364、pIJ702もしくはpIJ361であり、バシラス(Bacillus)では、pUB110、pC194もしくはpBD214であり、コリネバクテリウム(Corynebacterium)では、pSA77もしくはpAJ667であり、菌類では、pALS1、pIL2もしくはpBB116であり、酵母では、2μM、pAG-1、YEp6、YEp13もしくはpEMBLYe23であり、あるいは植物では、pLGV23、pGHlac⁺、pBIN19、pAK2004もしくはpDH51である。これらのプラスミドは、使用可能なプラスミドから選択された少数の例である。このほかのプラスミドが当業者に周知であり、例えば、著書Cloning Vectors (Pouwels P. H.ら編 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)中に見いだすことができる。
【００５４】
核酸構築物はまた、有利には、存在する他の遺伝子を発現させるために、選択された宿主生物および1種もしくは複数種の遺伝子に応じた最適な発現を行うべく選ばれた発現を増大させる調節配列を3’末端および／または5’末端に更に含有する。
【００５５】
これらの調節配列は、遺伝子の特異的発現およびタンパク質発現が可能となるように設定されている。このことは、例えば、宿主生物にもよるが、遺伝子が誘導の後でのみ発現もしくは過剰発現されるか、または直ちに発現および／または過剰発現されることを意味するものであってよい。
【００５６】
更に、調節配列または因子は、好ましくは、誘導された遺伝子の発現に正の影響を及ぼすことが可能であり、従って、発現を増大させることが可能である。この場合、調節エレメントの強化は、プロモーターおよび／またはエンハンサーのような強力な転写シグナルを用いることにより転写レベルで行うことが可能である。しかしながら、このほかに、例えば、mRNAの安定性を向上させることにより翻訳を強化することも可能である。
【００５７】
ベクターのもう一つの実施形態において、本発明に係る核酸構築物または本発明に係る核酸を含有するベクターを、有利には、線状DNAの形態で微生物に導入し、そして非相同的または相同的組換えにより宿主生物のゲノム中に組み込むことも可能である。この線状DNAは、プラスミドのような線状化ベクターからなるものであってもよいし、核酸構築物または核酸だけからなるものであってもよい。
【００５８】
生物中で異種遺伝子の最適発現を行うべく、生物中で特異的に用いられるコドン使用に応じて核酸配列を改変することが有利である。コドン使用は、問題にする生物における他の既知の遺伝子のコンピュータ解析に基づいて容易に確定可能である。
【００５９】
本発明に係る核酸または核酸構築物に好適な宿主生物は、原理的には、すべての原核または真核生物である。有利に使用される宿主生物は、細菌、菌類または酵母のような微生物である。グラム陽性またはグラム陰性細菌、好ましくはエンテロバクテリア科(Enterobacteriaceae)またはノルカジア科(Nocardiaceae)の細菌、特に好ましくはエシェリキア(Escherichia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属またはロドコッカス(Rhodococcus)属の細菌である。特に非常に好ましいものは、Escherichia属coli種である。
【００６０】
更に、本発明に係る宿主生物は、好ましくは、合成されたポリペプチドをフォールディングするための少なくとも1種のタンパク質性作用因子、および特に本発明に記載のニトリラーゼ活性を有する核酸配列および／またはこの作用因子をコードする遺伝子を有する。但し、この作用因子の存在量は、対象微生物中の基本量に対応する量よりも多い。この作用因子をコードする遺伝子は、染色体中または例えばプラスミドのような染色体外エレメント中に存在する。
【００６１】
実施例
実施例 1: アルカリゲネス・フェカーリス (Alcaligenes faecalis) 1650 に由来するニトリラーゼの精製
1. 細胞生産
30℃の培地A中で振とうしながら8時間にわたりアルカリゲネス・フェカーリス 1650を培養した。
培地A:
酵母抽出物 5 g/l
ペプトン 3.5 g/l
CH₃CO₂NH₄ 5 g/l
KH₂PO₄ 5 g/l
MgSO₄ 0.2 g/l
FeSO₄ 0.03 g/l
NaCl 1 g/l
ブチロニトリル 1 g/l
【００６２】
この前培養物200 mlを用いて、8 Lの新しい培地Aの入った10 L発酵槽に植え付けた。pH、温度、空気流量および攪拌速度は、7.2、30℃、300 l/hおよび300 rpmであった。22時間後、湿潤バイオマス81 gを得た。これは、細胞の乾燥重量3.8 g/lおよび600 nmにおける光学濃度8に相当する。
