JPH0448435B2 - - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、特定の微生物の産生するニトリラー
ゼに基づくニトリル水和活性の経時的な低下を防
止し、この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酵素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリラーゼは、ニトリル類を水和して対応す
るアミド類を生成せしめる酵素として知られてお
り、その具体的利用例としてニトリラーゼを産生
するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属
またはノカルジア(Nocardia)属の微生物を用
いて、(メタ)アクリロニトリルより(メタ)ア
クリルアミドを生成させる方法(特公昭56−
17918号広報参照)、ロドコツカス
(Rhodococcus)属の微生物を用いて、C2-4のニ
トリルより対応するアミドを生成させる方法(特
願昭60−452明細書参照)、バシラス(Bacillus)
属、バクテリジウム(Bacteridium)属、ミクロ
コツカス(Micrococcus)属またはブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属の微生物を用いて、
ニトリルより対応するアミドを生成させる方法
(特開昭51−86186号公報参照)を挙げることがで
きる。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において、上記ニトリルラーゼのニトリル水和活
性は不安定で、温度や精製度を上げるにしたがい
活性が低下することが判明した。この低下はこの
酵素を固定化した場合にも認められる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリラーゼ
のニトリル水和活性を効率的に利用することを目
的として、鋭意検討した結果、特定の物質、すな
わち、ニトリル類、アミド類および有機酸または
その塩類等の使用が該目的に極めて有効であるこ
とを見出し、この知見に基づいてなされたもので
ある。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るグラム陽性の微生物から分離、抽出した酵素ニ
トリラーゼまたはその固定化物の溶液または懸濁
液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、お
よび有機酸またはその塩類の中から選ばれた少な
くとも1種の化合物を添加して、該酵素活性を1
日以上安定に維持すること、を特徴とするニトリ
ル水和活性の保持方法、を要旨とするものであ
る。 発明の具体的な説明 微生物: 本発明における微生物は、ニトリルラーゼを産
生し、ニトリル特にアクリロニトリルを水和し
て、対応するアミド特にアクリルアミドを生成す
ることができる特定の微生物である。具体的に
は、例えば、前記特公昭56−17918号広報に記載
のコリネバクテリウム属のN−771菌株〔微工研
菌寄第4445〕およびN−774菌株〔微工研菌寄第
4446〕ならびにノカルジア属のN−775菌株〔微
工研菌寄第4447〕、前記特願昭60−452明細書記載
のロドコツカス属のsp.S−6〔微工研条寄第687
号〕および同じく前記特開昭51−86186号公報記
載のバシラス(Bacillus)属、バクテリジウム
(Bacteridium)属、ミクロコツカス
(Micrococcus)属およびブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属の菌株等を挙げることがで
きる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコース、
シユークロース、デキストリン、グリセリン等の
炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒素源、酵
母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン等の
窒素源、その他を適宜含有する培地に、それぞれ
の菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは5〜9程度、好ましくは6〜8程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜30
℃程度とし、培養時間は1〜3日程度で充分であ
る。培養により得た菌体は遠心分離等により集菌
することができる。 ニトリラーゼ: 本発明におけるニトリラーゼは前記微生物が産
生する酵素であり、その活性を充分に発現させる
には光照射を必要とする(特願昭60−2724号明細
書参照)。この酵素の分離、抽出は次のようにし
て行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体を
所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁し、
超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチプレス
等により菌体を破砕し、遠心分離等により未破砕
菌体および細胞璧、膜を除去し、可溶性画分(菌
体抽出液)を得る。さらに、この菌体抽出液は常
法に従い、適宜、硫安分画、DEAE−Sephacel
Phenyl−sepharose、sephadex等のカラムを用
いたり、さらには結晶化等により精製することに
より、部分精製酵素液または精製酵素(液)を得
ることができる。 本発明では、これら精製段階の如何によらず、
いずれの酵素も対象となる。 固定化酵素: 本発明における固定化酵素は、上記ニトリラー
ゼを常法に従い活性炭等へ吸着させる吸着法、イ
オン交換樹脂等に結合させるイオン結合法、ガラ
スビーズ等に共有結合させる共有結合法、および
アクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸等で
包括する包括法等により得ることができる。 安定化剤: 本発明において使用する安定化剤は、ニトリル
類、アミド類および有機酸類の中から選ばれた化
合物であり、これらはそれぞれ単独にまたは混合
して使用することができる。 具体的には、例えば次の化合物を挙げることが
できる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブ
チロニトリルのような脂肪族ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニト
リル、β−アミノプロピオニトリルのようなア
ミノニトリル類と対応するアミドおよび酸また
はその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのような
ヒドロキシニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルのよ
うな不飽和ニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシポ
ニトリルのようなジニトリル類と対応するジア
ミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモノ
シアノアミドおよびモノシアノ酸またはその塩
類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリルの
ような芳香族ニトリル類と対応するアミドおよ
び酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルの
ような複素環式ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピオ
ニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有す
る酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持: 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、前
記した化合物を、同じく前記したニトリルラーゼ
またはこれらの固定化物を各種バツフアー溶液、
生理食塩水などに溶解または分散させた溶液また
は懸濁液に添加することにより達成することがで
きる。安定化剤の添加量は通常0.01〜50g/の
範囲であるが、長期保存、コスト等を考慮すると
0.1〜10g/添加することが望ましい。 溶液または懸濁液のPHは5〜8、好ましくは
5.5〜7の範囲で、リン酸バツフアー、トリスバ
ツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用いられ
る。また、場合によつては、塩酸、硫酸等の酸、
カセイソーダ、カセイカリ等のアルカリを添加
し、PHをコントロールすることも有効である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、低
温、特に0℃付近で保存することが望ましい。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長時間、
例えば1日以上安定に保持することができる。そ
の効果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存
安定性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の
保持においても認められる。従つて、安定化剤は
各精製工程において使用する酵素液またはバツフ
アー溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液0.1mlを9.9mlのリン酸バツフアーを入れた50ml
ビーカーに採り、10℃のバス中で予め100Wアイ
ランプ(東芝製)にて50cmの距離から30分間光を
照射し充分に活性を発現させた後、アクリロニト
リル5.0重量%含むM/20リン酸バツフアー(PH
7.7)10mlに加えて、10℃、10分間反応させ、こ
の時生成したアクリルアミドをガスクロマトグラ
フイーにより定量することにより測定した。 また、酵素液について1分間に1μモルのアク
リルアミドを生成する能力を1単位(U)として表示
した。 実施例1および比較例1 グルコースス10g/、ペプトン5g/、酵
母エキス3g/および麦芽エキス3g/から
なる培地をPH7.2に調整後、それぞれ100mlを500
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。 冷却後、これに上記と同一培地で2日間予め培
養したコリネバクテリウム属のN−774菌株〔微
工研菌寄第4446号〕の培養液1mlを接種し、30℃
にて2日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離(3℃、10000rpm、
20分)により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液を得た。 次いで、この洗浄菌体懸濁液50mlと10g/の
イソ酪酸アンモニウム塩を含有するM/10リン酸
バツフアー(PH6.5)50mlを混合した(2.5×
103U/ml)。 本菌体懸濁液をフレンチプレス(大岳製作所
製)にかけ、1000〜1500KgGの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離(12000rpm、30分)にて未
破砕菌体および細胞璧等の不溶分を除去し、菌体
抽出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液(2.5×103U/ml)を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を20℃にて、2日間放置し、放置
開始前後のニトリ水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率(表中、活性残存率と略す。以下
同じ)を算出し表−1に示す結果を得た。
ゼに基づくニトリル水和活性の経時的な低下を防
止し、この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酵素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリラーゼは、ニトリル類を水和して対応す
るアミド類を生成せしめる酵素として知られてお
り、その具体的利用例としてニトリラーゼを産生
するコリネバクテリウム(Corynebacterium)属
またはノカルジア(Nocardia)属の微生物を用
いて、(メタ)アクリロニトリルより(メタ)ア
クリルアミドを生成させる方法(特公昭56−
17918号広報参照)、ロドコツカス
(Rhodococcus)属の微生物を用いて、C2-4のニ
トリルより対応するアミドを生成させる方法(特
願昭60−452明細書参照)、バシラス(Bacillus)
属、バクテリジウム(Bacteridium)属、ミクロ
コツカス(Micrococcus)属またはブレビバクテ
