CN1158640A - 4-甲硫基丁腈的酶水解 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用粪产碱杆菌、红球菌sp.HT-29-7或Gordona terrae腈水解酶，将α取代4-甲硫基丁腈酶水解成外消旋的α取代4-甲硫基丁酸的新方法。

Description

4-甲硫基丁腈的酶水解
本发明涉及腈水解酶作为由腈基水解生成羧基的催化剂的应用。更确切地说，本发明涉及选自产碱菌、红球菌或Gordona菌菌种微生物的，更确切地说选自于寄存号为ATCC8750的粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)、寄存号为FERM BP-3857的红球菌Rhodo-coccussp.HT 29-7、寄存号为FERM BP-4535的Gordona terrae MA-1微生物的腈水解酶的应用。
例如，粪产碱杆菌腈水解酶在以其专利号分别是EP348901和JP03224496公告的ASAHI公司的欧洲和日本专利中描述过。在这些专利中，尤其是欧洲专利中，这种腈水解酶用来由外消旋腈生产旋光性酸。优选的原料腈是α取代的腈，并且这些腈含有优选的是有1-3个碳原子的烷基链或芳基。上述欧洲专利中的第11个实施例描述了用粪产碱杆菌水解外消旋扁桃腈，得到R-(-)扁桃酸，对映体过量为91％。NITTO CHEMICAL公司的欧洲专利486289与其美国等效专利US5326702，都描述了在亚硫酸盐存在下用产碱杆菌sp.BC35-2(FERM No 11265或FERM-BP-3318)水解扁桃腈，在这种情况下得到扁桃酸，对映体过量约98％。
ASAHI公司的专利JP04341185还描述了粪产碱杆菌ATCC8750腈水解酶的制备和应用，以解决由其外消旋腈制备光学纯化合物的问题。更优选地，在上面引用的日本专利中描述的对映选择的腈水解酶能够将具有下述通式(I)的2-羟基腈水解成具有下述化学式(II)的2-羟基羧酸：
式中R表示或许取代的芳基或可能取代的杂环基。该专利指出，用所述腈水解酶水解扁桃酸的腈能够达到R-(-)扁桃酸对映体过量100％。在其实施例5中指出，可以使用所述的腈水解酶水解如戊腈、丙烯腈、2-卤代丙腈、氯乙腈之类的脂族腈。但没有明确指出有关有非对称中心的脂族腈的这种水解对映选择性。
这份说明书还明确说明了粪产碱杆菌腈水解酶在pH6.5-8.0，所述酶的使用温度(根据这份参考文献)总是低于45℃的条件下活性最高。
非常惊奇地看到，所述粪产碱杆菌ATCC8750的酶用于水解4-甲硫基-2-羟基丁腈时进行这种水解，从光学纯度来看没有任何选择性。这种酶水解所述的腈，得到两种酸的外消旋混合物，其中任何一种异构体都没有优势。
寄存号为FERM BP-3857的红球菌sp.HT 29-7的腈水解酶，例如在公告号分别为EP610049和US5296373的欧洲专利和美国专利中描述过，这两份专利都是NITTO公司的。
在这些专利中，尤其在这份美国专利中，使用这种腈水解酶由带苯基的外消旋腈生产旋光性酸。这些原料腈都含有芳基，主要涉及扁桃腈或其芳环取代衍生物的水解。上述这份美国专利的实施例1描述了用红球菌sp.HT 29-7水解外消旋扁桃腈，得到R-(-)扁桃酸，对映体过量100％。实施例2描述了在其环上取代的扁桃腈衍生物的水解，扁桃酸衍生物对映体过量也是100％。用苯醛的腈进行水解时同样是如此。
NITTO CHEMICAL公司的欧洲专利610049描述了红球菌sp.HT29-7(FERM BP-3857)、产碱杆菌sp.BC35-2(FERM BP-3318)或Breuibacte-rium acetylicum乙酰短杆菌IAM1790，在γ位被芳环取代的α羟基腈水解生成被旋光性苯基取代的α羟基羧酸这一过程中的用途。用红球菌sp.HT 29-7得到的酸，因原料腈的情况，和因是否有磷酸的存在(pH固定在约8.2)，其对映体过量总是不相同。
非常惊奇地看到，红球菌sp.HT 29-7(FERM BP-3318)的这种腈水解酶在其用于水解4-甲硫基-2-羟基丁腈时，从对映体来看没有任何选择性。这种酶水解所述的腈，得到两种酸的外消旋混合物，其中任何异构体都没有优势。
欧洲专利0610048描述了寄存号为FERM BP-4535的GordonaterraeMA-1的腈水解酶，用于将γ位为苯基和α位为羟基的腈水解成相应的旋光性酸。在所有这些实施例中，对映体过量是92-100％。
非常惊奇地发现，寄存号为FERM BP-4535的Gordona terrae MA-1的腈水解酶在其用于水解4-甲硫基-2-羟基丁腈时，从对映体来看没有任何选择性。这种酶水解所述的腈，得到两种酸的外消旋混合物，其中任何一种异构体都没有优势。
因此，本发明涉及一种通过用下述微生物的腈水解酶水解外消旋的α取代的4-甲硫基丁腈，制备外消旋的α取代的4-甲硫基丁酸的方法：寄存号为ATCC8750的粪产碱杆菌、寄存号为FERM BP-3857的红球菌sp.HT29-7、寄存号为FERM BP-4535的Gordona terrae MA-1。
根据本发明的方法，这种微生物可以原样使用或固定在本领域技术人员熟知的载体上使用。
另外，这种酶编码的遗传信息可以从母体微生物(如粪产碱杆菌ATCC8750等)转移到如枯草杆菌之类的微生物上。
本发明方法的一种实施方式是使用相应量的自由的或固定的酶代替微生物，这种酶完全地或部分地已被纯化。
在α取代的4-甲硫基丁腈中，使用4-甲硫基-2-羟基丁腈更可取，所述的4-甲硫基-2-羟基丁腈能够制备外消旋的蛋氨酸羟基类似物。这种蛋氨酸衍生物的制备技术能够避免生成大量的无机副产物，由于涉及到环境保护的限制，排放这些副产物越来越成问题。
在本发明的范围内，这些酶在pH为4-11时具有腈水解酶的活性，pH为5-9时其活性最大。最佳使用温度是30-60℃，不过在30-50℃使用这些酶更好。
