JPH10507631A

JPH10507631A - ４−メチルチオブチロニトリルの酵素による加水分解

Info

Publication number: JPH10507631A
Application number: JP8510644A
Authority: JP
Inventors: オリビエフアブル−ビユル，; マリー−クロードボントウ，; デニラルジヨ，; アンドレアリアグノ，
Original assignee: ローン−プーラン・ニユトリシヨン・アニマル
Priority date: 1994-09-22
Filing date: 1995-09-19
Publication date: 1998-07-28
Also published as: HUT77079A; PL319298A1; DE69506430D1; DE69506430T2; EP0782629B1; CN1077599C; BR9509176A; PL180871B1; SK281956B6; DK0782629T3; FI971198A0; CZ84497A3; CN1158640A; AU699625B2; US5814497A; EP0782629A1; AU3476495A; KR100398595B1; ATE174059T1; UA48953C2

Abstract

(57)【要約】本発明は、アルカリゲネス・フェカリス、ロドコッカス・エスピー HT29-7又はゴルドナ・テルレのニトリル分解酵素を使用する、4-メチルチオブチロニトリルの、ラセミ体4-メチルチオ酪酸への酵素による加水分解の新規な方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】４−メチルチオブチロニトリルの酵素による加水分解本発明はニトリル基をカルボキシル基に加水分解するための触媒としての、ニトリル分解酵素の使用に関する。本発明はより詳細には、アルカリゲネス（Alca ligenes）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属又はゴルドナ（Gorodona）属の、そしてより詳細にはATCC 8750として出願されたアルカリゲネス・フェカリス（A lcaligens faecalis）、FERM BP-3857として寄託されたロドコッカス・エスピー（Phodococcus sp.）HT29-7又はFERM BP-4535として寄託されたゴルドナ・テルレ（Gordona terrae）MA-1の微生物のニトリル分解酵素から選ばれる、ニトリル分解酵素の使用に関する。アルカリゲネス・フェカリスのニトリル分解酵素は例えば、両者ともアサヒ・カンパニーに属する、それぞれ欧州特許第348,901号及び特開平3-224 496号公報に公開された欧州及び日本特許明細書に記載されている。これらの特許において、そしてより具体的には該欧州特許において、ニトリル分解酵素がラセミ体ニトリルから光学活性の酸を生成するために使用されている。好ましい出発ニトリルはα−置換体であって、好ましくは１から３個の炭素原子を含有するアルキル鎖又は芳香族基を含有する。前記の欧州特許明細書の実施例１１は、アルカリゲネス・フェカリスによるラセミ体マンデロニトリルの加水分解につき記載している；R-(-)-マンデル酸は９１％のエナンチオマー過剰率で得られる。ニットー・ケミカル社からの、欧州特許第486,289号及びその等価物の米国特許第5,326,702号明細書は、亜硫酸塩の存在下においてマンデロニトリルを加水分解するためのアルカリゲネス・エスピー BC35-2（FERM No．11265 又はFERM-BP-3318）の使用につき記載している；この場合、マンデル酸は約９８％のエナンチオマー過剰率で得られる。アサヒ・カンパニーからの特開平4-341 185号公報はまた、それらのラセミ体ニトリルから光学的に純粋な化合物の製造の問題を解決するために、アルカリゲネス・フェカリス ATCC 8750からのニトリル分解酵素の製造及び使用につき記載している。前記の日本特許明細書中に記載のエナンチオ選択性ニトリル分解酵素は、より好ましくは、下記の一般式（Ｉ）の2-ヒドロキシニトリルを、下記の式（II）：［式中、Ｒは場合によっては置換されているアリール基又は場合によっては置換されている複素環基を表す］の2-ヒドロキシカルボン酸に加水分解させることができる。当該特許明細書中では、前記のニトリル分解酵素によるマンデル酸のニトリルの加水分解は、R-(-)- マンデル酸の１００％エナンチオマー過剰率をもたらすことができると記載されている。実施例５において、前記のニトリル分解酵素は、バレロニトリル、アクリロニトリル、2-ハロプロピオニトリル及びクロロアセトニトリルのような脂肪族ニトリルを加水分解させるために使用することができることが記載されている。不斉中心をもつ脂肪族ニトリルにおけるこの加水分解のエナンチオ選択性に関しては何も具体的に記載されていない。前記の文献はまたアルカリゲネス・フェカリスのニトリル分解酵素が６．