CN1411506A - 来自玫瑰色红球菌ncimb11216的腈水解酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，涉及包含该核酸序列的核酸构建体，并涉及包含该核酸序列或该核酸构建体的载体。本发明还涉及由该核酸序列编码的氨基酸序列，并涉及含有该核酸序列、该核酸构建体或载体的微生物，其中所述载体包含该核酸序列或该核酸构建体。本发明另外涉及用于从对应的腈制备羧酸的酶催化方法。

Description

来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的腈水解酶
本发明涉及编码具腈水解酶活性的多肽的核酸序列，涉及包含该核酸序列的核酸构建体，并涉及包含该核酸序列或该核酸构建体的载体。本发明还涉及由该核酸序列编码的氨基酸序列，并涉及含有该核酸序列、该核酸构建体或载体的微生物，其中所述载体包含该核酸序列或该核酸构建体。
本发明另外涉及用于从对应的腈制备羧酸的酶催化方法。
脂族羧酸、芳香羧酸和芳香杂环羧酸为有机化学合成所需要的化合物。它们是大量活性药物成分或用于作物保护的活性成分的起始物质。
文献中公开了非手性或手性羧酸的多种不同的合成路线。由此，例如工业上通过发酵方法获得光学活性氨基酸。它们的不足之处是对每种氨基酸都必须开发一种特有的工艺。这就是为什么使用化学方法或酶催化方法，以便能制备最大范围的不同化合物。化学方法的不足之处在于通常不得不以复杂的、多步骤的、不可广泛应用的合成法构建立构中心。
在一些专利或专利申请中可找到手性羧酸的酶催化合成。WO92/05275描述了在存在生物材料时α-羟基-α-烷基-或α-烷基羧酸的对映异构体合成。在EP-B-0 348 901、EP-B-0 332 379、EP-A-0 348 901或其在美国的同族专利US 5,283,193、EP-A-0 449 648、EP-B-0 473 328、EP-B-0 527 553或其在美国的同族专利US 5,296,373、EP-A-0 610 048、EP-A-0 610 049、EP-A-0 666 320或WO 97/32030中描述了其它用微生物进行α-取代的光学活性有机酸的合成法。
用微生物进行的非手性羧酸的生物技术合成法例如在EP-A-0 187680、EP-A-0 229 042、WO 89/00193、JP 08173152、JP 06153968、FR 2694571、EP-A0 502 476、EP-A-0 444 640或EP-A-0 319 344中进行了描述。
这些方法的缺点是它们往往导致产物只具有低光学纯度和/或它们以低的时空产率进行。这样产生的是经济上没有吸引力的方法。另一缺点是：存在于微生物中、用于合成非手性或手性羧酸的酶通常只有受限的底物范围，也就是说一种微生物总是只转化特定的脂族腈、芳香腈或芳香杂环腈。具体地说，芳香腈和芳香杂环腈如氰噻吩或苯基氰极少地或根本不被转化为对应的羧酸。
本发明的一个目的是开发另外的用于制备非手性和/或手性羧酸的酶，其可用在制备非手性和/或手性羧酸的方法中，该方法没有上述缺点并可特异性从对应的腈得到芳香羧酸和/或芳香杂环羧酸。
我们发现通过本发明分离的核酸序列可达到该目的，其中分离的核酸序列编码具有腈水解酶活性的多肽，所述核酸序列选自：
a)具有SEQ ID NO：1中所述序列的核酸序列，
b)按照遗传密码的简并性而衍生于SEQ ID NO：1中所述核酸序列的核酸序列，
c)SEQ ID NO：1中所述核酸序列的衍生物，其编码的多肽具有SEQID NO：2中所述的氨基酸序列，且编码的多肽在氨基酸水平具有至少95％的同源性，在多肽的酶活性上具有可忽略的降低。
具有序列SEQ ID NO：1的本发明核酸序列的同系物是指例如在整个序列范围内所得的氨基酸水平上具有至少95％同源性的等位基因变体，有利地至少97％的同源性，优选地至少98％，更尤其优选地至少99％的同源性。在区域中形成序列的部分同源性较高是可能且为有利的。来自SEQ IDNO：1的氨基酸序列见SEQ ID NO：2。等位基因变体尤其包含功能变体，后者可通过对SEQ ID NO：1中描述的序列进行核苷酸的删除、插入或替换获得，但是所得到人造蛋白质在酶活性上具有可忽略的降低。酶活性上可忽略的降低是指其酶活性有利地为SEQ ID NO：2所代表的酶的至少10％，优选地30％，尤其优选地50％，更尤其优选地70％的酶活性。本发明因此也涉及由上述核酸序列组编码的氨基酸序列。本发明有利地涉及由序列SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1的同系物也指例如真菌或细菌同系物、截短序列、编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。SEQ ID NO：1的同系物在SEQ IDNO：1中所示出的整个序列范围内的DNA水平上具有至少60％，优选地至少70％，尤其优选地至少80％，更尤其优选地至少90％的同源性。
SEQ ID NO：1的同系物另外指衍生物，如启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子可通过一个或多个核苷酸的交换、通过插入和/或删除而改变，但这些改变对启动子的功能或有效性没有不利影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效启动子完全替换，可使启动子的有效性升高。
衍生物也指这样的变体，其起始密码子之前的从-1至-200位区域或终止密码子之后的0至1000位碱基对的核苷酸序列以某种方式改变，从而改变了基因表达和/或蛋白质表达，优选地表达升高。
SEQ ID NO：1或其同系物有利地通过技术人员公知的方法从细菌中分离，有利地从革兰氏阳性菌，优选地从诺卡氏菌属(Nocardia)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、分支杆菌属(Mycobacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、微球菌属(Micrococcus)、Proactinomyces或芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌中分离，尤其优选地从红球菌属、分支杆菌属或诺卡氏菌属的细菌中分离，非常尤其优选地从红球菌sp.、玫瑰色红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、玫瑰色诺卡氏菌(Nocardia rhodochrous)或玫瑰色分支杆菌(Mycobacteriumrhodochrous)的属和种分离。
SEQ ID No：1或其同系物或这些序列的部分可例如用常规的杂交方法或PCR技术从真菌或细菌分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。杂交有利地用例如来自活性中心的保守区域的短寡核苷酸进行，并且这些短的寡核苷酸可以技术人员公知的方式通过与其它的腈水解酶或腈水合酶比较而确定。但是也可使用较长的本发明核酸片段或全序列用于杂交。这些标准条件依用于杂交的核酸是否为寡核苷酸、较长的片段或全序列的不同而不同，或依用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)的不同而不同。因此，例如DNA：DNA杂交体的解链温度比同样长度的DNA：RNA杂交体约低10℃。
标准条件是指例如温度依核酸类型的不同而为浓度在0.1至5×SSC(1×SSC＝0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)的含水缓冲液中的42℃和58℃之间，或另外地当存在50％甲酰胺时，标准条件为在5×SSC、50％甲酰胺中温度为42℃。DNA：DNA杂交体的杂交条件有利地包含0.1×SSC且温度在约20℃至45℃之间，优选地在约30℃和45℃之间。DNA：RNA杂交体的杂交条件优选地包含0.1×SSC且温度在约30℃至55℃之间，优选地在约45℃至55℃之间。所述的这些用于杂交的温度为解链温度，其计算是通过例如在缺乏甲酰胺时对核酸长度在约100个核苷酸且G+C含量为50％时进行的计算。在相关的遗传学教科书如Sambrook等人，“分子克隆”(“Molecular Cloning”)，冷泉港实验室，1989一书中描述了用于DNA杂交的实验条件，并且可通过为技术人员公知的公式计算，DNA杂交的实验条件例如依核酸的长度、杂交体的性质或G+C含量的不同而不同。在下列教科书中技术人员可找到其它关于杂交的信息：Ausubel等人(编辑)，1985，分子生物学最新方法(Current Protocols in Molecular Biology)，JohnWiley & Sons，纽约；Hames和Higgins(编辑)，1985，核酸杂交：实用方法(Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach)，位于牛津大学出版社的IRL出版社，牛津；Brown(编辑)，1991，基本分子生物学：实用方法(Essential Molecular Biology：A Practical Approach)，位于牛津大学出版社的IRL出版社，牛津。
本发明的核酸构建体是指序列SEQ ID No.1的腈水解酶基因及其同系物，其有利地功能性连接于一种或多种调节信号，以增强基因表达。这些调节信号为例如结合诱导者或阻遏物的序列，并因此调节核酸的表达。除了这些新的调节序列外，也可存在对实际的结构基因之前的这些序列的天然调节，且根据需要，这些序列的天然调节已被遗传修饰，这样关闭了天然调节并增强了基因的表达。但是核酸构建体也可具有较简单的结构，也就是说在序列SEQ ID NO：1或其同系物之前没有插入其它调节信号，且未删除具有调节作用的天然启动子。取而代之的是，以某种方式突变天然调节序列，以使调节不再发生且基因表达被增强。核酸构建体可额外有利地包含一种或多种功能性与启动子连接的、可提高核酸序列表达的增强子序列。在DNA序列的3’末端也可插入其它有利的序列，如其它调节元件或终止子。在该构建体中可存在一个或多个本发明的核酸拷贝。该构建体也可包含进一步的标记物如抗生素抗性或辅源营养互补基因，它们适用于构建体的选择。
对本发明方法有利的调节序列例如存在于有利地用于革兰氏阴性细菌的启动子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PR或λ-PL启动子。更有利的调节序列例如存在于革兰氏阳性启动子amy和SPO2中、存在于真菌或酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在这方面也有利地为来自如汉森酵母属(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶启动子和甲醇氧化酶启动子。也可使用人工启动子来调节。
