DE3788298T2

DE3788298T2 - Verfahren zur Erhaltung der Nitrilhydrierungsaktivität.

Info

Publication number: DE3788298T2
Application number: DE3788298T
Authority: DE
Inventors: Kanehiko Enomoto; Koitchiro Ryuno; Hitoshi Shimizu
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd; Nitto Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 1986-05-02
Filing date: 1987-04-30
Publication date: 1994-06-23
Anticipated expiration: 2007-05-01
Also published as: EP0243967B1; EP0243967A3; JPS62259586A; US4931391A; DE3788298D1; EP0243967A2; JPH0448435B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung der Verminderung der Nitrilhydratisierungsaktivität von Nitrilase im Verlauf der Zeit, wobei die Nitrilase durch spezifische Mikroorganismen hergestellt worden ist, sowie ein Verfahren zur Stabilisierung dieser Aktivität.
In jüngster Zeit hat sich die Technik der immobilisierten Enzyme und Mikroorganismen rasch entwickelt und zu verstärkten Versuchen geführt, Mikroorganismen und Enzyme in der Form, wie sie vorliegen, oder in immobilisiertem Zustand als Katalysator für verschiedene einzelne oder komplexe chemische Umsetzungen zu verwenden.
Nitrilase ist als ein Enzym bekannt, das Nitrile zu den entsprechenden Amiden hydratisieren kann. Als Beispiele für die Verwendung dieses Enzyms sind als bekannt zu nennen: Verfahren zur Herstellung von (Meth)acrylamid aus (Meth) acrylnitril unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium oder Nocardia, die Nitrilase erzeugen (japanische Patentveröffentlichung Nr. 17918/1981); Verfahren zur Herstellung von Amiden aus den entsprechenden C&sub2;&submin;&sub4;- Nitrilen unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Rhodococcus (japanische Patentanmeldung Nr. 452/1985) und Verfahren zur Herstellung von Amiden aus den entsprechenden Nitrilen unter Verwendung von Mikroorganismen der Gattung Bacillus, Bacteridium, Micrococcus oder Brevibacterium (japanische Offenlegungsschrift Nr. 86186/1976).
Als Ergebnis weiterer Forschungen wurde jedoch gefunden, daß die Nitrilhydratisierungsaktivität der oben erwähnten Nitrilase labil ist und mit steigender Temperatur oder steigender Reinheit des Enzyms abnimmt. Diese Abnahme erfolgt auch bei immobilisierten Enzymen.

Zusammenfassung der Erfindung

Als Ergebnis ausgedehnter Forschungen zur Lösung der oben erwähnten Schwierigkeiten und zum wirksamen Einsatz der Nitrilhydratisierungsaktivität von Nitrilase wurde nun gefunden, daß spezifische Substanzen, d. h. Amide und organische Säuren oder Salze davon zu diesem Zweck sehr wirksam sind, was die Grundlage der vorliegenden Erfindung darstellt.
Im einzelnen ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Erhaltung der Mitrilhydratisierungsaktivität von Nitrilase, die von einem grampositiven Mikroorganismus oder einer immobilisierten Form davon, die beide eine nitrilhydratisierende Wirkung aufweisen, hergestellt worden ist, wobei bei dem Verfahren als Stabilisator mindestens eine Verbindung aus der Gruppe der Amide und organischen Säuren und deren Salzen einer Lösung oder Suspension der Nitrilase oder der immobilisierten Form davon zugesetzt wird.

Einzelbeschreibung der Erfindung

Mikroorganismus:

Die gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen sind spezifische Mikroorganismen, die in der Lage sind, Nitrilase zu erzeugen und Nitrile, insbesondere Acrylnitril, zu den entsprechenden Amiden, insbesondere Acrylamid, zu hydratisieren. Spezifische Beispiele derartiger Mikroorganismen sind die Stämme N-771 (FERM P-4445) und N-774 (FERM P-4446) der Gattung Corynebacterium sowie Stamm N-775 (FERM P-4447) der Gattung Nocardia, bekannt aus der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 17918/1981, die oben erwähnt ist, und aus der entsprechenden US-PS 4 248 968 (3. Februar 1986), ferner der Stamm sp. S-6 (FERM BP 687) der Gattung Rhodococcus, bekannt aus der ebenfalls oben erwähnten japanischen Patentanmeldung Nr. 452/1985 und der entsprechenden EP-OS 188 316 AI (23. Juli 1986), sowie ferner die Stämme der Gattungen Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium, aus der oben erwähnten JP-OS 86186/1976 und der entsprechenden US-PS 4 001 081 bekannt.
Die Züchtung dieser Microorganismen wird normalerweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, indem man Stämme der entsprechenden Microorganismen in Kulturmedien einimpft, die folgende Zusammensetzung besitzen: Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glucose, Saccharose, Dextrine und Glycerin; Stickstoffquellen, wie beispielsweise Ammoniumsulfat und Harnstoff; organische Nährstoffquellen, wie beispielsweise Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt und Pepton; und weitere gegebenenfalls vorhandene Bestandteile.
Der pH-Wert des Kulturmediums liegt in der Größenordnung von 5 bis 9, vorzugsweise in der Größenordnung von 6 bis 8, während die Züchtungstemperatur in der Größenordnung von 20 bis 37ºC, vorzugsweise in der Größenordnung von 20 bis 30ºC liegt und die Züchtungsdauer etwa 1 bis 3 Tage beträgt. Zellen, die durch die Züchtung erhalten worden sind, können beispielsweise durch Zentrifugieren gesammelt werden.

Nitrilase:

Die gemäß der Erfindung verwendete Nitrilase ist ein Enzym, das durch die genannten Mikroorganismen erzeugt wird, wobei Bestrahlung mit Lichtstrahlen erforderlich ist, um zu bewirken, daß ihre Aktivität das größte Ausmaß erreicht (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 2724/1985). Dieses Enzym kann auf folgende Weise abgetrennt und extrahiert werden.
Zunächst werden die Zellen, die aus der Kultivierungsflüssigkeit durch Zentrifugieren und dergleichen gesammelt worden sind, in einer Pufferlösung in einer solchen Menge gelöst, die ausreicht, um eine gegebene Zellkonzentration zu erzielen, und in einem Ultraschall-Zellzerstoßer, einer Daino-Mühle oder einer französischen Presse zerstoßen. Nicht zerstoßene Zellen und Zellwände oder Membranen werden entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren, wobei man eine lösliche Fraktion (Zellextrakt) erhält. Der auf diese Weise erhaltene Zellextrakt wird nach herkömmlichen Methoden gereinigt, wie beispielsweise durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat, Säulenchromatographie an DEAE- Sephacel, Phenyl-Sepharose® oder Sephadex® oder durch Kristallisieren, wodurch eine teilweise gereinigte Enzymlösung oder ein gereinigtes Enzym (Lösung) erhalten werden kann.
Beide Enzymsorten können gemäß der Erfindung verwendet werden, unabhängig davon, ob sie teilweise oder vollständig gereinigt sind.

Immobilisiertes Enzym:

Die immobilisierten Enzyme gemäß der Erfindung können erhalten werden, indem man die oben erwähnte Nitrilase der Adsorptionsmethode, bei der Adsorption an Aktivkohle oder dergleichen erfolgt, der Ionenbindungsmethode, bei der Bindung an Ionenaustauscherharze und dergleichen erfolgt, der Kovalenzbindungsmethode, bei der eine kovalente Bindung an Glasperlen erfolgt, oder der Einfangsmethode unterwirft, bei der auf herkömmliche Weise ein Einfangen mit Acrylamid, Carrageenan, Alginat und dergleichen erfolgt.

Stabilisator:

Die gemäß der Erfindung verwendeten Stabilisatoren sind Verbindungen, die aus Amiden und organischen Säuren sowie deren Salzen ausgewählt sind, und diese Verbindungen können allein oder in Kombination miteinander verwendet werden.
Spezifische Beispiele für derartige Verbindungen sind:
(1) Aliphatische Amide, wie Acetamid, Propionamid und Isobutyramid, und die entsprechenden Säuren oder deren Salze;
(2) Aminosäureamide, wie beispielsweise Glycinamid, α-Aminopropionamid und β-Aminopropionamid, sowie die entsprechenden Säuren oder deren Salze;
(3) Hydroxycarbonsäureamide, wie beispielsweise Lactamid, Hydroxyacetamid und β-Hydroxypropionamid, und die entsprechenden Säuren und deren Salze;
(4) Ungesättigte Amide, wie beispielsweise Acrylamid und Methacrylamid, und die entsprechenden Säuren oder deren Salze;
(5) Diamide, wie beispielsweise Malonsäurediamid, Bernsteinsäurediamid oder Adipinsäurediamid, und die entsprechenden zweibasigen Säuren oder deren Salze;
(6) Aromatische Amide, wie beispielsweise Benzamid und Phenylacetamid, und die entsprechenden Säuren oder deren Salze;
(7) Heterocyclische Amide, wie beispielsweise Nicotinamid und Isonicotinamid, sowie die entsprechenden Säuren oder deren Salze;
(8) Halogenierte Amide, wie beispielsweise Chloracetamid und β-Chlorpropionamid, und die entsprechenden Säuren oder deren Salze und
(9) Säuren mit einer Aldehydgruppe, wie beispielsweise Glyoxylsäure oder deren Salze.

Erhaltung der Nitrilhydratisierungsaktivität:

Die Erhaltung der Nitrilhydratisierungsaktivität kann erreicht werden, indem man eine der oben genannten Verbindungen einer Lösung oder Suspension der oben erwähnten Nitrilase oder einer immobilisierten Form davon, wobei die Lösung oder Dispergierung in verschiedenen Puffern oder physiologischer Kochsalzlösung erfolgt, zusetzt. Normalerweise liegt die Menge des zugesetzten Stabilisators im Bereich von 0,01 bis 50 g/l, jedoch werden 0,1 bis 10 g/l des Stabilisators vorzugsweise aus Gründen der Lagerstabilität, der Kosten und dergleichen zugesetzt.
Der pH-Wert der Lösung oder Suspension beträgt 5 bis 8, vorzugsweise 5,5 bis 7, und eine Reihe von Puffern, wie beispielsweise Phosphatpuffer und Trispuffer, werden normalerweise verwendet. In einigen Fällen kann es wirksam sein, den pH-Wert durch Zugabe einer Säure, wie beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure, oder eines Alkalis, wie beispielsweise Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid, zu steuern.
Während die so erhaltene Lösung oder Suspension bei Raumtemperatur aufbewahrt werden kann, solange die Aufbewahrungsdauer kurz ist, wird eine Aufbewahrung bei niedriger Temperatur, insbesondere bei einer Temperatur in der Nähe von 0ºC, bevorzugt.
Gemäß der Erfindung kann die Nitrilhydratisierungsaktivität über eine lange Zeit stabil aufrechterhalten werden. Diese Wirkung wird nicht nur bei der Lagerstabilität der Enzymlösung auf den entsprechenden Reinigungsstufen des Enzyms, wie sie oben beschrieben wurden, beobachtet, sondern auch bei der Aufrechterhaltung der Enzymaktivität in jeder Reinigungsstufe. Es ist daher bevorzugt, daß der Stabilisator der Enzymlösung oder dem Puffer, die in jeder Reinigungsstufe verwendet werden, zugesetzt wird.
Um die Art und Anwendbarkeit der Erfindung näher zu erläutern, werden die folgenden Ausführungsbeispiele angegeben, wobei es sich versteht, daß diese Beispiele die Erfindung nicht beschränken sollen.

Experimentelle Beispiele

Bei jedem der folgenden experimentellen Beispiele wurden 0,1 ml einer Enzymlösung in ein Becherglas eingebracht, das 9,9 ml Phosphatpuffer enthielt, und mit einer 100-Watt- EYE-LAMPE von Toshiba, Japan, die in einer Entfernung von 50 cm plaziert war, 30 min lang in einem Bad, das auf 10ºC gehalten war, bestrahlt, um die Enzymaktivität bis zu ihrem größten Ausmaß zu induzieren. Die erhaltene Lösung wurde anschließend zu 10 ml einer einer 1/20 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,7 zugesetzt, die 5,0 Gew.-% Acrylnitril enthielt, um 10 min lang bei 10ºC eine Umsetzung zu bewirken. Die Nitrilhydratisierungsaktivität der Testenzymlösung wurde bestimmt, indem man die Menge an erzeugtem Acrylamid gaschromatographisch bestimmte, wobei die Fähigkeit, 1 umol Acrylamid je ml Enzymlösung und Minute zu erzeugen, als eine Einheit (U) bezeichnet wurde.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1

