CZ84497A3

CZ84497A3 - Process for preparing racemic alpha-substituted 4-methylthiobutyric acids

Info

Publication number: CZ84497A3
Application number: CZ97844A
Authority: CZ
Inventors: Olivier Favre-Bulle; Marie Claude Bontoux; Denis Largeau; Andre Ariagno
Original assignee: Rhone Poulenc Nutrition Animal
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1997-06-11
Also published as: UA48953C2; PL180871B1; NZ292559A; FI971198A; KR970706401A; HU220860B1; JPH10507631A; BR9509176A; SK281956B6; AU699625B2; DE69506430T2; PL319298A1; CN1158640A; WO1996009403A1; DE69506430D1; EP0782629B1; AU3476495A; CN1077599C; US5814497A; DK0782629T3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití nitrilázy jako hydrolyzního katalyzátoru pro hydrolýzu nitrilové skupiny na karboxylovou skupinu. Vynález se přesněji týká použití nitrilázy zvolené z množiny zahrnující nitrilázy mikroorganizmů rodu Alcaligenes, Rhodococcus a Gordona a přesněji mikroorganismu Alcaligenes faecalis uloženého pod číslem ATCC8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslem FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslem FERM BP-4535.

Dosavadní stav techniky

Nitriláza z Alcaligenes faecalis je popsána například v evropském patentu EP 348901 a v japonském patentu JP 03 224 496, přičemž oba tyto patenty patří společnosti Asahi.

V těchto patentových dokumentech a zejména v evropském patentovém dokumentu je popsáno použití nitrilázy pro přípravu opticky aktivních kyselin z racemických nitrilů. Výhodnými výchozími nitrily jsou alfa-substituované nitrily, které mají alkylový řetězec obsahující výhodně 1 až 3 uhlíkové atomy nebo aromatickou skupinu. Příklad 11 výše uvedeného evropského patentu popisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandlové působením mikroorganizmu Alcaligenes faecalis, přičemž kyselina R-(-)-mandlová se získá v enantiomerním přebytku 91 %. Evropský patent 486289 a jeho americký ekvivalent,patent US 5 326 702 společnosti Nitto Chemical popisují použití mikroorganizmu Alcaligenes sp. BC35-2 (FERM č.11265 nebo FERMBP-3318) pro hydrolýzu nitrilu kyseliny mandlové v přítomnosti siřičitanu, přičemž kyselina mandlová se v tomto případě získá v enantiomerním přebytku 98 %.

Patent JP 04 341 185 společnosti Asahi ještě popisuje přípravu a použití nitrilázy z Alcaligenes faecalis ATCC 8750 pro řešení problémů přípravy opticky čistých sloučenin z jejich racemických nitrilu. Enantioselektivní nitriláza popsaná ve výše uvedeném japonském patentu je schopna preferenčně hydrolyzovat dále uvedený 2-hydroxynitril obecného vzorce I na kyselinu 2-hydroxykarboxylovou následujícího obecného vzor ce II

OH

R-C-CN (I) i

H

OH . I

R —C—COOH (||)

H přičemž v uvedených obecných vzorcích I a II R znamená arylovou skupinu, která je případně substituována, nebo případně substituovanou heterocyklickou skupinu. V uvedeném patentu je uvedeno, že hydrolýza nitrilu kyseliny mandlové umožňuje získat kyselinu R-(-)-mandlovou v enantiomerním přebytku 100 %.

V příkladu 5 je uvedeno, že uvedená nitriláza může být použita pro hydrolýzu alifatických nitrilů, jakými jsou například valeronitril, akrylonitril, 2-halogenpropionitrily a chloracetonitril. Pokud je o enantioselektivitu této hydrolýzy,týkájící se alifatických nitrilů majících asymetrické centrum, není zde uvedeno nic přesného.

Tento text také uvádí, že nitriláza z Alcaligenes faecalis má optimální účinnost při hodnotě pH v rozmezí od 6,5 do 8,0, přičemž teplota musí být při použití uvedeného enzymu podle tohoto odkazu vždy nižší než 45 °C.

Ukázalo se zcela překvapivě, že uvedený enzym z Alcaligenes faecalis ATCC 8750 v případě, kdy je použit pro hydrolýzu 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje uvedenou hydrolýzu bez jakékoliv selektivity, pokud jde o optickou čistotu. Tento enzym hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemické směsi obou kyselin a to bez jakékoliv převahy jednoho či druhého z izomerů.