【００６３】
2. マンデロニトリルに対する酵素活性の測定
実施例1の記載に従って細胞を取得し、10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 7.2で2回洗浄した。乾燥重量40 mgの細胞を20 mlの10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 6.8中に再懸濁し、8.3 mMマンデロニトリルを添加することにより反応を開始させた。反応は、振とうしながら40℃で行った。サンプルを採取し、続いて高速液体クロマトグラフィー(ODS Hypersil)を利用して細胞を除去した後、ラセミ体分割の反応速度を追跡した。この場合には、マンデロニトリル、ベンズアルデヒド、マンデルアミドおよびマンデル酸を測定した。結果は図1に示されている[マンデロニトリルからマンデル酸への転化率、バッチ]。マンデル酸の生成速度は、41.3 U/g細胞乾燥重量であり、転化率は30%である。ここで、1 Uは、40℃において毎分1μmolのマンデル酸が生成する速度として定義される。
【００６４】
3. マンデロニトリルに対する酵素の選択性の測定
実施例1の記載に従って細胞を取得し、10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 7.2で2回洗浄した。乾燥重量40 mgの細胞を20 mlの10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 6.8中に再懸濁し、8.3 mMマンデロニトリルを添加することにより反応を開始させた。反応は、振とうしながら30℃で行った。サンプルを採取し、続いて高速液体クロマトグラフィー(Nucleodex β-PM)を利用して細胞を除去した後、反応速度を追跡した。この場合には、S-(+)-およびR-(-)-マンデル酸を測定した。生成したR-(-)-マンデル酸の光学純度(ee_R-MA)は、転化率50%において98%であった。酵素(E)の選択性は、転化率50%において499であった。
【００６５】
4. 精製
特に記載のない限り、精製時、いずれの緩衝液中にも10 mM DTTが存在していた。
【００６６】
ステップ 1: 細胞破壊
いずれの場合においても、2回の10 L発酵物から実施例1の記載に従って細胞を取得し、そして遠心沈降させ、更に1 Lの0.1 M Tris/HCl緩衝液, pH 7.2で2回洗浄した。収量は、細胞の湿潤重量で約162 gであった。いずれの場合においても、湿潤重量81 gの細胞を160 mlの0.1 M Tris/HCl緩衝液, pH 7.2中に再懸濁し、そして、750バーでMenton-Gaulinを用いて4回破壊した。次に、ホモジネートを30,000 gで39分間遠心分離し、そしてペレットを廃棄した。上清(140 ml)は、表1に示されているように、73%の残留活性を有していた。
【００６７】
ステップ 2: イオン交換クロマトグラフィー
緩衝液A(20 mM Tris/HCl, pH 8.5)を用いて上清を400 mlに希釈し、もう一度、23,000 gで20分間遠心分離した。次に、緩衝液A中、Q-Sepharoseカラム(直径5 cm、高さ22 cm、容積432 ml、Pharmacia製のQ-Sepharose Fast Flow)に350 mlを充填した。最初に、10%緩衝液B(1 M NaClを含有する緩衝液A)を用いて20 ml/分の流量で洗浄した(充填液および洗液の合計体積は1.5 Lに相当した)。90分間にわたり線形的に60% Bまでその比を増加させた。次に、100%緩衝液Bを用いて91〜120分間の洗浄を行った。40 mlずつの100画分を回収した。ニトリラーゼは、画分50と60との間で溶出した。これらの画分を一緒にし、10 kDa膜(Amicon)に通して限外濾過することにより10 mlの体積まで濃縮した。
【００６８】
ステップ 3: 分子ふるいクロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィー(ステップ2)から得られた濃縮物を、各5 mlの二つの部分に分けて分子ふるいクロマトグラフィー(Superdex 200分取グレード、Pharmacia製、分離範囲10〜600 kDa、直径2.6 cm、高さ60 cm、容積325 ml)により更に精製した。検出は280 nmで行った。カラムは、20 mMリン酸緩衝液, pH 7.4、5 mM DTTおよび150 mM NaClで平衡化し、そして流量1.5 ml/分で操作した。40の画分を回収した。ニトリル加水分解活性は、画分3〜5で見いだされた。