有利地将核酸构建体插入载体，如用于在宿主生物体中表达的质粒、噬菌体或其它DNA，它们使得基因在宿主中的最佳表达成为可能。这些载体代表本发明的进一步改进。在大肠杆菌中的合适质粒的实例为pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，在链霉菌属中的质粒实例为pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，在芽孢杆菌属中的质粒实例为pUB110、pC194或pBD214，在棒杆菌属中的质粒实例为pSA77或pAJ667，在真菌中的质粒实例为pALS1、pIL2或pBB116，在酵母中的质粒实例为2μM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23，或在植物中的质粒实例为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒代表一小部分的可能质粒。其它质粒为技术人员公知且在例如克隆载体(Cloning Vectors)(Pouwels，P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)一书中可以找到。
为了表达其它存在的基因，该核酸构建体也有利地包含除3’-和/或5’-末端调节序列外的其它用于促进表达的序列，并根据所选择的宿主生物和基因对它们进行选择以用于最佳表达。
这些调节序列用于使基因的特异性表达和蛋白质表达成为可能。这意味着例如根据宿主生物的不同，基因只是在诱导后表达或过表达，或基因立即表达和/或过表达。
而且，调节序列或调节因子优选地对所导入基因的表达具有有利的作用，从而促进导入基因的表达。这样，通过使用强转录信号如启动子和/或增强子可在转录水平有利地增强调节元件。但是，进一步也可通过例如提高mRNA的稳定性来增强翻译。
在载体的另一个实施方案中，包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体也可有利地以线型DNA导入微生物，并通过异源或同源重组整合入宿主生物体的基因组。该线型DNA可由线性化载体如质粒组成，或仅由核酸构建体或核酸组成。
为了优化异源基因在生物体中的表达，对核酸序列进行改变使其与生物体特定使用的密码子使用相一致是有利的。基于对其它已知基因在相关生物体中的计算机分析，可不费劲地建立密码子使用。
原则上，适用于本发明的核酸或核酸构建体的宿主生物为所有的原核或真核生物。有利地使用的宿主生物为微生物如细菌、真菌或酵母。有利地使用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选地为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、分支杆菌科(Mycobacteriaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，尤其优选埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、诺卡氏菌属、分支杆菌属、链霉菌属或红球菌属。非常尤其优选的属和种为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、玫瑰色红球菌、玫瑰色诺卡氏菌、玫瑰色分支杆菌或变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)。
本发明的宿主生物还优选地包含至少一种蛋白质介质用于该生物已合成多肽的折叠，且具体地说为包含至少一种本发明中描述的具有腈水解酶活性的核酸序列和/或编码该介质的基因，宿主生物中所存在的该介质的量大于该微生物所对应的基本量。编码该介质的基因存在于染色体上或存在于染色体外的元件如质粒上。
本发明还涉及制备手性或非手性羧酸的方法，其包括在存在由本发明的核酸所编码的氨基酸序列时，或在存在生长的、休眠的或破碎的上述微生物(＝宿主生物)时，转化腈，其中所述微生物包含本发明的核酸序列、本发明的核酸构建体或本发明的载体，所述本发明的核酸构建体包含与一个或多个调节信号连接的本发明的核酸。
本方法的一个有利的实施方案为将手性或非手性脂族腈转化为对应的羧酸。
本方法的另一个优选的实施方案为用于制备手性或非手性羧酸的方法，其中通式I的腈在存在由本发明的核酸所编码的氨基酸序列时，或在存在生长的、休眠的或破碎的上述微生物时，被转化为通式II的羧酸，其中所述微生物包含本发明的核酸序列、本发明的核酸构建体或本发明的载体，所述本发明的核酸构建体包含与一个或多个调节信号连接的本发明的核酸，通式II为
其中在式I和II中的取代基和变量具有以下含义：
n＝0或1
m＝0、1、2或3，其中当m＞2时，在两个相邻的碳原子之间有一个双键或没有双键存在，
p＝0或1
A、B、D和E相互独立地为CH、N或CR3
当n＝0时，H＝O、S、NR4、CH或CR3，或当n＝1时，H＝CH、N或CR3，
两个相邻的变量A、B、D、E或H可一起形成另一个取代或未取代的芳香的、饱和或部分饱和环，环中具有5至8个原子且其可包含一个或更多的杂原子如O、N或S原子，且变量A、B、D、E或H中不多于三个为杂原子，
R1为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R2为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R3为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基、杂芳基、羟基、卤素、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R4为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基。
在式I和II的化合物中R1为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素(如氟、氯或溴)、C1-C10-烷基氨基或氨基。
所提及的烷基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基链，如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基或异丁基。
所提及的烷氧基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷氧基链，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、3，3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基或癸氧基以及它们的支链同系物。
所提及的芳基为在环或环体系中含有6至20个碳原子的取代或未取代芳基。它们可包括相互融合的芳香环或由烷基、烷基羰基、链烯基或烯基羰基链、羰基、氧或氮连接的芳香环。根据需要，可将多个芳基通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基、C3-C6-炔基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。优选苯基或萘基。
所提及的杂芳基体系为取代或未取代的、简单或融合的芳香环体系，其具有一个或多个含3至7元环的芳香杂环，其中所述芳香杂环可含有一个或多个杂原子如N、O或S，且根据需要，可通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。此类杂芳基的实例为吡唑、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、三唑、吡啶、喹啉、异喹啉、吖啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吩嗪、嘌呤或蝶啶。杂芳基可通过环或环体系中的杂原子或不同的碳原子或通过取代基连接至基本构架。优选吡啶、咪唑、嘧啶、嘌呤、吡嗪或喹啉。
所提及的烷基氨基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基氨基链，如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、1-甲基乙基氨基、正丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙基氨基、1，1-二甲基乙基氨基、正戊基氨基、1-甲基丁基氨基、2-甲基丁基氨基、3-甲基丁基氨基、2，2-二甲基丙基氨基、1-乙基丙基氨基、正己基氨基、1，1-二甲基丙基氨基、1，2-二甲基丙基氨基、1-甲基戊基氨基、2-甲基戊基氨基、3-甲基戊基氨基、4-甲基戊基氨基、1，1-二甲基丁基氨基、1，2-二甲基丁基氨基、1，3-二甲基丁基氨基、2，2-二甲基丁基氨基、2，3-二甲基丁基氨基、3，3-二甲基丁基氨基、1-乙基丁基氨基、2-乙基丁基氨基、1，1，2-三甲基丙基氨基、1，2，2-三甲基丙基氨基、1-乙基-1-甲基丙基氨基、1-乙基-2-甲基丙基氨基、正庚基氨基、正辛基氨基、正壬基氨基或正癸基氨基。优选甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、正丁基氨基、异丙基氨基或异丁基氨基。
所述R1基的合适取代基为例如一种或多种以下取代基，如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、氰基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其它芳香环或芳香环体系，或其它饱和或不饱和非芳香环或非芳香环体系。优选烷基如C1-C6-烷基(例甲基、乙基、丙基或丁基)、芳基如苯基、卤素(如氯、氟或溴)、羟基或氨基。
在式I和II的化合物中R2为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、C1-C10-烷基氨基或氨基。
所提及的烷基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基链，如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基或异丁基。
所提及的烷氧基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷氧基链，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、3，3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基或癸氧基以及它们的支链同系物。