在原料溶液中，腈的可取浓度为每升10-400毫摩尔，优选的是每升50-200毫摩尔。得到的酸的铵盐浓度在其浓度低于每升2摩尔时，优选的是每升0.1-1.5摩尔时不太影响这种酶的活性。
可通过下述的实施例更完整地说明本发明，这些实施例不应看作是对本发明的限制。实施例1
在下述的介质中培养粪产碱杆菌ATCC8750微生物：
乙酸铵              10克/升
酵母提取物          5克/升
胨                 5克/升
K2HPO4          5克/升
MgSO4·7H2O     0.2克/升
FeSO4·7H2O     30毫克/升
NaCl               1克/升
苯基氰             0.5克/升
pH7.2
在2升装600毫升这种介质的锥瓶中于30℃进行所述的培养。整个溶液以每分钟150转搅拌30小时。回收细胞沉淀物，用9克/升氯化钠溶液洗涤，然后冷冻。
丁腈水解的操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈     50mM
细胞                    5毫克/毫升
磷酸盐缓冲液            200mM
温度                    30℃
时间                    4小时
4-甲硫基-2-羟基丁腈水解动力学研究表明，线性生成每小时每毫克干细胞2.8微摩尔蛋氨酸羟基类似物。生成的酸的对映体过量是用液相色谱测定的，酸的产率为80％时，其对映体过量是0％。实施例2
根据用自由的细胞在180小时生成蛋氨酸羟基类似物的动力学评价酶的稳定性。
这些操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈    100mM
细胞                   10毫克/毫升
磷酸盐缓冲液300mM  5毫升
温度                   25℃
在排干后接着加100mM腈。生成相应的酸列于表1：
    时间     生成的酸     活性
   小时     mM/升  微摩尔/小时·毫克干细胞
    0217244770172180     039230312466556860940     01.71.31.71.20.40.60.6
起始活性是每小时每毫克干细胞2微摩尔。尽管酸的浓度很高(0.9M蛋氨酸羟基类似物)，但这个实施例仍证明了酶的稳定性。实施例3
在下述条件下还测定了酶的稳定性随底物量和生成的酸量的变化：
酶的稳定性随底物量的变化
腈                            表中的结果
细胞                          10毫克/毫升
磷酸盐缓冲液300mMpH7.0      5毫升
温度                          25℃
时间                          1小时
   腈浓度mM             活性微摩尔/小时·毫克干细胞
    50100150200500     22220
酶的稳定性随生成酸量的变化关系操作条件如下：腈                             50mM细胞                           2.5毫克/毫升磷酸盐缓冲液100mMpH7.0      1毫升温度                           30时间                           2小时
   酸浓度mM            活性微摩尔/小时·毫克干细胞
    0100200300400500600700     3.24.53.84.1443.42.8
实施例4
腈水解酶的纯化
在实施例1描述的介质中于30℃培养粪产碱杆菌细胞24小时。
在离心分离培养物后，将沉淀物溶于所述的pH7.5缓冲液[25mMtrisHCl，10％(重量/体积)甘油]中。这种细胞悬浮液用超声波处理，然后离心得到粗提取物。再用最高为30％饱和度的硫酸铵处理这种粗提取物。得到的沉淀在pH7.5缓冲液中再制成悬浮液，然后对2升同样的缓冲液透析一夜。
然后，将得到的溶液放到预先用所述的pH7.5缓冲溶液平衡的QSepharose Fast Flow HR 26/10阴离子交换柱中。再用0-1摩尔梯度氯化钠溶液淋洗其活性物。
然后，将这些活性馏分放到预先用所述的pH7.5缓冲溶液平衡的MonoQ HR 5/5阴离子交换柱中。再用0-1摩尔梯度氯化钠溶液淋洗其腈水解酶。
为了完成其纯化，合并含有活性物的馏分，然后加1摩尔硫酸铵。将这种溶液放到预先用被加入1摩尔(NH4)2SO4的所述pH7.5缓冲溶液平衡的Phenyl Sepharose HR 5/5疏水相互作用柱中。再用1-0摩尔梯度硫酸铵溶液淋洗其活性物。
用凝胶过滤法测定其蛋白质的分子量。其分子量是约260kDa。在SDS-PAGE柱上，观察到唯一的43kDa带(纯度为95％)。
用粪产碱杆菌的腈水解酶将4-甲硫基-2-羟基丁腈水解成蛋氨酸羟基类似物的动力学是线性的。
   时间小时           活性微摩尔/小时·毫克蛋白质     RR％
    00.5121.524.829     0150171150150150     135687787
实施例5 pH的影响
操作条件如下：
腈                            50mM
蛋白质                        50微克/毫升
pH4-5、100mM乙酸盐缓冲液
pH6-7、100mM磷酸盐缓冲液      1毫升
pH8-9、100mMTRIS-HCl缓冲液
pH10-11、100mM硼酸盐缓冲液
温度                         30℃
时间                         1-2小时
   pH            活性微摩尔/小时·毫克蛋白质