リウム(Brevibacterium)属の微生物を用いて、
ニトリルより対応するアミドを生成させる方法
(特開昭51−86186号公報参照)を挙げることがで
きる。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において、上記ニトリルラーゼのニトリル水和活
性は不安定で、温度や精製度を上げるにしたがい
活性が低下することが判明した。この低下はこの
酵素を固定化した場合にも認められる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリラーゼ
のニトリル水和活性を効率的に利用することを目
的として、鋭意検討した結果、特定の物質、すな
わち、ニトリル類、アミド類および有機酸または
その塩類等の使用が該目的に極めて有効であるこ
とを見出し、この知見に基づいてなされたもので
ある。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るグラム陽性の微生物から分離、抽出した酵素ニ
トリラーゼまたはその固定化物の溶液または懸濁
液に、安定化剤としてニトリル類、アミド類、お
よび有機酸またはその塩類の中から選ばれた少な
くとも1種の化合物を添加して、該酵素活性を1
日以上安定に維持すること、を特徴とするニトリ
ル水和活性の保持方法、を要旨とするものであ
る。 発明の具体的な説明 微生物: 本発明における微生物は、ニトリルラーゼを産
生し、ニトリル特にアクリロニトリルを水和し
て、対応するアミド特にアクリルアミドを生成す
ることができる特定の微生物である。具体的に
は、例えば、前記特公昭56−17918号広報に記載
のコリネバクテリウム属のN−771菌株〔微工研
菌寄第4445〕およびN−774菌株〔微工研菌寄第
4446〕ならびにノカルジア属のN−775菌株〔微
工研菌寄第4447〕、前記特願昭60−452明細書記載
のロドコツカス属のsp.S−6〔微工研条寄第687
号〕および同じく前記特開昭51−86186号公報記
載のバシラス(Bacillus)属、バクテリジウム
(Bacteridium)属、ミクロコツカス
(Micrococcus)属およびブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属の菌株等を挙げることがで
きる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコース、
シユークロース、デキストリン、グリセリン等の
炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒素源、酵
母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペプトン等の
窒素源、その他を適宜含有する培地に、それぞれ
の菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは5〜9程度、好ましくは6〜8程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜30
℃程度とし、培養時間は1〜3日程度で充分であ
る。培養により得た菌体は遠心分離等により集菌
することができる。 ニトリラーゼ: 本発明におけるニトリラーゼは前記微生物が産
生する酵素であり、その活性を充分に発現させる
には光照射を必要とする(特願昭60−2724号明細
書参照)。この酵素の分離、抽出は次のようにし
て行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体を
所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁し、
超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチプレス
等により菌体を破砕し、遠心分離等により未破砕
菌体および細胞璧、膜を除去し、可溶性画分(菌
体抽出液)を得る。さらに、この菌体抽出液は常
法に従い、適宜、硫安分画、DEAE−Sephacel
Phenyl−sepharose、sephadex等のカラムを用
いたり、さらには結晶化等により精製することに
より、部分精製酵素液または精製酵素(液)を得
ることができる。 本発明では、これら精製段階の如何によらず、
いずれの酵素も対象となる。 固定化酵素: 本発明における固定化酵素は、上記ニトリラー
ゼを常法に従い活性炭等へ吸着させる吸着法、イ
オン交換樹脂等に結合させるイオン結合法、ガラ
スビーズ等に共有結合させる共有結合法、および
アクリルアミド、カラギーナン、アルギン酸等で
包括する包括法等により得ることができる。 安定化剤: 本発明において使用する安定化剤は、ニトリル
類、アミド類および有機酸類の中から選ばれた化
合物であり、これらはそれぞれ単独にまたは混合
して使用することができる。 具体的には、例えば次の化合物を挙げることが
できる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソブ
チロニトリルのような脂肪族ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニト
リル、β−アミノプロピオニトリルのようなア
ミノニトリル類と対応するアミドおよび酸また
はその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのような
ヒドロキシニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルのよ
うな不飽和ニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシポ
ニトリルのようなジニトリル類と対応するジア
ミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモノ
シアノアミドおよびモノシアノ酸またはその塩
類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリルの
ような芳香族ニトリル類と対応するアミドおよ
び酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリルの
ような複素環式ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピオ
ニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と対応
するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有す
る酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持: 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、前
記した化合物を、同じく前記したニトリルラーゼ
またはこれらの固定化物を各種バツフアー溶液、
生理食塩水などに溶解または分散させた溶液また
は懸濁液に添加することにより達成することがで
きる。安定化剤の添加量は通常0.01〜50g/の
範囲であるが、長期保存、コスト等を考慮すると
0.1〜10g/添加することが望ましい。 溶液または懸濁液のPHは5〜8、好ましくは
5.5〜7の範囲で、リン酸バツフアー、トリスバ
ツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用いられ
る。また、場合によつては、塩酸、硫酸等の酸、
カセイソーダ、カセイカリ等のアルカリを添加
し、PHをコントロールすることも有効である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、低
温、特に0℃付近で保存することが望ましい。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長時間、
例えば1日以上安定に保持することができる。そ
の効果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存
安定性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の
保持においても認められる。従つて、安定化剤は
各精製工程において使用する酵素液またはバツフ
アー溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液0.1mlを9.9mlのリン酸バツフアーを入れた50ml
ビーカーに採り、10℃のバス中で予め100Wアイ
ランプ(東芝製)にて50cmの距離から30分間光を
照射し充分に活性を発現させた後、アクリロニト
リル5.0重量%含むM/20リン酸バツフアー(PH
7.7)10mlに加えて、10℃、10分間反応させ、こ
の時生成したアクリルアミドをガスクロマトグラ
フイーにより定量することにより測定した。 また、酵素液について1分間に1μモルのアク
リルアミドを生成する能力を1単位(U)として表示
した。 実施例1および比較例1 グルコースス10g/、ペプトン5g/、酵
母エキス3g/および麦芽エキス3g/から
なる培地をPH7.2に調整後、それぞれ100mlを500
ml容三角フラスコに入れて滅菌した。 冷却後、これに上記と同一培地で2日間予め培
養したコリネバクテリウム属のN−774菌株〔微
工研菌寄第4446号〕の培養液1mlを接種し、30℃
にて2日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離(3℃、10000rpm、
20分)により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液を得た。 次いで、この洗浄菌体懸濁液50mlと10g/の
イソ酪酸アンモニウム塩を含有するM/10リン酸
バツフアー(PH6.5)50mlを混合した(2.5×
103U/ml)。 本菌体懸濁液をフレンチプレス(大岳製作所
製)にかけ、1000〜1500KgGの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離(12000rpm、30分)にて未
破砕菌体および細胞璧等の不溶分を除去し、菌体
抽出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液(2.5×103U/ml)を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を20℃にて、2日間放置し、放置
開始前後のニトリ水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率(表中、活性残存率と略す。以下
同じ)を算出し表−1に示す結果を得た。
【表】
実施例2〜6および比較例2〜6
比較例1と同様にして調整した表−2に示す各
種の属の菌体懸濁液について、比較例1と同様に
してフレンチプレス処理および遠心分離を行い、
菌体抽出液を得た。 この菌体抽出液を2分し一方はその1mlを10
g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含有するM/
10リン酸バツフアー(PH6.5)1mlと混合し、他
方は比較例としてM/10リン酸バツフアー(PH
6.5)1mlと混合した。両溶液を20℃にて2日間
放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定値か
らニトリル水和活性の残存率を算出し、同表に示
す結果を得た。
種の属の菌体懸濁液について、比較例1と同様に
してフレンチプレス処理および遠心分離を行い、
菌体抽出液を得た。 この菌体抽出液を2分し一方はその1mlを10
g/のイソ酪酸アンモニウム塩を含有するM/
10リン酸バツフアー(PH6.5)1mlと混合し、他
方は比較例としてM/10リン酸バツフアー(PH
6.5)1mlと混合した。両溶液を20℃にて2日間
放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定値か
らニトリル水和活性の残存率を算出し、同表に示
す結果を得た。
【表】
実施例7〜27および比較例7
比較例1と同様にして得た菌体抽出液(0.8×
103U/ml)2.5mlに表−3に示すニトリル類を10
mg含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加え、PH
6.5に調整後、20℃にて2日間放置し、前例と同
様にして活性残存率を算出した。結果を表−3に
示した。
103U/ml)2.5mlに表−3に示すニトリル類を10
mg含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加え、PH
6.5に調整後、20℃にて2日間放置し、前例と同
様にして活性残存率を算出した。結果を表−3に
示した。
【表】
【表】
実施例28〜45および比較例8
実施例7〜27において、ニトリル類に代えてア
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−4
に示す結果を得た。
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−4