【００６９】
ステップ 4: イオン交換クロマトグラフィー
分子ふるいクロマトグラフィー(ステップ3)から得られた画分を一緒にしたものを、Mono Qカラム(カラム容積1 ml、Mono Q HR515、Pharmacia製)を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行うことにより更に精製した。使用した緩衝液Aは、20 mM Tris/HCl, pH 8.5、5 mM DTTであり、そして緩衝液Bは、Aに1 M NaClを加えたものと同一の緩衝液であった。流量は1 ml/分であった。分子ふるいクロマトグラフィーから得られた活性画分(約100 ml)を約6 mS/cmの伝導率まで希釈してMono Qカラム上に直接充填することにより、タンパク質を吸着させた。充填後、5%緩衝液Bでカラムを洗浄した。30分間かけて5% Bから40% Bまでの勾配を用い、その後の10分間は100% Bを用いることにより、カラムから溶出させた。ニトリラーゼは、そのような勾配画分17および18中に溶出した。
【００７０】
精製のステップ1〜4を表Iに示す。
【表１】
表I: 精製スキーム

【００７１】
分子ふるいクロマトグラフィー(ステップ3)、およびMono Qを用いたイオン交換クロマトグラフィー(ステップ4)から得られた活性画分(= AF, 表I)を図2に示されているようにSDS-PAGEにより分画した。
【００７２】
ステップ 5: 逆相 (RP) 高速液体クロマトグラフィー
Mono Qクロマトグラフィー(ステップ4)の活性画分(画分17および18)の均一性をRPクロマトグラフィーにより検査し、そして、トリプシンによる切断に付すべく更に精製した。分離は、Hewlett-Packard製の装置(HP 1090)を用いてAbimedカラム(3 cm)で行った。使用した移動相は、緩衝液A:0.1% TFAを含有する水、および緩衝液B:0.1% TFAを含有するアセトニトリルであった。注入体積0.1 ml、流量0.5 ml/分。溶離勾配は、次のようなプロフィルであった。
【００７３】
【表２】

【００７４】
ニトリラーゼは、12〜13分で溶出した。これは、SDS-PAGEの37 kDaバンドに相当する。Applied Biosystems 494 Prociseタンパク質シークエンサーを用いて、このバンドについて部分的に配列決定を行った。こうして得られた39個のアミノ酸のN末端配列は、これ以降は、配列番号3と記す。この配列は、添付の配列表に含まれており、次の通りである：Met Gln Thr Arg Lys Ile Val Arg Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Ser Pro Asn Tyr Asp Leu Ala Thr Gly Val Asp Lys Thr Ile Glu Leu Ala Arg Gln Ala Arg Asp Glu Gly。
【００７５】
トリプシンペプチドの調製
Mono Qクロマトグラフィー(ステップ4)から得られたサンプルを次のように前処理した。12.5 % TCAを用いてこのタンパク質(約0.6 mg)を沈殿させ、1 mlのエーテル/エタノール(1:1)を用いてペレットを3回洗浄した。ペレットを、0.2 mlの6 M グアニジンHCl、25 mM tris/HCl, pH 8.5に溶解させた。この溶液に2.6μlの1 M DTT溶液を添加して、ジスルフィド(disulfite)結合を還元した。サンプルを暗所で1時間振とうした。次に、このタンパク質を暗所で1.5μlの4-ビニルピリジン溶液(35 %)と2時間反応させた。2.6μlの1 M DTT溶液と一緒に1時間インキュベートとすることにより、反応を停止させた。ビニルピリジデート化(pyrrilidated)された酵素を、先に記載したように、RP-HPLCで精製した。この時点で、保持時間は10〜11分間であった。活性画分をその分子量により同定して回収し、0.02 mlに濃縮した。これに0.01 mlのアセトニトリルおよび0.1 M Tris/HCl, pH 8.5を添加して0.2 mlに調節した。また約0.05 mlの0.1 M NaOHを添加することによりpHを補正した。サンプル(概算タンパク質量0.3 mg)を、0.1M Tris/HCl, pH 8.5、5%アセトニトリルを溶剤とする1 mg/mlトリプシン溶液0.032 mlと混合し、そして37℃で一晩インキュベートした。0.01 mlの酢酸で消化を停止させ、続いて、遠心分離した。C18を用いてRP-HPLCにより上清を分画した(溶出系: 緩衝液A:水、0.1% TFA、および緩衝液B:アセトニトリル、0.1% TFA)。ペプチド(205 nmおよび280 nmで検出)を回収して配列決定した。Applied Biosystems 494 Prociseタンパク質シークエンサーを使用した。21個のアミノ酸の内部ペプチド配列は、これ以降は、配列番号4と記し、また11個のアミノ酸の内部ペプチド配列は、これ以降は、配列番号5と記す。配列番号4および5は、添付の配列表に含まれており、次の通りである：