所提及的芳基为在环或环体系中含有6至20个碳原子的取代或未取代芳基。它们可包括相互融合的芳香环或由烷基、烷基羰基、链烯基或烯基羰基链、羰基、氧或氮连接的芳香环。根据需要，可将多个芳基通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基、C3-C6-炔基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。优选苯基或萘基。
所提及的杂芳基体系为取代或未取代的、简单或融合的芳香环体系，其具有一个或多个含3至7元环的芳香杂环，其中所述芳香杂环可含有一个或多个杂原子如N、O或S，且根据需要，可通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。此类杂芳基的实例为吡唑、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、三唑、吡啶、喹啉、异喹啉、吖啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吩嗪、嘌呤或蝶啶。杂芳基可通过环或环体系中的杂原子或不同的碳原子或通过取代基连接至基本构架。优选吡啶、咪唑、嘧啶、嘌呤、吡嗪或喹啉。
所提及的烷基氨基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基氨基链，如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、1-甲基乙基氨基、正丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙基氨基、1，1-二甲基乙基氨基、正戊基氨基、1-甲基丁基氨基、2-甲基丁基氨基、3-甲基丁基氨基、2，2-二甲基丙基氨基、1-乙基丙基氨基、正己基氨基、1，1-二甲基丙基氨基、1，2-二甲基丙基氨基、1-甲基戊基氨基、2-甲基戊基氨基、3-甲基戊基氨基、4-甲基戊基氨基、1，1-二甲基丁基氨基、1，2-二甲基丁基氨基、1，3-二甲基丁基氨基、2，2-二甲基丁基氨基、2，3-二甲基丁基氨基、3，3-二甲基丁基氨基、1-乙基丁基氨基、2-乙基丁基氨基、1，1，2-三甲基丙基氨基、1，2，2-三甲基丙基氨基、1-乙基-1-甲基丙基氨基、1-乙基-2-甲基丙基氨基、正庚基氨基、正辛基氨基、正壬基氨基或正癸基氨基。优选甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、正丁基氨基、异丙基氨基或异丁基氨基。
所述R2基的合适取代基为例如一种或多种以下取代基，如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、氰基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其它芳香环或芳香环体系，或其它饱和或不饱和非芳香环或非芳香环体系。优选烷基如C1-C6-烷基(例甲基、乙基、丙基或丁基)、芳基如苯基、卤素(如氯、氟或溴)、羟基或氨基。
在式I和II的化合物中R3为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素(如氟、氯或溴)、C1-C10-烷基氨基或氨基。
所提及的烷基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基链，如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基或异丁基。
所提及的烷氧基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷氧基链，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、1-甲基乙氧基、丁氧基、1-甲基丙氧基、2-甲基丙氧基、1，1-二甲基乙氧基、戊氧基、1-甲基丁氧基、2-甲基丁氧基、3-甲基丁氧基、1，1-二甲基丙氧基、1，2-二甲基丙氧基、2，2-二甲基丙氧基、1-乙基丙氧基、己氧基、1-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、3-甲基戊氧基、4-甲基戊氧基、1，1-二甲基丁氧基、1，2-二甲基丁氧基、1，3-二甲基丁氧基、2，2-二甲基丁氧基、2，3-二甲基丁氧基、3，3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基、1，1，2-三甲基丙氧基、1，2，2-三甲基丙氧基、1-乙基-1-甲基丙氧基、1-乙基-2-甲基丙氧基、己氧基、庚氧基、辛氧基、壬氧基或癸氧基以及它们的支链同系物。
所提及的芳基为在环或环体系中含有6至20个碳原子的取代或未取代芳基。它们可包括相互融合的芳香环或由烷基、烷基羰基、链烯基或烯基羰基链、羰基、氧或氮连接的芳香环。根据需要，可将多个芳基通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基、C3-C6-炔基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。优选苯基或萘基。
所提及的杂芳基体系为取代或未取代的、简单或融合的芳香环体系，其具有一个或多个含3至7元环的芳香杂环，其中所述芳香杂环可含有一个或多个杂原子如N、O或S，且根据需要，可通过C1-C10-烷基、C3-C8-链烯基或C3-C8-环烷基链连接至基本构架。此类杂芳基的实例为吡唑、咪唑、噁唑、异噁唑、噻唑、三唑、吡啶、喹啉、异喹啉、吖啶、嘧啶、哒嗪、吡嗪、吩嗪、嘌呤或蝶啶。杂芳基可通过环或环体系中的杂原子或不同的碳原子或通过取代基连接至基本构架。优选吡啶、咪唑、嘧啶、嘌呤、吡嗪或喹啉。
所提及的烷基氨基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基氨基链，如甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、1-甲基乙基氨基、正丁基氨基、1-甲基丙基氨基、2-甲基丙基氨基、1，1-二甲基乙基氨基、正戊基氨基、1-甲基丁基氨基、2-甲基丁基氨基、3-甲基丁基氨基、2，2-二甲基丙基氨基、1-乙基丙基氨基、正己基氨基、1，1-二甲基丙基氨基、1，2-二甲基丙基氨基、1-甲基戊基氨基、2-甲基戊基氨基、3-甲基戊基氨基、4-甲基戊基氨基、1，1-二甲基丁基氨基、1，2-二甲基丁基氨基、1，3-二甲基丁基氨基、2，2-二甲基丁基氨基、2，3-二甲基丁基氨基、3，3-二甲基丁基氨基、1-乙基丁基氨基、2-乙基丁基氨基、1，1，2-三甲基丙基氨基、1，2，2-三甲基丙基氨基、1-乙基-1-甲基丙基氨基、1-乙基-2-甲基丙基氨基、正庚基氨基、正辛基氨基、正壬基氨基或正癸基氨基。优选甲基氨基、乙基氨基、正丙基氨基、正丁基氨基、异丙基氨基或异丁基氨基。
所述R3基的合适取代基为例如一种或多种以下取代基，如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其它芳香环或芳香环体系，或其它饱和或不饱和非芳香环或非芳香环体系。优选烷基如C1-C6-烷基(例甲基、乙基、丙基或丁基)、芳基如苯基、卤素(如氯、氟或溴)、羟基或氨基。
在式I和II的化合物中R4为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基。
所提及的烷基为取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基链，如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基、正丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基、1-乙基-2-甲基丙基、正庚基、正辛基、正壬基或正癸基。优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基或异丁基。
所述R4基的合适取代基为例如一种或多种以下取代基，如卤素(如氟、氯或溴)、巯基、硝基、氨基、羟基、烷基、烷氧基、链烯基、链烯氧基、炔基或其它芳香环或芳香环体系，或其它饱和或不饱和非芳香环或非芳香环体系。优选烷基如C1-C6-烷基(例甲基、乙基、丙基或丁基)、芳基如苯基、卤素(如氯、氟或溴)、羟基或氨基。
在本发明的方法中，也可以并有利地转化芳族或脂族、饱和或不饱和二腈。
本发明的方法有利地在pH值为4至11时进行，优选地在pH值为4至9时进行。
此外，在该方法中有利地使用重量占0.01至10％、优选地重量占0.1至10％、尤其优选地重量占0.5至5％的腈。依所用腈的种类在反应中可使用不同量的腈。最小量的腈(等于重量在0.01至5％之间的腈)有利地用于与对应的醛和氢氰酸相平衡的腈(羟腈)。因为醛通常对微生物或酶是有毒的。挥发性腈同样有利地使用重量在0.01至5％之间的量。如果用较大量的羟腈或腈，则反应减慢。在腈只有轻微的或事实上没有溶剂特性时，或腈只以很小的量溶于含水介质时，可以并有利地使用较上述量要大的腈。为增加转化和产率，有利地在不断添加腈时进行反应。产物可在反应结束后分离，或者通过旁通管不断移走。
本发明的方法有利地在温度为0℃至80℃之间进行，优选地在10℃至60℃之间进行，尤其优选地在15℃至50℃之间进行。
在本发明的方法中，需提及的是芳香腈或芳香杂环腈有利地为2-苯基丙腈、2-羟基-苯基乙腈、2-氨基-2-苯基乙腈、苯基氰、苯基乙腈、反-苯乙烯基腈(trans-cinnamonitrile)、3-氰基噻吩或3-氰甲基噻吩。
在本发明的方法中手性腈是指由两种对映异构体以50∶50的混合物组成的腈，或由任一其它在混合物中富含两种对映异构体之一的混合物组成的腈。可提及的此类腈的实例为2-苯基丙腈、2-羟基-苯基乙腈、2氨基-2-苯基乙腈、2-氯丙腈或2-羟基丙腈。
在本发明的方法中手性羧酸是指那些显示对映异构体富集的羧酸。该方法优选地导致至少90％ee的对映异构体纯度，优选地至少95％ee，尤其优选地至少98％ee，非常尤其优选地至少99％ee。
本发明的方法使得可将大量的手性或非手性腈转化为对应的手性或非手性羧酸。在本方法中可转化至少25mmol的腈/h×mg蛋白质或至少25mmol腈/h×g微生物干重，优选地至少30mmol腈/h×mg蛋白质或至少30mmol腈/h×g干重，尤其优选地至少40mmol腈/h×mg蛋白质或至少40mmol腈/h×g干重，非常尤其优选至少50mmol腈/h×mg蛋白质或至少50mmol腈/h×g干重。
可使用包含本发明的核酸、核酸构建体或载体的培养细胞用于本发明的方法。也可使用休眠的或破碎的细胞。破碎的细胞是指例如通过处理(如溶剂)已变为可通透的细胞或通过酶处理、机械处理(如French压榨法或超声)或任一其它方法处理已分解的细胞。以这种方式获得的粗提取物适用于本发明的方法并且对本发明的方法是有利的。纯化或部分纯化的酶也可用于该方法。固定化微生物或酶同样适用且可有利地用在反应中。