Ein Kulturmedium, das 10 g/l Glucose, 5 g/l Pepton, 3 g/l Hefeextrakt und 3 g/l Malzextrakt enthielt, wurde auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, und 100 ml des erhaltenen Kulturmediums wurden in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben sterilisiert.
Nach dem Abkühlen wurde das sterilisierte Kulturmedium mit 1 ml einer Kulturflüssigkeit beimpft, die durch Vorzüchten des Stammes N-774 (FERM p-4446) der Gattung Corynebacterium in demselben Kulturmedium, wie oben beschrieben, über 2 Tage erhalten worden war, beimpft, und die Züchtung wurde aerob während 2 Tagen bei 30ºC durchgeführt.
Die Zellen wurden von der Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren (3ºC, 10000 U/min, 20 min) abgetrennt und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden unter denselben Bedingungen zentrifugiert und anschließend in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, und man erhielt eine Suspension von gewaschenen Zellen.
Danach wurden 50 ml dieser Zellsuspension mit 50 ml M/10 Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen, der 10 g/l Ammoniumisobutyrat enthielt (2,5·10³ U/ml).
Die erhaltene Zellsuspension wurde in einer französischen Presse der Ohtake Seisaku-sho, Japan verpreßt, um zerstoßene Zellen unter einem Druck von 1000 bis 1500 kg Überdruck zu erhalten, und anschließend zentrifugiert (12000 U/min, 30 min), um unzerstoßene Zellen und unlösliche Anteile, wie beispielsweise Zellwände, zu entfernen, wodurch ein Zellextrakt, d. h. eine rohe Enzymlösung, erhalten wurde.
Zu Vergleichszwecken wurde eine ähnliche Zellsuspension (2,5·10³ U/ml), die kein Ammoniumisobutyrat enthielt, hergestellt und einer Behandlung in der französischen Presse und der Zentrifugierung unter gleichen Bedingungen unterworfen, wodurch ein Vergleichszellextrakt erhalten wurde.
Beide Zellextrakte wurden 2 Tage lang bei 20ºC stehengelassen, und die Nitrilhydratisierungsaktivitätswerte wurden vor und nach dem Stehenlassen des Extrakts bestimmt. Die restliche Nitrilhydratisierungsaktivität in Prozenten (in der Tabelle 1 sowie in allen weiteren Tabellen abgekürzt als % Restaktivität) wurde auf der Grundlage der auf diese Weise erhaltenen Daten errechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Tabelle 1 Beispiel Ammoniumisobutyrat Aktivität vor dem Stehenlassen Aktivität nach dem Stehenlassen % Restaktivität Beispiel 1 zugesetzt Vergleichsbeispiel 1 keines

Beispiele 2 bis 6 und Vergleichsbeispiele 2 bis 6

Jeder aliquote Teil eines Suspension von Zellen einer Gattung, wie sie in Tabelle 2 dargestellt sind, hergestellt, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, wurde der Behandlung in der französischen Presse und der Zentrifugierung analog, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, unterworfen, wodurch ein Zellextrakt erhalten wurde.
Der auf diese Weise erhaltene Zellextrakt wurde in zwei aliquote Teile geteilt, wonach 1 ml eines aliquoten Teils mit 1 ml M/10 Phosphatpuffer (pH 6,5) mit einem Gehalt von 10 g/l Ammoniumisobutyrat vermischt wurde und 1 ml des anderen aliquoten Teils mit 1 ml M/10 Phosphatpuffer (pH 6,5) als Vergleichsbeispiel vermischt wurde. Beide Lösungen wurden 2 Tage bei 20ºC stehengelassen, und die Nitrilhydratisierungsaktivitätswerte wurden vor und nach dem Stehenlassen jeder Lösung bestimmt, um die prozentuale Restaktivität zu errechnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2 Beispiel Gattung Stamm % Restaktivität Beispiel 2 Bacillus Beispiel 3 Bacteridium Beispiel 4 Micrococcus Beispiel 5 Brevibacterium Beispiel 6 Nocardia Vergleichsbeispiel 2 Bacillus Vergleichsbeispiel 3 Bacteridium Vergleichsbeispiel 4 Micrococcus Vergleichsbeispiel 5 Brevibacterium Vergleichhsbeispiel 6 Nocardia