Nitriláza z Rhodococcus sp. HT 29-7 uložená pod číslem FERM BP-3857 je popsána například v evropském patentu EP 610

049 a americkém patentu US 5 296 373, přičemž oba tyto patenty patří společnosti Nitto.

V těchto patentech a zejména v americkém patentu je popsáno použití nitrilázy pro přípravu opticky aktivních kyselin z racemických nitrilů nesoucích fenylovou skupinu. Všechny výchozí nitrily obsahují aromatickou skupinu, přičemž se v podstatě jedná o hydrolýzu nitrilu kyseliny mandlové nebo jeho derivátů substituovaných na aromatickém jádře. Příklad 1 amerického patentu US 5 296 373 popisuje hydrolýzu racemického nitrilu kyseliny mandlové působením Rhodococcus sp. HT 29-7, při které se získá kyselina R-(-)-mandlová v enantiomerním přebytku 100 %. Příklad 2 popisuje hydrolýzu derivátů nitrilu kyseliny mandlové substituovaných na jádře, přičemž i v tomto případě činí enantiomerní přebytek získané kyseliny mandlové 100 %. Stejně je tomu i v případě, kdy se provede hydrolýza nitrilů benzaldehydu.

Evropský patent 610 049 společnosti Nitto Chemical popisuje použití mikroorganismu Rhodococcus sp. HT 29-7 (FERM BP-3857), Alcaligenes sp.BC35-2 (FERM BP-3318) nebo Brevibacterium acetylicum IAM 1790 pro hydrolýzu alfa-hydroxy-nitrilů substituovaných v poloze gama aromatickým jádrem za vzniku opticky aktivní alfa-hydroxykarboxylové kyseliny substituované fenylovou skupinou. Kyseliny získané za použití Rhodococcus sp. HT 29-7 mají vždy proměnlivý enantiomerní přebytek, který je v kadém konkrétním případě závislý na výchozím nitrilu a na přítomnosti nebo nepřítomnosti kyseliny fosforečné (hodnota pH nastavená na asi 8,2).

Ukázalo se zcela překvapivě, že uvedený enzym v případě, kdy je použit pro hydrolýzu 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje tuto hydrolýzu bez jakékoliv selektivity z hlediska enantiomerní čistoty. Tento enzym hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemické směsi obou kyselin bez jakékoliv převady jednoho či druhého z izomerů.

Nitriláza z Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslem FERM BP-4335 je popsána v evropském patentu 0 610 048 pro hydrolýzu nitrilů nesoucích v poloze gama fenylovou skupinu a v poloze alfa hydroxy-skupinu na odpovídající opticky aktivní kyselinu. Enantiomerní přebytek se ve všech příkladech pohybuje mezi 92 a 100 %.

Ukázalo se zcela překvapivě, že uvedený enzym z Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslem FERM BP-4535 v případě, že je použit pro hydrolýzu 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu, realizuje tutu hydrolýzu bez jakékoliv selektivity z hlediska enantiomerní čistoty. Tento enzym hydrolyzuje uvedený nitril za vzniku racemické směsi obou kyselin bez jakékoliv převahy jednoho či druhého z izomerů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je tudíž způsob přípravy racemických alfa-substituovaných kyselin 4-methylthio máselných hydrolýzou racemických alfa-substituovaných 4-methylthiobutyronitrilů působením nitrilázy jednoho z následujících mikroorganizmů: Alkaligenes faecalis uloženého pod číslem ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 uloženého pod číslem FERM BP-3857 a Gordona terrae MA-1 uloženého pod číslem FERM BP-4535.

V rámci vynálezu může být mikroorganismus použit jako takový nebo imobilizován na o sobě známých nosičích.

Jinak může být genetická informace, která kóduje uvedený enzym, transfekována z rodičovského mikroorganismu (jakým je A.faecalis ATCC 8750...) do mikroorganismu, jakým je Bacillus subtilis.

Variantní provedení způsobu podle vynálezu spočívá v tom, že se namísto mikroorganizmu použije v odpovídajícím množství jeho volný nebo imobilizovaný enzym, který je zcela nebo částečně vyčištěn.

Z alfa-substituovaných 4-methylthiobutyronitrilů je výhodné použít 4-methylthio-2-hydroxybutyronitril, který umožňuje připravit hydroxy-analog racemického methioninu. Tato technologie přípravy derivátů methioninu umožňuje eliminovat tvorbu minerálních vedlejších produktů ve velkém množství, jejichž likvidace je čím dál tím více obtížná vzhledem k ochraně životního prostředí.