在本发明方法中制备的手性或非手性羧酸可有利地通过提取或结晶或通过提取和结晶从含水反应液中分离。为此，用酸如无机酸(如HCl或H2SO4)或有机酸来酸化含水反应液，有利地至pH值低于2，然后用有机溶剂提取。提取可重复几次以增加产率。可使用的有机溶剂原则上为显示出与水具有相界的所有溶剂，根据需要，可使用的有机溶剂为在加入盐后显示出与水具有相界的所有溶剂。有利的溶剂为以下溶剂，如甲苯、苯、己烷、甲基叔丁基醚或乙酸乙酯。可有利地通过与离子交换剂结合以及接下来用无机酸或羧酸(如HCl、H2SO4、甲酸或乙酸)洗脱来纯化产物。
在浓缩水相或有机相后，产物通常以好的化学纯度分离，好的化学纯度是指化学纯度大于90％。但在提取后也可仅部分浓缩具有产物的有机相，并且结晶该产物。为此，有利地将溶液冷却至0℃至10℃的温度。也可直接从有机溶液中进行结晶。可将结晶产物再溶于相同或不同的溶剂以便重新结晶，并进行再次结晶。依据低共熔组合物的位置，接下来至少一次的结晶可进一步提高产物的对映异构体纯度。
但也可在用酸将含水反应液酸化至pH值有利地低于2后，立即将手性或非手性羧酸从含水反应液中结晶出来。这有利地需要通过加热浓缩该含水反应液，使其体积减少10至90％，优选地减少20至80％，尤其优选地减少30至70％。结晶优选地通过冷却进行。用于结晶的温度优选在0℃至10℃之间。因为成本的原因，优选直接从含水溶液中进行结晶。同样优选通过提取处理手性羧酸，且根据需要接下来进行结晶。
通过这些优选的处理方法，根据用于反应的腈的种类，本发明方法的产物可以从60至100％，优选地从80至100％，尤其优选地从90至100％的产率分离。分离的产物具有＞90％，优选地＞95％，尤其优选地＞98％的高化学纯度。此外，在为手性腈和手性羧酸时，产物具有高对映异构体纯度，后者可通过结晶进一步提高。
以这种方式获得的产物适于作为有机合成的起始材料来制备药物或农业化学品，或适用于作为外消旋物拆分的起始材料。
实施例：
从玫瑰色红球菌NCIMB 11216分离并异源表达nitA基因
实施例1：从玫瑰色红球菌NCIMB 11216分离nitA基因
通过从玫瑰色红球菌NCIMB 11216的细胞中分离DNA，建立噬菌体基因库并用寡核苷酸探针筛选后者而分离nitA基因。
1.1从玫瑰色红球菌NCIMB 11216分离DNA
如Sambrook等人，1989所述从玫瑰色红球菌NCIMB 11216制备基因组DNA，离心2×100ml过夜培养物(在dYT培养基中，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，1989，分子克隆：实验室手册，第二版(Molecularcloning：a laboratory manual，2nd edition)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，并将沉淀重悬于8ml的25mM Tris/HCl、25mM EDTA、10％蔗糖(w/v)，pH8.0。将合并的培养物用溶菌酶于37℃处理15分钟(加入2ml溶菌酶，溶菌酶用10mM Tris/HCl、0.1mM EDTA，pH8.0配制为100mg/ml)，然后加入2ml 10％(w/v)月桂酰基肌氨酸钠并于65℃温育15分钟，充分混合几次。然后以1g/ml的终浓度加入CsCl并于65℃溶解，以0.4mg/ml的终浓度加入溴化乙锭后，用固定角转头(Sorvall T1270，83500g，48小时，17℃)进行超离心。在紫外线下吸出染色体DNA带，用TE 10.1(10mM Tris/HCl，1mM EDTA，pH8.0)透析2小时，并用酚溶液(10mM Tris/HCl饱和酚，pH8)提取三次。最后该DNA再用TE 10.01(10mMTris/HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)透析3次，并贮存在4℃。这样产生约1.5ml的浓度为约500μg/ml的DNA溶液。
1.2从来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的DNA制备噬菌体基因库
用于基因库的载体为噬菌体λ±RESIII：该置换型载体包含作为取代片段的lux操纵子(其使得可通过生物发光可视检测背景)、来自Tn1721的整合res(“分解”)位点以及pTW601-1的复制功能，这样载体可转化入具有合适转座酶的菌株中，成为自主复制的质粒(Altenbuchner，1993，一种具有内在编码Tn1721、移除体系的新λRES载体(A newλRES vector with abuilt-in Tn1721-encoded，excision system)，基因(Gene)123，63-68)。
1.2.1 λ±RESIII-DNA的分离(如Sambrook等人，1989所述)
从大肠杆菌(E.coli)TAP 90(LB0，Sambrook等人，1989，以及10mMMgSO4，0.2％麦芽糖(w/v))的过夜培养物离心下来1010个细胞，并将沉淀重悬于3ml SM噬菌体缓冲液(50mM Tris/HCl，100mM NaCl，8mM MgSO4，0.01％(w/v)明胶)。用1.5×108-1.5×109噬斑形成单位(pfu)的λRESIII噬菌体裂解物37℃感染20分钟后，将该混合物加至2升锥形瓶中的500ml LB0，10mM MgSO4，0.2％麦芽糖。总共四个此类混合物于37℃搅拌9至12小时，直至可检测到细胞裂解。为了完全裂解，向每个烧瓶加入10ml氯仿，并继续于37℃搅拌30分钟。加入Dnase和RNase(各1μg/ml)并于室温搅拌30分钟消化细胞核酸。然后向每个混合物中加入29.2gNaCl并溶解，该混合物于8300g离心10分钟，并将上清与10％PEG 6000混合。为了接下来的噬菌体沉淀，该混合物于4℃过夜搅拌，然后14000g离心15分钟。干燥沉淀、并溶于5ml SM缓冲液、与5ml氯仿混合，并于3000g离心15分钟。合并具有噬菌体的水相，与0.75g/ml CsCl混合，并在溶解完全后，离心24小时(Sorvall T1270固定角转头，98400g，48小时，17℃)。吸出可见的噬菌体带，并用50mM Tris/HCl，10mM NaCl，10mM MgCl2，pH8.0透析2次。加入20mM EDTA，50μg/ml蛋白酶K和0.5％SDS，然后65℃温育1小时。然后用酚(10mM Tris/HCl饱和酚，pH8)提取一次、酚(10mM Tris/HCl饱和酚，pH8)/氯仿(50/50v/v)提取一次以及用氯仿提取一次。最终将该DNA用TE 10.1透析三次，并用TE 10.01透析一次，用大肠杆菌TAP 90测定滴度(参见1.2.2)，并将该λ±RESIII DNA贮存在4℃。
1.2.2将基因组DNA克隆入λ±RESIII载体
为克隆玫瑰色红球菌NCIMB 11216的基因组DNA片段，首先通过消化λ±RESIII DNA制备λ±RESIII臂片段，在100μl的体积中将2μg的λ±RESIIIDNA用20 U BamHI于37℃消化5小时。用酚(10mM Tris/HCl饱和酚，pH8)/氯仿(50/50 v/v)提取、异丙醇沉淀并用70％和100％乙醇(预冷却至-20℃)洗涤后，将DNA溶于TE 10.01，然后用20 U SalI处理(37℃处理5小时)。重复进行酚/氯仿提取、异丙醇沉淀、洗涤并溶于TE 10.01。
在检测所用酶批次的动力学后，通过部分消化制备基因组DNA片段，将10μg基因组DNA在具有0.5 U Sau3AI的100μl混合物中消化5分钟。如Parker和Seed(1980)所述在0.8％低熔点琼脂糖凝胶上电泳分离后，从凝胶上分离8至14kb范围的片段并洗脱。基因组DNA片段与λ±RESIII臂16℃过夜连接。
最后用噬菌体提取物体外包装连接混合物，其中所述噬菌体提取物之前已从“包装提取供体”大肠杆菌BHB 2688(“冻融裂解物”，FTL，Sambrook等人，1989)和“预加热供体”大肠杆菌BHB 2690(“超声提取物”，SE，Sambrook等人，1989)制备。为了包装，将5μl连接混合物，7μl缓冲液A(20mM Tris/HCl，3mM MgCl2，1mM EDTA，0.05％β-巯基乙醇，pH8.0)，7μl缓冲液M1(6.7mM Tris/HCl，33mM亚精胺，100mM肉毒碱，17.8mM ATP，0.2％β-巯基乙醇，20mM MgCl2，pH8)，15μl SE和10μlFTL混合并室温温育1小时。然后加入500μlSM缓冲液和1滴氯仿并混合，离心混合物并贮存在4℃。
通过感染大肠杆菌菌株TAP 90测定所制备的噬菌体基因库的滴度(Patterson和Dean，1987)。其过程为将对数生长细胞(培养于LB0，10mM MgCl2，0.5％麦芽糖)与100μl不同稀释度的包装或噬菌体裂解物在SM缓冲液中37℃温育30分钟。然后每种混合物与3ml 42℃平衡的顶层琼脂(0.8％的细菌培养用琼脂，10mM MgCl2，0.5％麦芽糖)简短混合，并铺于含10mM MgCl2的LB0琼脂平板上(已预温至37℃)。37℃温育12-16小时后，计数空斑以测定滴度。所制备的基因库的滴度约为4×105pfu/ml。
1.2.3重组λ±RESIII噬菌体转化入质粒
所得的重组λ±RESIII噬菌体转化大肠杆菌菌株HB 101F’[∷Tn1739lac]，后者具有转座子Tn1739，其中解离酶基因位于tac启动子控制下(Altenbuchner，1993，参见上面)，从而成为自主复制的质粒。在感染前，将菌株培养于5ml含10mM MgCl2和0.5％麦芽糖的LB0直至OD600达到0.6至0.8，并将其中的100μl用适量的噬菌体裂解物室温感染30分钟。该混合物于5 ml预温的dYT，1mM异丙基β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)37℃转管培养1小时，离心并重悬于上述培养基，并将细胞铺于含100μg/ml卡那霉素的dYT琼脂平板，37℃过夜温育。
细胞中转化的λ±RESIII分子仍然含有原来具有lux操纵子的取代片段并因此不含有基因组插入物(基因库背景)，将平板于30℃诱导3小时使细胞可见，在暗处计数生物发光细胞。按照发光细胞的比例，基因库背景达到13％。
1.3从玫瑰色红球菌NCIMB 11216筛选腈水解酶基因nitA
通过将噬菌体空斑与下列寡核苷酸探针杂交鉴定含有来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的腈水解酶基因的染色体DNA片段的重组λ±RESIII噬菌体
“nit1下游”具有序列：5’-TGGAA(AG)TG(CT)TCCCA(AG)CA-3’，
Kobayashi，M.，Komeda，H.，Yanaka，N.，Nagasawa，T.和Yamada，H.(1992)
来自玫瑰色红球菌J1的腈水解酶(Nitrilase from Rhodococcusrhodochrous J1)。
Kobayashi，M.，Izui，H.，Nagasawa，T.和Yamada，H.(1993)