Beispiele 7 bis 24 und Vergleichsbeispiel 7

Jeder aliquoter Teil in einer Menge von 2,5 ml eines Zellextraktes (0,8·10³ U/ml), der, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, hergestellt worden war, wurde mit 2,5 ml M/10 Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 10 mg eines in Tabelle 3 angegebenen Amids versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 6,5 eingestellt, und die erhaltene Lösung wurde danach 2 Tage bei 20ºC stehengelassen. Die prozentuale Restaktivität wurde analog berechnet, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, worauf die Ergebnisse erhalten wurden, die in Tabelle 3 zusammengefaßt sind. Tabelle 3 Beispiel Zugesetztes Amid % Restaktivität Vergleichsbeispiel 7 keines Beispiel 7 Acetamid Beispiel 8 Propionamid Beispiel 9 n-Butyramid Beispiel 10 Isobutyramid Beispiel 11 n-Valeramid Beispiel 12 n-Capronamid Beispiel 13 Glycinamid Beispiel 14 β-Aminopropionamid Beispiel 15 Lactmid 50 Beispiel 16 β-Hydroxypropionamid Beispiel 17 Acrylamid Beispiel 18 Methacrylamid Beispiel 19 Malondiamid Beispiel 20 Succindiamid Beispiel 21 Benzamid Beispiel 22 Nicotinamid Beispiel 23 Chloracetamid Beispiel 24 β-Chlorpropionamid

Beispiele 25 bis 41 und Vergleichsbeispiel 8

Die Verfahren gemäß Beispielen 7 bis 24 wurden mit der Abweichung wiederholt, daß die zugesetzten Amide durch organische Säuren ersetzt wurden und der pH-Wert der Lösung auf 6,5 eingestellt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4 Beispiel Zugesetzte organische Säure Restaktivität Vergleichsbeispiel 8 keine 21 Beispiel 25 Ameisensäure 48 Beispiel 26 Essigsäure 55 Beispiel 27 Propionsäure 78 Beispiel 28 Isobuttersäure Beispiel 29 Valeriansäure 81 Beispiel 30 Capronsäure Beispiel 31 β-Aminopropionsäure 45 Beispiel 32 Apfelsäure 43 Beispiel 33 Glycolsäure 52 Beispiel 34 DL-Glycerinsäure 60 Beispiel 35 Oxalessigsäure 68 Beispiel 36 Bernsteinsäure 59 Beispiel 37 Benzosäure 48 Beispiel 38 Monochloressigsäure 39 Beispiel 39 Glyoxylsäure 72 Beispiel 40 Acrylsäure 53 Beispiel 41 Methacrylsäure 59

Beispiele 42 bis 50 und Vergleichsbeispiele 9 bis 12

Jeder aliquote Teil in einer Menge von 2,5 ml eines Zellextraktes (1,8·10³ U/ml), hergestellt, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, wurde mit 2,5 ml M/10 Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 25 mg eines in Tabelle 5 aufgeführten Stabilisators versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf einen vorherbestimmten Wert eingestellt, und die erhaltene Lösung wurde 2 Tage bei 20ºC stehengelassen.
Die Nitrilhydratisierungsaktivitätswerte wurden vor und nach Stehenlassen jeder Lösung bestimmt, um die prozentuale Restaktivität zu errechnen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Tabelle 5 Beispiel 9 Zugesetzter Stabilisator pH % Restaktivität Vergleichsbeispiel 9 keiner Vergleichsbeispiel 10 keiner Vergleichsbeispiel 11 keiner Vergleichsbeispiel 12 keiner Beispiel 42 Isobutyramid Beispiel 43 Isobutyramid Beispiel 44 Isobutyramid Beispiel 45 Isobutyramid Beispiel 46 Isobuttersäure Beispiel 47 Isobuttersäure Beispiel 48 Isobuttersäure Beispiel 49 Isobuttersäure Beispiel 50 Isobuttersäure