配列番号4
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys Ile Ala Ser Val Ala Ile Ser His Pro Gln
配列番号5
Glu Glu Ala Pro Glu Gln Gly Val Gln Ser Lys
【００７６】
6. マンデロニトリルに対する精製ニトリラーゼの活性
実施例2の記載に従って、マンデロニトリルに対する精製ニトリラーゼの活性を調べた。マンデロニトリルに対する精製ニトリラーゼの比活性は、12,380 U/gタンパク質であった。
【００７７】
実施例 2: アルカリゲネス・フェカーリス 1650 に由来するニトリラーゼのクローニング
実施例1に記載の配列番号3および4のペプチド配列からヌクレオチドプローブを合成した。N末端ペプチド配列である配列番号3に由来するヌクレオチドプローブは、64重の縮重23merである(ヌクレオチドプローブの配列中、A、C、GまたはTはNと、AまたはGはRと、CまたはGはSと入れ換える)。文献(Wadaら, 1992, Nucl. Acids Res., 20, 2111-2118)に記載のアルカリゲネス株中のGCの割合が高いことは、グルタミンおよびイソロイシンの場合、コドンの第三位置の選択が予め決まっていることを意味するものであった。これ以降は配列番号6(ただし、S=CまたはGかつN=A、C、GまたはT)と記されるこのヌクレオチドプローブは、後続のPCR用の5’プライマーであり、次の通りである：
配列番号6
5’-ATGCAGACNAGNAARATCGTSCG-3’
【００７８】
内部ペプチド配列である配列番号4からヌクレオチドプローブとして256重の縮重20merを誘導した(ヌクレオチド塩基の配列中、A、C、GまたはTはNと、AまたはGはRと、CまたはGはSと入れ換える)。アルカリゲネス株中のGCの割合が高いことは、リシンの場合、コドンの第三位置の選択が予め決まっていることを意味するものであった。このヌクレオチドプローブは、後続のPCRに対する3’プライマーであり、これ以降は、配列番号7と記す。これは添付の配列表に含まれており、次の通りである：
配列番号7
5’-TNGCSACNGANGCRATCTTG-3’
【００７９】
このプライマー対、すなわち、配列番号6および7を用いて、アルカリゲネス・フェカーリス 1650に由来する染色体DNAに対しPCRを行った。染色体DNAの単離は、当業者に周知の古典的な方法によりリゾチームおよびプロテイナーゼK処理で細胞溶解した後、行った(Ausubel, F. M.ら (1994) Current protocols in molecular biology, John WileyおよびSons)。
【００８０】
Pwoポリメラーゼを用いるPCRには、95℃における3分間の変性；95℃における1分間の変性、58℃における1分30秒間のプライマーアニーリングおよび72℃における1分30秒間の重合が35サイクル；更に、72℃における5分間の最終重合が含まれていた。
【００８１】
これらの条件下で、アルカリゲネス・フェカーリス 1650に由来する染色体DNAからサイズ約1 kbの断片を増幅した。PCR産物をクローン化するために、XbaI制限切断部位および2種の更なるヌクレオチド(5’-AATCTAGAおよび5’-ATTCTAGA)を上記のプライマーのそれぞれに結合させ、そして上記の条件下でPCR反応を繰り返した。さらにもう一度、サイズ約1 kbの断片の増幅が行われた。精製およびXbaI消化を行った後、同様に消化させたpUC18中に、この断片をライゲーションした。大腸菌JM109の形質転換および得られたプラスミドの単離を行った後、シークエンシングおよびそれに続くゲノムサザンブロットによりDNAを精製した。完全ニトリラーゼ遺伝子(nit)を単離するための分子生物学的および微生物学的方法は、当業者に周知の古典的方法により行った。完全長ニトリラーゼ配列は、配列番号1に示されている。
【００８２】
実施例 3: 他のタンパク質との相同性、相同配列の同定