腈水解酶在从吲哚-3-乙腈生物合成植物激素吲哚-3-乙酸中的作用：产碱菌属基因的克隆及半胱氨酸残基的定点诱变(Nitrilase in biosynthesis ofthe plant hormone indole-3-acetic acid from indole-3-acetonitrile：Cloningof the Alcaligenes gene and site-directed mutagenesis of cysteine residues)。
寡核苷酸的序列来自推测的具有催化活性物半胱氨酸残基的保守氨基酸序列区(Kobayashi等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267，1992，20746-20751和美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90，1993，247-251)。在以前公开的来自菌株玫瑰色红球菌J1的腈水解酶基因的DNA序列(GenBank Acc.#D11425)以及来自玫瑰色红球菌K22的腈水解酶基因的DNA序列(GenBank Acc.#D12583)可找到该基序。
1.3.1 DNA转移和杂交
将圆形尼龙膜置于总共具有2500个空斑的5个琼脂平板上1分钟，其中所述琼脂平板已如所述制备，用于在1.2.2中测定滴度。将该膜的空斑面置于含变性溶液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)的滤纸上2×5分钟，然后置于含中和溶液(0.5M Tris/HCl，1.5M NaCl，pH 7.5)的滤纸上2×5分钟。然后将它们在50mM NaCl中简短漂洗并干燥，该DNA于120℃固定30分钟。
为用于杂交，将膜与50ml杂交缓冲液于37℃预温育2小时，并与在12ml杂交缓冲液中的10pmol 32p-标记的寡核苷酸37℃过夜杂交。寡核苷酸在具80μCi(γ-32p)-ATP的30μl混合物中用10U T4多核苷酸激酶标记，并通过具Sephadex G-25的滴流柱凝胶过滤与过量的(γ-32P)ATP分离开。
杂交后，用0.5g/l NaCl，8.8g/l柠檬酸钠(2×SSC)，0.1％SDS室温漂洗尼龙膜1×5分钟，并用0.125g/l NaCl，2.2g/l柠檬酸钠(0.5×SSC)，0.1％SDS于32℃漂洗尼龙膜2×15分钟，并在具增感屏的胶片暗盒中曝光于X-射线胶片。
1.3.2 nitA基因的鉴定和测序
总共鉴定了3个阳性克隆，其中两个具有不完全的nitA基因片段，一个具有全长nitA基因。挑取阳性空斑，每个空斑在0.5ml SM[缓冲液中室温温育2小时，加入2滴氯仿后，贮存在4℃。在用全长nitA基因转化重组λ±RESIII噬菌体后所得的质粒(参见1.2.3)称为pDHE 6(图1显示pDHE 6具有来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的基因组基因库片段的12kb片段)，且通过用寡核苷酸探针“nit1下游”进行Southern杂交限制性酶切绘出了nitA基因的邻近区图谱。具有全长nitA基因的1.5kb PvuI片段用克列诺片段处理，并亚克隆入EcoRV处理的pBluescriptSK+(pDHE 7具有pDHE 6中来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的基因组12kb基因库片段的1.5kb PvuI片段，图2)。在进一步的将重叠的pDHE 7片段HindIII(载体)/EcoRI、KpnI/XhoI、EcoRV/BamHI和ApaI/EcoRI(载体)亚克隆入每一相应消化的pBluescriptSK+后，用Sanger等人的方法(美国国家科学院院报74，1977，5463-5467)使用自动测序仪对PvuI片段进行双链测序。用市售的测序试剂盒及同样市售的通用和反向引物(Vieira和Messing，基因(Gene)，19，1982：259-268)进行测序反应。1.5kb PvuI片段的DNA序列描述见SEQ ID NO：1.所得的氨基酸见SEQ ID NO：2。
2来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的nitA基因在大肠杆菌中的异源表达，以及重组腈水解酶蛋白质的纯化
为克隆入表达载体，将来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的nitA基因从翻译起始密码子至翻译终止密码子扩增。所用引物为
“nit NdeI”(上游)序列为：
5’-TATATAT CATATGGTCGAATACACAAACA-3’
以及
“nit HindIII”(下游)序列为：
5’-TAATT AAGCTTCAGAGGGTGGCTGTCGC-3’
其中与翻译起始重叠的NdeI切割位点在5’-nitA末端，且与终止密码子重叠的HindIII切割位点在3’-nitA末端。这对引物用于从pDHE 7使用Pwo聚合酶扩增nitA基因，反应体积为40μl，每个反应体积在10 mM Tris/HCl，pH8.85，25mM KCl，5mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.2mM dATP，0.2mM dTTP，0.2mM dGTP和0.2mM dCTP中含8pmol引物，100pgpDHE7模板和2.5单位Pwo，反应条件为：
94℃变性3分钟；
每个循环为93℃变性1分钟，48℃引物退火1分钟30秒，以及72℃聚合1分钟30秒，进行25个循环
最后72℃聚合5分钟。
纯化所得的nit PCR片段，NdeI/HindIII消化并整合入类似消化的载体pJOE 2702分子(Volff等人，分子微生物学(Mol.Microbiol.)，21，1996：1037-1047)，且所得质粒称为pDHE 17(图2：pDHE 17中nitA位于L-鼠李糖诱导型表达载体pJOE 2702中)。通过NdeI/HindIII整合是指质粒pDHE 17中的nitA基因位于启动子rhap的转录控制下，其中所述rhap存在于pJOE 2702中，并来自于大肠杆菌中的L-鼠李糖操纵子rhaBAD(Egan和Schleif，分子生物学(Mol.Biol.)243，1994：821-829)。NitA基因的转录终止和转录体的翻译起始同样通过载体序列而进行(Volff等人，1996)。将pDHE 17转化入大肠杆菌JM 109后，加入L-鼠李糖可诱导来自玫瑰色红球菌NCIMB 11216的nitA基因。
为了通过咪唑亲和层析纯化重组腈水解酶蛋白质，将该nitA基因额外地融合至一个3’序列，以便得到C-末端的His6基序，融合方法为通过在上述条件下进行nitA基因的扩增，所用引物为5’引物“nitNdeI”(上游)和改变了的无终止密码子的、具有序列5’-CGAGGGTGGCTGTCGCCCG-3’的3’引物，并将所得的PCR产物整合入改变了的、在BamHI切割位点后包含序列[CAT]6TGA的pJOE 2702载体。载体用BamHI消化、克列诺处理及NdeI消化后，与已用NdeI酶切的nitA Pwo扩增子融合，即为在nitA Pwo扩增子的3’末端通过平端依据读码框与His6基序序列连接，所得的质粒称为pDHE 18。
为进行实验室规模的异源表达，来自37℃过夜培养的JM 109(pDHE 17)以1∶200接种至具0.2％L-鼠李糖的50ml dYT完全培养基(Sambrook等人，1989)中，并将培养物在摇动水浴中30℃诱导培养8小时。然后将细胞在50mM Tris/HCl，pH7.5中洗涤一次，并重悬于同一缓冲液直至OD600为10，超声处理破碎。用JM 109(pDHE 18)的步骤是类似的。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，与未诱导的对照比较；与所提及的多个诱导条件比较而确定通过超声处理获得并通过离心澄清的粗提取物的蛋白质模式，对JM 109(pDHE 17)和JM 109(pDHE 18)而言，腈水解酶在蛋白质中的比例为约30％。
来自JM 109(pDHE 18)的具His6基序的腈水解酶通过在50mMTris/HCl，pH 7.5中洗涤细胞，重悬至约50 OD600/ml，并用French压榨法(在20000psi下进行两次)制备提取物而纯化。于15000g离心30分钟澄清提取物，然后用QIAexpress-Ni2+-NTA(QIAGEN)纯化。用20mM Tris/HCl，pH7.5平衡的1ml材料可用于每ml粗提取液。装柱后，用5倍柱体积的20mM Tris/HCl，300mM NaCl，40mM咪唑，pH7.0洗涤，并用20mMTris/HCl，300mM NaCl，300mM咪唑，pH7.5洗脱。根据凝胶电泳，以这种方式获得的腈水解酶蛋白质的纯度＞90％。用50mM Tris/HCl，0.1mMDTT，0.5M(NH4)2SO4，pH 7.5透析两次后，可将纯化的腈水解酶贮存在-20℃。
对粗提取物的测定显示在每种情况下，约2U/mg的粗提取物用于将2-苯基氰转化为苯甲酸，且用QIAexpress-Ni2+-NTA纯化的具His6基序的腈水解酶在酶浓度为50μg/ml时显示为约11U/mg。此时，在起始苯基氰浓度为10mM，30℃且pH7.5时，一单位的纯化腈水解酶等于1μmol苯甲酸的产量。通过腈水解酶粗提取物将2-苯基氰转化为苯甲酸是在50mM Tris/HCl，pH7.5时进行的，且用纯化的腈水解酶的转化是在50mM Tris/HCl，pH7.5，0.1mM DTT时进行的。用HPLC测定苯甲酸的形成(RP18柱，250×4mm，流动相为47％甲醇、0.3％H3PO4)。
以类似于上述实施例的方法，转化了多种腈，并测定了转化率。
用大肠杆菌菌株JM109(pDHE 17和pDHE 18)转化了多种腈。用于此目的的细胞在30℃和200转/分钟培养于250ml LB/氨苄青霉素培养基+2g/l鼠李糖9小时(＝h)。离心收获细胞(20分钟，4℃，5000转/分钟)。然后将细胞重悬于10mM磷酸盐缓冲液，pH7.2，这样干生物量(dry biomass，DBM)的浓度为2g DBM/l。向微滴定板的每孔移入150μl细胞悬液。然后离心板。吸弃上清并用Na2HPO4(在Finnaqua中为1.42g/l，pH7.2)洗涤细胞沉淀两次。在另一次的离心步骤之后，重悬细胞沉淀于各自的底物溶液(150μl)。一种底物加入微滴定板的每行12个孔中。有底物溶液而无细胞的行用作对照(空白)。于振摇培养箱中30℃和200转/分钟培养微滴定板1小时。离心细胞，并用一种Biomek仪器测定上清中所产生的NH4离子。在620nm处进行测定，并与用不同NH4OH溶液产生的校准标定图比较。用于实验1的底物(参见图3，表1)为下列底物：苯基氰(＝1)、3-羟基丙腈(＝2)、2-甲基戊二腈(＝3)、4-氯-3-羟基丁腈(＝4)、丙二腈(＝5)、丁烯腈(＝6)、香叶腈(＝7)、辛二腈(＝8)、新戊腈(＝9)、氨基己腈(＝10)、3，4-二羟基苯基氰(＝11)、3，5-二溴-4-羟基苯基氰(＝12)、3-氰基吡啶(＝13)、4-溴苄基氰(＝14)、4-氯苄基氰(＝15)、2-苯基丁腈(＝16)、2-氯苄基氰(＝17)、2-吡啶基乙腈(＝18)、4-氟苄基氰(＝19)、4-甲基苯基氰(＝20)、苄基氰(＝21)。用于实验2的底物(参见图4，表2)为下列底物，实验2以类似于实验1的方法进行：2-苯基丙腈(＝1)、苯乙醇腈(＝2)、2-氨基-2-苯基乙腈(＝3)、2-羟基丙腈(＝4)、3，3-二甲氧基丙腈(＝5)、3-氰基噻吩(＝6)、3-氰甲基噻吩(＝7)、苯基氰(＝8)、丙腈(＝9)、反-苯乙烯基腈(＝10)、2-羟基-4-苯基丁腈(＝11)、3-苯基戊二腈(＝12)、反丁烯二腈(＝13)、戊二腈(＝14)、戊腈(＝15)。