Uvedené enzymy vykazují v rámci vynálezu nitrilační účinnost v oblasti pH v rozmezí od 4 do 11, přičemž optimální účinnost vykazují v rozmezí pH od 5 do 9. Jejich optimální aplikační teplota se pohybuje mezi 30 a 60 °C, přičemž je nicméně výhodné použít teplotu mezi 30 a 50 °C.

Výhodně se pracuje s koncentrací nitrilů ve výchozím roztoku pohybující se mezi 20 a 400 moly na litr, výhodně mezi 50 a 200 mmoly na litr. Koncentrace amonné soli získané kyseliny má jen velmi malý vliv na účinnost enzymu v případě, že je nižší než 2 moly na litr a když výhodně leží v rozmezí mezi 0,1 a 1,5 molu na litr.

V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen formulací definice patentových nároků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Mikroorganismus Alcaligenes faecalis ATCC 8750 se kultivuje v následujícím prostředí:

octan amonný 10 g/1 kvasničný extrakt 5 g/1 pepton 5 g/1

K₂HPO₄ 5 g/1

MgSO₄.7H₂O 0,2 g/1

FeSO₄.7H₂O 30 mg/1

NaCl 1 g/1 benzonitril 0,5 g/1 pH 7,2.

Kultivace se provádí při teplotě 30 °C v Erlenmeyerových baňkách o obsahu 2 litrů obsahujících 600 ml uvedeného kultivačního prostředí. Veškerý podíl se míchá při 150 otáčkách za minutu po dobu 30 minut. Izoluje se buněčný pevný podíl, který se promyje roztokem chloridu sodného s koncentrací 9 g/1 a potom zmrazí.

Pracovní podmínky pro hydrolýzu butyronitrilu:

4-methylthio-2-hydroxybutyronitrii	50 mM
buňky	5 mg/ml
fosfátový pufr	200 mM
teplota	30 °C
doba	4 hodiny.

Kinetická studie hydrolýzy 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu ukazuje, že dochází k lineární produkci 2,8/Umolu hydroxy-analogu methioninu za hodinu a na miligram buněčné sušiny. Enantiomerní přebytek získané kyseliny, který byl stanoven kapalinovou chromatografií, je roven 0 % při výtěžku kyseliny 80 %.

Příklad 2

Sledováním kinetiky produkce hydroxy-analogu methioninu po dobu 180 hodin za použití volných buněk se vyhodnotí stabilita enzymu.

Použijí se následující pracovní podmínky:
4-methylthio-2-hydroxybutyronitril	100	mM
buňky	10	mg/ml
300mM fosfátový pufr	5	ml
teplota	25	°C.

Nitril se přidává postupně ve množství 100 mmolů vždy po jeho vyčerpání. Tvorba odpovídající kyseliny je patrná z následující tabulky I:

Čas	Vytvořená kyselina (mmoly/litre)	Účinnost (.moly/h.mg buněčné ' sušiny)
0	0	0
2 h	39	1,7
17 h	230	1,3
24 h	312	1,7
47 h	466	1,2
70 h	556	0,4
172 h	860	0,6
180 h	940	0,6

Výchozí účinnost je rovna 2/Umolům/h.mg buněčné sušiny. Tento příklad demonstruje stabilitu enzymu i přes vysoké koncentrace kyseliny (0,9 molu hydroxy-analogu methioninu)

Příklad 3

Rovněž byla stanovena za následujících podmínek stabilita enzymu v závislosti na množství substrátu a na množství vytvořené kyseliny.

Stabilita enzymu v závislosti na množství substrátu

Nitril viz následující tabulka buňky 10 mg/ml

300mM fosfátový pufr, pří 7,0 5 ml teplota 25 °C doba 1 hodina

Koncentrace nitrilu (mM)

Účinnost umoly/h.mg buněčné sušiny)

100

Tabulka (pokračování)

150	2
200	2
500	0

Stabilita enzymu v závislosti na množství vytvořené kyše
Pracovní podmínky:
nitril	50 mM
buňky	2,5 mg/ml
100 mM fosfátový pufr, pH 7,0	1 ml
teplota	30 °C
doba	2 hodiny.

Koncentrace kyseliny	Účinnost
(mM)	(/moly/h.mg buněčné sušiny)
0	3,2
100	4,5
200	3,8
300	4,1
400	4
500	4
600	3,4
700	2,8

Příklad 4

Purifikace nitrilázy

Buňky Alcaligenes faecalis se kultivují 24 hodin při teplotě 30 °C v kultivačním prostředí popsaném v příkladu 1.