SWISSPROTタンパク質データベースから得られる配列との比較を行ったところ、本発明のニトリラーゼ遺伝子は、周知のニトリラーゼに対してアミノ酸レベルで11〜96%の相同性を有することが分かった。アルカリゲネス・フェカーリス JM3に由来するアリールアセトニトリル特異的ニトリラーゼ(Nagasawaら, Eur. J. Biochem. 1990, 194, 765-772)に対して最大の配列相同性が見いだされた。これらの2種のニトリラーゼ遺伝子は、1071 bpの領域にわたりヌクレオチドレベルで93.2%の同一性を有する。誘導されるアミノ酸配列は、356個のアミノ酸の領域にわたり96.1%の同一性を有する。ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis) SK92に由来するニトリラーゼ(EP-A-0 719 862)のときに、534個のアミノ酸の領域にわたり最小の相同性11.4%を示すことが分かった。
【００８３】
実施例 4: 大腸菌中におけるニトリラーゼの異種発現
発現ベクターpJOE2702中にクローン化するために、nit遺伝子を増幅した。この場合にPCR用として選択した5’プライマーは上記の配列番号3であり、nit 5’末端に接続した翻訳開始部位とオーバーラップしたNdeI切断部位を有する。このプライマーは、これ以降は配列番号8と記され、添付の配列表に含まれている。選択された3’プライマーは、nit遺伝子の3’領域に由来する24merであり、接続した停止コドンに隣接するBamHI切断部位を有する。これは、これ以降は配列番号9と記され、後続の配列表に含まれている。
5’-TTAATCATATGCAGACAAGAAAAATCGTCCG-3’ (=配列番号8)
5’-AAGGATCCTCAAGACGGCTCTTGCACTAGCAG-3’ (=配列番号9)
【００８４】
Pwoポリメラーゼを用いるPCRには、94℃における3分間の変性；93℃における1分間の変性、55℃における1分30秒間のプライマーアニーリングおよび72℃における1分30秒間の重合が25サイクル、更に、72℃における5分間の最終重合が含まれていた。得られたPCR断片を精製し、NdeI/BamHIで消化し、そして同様に消化したベクターpJOE2702中に組み込んだ(Volffら, 1996, Mol. Microbiol., 21(5), 1037-1047)。得られたプラスミドをpDHE 19.2と名付けた。これは図3に示されている。NdeI/BamHI切断部位を介した組み込みとは、プラスミドpDHE 19.2中で、nit遺伝子が、pJOE2702中に存在しかつ大腸菌中で正の調節を受けるL-ラムノースオペロンrhaBADに由来するプロモーターrha_pの転写制御下にあることを意味する(Egan & Schleif, 1994, J. Mol. Biol., 243, 821-829)。nit遺伝子の転写の終結および翻訳の開始は、同様に、ベクター配列を介して行われる。また、プラスミドには、アンピシリン耐性Ap^Rが含まれている。
【００８５】
ニトリラーゼの異種発現を、プラスミドpDHE 19.2を含有する大腸菌JM109株を用いて実証した。この目的のために、37℃において振とうさせながら、100μg/mlアンピシリンを含むTB培地(Tartof, Hobbs 1987)中でJM109(pDHE 19.2)株を培養した。OD₆₀₀が1.7に達したら、ニトリラーゼを誘導するための0.2% (w/v)L-ラムノースを含有する新しいTB培地に1:200で培養物を移し、30℃において振とうさせながら培養した。8時間後、細胞を回収し、10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH7.2で洗浄し、OD₆₀₀が10になるように同じ緩衝液中に再懸濁し、そして超音波で処理した後破壊した。
【００８６】
実施例 5: 組換え大腸菌 JM109(pDHE 19.2) 株のニトリラーゼ活性の測定
1. 細胞生産
37℃において振とうさせながらTB培地+ 100μg/mlアンピシリン中で大腸菌JM109(pDHE 19.2)を6時間培養した。OD₆₀₀が4に達したら、この前培養物100 mlを用いて、8 Lの新しいTB培地+ 100μg/mlアンピシリン+ 2 g/l L-ラムノースの入った10 Ｌ発酵槽に植え付けた。pH、温度、空気流量および攪拌速度は、7.2、30℃、300 l/hおよび400-650 rpmであった。16時間後、細胞を回収した。この時の600 nmにおける光学濃度は、18であった。これは、細胞の乾燥重量7.8 g/lに相当する。
【００８７】
2. マンデロニトリルに対する比活性の測定