                                   表1
    1     苯基氰     0.4051
    2     3-羟基丙腈     0.1785
    3     2-甲基戊二腈     0.4758
    4     4-氯-3-羟基丁腈     0.1208
    5     丙二腈     0.1208
    6     丁烯腈     0.4946
    7     香叶腈     0.1517
    8     辛二腈     0.4548
    9     新戊腈     0.1569
    10     氨基己腈     0.1236
    11     3，4-二羟基苯基氰     0.1569
    12     3，5-二溴-4-羟基苯基氰     0.1624
    13     3-氰基吡啶     0.2393
    14     4-溴苄基氰     0.5213
    15     4-氯苄基氰     0.4830
    16     2-苯基丁腈     0.1376
    17     2-氯苄基氰     0.4530
    18     2-吡啶基乙腈     0.1222
    19     4-氟苄基氰     0.2361
    20     4-甲基苯基氰     0.4326
    21     苄基氰     0.2755
                             表2
    1     2-苯基丙腈     0.0000
    2     苯乙醇腈     0.0000
    3     2-氨基-2-苯基乙腈     0.0000
    4     2-羟基丙腈     0.0000
    5     3，3-二甲氧基丙腈     0.1466
    6     3-氰基噻吩     1.9038
    7     3-氰甲基噻吩     0.9949
    8     苯基氰     1.9518
    9     丙腈     0.4135
    10     反-苯乙烯基腈     2.2509
    11     2-羟基-4-苯基丁腈     0.0000
    12     3-苯基戊二腈     0.0000
    13     反丁烯二腈     2.2510
    14     戊二腈     2.0809
    15     戊腈     1.9218
                         序列表<212>DNA<213>玫瑰色红球菌<220><221>CDS<222>(286)..(1386)<400>1cgatcgaacc agcaacgggg acgcacagtc gacgtagacc tcgacctatc cgccgttccg 60cagaaggaca ccgaccacca ccacttcaac atccttcaac gtgcccggcc agtccttcga 120cgaatcgaaa cggcgaagag ccgcctcgga ccccccggcc gaaccgctcg atgaactccc 180ctacacgggt ggcgcagaat gccaggaccc gtgtcattcc acgtcaattc acgcgccttt 240tcacctcgta ctgtcctgcc aaacacaagc aacggaggta cggac atg gtc gaa tac 297
                                              Met Val Glu Tyr
                                                1aca aac aca ttc aaa gtt gct gcg gtg cag gca cag cct gtg tgg ttc   345Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln Pro Val Trp Phe5                  10                  15                  20gac gcg gcc aaa acg gtc gac aag acc gtg tcc atc atc gcg gaa gca   393Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile Ile Ala Glu Ala
             25                  30                  35gcc cgg aac ggg tgc gag ctc gtt gcg ttt ccc gag gta ttc atc ccg   441Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu Val Phe Ile Pro
         40                  45                  50ggg tac ccg tac cac atc tgg gtc gac agc ccg ctc gcc gga atg gcg   489Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu Ala Gly Met Ala
     55                  60                  65aag ttc gcc gtg cgc tac cac gag aat tcc ctg acg atg gac agc ccg   537Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr Met Asp Ser Pro
 70                  75                  80cac gta cag cgg ttg ctc gat gcc gcc cgc gac cac aac atc gcc gta   585His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His Asn Ile Ala Val 85                  90                  95                 100gtg gtg gga atc agc gag cgg gat ggc ggc agc ttg tac atg acc cag   633Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu Tyr Met Thr Gln
            105                 110                     115ctc atc atc gac gcc gat ggg caa ctg gtc gcc cga cgc cgc aag ctc   681Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg Arg Arg Lys Leu
        120                 125             130aag ccc acc cac gtc gag cgt tcg gta tac gga gaa gga aac ggc tcg   729Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu Gly Asn Gly Ser
    135                 140                 145gat atc tcc gtg tac gac atg cct ttc gca cgg ctt ggc gcg ctc aac   777Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu Gly Ala Leu Asn
150                 155                 160tgc tgg gag cat ttc cag acg ctc acc aag tac gca atg tac tcg atg   825Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala Met Tyr Ser Met165                 170                 175                 180cac gag cag gtg cac gtc gcg agc tgg cct ggc atg tcg ctg tac cag   873His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met Ser Leu Tyr Gln
            185                 190                 195ccg gag gtc ccc gca ttc ggt gtc gat gcc cag ctc acg gcc acg cgt   921Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu Thr Ala Thr Arg
        200                 205                 210atg tac gca ctc gag gga caa acc ttc gtg gtc tgc acc acc cag gtg   969Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys Thr Thr Gln Val
    215                 220                 225gtc aca ccg gag gcc cac gag ttc ttc tgc gag aac gag gaa cag cga   1017Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn Glu Glu Gln Arg