Po odstředění kultury se buněčná peleta vyjme pufrem s pH 7,5 (25 mM Tris-HCl, 10 % (hni./obj.) glycerolu). Získaná buněčná suspenze se zpracuje ultrazvukem a potom odstředí za účelem získání surového extraktu. Tento surový extrakt se potom zpracuje síranem amonným až do 30% nasycení. Získaná sraženina se resuspenduje v pufru s pH 7,5 a potom dialyzuje proti 2 litrům stejného pufru v průběhu noci. Získaný roztok se potom zavede na sloupec aniontóměničové pryskyřice Q Sephadex Fast Flow HR 26/10, která byla předtím uvedena do rovnovážného stavu s pufrem s pH 7,5. Aktivní podíl se potom eluuje za použití elučního gradientu od 0 do 1M NaCl. Aktivní frakce se potom zavedou na aniontoměničovou pryskyřici Mon® Q HR R/R, která byla předběžná uvedena do rovnovážného stavu s pufrem s pH 7,5. Nitriláza se eluuje pomocí elučního gradientu 0 až lM'.’NaCl Nakonec se frakce vykazující účinnost sloučí, načež se přidá 1 M síranu amonného. Tento roztok se potom zavede na hydrofobní interakční sloupec pryskyřice Phenyí sepharose HR 5/5, která byla předběžně uvedena do rovnovážného stavu s pufrem s pH 7,5, ke kterému byl přidán 1 M síranu amonného.

Gelovou filtrací se stanoví molekulová hmotnost proteinu. Činí asi 260 kDa. Na gelu SDS-PAGE lze pozorovat jediný pás s 43 kDa (čistota 95 %).

Kinetika hydrolýzy 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu na hydroxy-analog methioninu působením nitrilázy mikroorganizmu A.faecalis je lineární.

Čas	Účinnost (/umoly/h.mg buň.suš.)	RR (%)
0	0	1
0,5	150	3
1	171	5
21,5	150	68
24,8	150	77
29	150	87

Příklad 5

Vliv hodnoty pH

Pracovní podmínky:

nitril protein

100mM acetátový pufr s pH 4 až 5 100mM fosfátový pufr s pH 6 až 7 100 mM Tris-HCl-pufr s pH 8 až 9 100mM boritanový pufr s pH 10 až 11 teplota doba mM 50/Ug/ml ml °C + až 2 hodiny.

pH	Účinnost (/umoly/h.mg proteinu)
4	0
5	42
6	232
7	272
8	405
9	412
10	158
1 1	0

Příklad 6

Vliv teploty

Pracovní podmínky:

nitril protein fosfátový pufr 100 mM,pH 7,0 proměnlivé teploty doba mM 50/ug/ml od 4 °C do 60 °C 1 hodina.

Optimální teplota pro funkci enzymu činí 50

C.

1

Teplota (°C)	Účinnost (/Umoly/h.mg proteinu)
4	45
10	67
20	140
30	272
40	419
50	570
60	333

Srovnávací příklad za použití nitrilu kyseliny mandlové
Pracovní podmínky:
nitril kyseliny mandlové	7 mM
protein	5/Ug/ml
100mM fosfátový pufr, pH 7,0	1 ml
teplota	30 °C.

Čas (min)	Účinnost (/umoly/h.mg proteinu)	ee
15	1000	1
60	1030	1

Purifikovaná nitriláza je tedy enantioselektivní pro nitril kyseliny mandlové, avšak nikoliv pro 4-methylthio-2-hydroxy butyronitril.

Příklad 7

Hydrolýza 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu za použití mikroorganismu Rhodococcus HT 29-7 FERM BP-3857.

Mikroorganismus Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM
se kultivuje v následujícím kultivačním	prostředí:
glycerol	20 g/1
kvasničný extrakt (Difco)	3 g/1
KH-PO. 2 4	1 g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	4,4 g/1
Na-SO. 2 4	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,85 g/1
CaCl₂.2H₂O	0,05 g/1
MnSO.. H_O 4 2	0,033 g/1
FeSO..7H_O 4 2	0,013 g/1
ZnSO.. 7H~O 4 2	0,005 g/1
benzonitril	0,5 g/1
pH 7,5.	.. o_ _ .

vých baňkách o obsahu 2 litrů obsahujících 600 ml kultivačního prostředí. Veškerý podíl se míchá při 150 otáčkách za minutu po dobu 140 hodin. Buněčná peleta se izoluje, načež se promyje vodným roztokem NaCl o koncentraci 9 g/1 a potom zmra Z1 .