５と８．０の間のｐＨにおいて至適活性をもち；前記の酵素の作用温度は当該文献によると常に４５℃未満でなければならないことを記載している。 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルを加水分解するために使用する際に、アルカリゲネス・フェカリス ATCC 8750の前記の酵素は、光学的純度の観点から、全く選択性なしにこの加水分解を実施したことは極めて驚くべきことに思われる。この酵素は前記のニトリルを加水分解して、どちらの異性体が優勢ということはなく、２種の酸のラセミ混合物を生成する。 FERM BP-3857として出願されたロドコッカス・エスピー HT 29-7のニトリル分解酵素は例えば、両者ともニットー社に属する、それぞれ欧州特許第610,049号及び米国特許第5,296,373号として公開された欧州及び米国特許明細書中に記載されている。これらの特許明細書において、そして特に当該米国特許明細書において、ニトリル分解酵素は、フェニル基をもつラセミ体ニトリルから光学活性の酸を生成するために使用されている。出発ニトリルはすべて芳香族基を含有する；これは本質的にマンデロニトリル又はその芳香族環上で置換されているその誘導体、の加水分解を伴う。前記の米国特許明細書の実施例１はロドコッカス・エスピー HT 29-7によるラセミ体マンデロニトリルの加水分解につき記載している；R-(-)-マンデル酸は１００％のエナンチオマー過剰率で得られる。実施例２は、環上で置換されたマンデロニトリル誘導体の加水分解につき記載している；マンデル酸誘導体のエナンチオマー過剰率はまた１００％でありそしてこれは、加水分解がベンズアルデヒドニトリルにつき実施される場合にも同様である。ニットー・ケミカル社からの欧州特許第610 049号明細書は、そのγ−位が芳香族環で置換されたα−ヒドロキシニトリルを、光学活性のフェニル基で置換されたα−ヒドロキシカルボン酸に加水分解させるための、ロドコッカス・エスピー HT 29-7（FERM BP-3857）、アルカリゲネス・エスピー BC35-2（FERM BP-331 8）又はブレビバクテリウム・アセチリクム（Brevibacterium acetylicum）IAM 1790の使用につき記載している。ロドコッカス・エスピー HT 29-7により得られた酸は常に、その出発ニトリル、及びリン酸（約８．２にｐＨを調整）の存在もしくは不在に応じて、種々のエナンチオマー過剰率を有する。 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルを加水分解させるために使用された場合、ロドコッカス・エスピー HT 29-7(FERM BP-3318)の前記の酵素が、この加水分解を全くエナンチオ選択性なしで実施したことは極めて驚くべきことに思われる。この酵素は前記のニトリルを加水分解して、どちらの異性体をも優勢にすることなく、２種の酸のラセミ混合物を生成する。 FERM BP-4535として出願されたゴルドナ・テルレ（Gordona terrae）MA-1のニトリル分解酵素は、欧州特許第0,610,048号明細書において、γ−フェニル基及びα−ヒドロキシ基をもつニトリルを、対応する光学活性の酸に加水分解することを記載している。そのエナンチオマー過剰率はすべての実施例において９２と１００％の間にある。 FERM BP-4535として出願されたゴルドナ・テルレ MA-1の前記の酵素は、4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルを加水分解させるために使用される場合、この加水分解をエナンチオ選択性なしに実施したことは極めて驚くべきことに思われる。この酵素は前記のニトリルを加水分解させ、どちらの異性体をも優勢にすることなく、２種の酸のラセミ混合物を生成する。従って本発明は、次の微生物：ATCC 8750として寄託されたアルカリゲネス・フェカリス、FERM BP-3857として寄託されたロドコッカス・エスピー HT 29-7又はFERM BP-4535として寄託されたゴルドナ・テルレ MA-1、のうちの１種類のニトリル分解酵素による、ラセミ体のα−置換4-メチルチオブチロニトリルの加水分解による、ラセミ体のα−置換４−メチルチオ酪酸の製造方法に関する。本発明の方法により、微生物をそのまま又は当該技術分野の専門家には周知の支持体で固定化して使用することができる。更に、酵素をコードする遺伝情報は親の微生物（アルカリゲネス・フェカリス ATCC 8750、等のような）から枯草菌（Bacillus subtilis）のような微生物に移すことができる。本発明の方法の一つの変法は、微生物の代わりに、相当量のその遊離もしくは固定化酵素（この酵素は全体的に又は部分的に精製されている）を使用することからなる。 α−置換された4-メチルチオブチロニトリルの中で、ラセミ体メチオニンのヒドロキシ誘導体を製造することを可能にする、4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルを使用することが好ましい。