    4567891011     0422322724054121580
实施例6  温度的影响
操作条件如下：
腈                           50mM
蛋白质                       50微克/毫升
pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液
温度                      4-60℃
时间                         1小时
这种酶最佳的作用温度是50℃
    温度℃             活性微摩尔/小时·毫克蛋白质
    41020     4567140
    30405060     272419570333
扁桃腈的对比实施例
操作条件如下：
扁桃腈                       7mM
蛋白质                       5微克/毫升
磷酸盐缓冲液100mM pH7.0    1毫升
温度                         30℃
    时间分           活性微摩尔/小时·毫克蛋白质     ee
    1560     10001030     11
因此，纯化的腈水解酶对这种扁桃腈是对映选择性的，而对4-甲硫基-2-羟基丁腈没有对映选择性。实施例7
用红球菌sp.HT 29-7 FERM BP-3857水解4-甲硫基-2-羟基丁腈
在下述介质中培养红球菌sp.HT-29-7 FERM BP-3857微生物：
甘油                      20克/升
酵母提取物(DIFCO)         3克/升
KH2PO4                  1克/升
Na2HPO4·12H2O         4.4克/升
Na2SO4                  2.8克/升
MgCl2·6H2O             0.85克/升
CaCl2·2H2O             0.05克/升
MnSO4·H2O               0.033克/升
FeSO4·7H2O              0.013克/升
ZnSO4·7H2O              0.005克/升
苯基氰                      0.5克/升
pH7.5
在2升装600毫升这种介质的锥瓶中于30℃进行培养。所有溶液均以每分钟150转搅拌140小时。回收细胞沉淀，用9克/升氯化钠溶液洗涤，然后冷冻。水解时pH的影响：操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈             100mM
660nm处光密度                   15
pH4-5、100mM乙酸盐缓冲液
pH6.0-7.0、100mM磷酸盐缓冲液   1毫升
pH8.0-9.0、100mMTRIS-HCl缓冲液
pH10.0-11.0、100mM硼酸盐缓冲液
温度                            30℃
时间                            10小时
    pH     酸的产率
    4567891011     0％100％100％100％100％100％20％0％
实施例8  底物浓度的影响
在下述条件下还测定了这种酶的稳定性随底物量的变化：
4-甲硫基-2-羟基丁腈                 见表中的结果
660nm处光密度                       20
pH7.0、300mM磷酸盐缓冲液           5毫升
温度                                30℃
时间                                2小时
    腈浓度mM     酸的产率
    50100200300400500     90％44％22％10％0％0％
实施例9  这种酶的稳定性随生成的酸量的变化操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈          100mM
660nm处光密度                15
pH7.0、300mM磷酸盐缓冲液    1毫升
温度                         30℃
时间                         6小时
   酸浓度mM     酸的产率
    0200     100％100％
    4006008001000     100％100％100％100％
实施例10  对映体过量
4-甲硫基-2-羟基丁腈           140mM
660nm处光密度                 14
pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液     1毫升
温度                          20℃
    培养时间     酸产率     光学纯度
    2小时6小时24小时     15％50％100％     000
4-甲硫基-2-羟基丁腈水解动力学研究表明，每小时每毫克干细胞线性生成蛋氨酸羟基类似物。生成的酸的对映体过量是用液相色谱法测定的，酸的产率为15-100％时，其对映体过量为0％。实施例11  温度的影响
操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈          100mM
660nm处光密度                15
pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液    1毫升
温度                         见表