Vliv hodnoty pH na hydrolýzu

Pracovní podmínky:

4-methylthio-2-hydroxybutyronitril optická hustota při 660 nm 100mM acetátový pufr s pH 4 až 5 100mM fosfátový pufr s pří 6,0 aŽ 7,0 100mM Tris-HCl-pufr s pH 8,0 až 9,0 100mM boritanový pufr s pH 10,0 až 11,0 teplota doba 10 hodin.

100 mM 15 ml °c pH

Výtěžek kyseliny (%)

100

Tabulka (pokračování)

6	100
7	100
8	100
9	100
10	20
1 1	0
Příklad 8 Vliv koncentrace substrátu
Za následujících podmínek byla také stanovena stab:
ta enzymu v závislosti na množství Pracovní podmínky:	substrátu.
4-methylthio-2-hydroxybutyronítrii	viz následující tabulka
optická hustota při 660 nm	20
300mM fosfátový pufr, pH 7,0	5 ml
teplota	30 °C
doba	2 hodiny.
Koncentrace nitrilu	Výtěžek kyseliny
(mM)	(%)
50	90
100	44
200	22
300	10
400	0
500	0

Příklad 9

Stabilita enzymu v závislosti na množství vytvořené kyseliny

Pracovní podmínky:
4-methylthio-2-hydroxybutyronitril	100	mM
optická hustota při 660 nm	15
lOOmM fosfátový pufr, pH 7,0	1	ml
teplota	30	°C
doba	6	hodin

Koncentrace kyseliny (mM)

200

400

600

800

1000

Výtěžek kyseliny (%)

100

Příklad 10

Enantiomerní přebytek

Pracovní podmínky:

4-methylthio-2-hydroxybutyronitril 140 mM optická hustota při 660 nm 14

100mM fosfátový pufr, pH 7,0 teplota 20 °C

Inkubační doba	Výtěžek kyseliny	Optická	čistota
(h)	(%)
2	15		0
6	50		0
24	100		0

Studium kinetiky hydrolýzy 4-methylthio-2-hydroxybutyronitrilu ukazuje lineární produkci hydroxy-analogu methio ninu za hodinu a na mg buněčné sušiny. Enantiomerní přebytek vytvořené kyseliny byl měřen kapalinovou chromatografií, při čemž bylo stanoveno, že činí 0 % pro výtěžek kyseliny měnící se mezi 15 a 100 %.

Příklad 11

Vliv teploty

Pracovní podmínky:

4-methylthio-2-hydroxybutyronitril	100 mM
optická hustota při 660 nm	15
100mM fosfátový pufr, pH 7,0	1 ml
teplota	viz tabulka
doba	6 hodin.

Teplota (°C)	Výtěžek kyseliny (%)
10	70
20	100
30	100
40	100
50	31
60	15

Příklad 12 Hydrolýza 4-methylthio-2-aminobutyronitrilu
Pracovní podmínky: 4-methylthio-2-hydroxybutyronitril optická hustota při 660 nm 100mM fosfátový pufr, pH 7,0 teplota	23 mM 15
1 30	ml °C
Čas Výtěžek kyseliny (h) (%)	Enantiomerní přebytek kyseliny

0,5 40 nestanoven i

Tabulka (pokračování)

51 0,12

62 nestanoven

78 0,15

Příklad 13

Pro kultivaci mikroorganismu Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) se použije kultivační prostředí mající následující složení:

glycerol	10 g/1
kvasničný extrakt	0,4 g/1
k₂hpo₄	6,8 g/1
Na₂HPO₄.12H₂O	7,1 g/1
Na₂SO₄	2,8 g/1
MgCl₂.6H₂O	0,4 g/1
CaCl₂.2H₂O	40 mg/1
MnSO₄.H₂O	4 mg/ml
FeCl₃	0,6 mg/1
ZnSC>₄	0,3 mg/1
benzonitril	0,5 g/1
pH 7,2.
Účinnost enzymu
Kultivované buňky se po	promytí uvedou do styku s
droxymethylthiobutyronitrilem	za účelem stanovení jejich
účinnosti.
Pracovní podmínky:
nitril	23 mM
buňky	6,8 g/1
100mM fosfátový pufr
teplota	35 °C

i pH 7,0.