メチオニン誘導体のこの製造方法は、その廃棄が、環境保護の圧力のために、果てしなく増大する問題を引き起こす、大量の無機の副生成物の生成を回避することを可能にする。本発明に関しては、これらの酵素は４と１１の間のｐＨ領域でニトリル分解酵素活性を、そして５と９の間のｐＨで至適活性をもつ。それらの至適な作用温度は３０と６０℃の間である；しかし３０と５０℃の間の温度を使用することが好ましい。１０ mmol/lと４００ mmol/lの間の、そして好ましくは５０ mmol/lと２００ mmol/lの間の、出発溶液中のニトリルの濃度で作用させることが好ましい。得られた酸のアンモニウム塩の濃度は、それが２ mol/l未満であり、そして好ましくは０．１ mol/lと１．５ mol/lの間にある場合には、酵素の活性に殆ど影響を与えない。本発明は以下の実施例の補助により、より詳細に記載され、それは本発明を限定すると考えられるべきではない。実施例１微生物のアルカリゲネス・フェカリス ATCC 8750を下記の培地中で培養する：酢酸アンモニウム１０ g/l 酵母抽出物５ g/l ペプトン５ g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ g/l ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．２ g/l ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ３０ mg/l ＮａＣｌ１ g/l ベンゾニトリル０．５ g/l ｐＨ７．２培養は培地６００ ml含有の２リットル用円錐形フラスコ中で３０℃ で実施される。全体の混合物を３時間、１５０回転／分で撹拌する。細胞ペレットを回収し、９ g/lのＮａＣｌ溶液で洗浄し次いで凍結させる。ブチロニトリルを加水分解させる実施条件： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル５０ mM 細胞５ mg/ml リン酸塩バッファー２００ mM 温度３０ ℃ 期間４時間 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルの加水分解の速度論の研究により、１時間当たり及び乾燥細胞１ mg当たりのメチオニンのヒドロキシ誘導体２．８ μmolの直線的生成が示される。生成された酸のエナンチオマー過剰率は液体クロマトグラフィーにより測定された；それは８０％の酸の収率に対して０％に等しい。実施例２酵素の安定性を、遊離細胞を用いて１８０時間にわたり、メチオニンのヒドロキシ誘導体生成の速度論により評価した。実施条件は下記である： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル１００ mM 細胞１０ mg/ml リン酸塩バッファー３００ mM ５ ml 温度２５ ℃ 分離後、ニトリル１００ mmolの添加によりニトリルを連続的に添加する。対応する酸の生成は表Ｉに示す。初回の活性は２ μmol/h・乾燥細胞1mgである。この実施例は高濃度の酸の存在にもかかわらず（メチオニンのヒドロキシ誘導体０．９モル）酵素の安定性を証明している。実施例３基質の量及び生成された酸の量の関数としての酵素の安定性もまた下記の条件下で測定された：基質量の関数としての酵素の安定性ニトリル結果の表を参照のこと細胞１０ mg/ml リン酸塩バッファーｐＨ７．０５ ml 温度２５ ℃ 期間１時間ニトリル濃度(mM) 活性(μmol/h・細胞1mg) ５０２１００２１５０２２００２５０００生成された酸の量の関数としての酵素の安定性実施条件：ニトリル５０ mM 細胞２．５ mg/ml リン酸塩バッファー100 mM、ｐＨ７．０１ ml 温度３０ ℃ 期間２時間酸濃度(mM) 活性(μmol/h・細胞1mg) ０３．２１００４．５２００３．８３００４．１４００４５００４６００３．４７００２．８実施例４ニトリル分解酵素の精製アルカリゲネス・フェカリスの細胞を実施例１に記載の培地中、３０ ℃で２４時間培養する。培養物を遠心分離後、ペレットをｐＨ７．５のバッファー［トリスＨＣｌ２５ mM、グリセロール１０％（ｗ／ｖ）］に取り込む。細胞の懸濁液を超音波処理し、次いで粗抽出物を得るために遠心分離する。次いで粗抽出物を３０％の飽和度まで硫酸アンモニウムで処理する。得られた沈澱物をｐＨ７．５のバッファー中に再懸濁させ、次いで同じバッファー２リットルに対して一夜透析する。次いで得られた溶液をｐＨ７．５バッファーで前以て平衡化させておいたQ Se pharose Fast Flow HR 26/10^(R)陰イオン交換カラムに充填させる。次いでその活性画分を０から１ M勾配のＮａＣｌで溶出させる。次いで活性画分を、ｐＨ７．５バッファーで前以て平衡化させておいたMono Q HR 5/5^(R)の陰イオン-交換カラムに充填させる。