230                 235                 240aag ttg atc ggc cga ggc gga ggt ttc gcg cgc atc atc ggg ccc gac   1065Lys Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile Ile Gly Pro Asp245                 250                 255                 260ggc cgc gat ctc gca act cct ctc gcc gaa gat gag gag ggg atc ctc   1113Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu Glu Gly Ile Leu
            265                 270                 275tac gcc gac atc gat ctg tct gcg atc acc ttg gcg aag cag gcc gct   1161Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala Lys Gln Ala Ala
        280                 285                 290gac ccc gtg ggc cac tac tca cgg ccg gat gtg ctg tcg ctg aac ttc   1209Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu Ser Leu Asn Phe
    295                 300                 305aac cag cgc cgc acc acg ccc gtc aac acc cca ctt tcc acc atc cat   1257Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro Leu Ser Thr Ile His
310                 315                 320gcc acg cac acg ttc gtg ccg cag ttc ggg gca ctc gac ggc gtc cgt   1305Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu Asp Gly Val Arg325                 330                 335                 340gag ctc aac gga gcg gac gaa cag cgc gca ttg ccc tcc aca cat tcc   1353Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro Ser Thr His Ser
            345                 350                 355gac gag acg gac cgg gcg aca gcc acc ctc tga ctcgggcgca cccgtggcgc 1406Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu
        360                 365ctccgaagcg ccacgggtgt gtgaaggggc gagacagggg aatcggagga tcaccgagta 1466caacgcatcg tcgatcg                                                1483<210>2<211>366<212>PRT<213>玫瑰色红球菌<400>2Met Val Glu Tyr Thr Asn Thr Phe Lys Val Ala Ala Val Gln Ala Gln1               5                  10                  15Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Lys Thr Val Asp Lys Thr Val Ser Ile
         20                  25                  30Ile Ala Glu Ala Ala Arg Asn Gly Cys Glu Leu Val Ala Phe Pro Glu
     35                  40                  45Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Val Asp Ser Pro Leu
 50                  55                  60Ala Gly Met Ala Lys Phe Ala Val Arg Tyr His Glu Asn Ser Leu Thr65                   70                  75                  80Met Asp Ser Pro His Val Gln Arg Leu Leu Asp Ala Ala Arg Asp His
             85                  90                  95Asn Ile Ala Val Val Val Gly Ile Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu
            100             105                 110Tyr Met Thr Gln Leu Ile Ile Asp Ala Asp Gly Gln Leu Val Ala Arg
    115                 120                 125Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Ser Val Tyr Gly Glu
130                 135                 140Gly Asn Gly Ser Asp Ile Ser Val Tyr Asp Met Pro Phe Ala Arg Leu145                 150                 155                 160Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Leu Thr Lys Tyr Ala
            165                 170                 175Met Tyr Ser Met His Glu Gln Val His Val Ala Ser Trp Pro Gly Met
        180                 185                 190Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Pro Ala Phe Gly Val Asp Ala Gln Leu
    195                 200                 205Thr Ala Thr Arg Met Tyr Ala Leu Glu Gly Gln Thr Phe Val Val Cys
210                 215                 220Thr Thr Gln Val Val Thr Pro Glu Ala His Glu Phe Phe Cys Glu Asn225                 230                 235                 240Glu Glu Gln Arg Lys Leu Ile Gly Arg Gly Gly Gly Phe Ala Arg Ile
            245                 250                 255Ile Gly Pro Asp Gly Arg Asp Leu Ala Thr Pro Leu Ala Glu Asp Glu
        260                 265                 270Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Asp Ile Asp Leu Ser Ala Ile Thr Leu Ala
    275                 280                 285Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Leu
290                 295                 300Ser Leu Asn Phe Asn Gln Arg Arg Thr Thr Pro Val Asn Thr Pro Leu305                 310                 315                 320Ser Thr Ile His Ala Thr His Thr Phe Val Pro Gln Phe Gly Ala Leu
            325                 330                 335Asp Gly Val Arg Glu Leu Asn Gly Ala Asp Glu Gln Arg Ala Leu Pro
        340                 345                 350Ser Thr His Ser Asp Glu Thr Asp Arg Ala Thr Ala Thr Leu
    355                 360                 365

Claims (13)

1.一种分离的核酸序列，其编码具有腈水解酶活性的多肽，所述核酸序列选自：
a)具有SEQ ID NO：1中所述序列的核酸序列，
b)按照遗传密码的简并性而衍生于SEQ ID NO：1中所述核酸序列的核酸序列，
c)SEQ ID NO：1中所述核酸序列的衍生物，其编码的多肽具有SEQID NO：2中所述的氨基酸序列，且编码的多肽在氨基酸水平具有至少95％的同源性，在多肽的酶活性上具有可忽略的降低。
2.一种氨基酸序列，其由权利要求1所述的核酸序列编码。