Hydrolýza AMTP-kyanhydrinu za použití mikroorganismu Gordona terrae MA-1

Kinetika hydrolýzy hydroxymethylthiobutyronitrilu má lineární charakter. Počáteční rychlost činí 13 mmolú/h.g bu něčné sušiny.

Příklad 14

Vliv koncentrace AMPT-kyanhydrinu na účinnost nitrilázy.

Výsledky stanovení vlivu výchozí koncentrace hydroxy methylthiobutyronitrilu na účinnost nitrilázy jsou uvedeny v následující tabulce.

Pracovní podmínky:

buňky 5,1 g/1

100mM fosfátový pufr teplota 35 °C pH 7,0.

Sledování kinetiky bylo provedeno v časových úsecích 0,5, 1 2 a 3 hodin

Koncentrace nitrilu (mM)	Účinnost (mmoly/h.g buněčné sušin;
50	14
100	13
200	15
300	0
400	0

Až do koncentrace nitrilu 200 mM se účinnost v závislosti na koncentraci substrátu mění jen velmi málo.

Příklad 15

Vliv koncentrace hydroxy-analogu methioninu na účinnost ni- » trilázy

V rámci tohoto příkladu byl studován vliv koncentrace 4-hydroxy-2-methlthiobutanoátu amonného na účinnost nitrilázy. Pracovní podmínky:

buňky 5 g/1 nitril 100 mM

100mM fosfátový pufr, pH 7,0 teplota 35 °C.

Koncentrace karboxylátu amonného se mění mezi 0 a 1,5 M.

Koncentrace kyseliny	Účinnost
(mol/1)	(/umol/h.mg buněčné sušiny)
0	9,4
0,5	14
1	19
1,5	15

Koncentrace 4-hydroxy-2-methylthiobutanoátu amonného nikterak neovlivňuje výchozí účinnost kmene Gordona terrae HT 29-7.

Příklad 16

Vliv hodnoty pH a teploty Pracovní podmínky: nitril 100 mM buňky 7,5 g/1

100mM acetátový pufr s pH 4 až 5 100mM fosfátový pufr s pH 6 až 7 100mM Tris-HCl-pufr s pH 8,9 100 mM boritanový pufr s pH 10 až teplota 30 °C.

Sledování kinetiky bylo provedeno v časových úsecích 1, 2, 4 a 6 hodin.

PH	Účinnost
(mmol)h.g buněčné sušiny)
4	0,6
5	2,5
6	7,8
7	9,6
8	15,3
9	18
10	5,7
11	1 1
Při použitých	pracovních podmínkách se optimální pH
pohybuje v blízkosti	pH 8 až 9.
Vliv teploty na účinnost nitrilázy mikroorganismu Gordona terrae MA-1 Pracovní podmínky:
nitril	10 mM
buňky	7,5 g/1
100mM fosfátový pufr,	pH 7,0
sledování kinetiky v	časovém úseku 1 hodiny.
Teplota	Účinnost
(°C)	(mmol/h.g buněčné sušiny)
10	0,6
20	2,3
30	3,2
40	3,4
50	3,5
60	1,9
Optimální teplota se	pohybuje v blízkosti 40 až 50 °C.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 . Způsob přípravy racemických alfa-substituovaných 4methylthiomáselných kyselin, vyznačený tím, že se racemické alfa-substituované 4-methylthiobutyronitrily hydrolyzují nitrilázou zvolenou z množiny zahrnující nitrilázy mikroorganizmů Alcaligenes faecalis ATCC-8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 a Gordona terrae FERM BP4535.
2. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že racemickým alfa-substituovaným 4-methylthiobutyronitrilem je 4-methylthio-2-hydroxybutyronitril.
3. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se pH prostředí pohybuje mezi 4 a 11, výhodně mezi 5 a 9.
4. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se hydrolyzní teplota pohybuje mezi 30 a 60 °C, výhodně mezi 30 a 50 °C.
5. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se koncentrace alfa-substituovaného 4-methylthiobutyronitrilu ve výchozím roztoku pohybuje mezi 10 a 400 mmoly, výhodně mezi 50 a 200 mmoly na litr.
6. Způsob podle nároku 1,vyznačený tím, že se koncentrace alfa-substituované 4-methylthiomáselné kyseliny v roztoku pohybuje mezi 10 a 2000 mmoly, výhodně mezi 100 a 1500 mmoly na litr.

Zastupuje :