ニトリル分解酵素を０から１ M勾配のＮａＣｌを使用して溶出させる。最後に活性を含む画分を合わせ、次いで硫酸アンモニウム１ Mを添加する。この溶液を、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄１ Mを添加した、ｐＨ７．５バッファーで前以て平衡化させておいた、Pheny1 Sepharose HR 5/5^(R)の疎水反応カラムに充填させる。次いで活性画分を硫酸アンモニウム１から０ M勾配で溶出させる。蛋白質の分子量をゲル濾過により測定する。それは約２６０ kDaである。４３ kDaの単一のバンドがSDS-PAGE(純度９５％)上に認められる。 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルの、メチオニンのヒドロキシ誘導体への、アルカリゲネス・フェカリスのニトリル分解酵素による加水分解の速度論は直線的である。実施例５ｐＨの影響実施条件：ニトリル５０ mM 蛋白質５０ μg/ml ｐＨ４から５の酢酸塩バッファー１００ mM ｐＨ６から７のリン酸塩バッファー１００ mM １ ml ｐＨ８から９のトリス−HCIバッファー１００ mM ｐＨ１０から１１の硼酸塩バッファー１００ mM 温度３０ ℃ 期間１から２時間ｐＨ活性（μmol/h・蛋白質1mg）４０５４２６２３２７２７２８４０５９４１２１０１５８１１０実施例６温度の影響実施条件：ニトリル５０ mM 蛋白質５０ μg/ml ｐＨ７．０のリン酸塩バッファー１００ mM 温度変化４℃から６０℃ 期間１時間酵素の至適作用温度は５０℃である。温度（℃）活性（μmol/h・蛋白質lmg）４４５１０６７２０１４０３０２７２４０４１９５０５７０６０３３３マンデロニトリルとの比較実験実施条件：マンデロニトリル７ mM 蛋白質５ μg/ml リン酸塩バッファー100 mM、ｐＨ７．０１ ml 温度３０℃ 従って精製されたニトリル分解酵素はマンデロニトリルに対してエナンチオ選択性であるが4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルに対してはエナンチオ選択性でない。実施例７ロドコッカス HT 29-7 FERM BP-3857による、4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルの加水分解微生物のロドコッカス・エスピー HT 29-7 FERM BP-3857を以下の培地中で培養する: グリセロール２０ g/l 酵母抽出物(DIFCO) ３ g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ １ g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ４．４ g/l Ｎａ₂ＳＯ₄ ２．８ g/l ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．８５ g/l ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ０．０５ g/l ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ０．０３３ g/l ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０１３ g/l ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．００５ g/l ベンゾニトリル０．５ g/l ｐＨ７．５培養は培地６００ ml含有の２リットル用円錐形フラスコ中で３０℃ で実施する。全体の混合物を１４０時間１５０回転／分で撹拌する。細胞ペレットを回収し、９ g/lのＮａＣｌ溶液で洗浄し次いで凍結させる。加水分解に対するｐＨの影響：実施条件： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル１００ mM ６６０ nmにおる光学濃度１５ｐＨ４から５の酢酸塩バッファー１００ mM ｐＨ６．０から７．０のリン酸塩バッファー１００ mM １ ml ｐＨ８．０から９．０のトリス-HClバッファー１００ mM ｐＨ１０．０から１１．０の硼酸塩バッファー１００ mM 温度３０ ℃ 期間１０時間ｐＨ酸の収率４０％５１００％６１００％７１００％８１００％９１００％１０２０％１１０％実施例８基質の濃度の影響基質の量の関数としての酵素の安定性もまた、下記の条件下で測定した： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル結果の表を参照のこと６６０ nmにおける光学濃度２０リン酸塩バッファー３００ mM、ｐＨ７．