実施例1の記載に従って細胞を取得し、10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 7.2で洗浄した。乾燥重量2 mgの細胞を1 mlの10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 7.2中に再懸濁し、8.3 mMマンデロニトリルを添加することにより反応を開始させた。反応は、振とうしながら40℃で行った。サンプルを採取し、続いて高速液体クロマトグラフィー(ODS Hypersil)にかけることにより、反応速度を追跡した。マンデロニトリル、ベンズアルデヒド、マンデルアミドおよびマンデル酸を測定した。マンデル酸の生成速度は、403 U/g細胞乾燥重量であり、転化率は30%である。ここで、1 Uは、40℃において毎分1μmolのマンデル酸が生成する速度として定義される。
【００８８】
実施例 6. 懸濁液中の大腸菌 JM109(pDHE 19.2) を使用してマンデロニトリルの加水分解を行うことによる R- マンデル酸の合成
40℃においてパドルスターラーで攪拌しながら、大腸菌JM109(pDHE 19.2)株を2 g/lの濃度で含有する1 Lの10 mM Na/Kリン酸緩衝液, pH 7.2中の、1.3 g/lの濃度のマンデロニトリルを10時間にわたり測定した。測定は、ニトリルの消費によって調節された。実施例5の記載に従ってR-マンデル酸の消費速度を追跡した。結果は図4に示されている。
【００８９】
実施例 7: 懸濁液中の大腸菌 JM109(pDHE 19.2) によるマンデロニトリルの加水分解で得られた反応混合物からの抽出による R- マンデル酸の単離
実施例6で得られた水性マンデル酸反応混合物を遠心分離して細胞を除去し、酸でpH2に調整し、そしてメチルtert-ブチルエーテル(MTBE)で3回抽出した。マンデル酸抽出物からエバポレーションにより有機溶剤を除去した後、得られた白色マンデル酸結晶を再溶解させ、高速液体クロマトグラフィーにより化学純度および光学純度を調べた。化学純度は99%であり、そしてR-マンデル酸の光学純度は97.4%eeであった。
【００９０】
実施例 8: 懸濁液中の大腸菌 JM109(pDHE 19.2) によるマンデロニトリルの加水分解で得られた反応混合物から冷却により結晶化させることによる、 R- マンデル酸の単離
実施例6で得られた水性マンデル酸反応混合物を遠心分離して細胞を除去し、加熱および攪拌しながら初期体積の40%まで濃縮し、そして酸でpH2に調節した。氷浴中で冷却することによりマンデル酸を結晶化させ、得られた白色マンデル酸結晶を吸引濾過により濾別し、そして乾燥させた。結晶を再溶解させ、高速液体クロマトグラフィーにより化学純度および光学純度を調べた。化学純度は99.1%であり、そしてR-マンデル酸の光学純度は99.8%eeであった。
【００９１】
実施例 9: 種々のニトリルの転化率
大腸菌株(実施例6を参照されたい)または最初のアルカリゲネス株を用いて種々のニトリルの転化を行った。30℃および160 rpmにおいて400 mlのアルカリゲネス用培地(上記の培地Aを参照されたい)中でアルカリゲネス細胞を16時間培養した。遠心分離(4℃および5000 rpm、30分間)により細胞を回収した。細胞懸濁液の一部150μlをピペットで取ってマイクロタイタープレートの各ウェルに入れた。次に、プレートを遠心処理にかけた。上清を吸引除去し、細胞ペレットをNa₂HPO₄ (1.42 g/l Finnaqua、pH 7.2)で2回洗浄した。次に、基質溶液(150μl)をピペットで取り、そして細胞を再懸濁した。1種の基質をマイクロタイタープレートの各列の12個の孔に添加した。基質溶液を含むが細胞を含まない列は、対照(=ブランク)として使用した。
【００９２】
マイクロタイタープレートを200 rpmおよび30℃の振とうインキュベーター中に2時間入れた。次に、細胞を遠心分離により沈殿させ、Biomek装置を用いて、上清中に生じたNH₄イオンの量を測定した。様々なNH₄OH溶液を使用して作製した検量プロット(図5を参照されたい)を用いて620 nmで測定を行った。使用した基質は、マンデロニトリル(=1)、2-フェニルプロピオニトリル(=2)、2-フェニルブチロニトリル(=3)、ベンジルシアニド(=4)、4-クロロベンジルシアニド(=5)、4-ブロモベンジルシアニド(=6)、プロピオニトリル(=7)、2-メチルブチロニトリル(=8、2-シアノブタン)、ゲラノニトリル(=9)、バレロニトリル(=10)、3-シアノピリジン(=11)、3-ビフェニル-2-ヒドロキシブチロニトリル(=12)、4-フルオロベンジルシアニド(=13、4-フルオロフェニルアセトニトリル)およびα-(3-ヘプチル)-ニトロ-トリアセトニトリル(=14)である。メタノールを溶剤とする0.2 Mストック溶液を各基質に対して作製し、これをNa₂HPO₄ (1.42 g/l Finnaqua、pH 7.2)で10 mMに希釈した。細胞懸濁液を2 g/l乾燥バイオマスに対して標準化した。表IIは、マイクロタイタープレートの列に対する転化率の平均を示している。