时间                         6小时
    T(℃)     酸的产率
    1020     70％100％
    30405060     100％100％31％15％
实施例12  4-甲硫基-2-氨基丁腈的水解
操作条件如下：
4-甲硫基-2-羟基丁腈            23mM
660nm处光密度                  15
pH7.0、100mM磷酸盐缓冲液      1毫升
温度                           30℃
    时间(小时)     酸的产率   酸对映体过量
    0.5125     40％51％62％78％     未测定0.12未测定0.15
实施例13
Gordona terrae MA-1(FERM BP-4535)使用的培养条件如下：
甘油                     10克/升
酵母提取物               0.4克/升
KH2PO4                 6.8克/升
Na2HPO4·12H2O        7.1克/升
Na2SO4                 2.8克/升
MgCl2·6H2O            0.4克/升
CaCl2·2H2O            40毫克/升
MnSO4·H2O             4毫克/升
FeCl3                   0.6毫克/升
ZnSO4                 0.3毫克/升
苯基氰                 0.5克/升
pH7.2
酶的活性
然后，洗涤培养的细胞，在羟基甲硫基丁腈存在下进行活性物数量测定。
操作条件如下：
[腈]＝23mM；
[细胞]＝6.8克/升；
100mM磷酸盐缓冲液
pH7.0；35℃图3：用Gordona terrae MA-1水解AMTP的氰醇
羟基甲硫基丁腈水解动力学是线性的。起始速度估计为13mM/小时。克干细胞。实施例14  AMTP氰醇浓度对腈水解酶的影响
测定了羟基甲硫基丁腈起始浓度对腈水解酶活性的影响，这些结果列于下表中。操作条件如下：
[细胞]＝5.1克/升
100mM磷酸盐缓冲液
pH7.0；35℃
测定了在0.5、1、2和3小时的动力学。
    腈浓度mM           活性mM/小时，克干细胞
    50100200     141315
    300400     00
直到200mM，其活性不太随底物的浓度改变。实施例15  蛋氨酸羟基类似物浓度对腈水解酶的影响
在这个试验中，我们研究了4-羟基-2-甲硫基丁酸铵浓度对腈水解酶活性的影响。其操作条件如下：
[细胞]＝5克/升；
[腈]＝100mM；
100mM磷酸盐缓冲液；pH7.0；
35℃
羧酸铵的浓度为0-1.5M。
    酸浓度摩尔/升            活性微摩尔/小时.毫克干细胞
    00.511.5     9.4141915
4-羟基-2-甲硫基丁酸铵浓度根本不改变Gordona terraeHT 29-7菌株腈水解酶的起始活性。实施例16  pH和温度的影响
操作条件如下：
[腈]＝100mM；
[细胞]＝7.5克/升；
pH4-5、100mM乙酸盐缓冲液
pH6-7、100mM磷酸盐缓冲液
pH8-9、100mMTRIS-HCl缓冲液
pH10-11、100mM硼酸盐缓冲液
30℃；测定了在1、2、4和6小时的动力学。
    pH             活性微摩尔/小时.克干细胞
    4567891011     0.62.57.89.615.3185.711
最佳pH在我们的操作条件下处在8-9附近。温度对Gordona terraeMA-1的腈水解酶活性的影响。操作条件如下：
[腈]＝100mM；
[细胞]＝7.5克/升；
100mM磷酸盐缓冲液；pH7.0；
测定在1小时的动力学。
    T℃           活性微摩尔/小时.克干细胞
    10203040     0.62.33.23.4
    5060     3.51.9
最佳温度在40-50℃。

Claims (9)

1、外消旋的α取代4-甲硫基丁酸的制备方法，其特征在于用选自粪产碱杆菌、红球菌sp.HT-29-7或Gordona terrae的腈水解酶水解外消旋的α取代4-甲硫基丁腈。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于外消旋的取代4-甲硫基丁腈是4-甲硫基-2-羟基丁腈。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于其介质的pH是4-11，优选的是5-9。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于水解温度是30-60℃，优选的是30-50℃。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于在起始溶液中α取代4-甲硫基丁腈的浓度是每升10-400mM，优选的是每升50-200mM。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于溶液中α取代4-甲硫基丁酸的浓度是每升10-2000mM，优选的是每升100-1500mM。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用产碱杆菌属微生物腈水解酶。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用红球菌属微生物腈水解酶。
9、根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用Gordona菌属微生物腈水解酶。
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