０５ ml 温度３０ ℃ 期間２時間ニトリル濃度（mM）酸の収率５０９０％１００４４％２００２２％３００１０％４０００％５０００％実施例９生成された酸の量の関数としての酵素の安定性実施条件： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル１００ mM ６６０ nmにおける光学濃度１５リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０１ ml 温度３０℃ 期間６時間酸濃度（mM）酸の収率０１００％２００１００％４００１００％６００１００％８００１００％１０００１００％実施例１０エナンチオマー過剰率 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル１４０ mM ６６０ nmにおける光学濃度１４リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０１ ml 温度２０℃ 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルの加水分解の速度論の研究により、乾燥細胞１ mg当たり１時間当たりのメチオニンのヒドロキシ誘導体の直線的生成が示される。生成された酸のエナンチオマー過剰率は液体クロマトグラフィーにより測定された；それは１５％から１００％にわたる酸の収率に対して０％に等しい。実施例１１温度の影響実施条件： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル１００ mM ６６０ nmにおける光学濃度１５リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０１ ml 温度表を参照期間６時間Ｔ（℃）酸の収率１０７０％２０１００％３０１００％４０１００％５０３１％６０１５％実施例１２ 4-メチルチオ-2-アミノブチロニトリルの加水分解実施条件： 4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリル２３ mM ６６０ nmにおける光学濃度１５リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０１ ml 温度３０℃ 実施例１３ゴルドナ・テルレ MA-1(FERM BP-4535)に使用された培養条件は下記である: グリセロール１０ g/l 酵母抽出物０．４ g/l ＫＨ₂ＰＯ₄ ６．８ g/l Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ₂Ｏ７．１ g/l Ｎａ₂ＳＯ₄ ２．８ g/l ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０．４ g/l ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ４０ mg/l ＭｎＳＯ₄・Ｈ₂Ｏ４ mg/ml ＦｅＣｌ₃ ０．６ mg/l ＺｎＳＯ₄ ０．３ mg/l ベンゾニトリル０．５ g/l ｐＨ７．２酵素の活性培養した細胞を次に洗浄し次いで活性を測定するためにヒドロキシメチルチオブチロニトリルと混合する。実施条件：［ニトリル］＝２３ mM；［細胞］＝６．８ g/l；リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０；３５℃ ヒドロキシメチルチオブチロニトリルの加水分解の速度論は直線的である。初期率は１３ mmol/h・乾燥細胞１gにおいて測定する。実施例１４ニトリル分解酵素活性に対するAMTPのシアノヒドリン濃度の影響ニトリル分解酵素活性に対するヒドロキシメチルチオブチロニトリルの初期濃度の影響を測定し、その結果を下表に示す。実施条件：［細胞］＝５．１ g/l；リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ７．０；３５℃ ０．５、１、２及び３時間にわたり速度論を研究する。ニトリル濃度（mM）活性（mmol/h・乾燥細胞１g）５０１４１００１３２００１５３０００４０００２００ mMまで、活性は基質の濃度によりほとんど変化しない。実施例１５ニトリル分解酵素活性に対するメチオニンのヒドロキシ誘導体の濃度の影響このテストにおいて、我々はニトリル分解酵素活性に対する4-ヒドロキシ-2- メチルチオブタン酸アンモニウムの濃度の影響を研究した。実施条件：［細胞］＝５ g/l；［ニトリル］＝１００ mM；リン酸塩バッファー１００ mM、Ｈ７．０；３５℃ カルボン酸アンモニウムの濃度は０と１．５ Mの間で変化する。酸濃度（mol/l）活性(μmol/h・乾燥細胞１mg) ０９．４０．５１４１１９１．５１５ 4-ヒドロキシ-2-メチルチオブタン酸アンモニウムの濃度はゴルドナ・テルレ HT29-7株の初期の活性を全く変化させない。実施例１６ｐＨ及び温度の影響。実施条件：［ニトリル］＝１００ mM；［細胞］＝７．