【００９３】
表II: ニトリラーゼ1650を用いたときの種々のニトリルの転化率
【表３】

【００９４】
図6は、転化の結果を活性で示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１におけるマンデロニトリルから転化したマンデル酸の生成量の時間経過を示す。
【図２】図２は、分子ふるいクロマトグラフィー、およびMono Qを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分のSDS-PAGEの結果を示す。
【図３】図３は、nit遺伝子を発現ベクターpJOE2702中に組み込んだプラスミドpDHE 19.2の模式図である。
【図４】図４は、実施例５におけるマンデロニトリルの加水分解によるR-マンデル酸の生成量の時間経過を示す。
【図５】図５は、様々な濃度のNH₄OH溶液を使用したNH₄イオンの検量プロットを示す。
【図６】図６は、ニトリラーゼ1650を用いた場合の基質に対する転化を活性によって示している。
【配列表】

Claims

以下の（a)または（b)に示す、ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸。
a) 配列番号1に示される核酸配列からなる核酸
b) 配列番号1に示される核酸配列から遺伝暗号の縮重の結果として誘導される核酸配列からなる核酸
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
1以上の調節シグナルに連結されている請求項１に記載の核酸を含む核酸構築物。
請求項１に記載の核酸または請求項３に記載の核酸構築物を含むベクター。
請求項１に記載の少なくとも1つの核酸または請求項３に記載の少なくとも1つの核酸構築物を含む微生物。
Escherichia属、Pseudomonas属またはAlcaligenes属の細菌である、請求項５に記載の微生物。
一般式I

で表されるキラルなカルボン酸を調製する方法であって、一般式II

で表されるラセミ体ニトリルを、請求項２に記載のポリペプチドまたは請求項５もしくは６に記載の増殖状態、休眠状態、もしくは破壊状態の微生物の存在下で変換することを含んでなり、その際1時間にタンパク質1mgあたり少なくとも25mmolのニトリルまたは1時間に乾燥重量1gあたり少なくとも25mmolのニトリルがキラルなカルボン酸に変換され、
式Iおよび式II中の置換基および変数が、次の意味を有する：
*は光学活性中心であり、
R¹、R²、R³は互いに独立して、水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、置換もしくは無置換のアリール、ヘテロアリール、OR⁴またはNR⁴R⁵であり、但し、基R¹、R²およびR³は必ず異なっており、
R⁴は水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、C₁〜C₁₀-アルキルカルボニル、C₂〜C₁₀-アルケニルカルボニル、アリール、アリールカルボニル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールカルボニルであり、
R⁵は水素、置換もしくは無置換の、分枝状または非分枝状C₁〜C₁₀-アルキル、C₂〜C₁₀-アルケニル、アリールまたはヘテロアリールである、
上記方法。
前記置換基R¹、R²またはR³のうちの一つがOR⁴である、請求項７に記載の方法。
前記置換基R¹、R²またはR³のうちの一つがアリールである、請求項７または８に記載の方法。
pH4〜11の水性反応溶液中で行われる、請求項７〜９のいずれか1項に記載の方法。
前記方法においてニトリル0.01〜10重量%または対応するアルデヒドもしくはケトン0.01〜10重量%およびシアン化水素酸0.01〜10重量%を反応させる、請求項７〜１０のいずれか1項に記載の方法。
温度0℃〜80℃で行われる、請求項７〜１１のいずれか1項に記載の方法。
前記キラルなカルボン酸が抽出または結晶化または抽出と結晶化により収率60〜100%で反応溶液から単離される、請求項７〜１２のいずれか1項に記載の方法。
前記キラルなカルボン酸が少なくとも90%eeの光学純度を有する、請求項７〜１３のいずれか1項に記載の方法。