3.如权利要求2所述的氨基酸序列，其由SEQ ID NO：1中所述的序列编码。
4.核酸构建体，其包含如权利要求1所述的核酸序列，其中核酸序列与一个或多个调节信号连接。
5.载体，其包含如权利要求1所述的核酸序列或包含如权利要求4所述的核酸构建体。
6.重组微生物，其包含如权利要求1所述的核酸序列、如权利要求4所述的核酸构建体或如权利要求5所述的载体。
7.如权利要求6所述的重组微生物，其中微生物为埃希氏菌属、红球菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属或分支杆菌属的细菌。
8.制备手性或非手性羧酸的方法，其包括在存在如权利要求2或3所述的氨基酸序列时，或在存在生长的、休眠的或破碎的如权利要求6或7所述的微生物时，将腈转化手性或非手性羧酸。
9.如权利要求8所述的制备手性或非手性羧酸的方法，其中通式I的腈
Figure A0180601600031
在存在如权利要求2或3所述的氨基酸序列时，或在存在生长的、休眠的或破碎的如权利要求6或7所述的微生物时，被转化为通式II的羧酸，
Figure A0180601600032
其中在式I和II中的取代基和变量具有以下特性：
n＝0或1
m＝0、1、2或3，其中当m＞2时，在两个相邻的碳原子之间有一个双键或没有双键存在，
p＝0或1
A、B、D和E相互独立地为CH、N或CR3
当n＝0时，H＝O、S、NR4、CH或CR3，或当n＝1时，H＝CH、N或CR3，
两个相邻的变量A、B、D、E或H可一起形成另一个取代或未取代的芳香的、饱和或部分饱和环，环中具有5至8个原子且其可包含一个或更多的杂原子如O、N或S原子，且变量A、B、D、E或H中不多于三个为杂原子，
R1为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、卤素、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R2为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基或杂芳基、羟基、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R3为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基或C1-C10-烷氧基、取代或未取代的芳基、杂芳基、羟基、卤素、C1-C10-烷基氨基或氨基，
R4为氢、取代或未取代的、支链或无支链的C1-C10-烷基。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中该方法于pH值为4至11时在含水反应液中进行。
11.如权利要求8至10中任意一项所述的方法，其中在该方法中重量占0.01至10％的腈参与反应。
12.如权利要求8至11中任意一项所述的方法，其中该方法在温度为0℃至80℃之间进行。
13.如权利要求8至12中任意一项所述的方法，其中非手性或手性羧酸通过提取或结晶或通过提取和结晶从反应液中以60％至100％的产率分离。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102796770A (zh) * 2004-12-22 2012-11-28 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102260696B (zh) * 2004-08-16 2013-03-27 纳幕尔杜邦公司 使用腈水解酶突变体生产3-羟基羧酸
CN103757068A (zh) * 2014-01-10 2014-04-30 浙江台州清泉医药化工有限公司 一种苯甲酸衍生物的制备方法
CN103898083A (zh) * 2014-04-21 2014-07-02 武汉大学 一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用
CN104017832A (zh) * 2013-02-28 2014-09-03 瑟维尔实验室 (7s)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
CN113025601A (zh) * 2019-12-25 2021-06-25 上海奥博生物医药技术有限公司 腈水解酶启动子优化表达及应用
CN114539458A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60043424D1 (de) * 1999-10-26 2010-01-14 Showa Denko Kk Rhodococcus-stamm, nitrilase-gen aus rhodococcus, nitrilhydratas-gen und amidase-gen und verfahren zur herstellung carboxylsäuren unter deren verwendung
US6562603B2 (en) 2000-08-04 2003-05-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company 3-hydroxycarboxylic acid production and use in branched polymers
EP1599584B1 (en) 2003-02-27 2009-07-01 Basf Se Modified nitrilases and their use in methods for the production of carboxylic acids
CN101268197A (zh) * 2005-09-22 2008-09-17 阿斯利康(瑞典)有限公司 用于将芳香卤代二腈转化为卤代氰基羧酸的新方法
JP4977362B2 (ja) * 2005-12-09 2012-07-18 矢崎総業株式会社 ローラ
CN102690766A (zh) * 2012-05-15 2012-09-26 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2623345B2 (ja) * 1988-06-27 1997-06-25 旭化成工業株式会社 光学活性なα―置換有機酸の製造方法
JP3009421B2 (ja) * 1990-02-28 2000-02-14 秀明 山田 有機酸の生物学的製造法
JPH0799980A (ja) * 1993-10-05 1995-04-18 Japan Energy Corp ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子ｄｎａ、およびこれを含有する形質転換体によるニトリル類からカルボン酸の製造法
US5628190A (en) * 1994-10-03 1997-05-13 Ormat Industries Ltd. Geothermal power plant and condenser therefor
GB9525372D0 (en) * 1995-12-12 1996-02-14 Allied Colloids Ltd Enzymes, their preparation and their use in the production of ammonium acrylate
DE19848129A1 (de) * 1998-10-19 2000-04-20 Basf Ag Verfahren zur Herstellung chiraler Carbonsäuren aus Nitrilen mit Hilfe einer Nitrilase oder Mikroorganismen, die ein Gen für die Nitrilase enthalten

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102260696B (zh) * 2004-08-16 2013-03-27 纳幕尔杜邦公司 使用腈水解酶突变体生产3-羟基羧酸
CN102899362B (zh) * 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102816799A (zh) * 2004-12-22 2012-12-12 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102796770A (zh) * 2004-12-22 2012-11-28 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102796769B (zh) * 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102816799B (zh) * 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN102796770B (zh) * 2004-12-22 2014-06-04 纳幕尔杜邦公司 乙醇酸的酶促生产
CN104017832A (zh) * 2013-02-28 2014-09-03 瑟维尔实验室 (7s)-3,4-二甲氧基双环并[4.2.0]辛-1,3,5-三烯-7-甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
CN104017832B (zh) * 2013-02-28 2017-04-12 瑟维尔实验室 (7s)‑3,4‑二甲氧基双环并[4.2.0]辛‑1,3,5‑三烯‑7‑甲酸的酶合成方法以及在伊伐布雷定及其盐的合成中的应用
CN103757068A (zh) * 2014-01-10 2014-04-30 浙江台州清泉医药化工有限公司 一种苯甲酸衍生物的制备方法
CN103898083A (zh) * 2014-04-21 2014-07-02 武汉大学 一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用
CN103898083B (zh) * 2014-04-21 2016-06-29 武汉大学 一种新型水解酶超家族酰胺酶Azl13及其制备与应用
CN113025601A (zh) * 2019-12-25 2021-06-25 上海奥博生物医药技术有限公司 腈水解酶启动子优化表达及应用
CN114539458A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法
CN114539458B (zh) * 2020-11-26 2023-07-25 西安蓝晓科技新材料股份有限公司 一种应用于固相合成的多孔树脂及其制备方法

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