５ g/l；酢酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ４から５；リン酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ６から７；トリス−ＨＣｌバッファー１００ mM、ｐＨ８から９；硼酸塩バッファー１００ mM、ｐＨ１０から１１；３３５℃；１、２、４及び６時間にわたる速度論ｐＨ活性（mmol/h・乾燥細胞１g）４０．６５２．５６７．８７９．６８１５．３９１８１０５．７１１１１最適なｐＨは我々の実施条件下で約８−９である。ゴルドナ・テルレ MA-1のニトリル分解酵素活性に対する温度の影響。実施条件：［ニトリル］＝１００ mM；［細胞］＝７．５ g/l；リン酸塩バッファー１００ m、ｐＨ７．０；１時間にわたる速度論。Ｔ（℃）活性（mmol/h・乾燥細胞１g）１００．６２０２．３３０３．２４０３．４５０３．５６０１．９最適な温度は約４０−５０℃である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年８月３０日【補正内容】請求の範囲１．ラセミ体のα−置換4-メチルチオブチロニトリルをアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ATCC-8750、ロドコッカス・エスピー（Rhodoco ccus sp.）HT 29-7 FERM BP-3857 又はゴルドナ・テルレ（Gordona terrae）FER M BP-4535 のニトリル分解酵素から選ばれたニトリル分解酵素により加水分解させることを特徴とする、ラセミ体のα−置換4-メチルチオ酪酸の製造方法。２．前記ラセミ体α−置換4-メチルチオブチロニトリルが4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルであることを特徴とする、第１項記載の方法。３．培地のｐＨが４と１１の間にありそして好ましくは５と９の間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。４．加水分解温度が３０℃と６０℃の間にありそして好ましくは３０℃と５０ ℃の間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。５．出発溶液中のα−置換4-メチルチオブチロニトリルの濃度が１０mmol/lと４００ mmol/lの間にありそして好ましくは５０ mmol/lと２００ mmol/lの間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。６．溶液中のα−置換4-メチルチオ酪酸の濃度が１０ mmol/lと２０００ mmol /lの間にありそして好ましくは１００ mmol/lと１５００ mmol/lの間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラルジヨ，デニフランス・エフ−69440タリユエール・ルートデユバタール・レジダンスレコト（番地なし) (72)発明者アリアグノ，アンドレフランス・エフ−69340フランシユビル・アレーデジヤルダン−デ−エスペリド11

Claims

【特許請求の範囲】１．ラセミ体のα−置換4-メチルチオブチロニトリルをアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）、ロドコッカス・エスピー（Rhodococcus sp. ）HT 29-7又はゴルドナ・テルレ（Gordona terrae）のニトリル分解酵素から選ばれたニトリル分解酵素により加水分解させることを特徴とする、ラセミ体のα −置換4-メチルチオ酪酸の製造方法。２．前記ラセミ体α−置換4-メチルチオブチロニトリルが4-メチルチオ-2-ヒドロキシブチロニトリルであることを特徴とする、第１項記載の方法。３．培地のｐＨが４と１１の間にありそして好ましくは５と９の間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。４．加水分解温度が３０℃と６０℃の間にありそして好ましくは３０℃と５０ ℃の間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。５．出発溶液中のα−置換4-メチルチオブチロニトリルの濃度が１０ mmol/l と４００ mmol/lの間にありそして好ましくは５０ mmol/lと２００ mmol/lの間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。６．溶液中のα−置換4-メチルチオ酪酸の濃度が１０ mmol/lと２０００ mmol /lの間にありそして好ましくは１００ mmol/lと１５００ mmol/lの間にあることを特徴とする、第１項記載の方法。７．アルカリゲネス属の微生物に属するニトリル分解酵素が使用されることを特徴とする、第１項記載の方法。８．ロドコッカス属の微生物に属するニトリル分解酵素が使用されることを特徴とする、第１項記載の方法。９．ゴルドナ属の微生物に属するニトリル分解酵素が使用されることを特徴とする、第１項記載の方法。