に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例46〜62および比較例9
実施例7〜27においてニトリル類に代えて有機
酸類を添加し、さらにPHを6.5に調整した以外は
同例と同様にして表−5に示す結果を得た。
酸類を添加し、さらにPHを6.5に調整した以外は
同例と同様にして表−5に示す結果を得た。
【表】
実施例63〜75および比較例10〜13
比較例1と同様にして調製した菌体抽出液
(1.8×103U/ml)2.5mlに、表−6に示す安定化
剤25mgを含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、20℃にて2日間放置した。 それぞれの抽出液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
6に示す結果を得た。
(1.8×103U/ml)2.5mlに、表−6に示す安定化
剤25mgを含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、20℃にて2日間放置した。 それぞれの抽出液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
6に示す結果を得た。
【表】
実施例76〜92および比較例14
比較例1と同様にして調製した菌体抽出液
(0.7×103U/ml)2.5mlに表−7に示す安定化剤
を所定量含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0(無添加はPH6.5)に調整後、20℃にて2
日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定
値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に示
す結果を得た。
(0.7×103U/ml)2.5mlに表−7に示す安定化剤
を所定量含むM/10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0(無添加はPH6.5)に調整後、20℃にて2
日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測定
値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に示
す結果を得た。
【表】
【表】
濃度:放置液中の安定化剤濃度
実施例93および比較例15 実施例1と同様にして調製した菌体抽出液40
ml、アクリルアミド4.5g、N、N′−メチレンビ
スアクリルアミド0.5gおよびM/20リン酸バツ
フアー(イソ酪酸アンモニウム10g/含有、PH
6.0)40mlを混合して、均一な懸濁液とした。こ
れに、5%ジメチルアミノプロピオニトリル水溶
液5mlおよび1.0%過硫酸カリウム水溶液10mlを
加えて、10℃に30分保つて重合させた。得られた
塊状の菌体含有ゲルを小粒子に破砕し5g/の
イソ酪酸アンモニウム塩を含むPH7.0のM/20リ
ン酸バツフアーで充分洗浄した固定化酵素約90g
を得た。 この洗浄固定化酵素を5g/のイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、20℃にて3日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、20℃にて5日間放置した。 これら固定化酵素について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル1gとアクリロニトリル5g、M/20
リン酸バツフアー(PH7.7)97mlを混合し、攪拌
下に0℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−8に示した。
実施例93および比較例15 実施例1と同様にして調製した菌体抽出液40
ml、アクリルアミド4.5g、N、N′−メチレンビ
スアクリルアミド0.5gおよびM/20リン酸バツ
フアー(イソ酪酸アンモニウム10g/含有、PH
6.0)40mlを混合して、均一な懸濁液とした。こ
れに、5%ジメチルアミノプロピオニトリル水溶
液5mlおよび1.0%過硫酸カリウム水溶液10mlを
加えて、10℃に30分保つて重合させた。得られた
塊状の菌体含有ゲルを小粒子に破砕し5g/の
イソ酪酸アンモニウム塩を含むPH7.0のM/20リ
ン酸バツフアーで充分洗浄した固定化酵素約90g
を得た。 この洗浄固定化酵素を5g/のイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、20℃にて3日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、20℃にて5日間放置した。 これら固定化酵素について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル1gとアクリロニトリル5g、M/20
リン酸バツフアー(PH7.7)97mlを混合し、攪拌
下に0℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−8に示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 ニトリル水和活性を有するグラム陽性の微生
物から分離、抽出した酵素ニトリラーゼまたはそ
の固定化物の溶液または懸濁液に、安定化剤とし
てニトリル類、アミド類、および有機酸またはそ
の塩類の中から選ばれた少なくとも1種の化合物
を添加して、該酵素活性を1日以上安定に維持す
ること、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法。 2 溶液または懸濁液中のニトリル類、アミド
類、および有機酸またはその塩類の濃度が0.01〜
50g/である特許請求の範囲第1項記載の保持
方法。 3 溶液または懸濁液のPHが5〜8である特許請
求の範囲第1〜2項記載の保持方法。 4 微生物が、コリネバクテリウム
(Corynebacterium)属、ノカルジア
(Nocardia)属、ロドコツカス(Rhodococcus)
属、バシラス(Bacillus)属、バクテリジウム
(Bacteridium)属、ミクロコツカス
(Micrococcus)属およびブレビバクテリウム
(Brevibacterium)属の中から選ばれた微生物で
ある特許請求の範囲第1〜3項記載の保持方法。
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