Beispiele 51 bis 62 und Vergleichsbeispiel 13

Jeder aliquote Teil in einer Menge von 2,5 ml eines Zellextraktes (0,7·10³ U/ml), hergestellt, wie in Vergleichsbeispiel 1 beschrieben, wurde mit 2,5 ml M/10 Phosphatpuffer mit einem vorherbestimmten Gehalt an einem Stabilisator, wie er in Tabelle 6 aufgeführt ist, versetzt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 6,0 (6,5 für die Lösung, die keinen Stabilisator enthielt) eingestellt, und die erhaltene Lösung wurde dann 2 Tage bei 20ºC stehengelassen.
Die Nitrilhydratisierungsaktivitätswerte wurden vor und nach Stehenlassen jeder Lösung ermittelt, um die prozentuale Restaktivität zu errechnen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefaßt. Tabelle 6 Beispiel Zugesetzter Stabilisator Konzentration (g/l) % Rest-Aktivität Vergleichhsbeispiel 13 keiner Beispiel 51 Butyramid Beispiel 57 Buttersäure Konzentration: Konzentration des Stabilisators in der stehengelassenen Lösung

Beispiel 63 und Vergleichsbeispiel 14

40 ml eines Zellextrakts, der, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt worden war, 4,5 g Acrylamid, 0,5 g N,N'- Methylenbisacrylamid und 40 ml M/20 Phosphatpuffer (mit einem Gehalt von 10 g/l Ammoniumisobutyrat und einem pH von 6,0) wurden zu einer homogenen Suspension vermischt. Diese Suspension wurde mit 5 ml einer 5%igen wäßrigen Lösung von Dimethylaminopropionitril und 10 ml einer 1,0%igen wäßrigen Lösung Kaliumpersulfat versetzt, und das Gemisch wurde 30 min bei 10ºC gehalten, um Polymerisation zu bewirken. Es wurde eine Masse an zellhaltigem Gel erhalten, die in kleine Teilchen zerstoßen wurde, die gründlich mit M/20 Phosphatpuffer mit einem Gehalt von 5 g/l Ammoniumisobutyrat und einem pH-Wert von 7,0 gewaschen wurden, wodurch etwa 90 g eines immobilisierten Enzyms erhalten wurden.
Das gewaschene, immobilisierte Enzym, das auf diese Weise erhalten wurde, wurde in denselben Puffer mit einem Gehalt von 5 g/l Isobuttersäure eingebracht und 3 Tage bei 20ºC stehengelassen.
Zu Vergleichszwecken wurde das Enzym immobilisiert und ähnlich gewaschen, jedoch unter Verwendung von Phosphatpuffer, der kein Ammoniumisobutyrat enthielt, und das erhaltene immobilisierte Enzym wurde 5 Tage bei 20ºC stehengelassen.
Die Nitrilhydratisierungsaktivitätswerte der Gelproben wurden wie folgt vor und nach dem Stehenlassen der immobilisierten Enzyme gemessen.
1 g des immobilisierten Gels wurde mit 5 g Acrylnitril und 97 ml M/20 Phosphatpuffer (pH 7,7) vermischt, und das Gemisch wurde 20 min bei 0ºC unter Rühren umgesetzt. Die Mengen an Acrylamid (AA) in den entsprechenden Reaktionslösungen wurden gaschromatographisch bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 zusammengefaßt. Tabelle 7 Beispiel Ammoniumisobutyrat Menge an vor dem Stehenlassen des Enzyms erzeugtem AA (%) Menge an nach dem Stehenlassen des Enzyms erzeugtem AA (%) Beisp. 63 Immobilisiert mit Zusatz von Isobuttersäure + Stehenlassen in Pufferlösung, die Isobuttersäure enthielt Vergl.-beisp. 14 keines

Claims

1. Verfahren zur Erhaltung der Nitrilhydratisierungsaktivität von Nitrilase, die von einem grampositiven Mikroorganismus oder einer unbeweglich gemachten Form davon hergestellt worden ist, die beide eine Nitrilhydratisierungsaktivität aufweisen, wobei man als Stabilisator mindestens eine Verbindung aus der Gruppe der Amide sowie der organischen Säuren und Salzen davon einer Lösung oder Suspension der Nitrilase oder der unbeweglich gemachten Form davon zusetzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Konzentration des Amids und der organischen Säure oder des Salzes davon in der Lösung oder Suspension im Bereich von 0,01 bis 50 g/l liegt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der pH-Wert der Lösung oder Suspension im Bereich von 5 bis 8 liegt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus aus den Gattungen Corynebacterium, Nocardia, Rhodococcus, Bacillus, Bacteridium, Microcoecus und Brevibacterium ausgewählt ist.