DE60223250T2

DE60223250T2 - Verfahren zur herstellung von alpha-hydroxysäure, glycolsäure und 2-hydroxyisobuttersäure aus dem entsprechenden alpha-hydroxynitril mittels nitrilase

Info

Publication number: DE60223250T2
Application number: DE60223250T
Authority: DE
Inventors: Sarita Landenburg CHAUHAN; Robert Rockland DICOSIMO; Robert D. Elkton FALLON; John E. Wilmington GAVAGAN; Mark S. Wilmington PAYNE
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: CA2433036A1; CN100402652C; US6383786B1; JP2005504506A; EP1399567B1; CN1549860A; DE60223250D1; US6416980B1; MXPA03007484A; KR20040004535A; EP1399567A1; WO2002068658A1; JP4235450B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von α-Hydroxysäuren unter Anwendung eines Katalysators mit Nitrilaseaktivität. Noch spezifischer bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung von Glykolsäure aus Glykolnitril oder 2-Hydroxyisobuttersäure aus Acetoncyanohydrin unter Anwendung eines Katalysators, der eine Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität besitzt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es sind verschiedene Methoden zum Herstellen von α-Hydroxysäuren bekannt, bei denen das entsprechende α-Hydroxynitril als Ausgangsmaterial und ein Mikroorganismus als Katalysator verwendet werden. Beispiele hergestellter α-Hydroxysäuren umfassen: Glykolsäure, Milchsäure, 2-Hydroxyisobuttersäure, 2-Hydroxy-2-hydroxyphenylpropionsäure, Mandelsäure, 2-Hydroxy-3,3-dimethyl-4-butyrolacton und 4-Methylthiobuttersäure.
Diese Produkte werden mit Hilfe von Mikroorganismen wie beispielsweise denjenigen, die zur Gattung Nocardia, Bacillus, Brevibacterium, Aureobacterium, Pseudomonas, Caseobacter, Alcaligenes, Acinetobacter, Enterobacter, Arthrobacter, Escherichia, Micrococcus, Streptomyces, Flavobacterium, Aeromonas, Mycoplana, Cellulomonas, Erwinia, Candida, Bacteridium, Aspergillus, Penicillium, Cochliobolus, Fusarium, Rhodopseudomonas, Rhodococcus, Corynebacterium, Microbacterium, Obsumbacterium und Gordona gehören, synthetisiert. ( JP-A-4-99495 , JP-A-4-99496 und JP-A-4-218385 , die der US-Patentschrift Nr. 5223416 entsprechen; JP-A-4-99497 , das der US-Patentschrift Nr. 5234826 entspricht; JP-A-5-95795 , das der US-Patentschrift Nr. 5296373 entspricht; JP-A-5-21987 ; JP-A-5-192189 , das der US-Patentschrift Nr. 5326702 entspricht; JP-A-6-237789 , das der EP-A-0610048 entspricht; JP-A-6-284899 , das der EP-A-0610049 entspricht; JP-A-7-213296 , das der US-Patentschrift Nr. 5508181 entspricht.)
Jedoch wird bei den meisten Methoden zur Herstellung von α-Hydroxysäuren aus den entsprechenden α-Hydroxynitrilen, wie oben erwähnt, kein Produkt in ausreichend hoher Konzentration hergestellt und angesammelt, um die kommerziellen Erfordernisse zu befriedigen. Dies ist häufig auf die Enzyminaktivierung zu einem frühen Zeitpunkt in der Reaktionsperiode zurückzuführen. Die US 5756306 lehrt, dass „Wenn ein α-Hydroxynitril enzymatisch mit Hilfe von Nitrilase oder Nitrilhydratase hydrolysiert oder hydratisiert wird, um eine α-Hydroxysäure oder ein α-Hydroxyamid herzustellen, so tritt ein Problem dahingehend auf, dass das Enzym innerhalb einer kurzen Zeitspanne inaktiviert wird. Es ist daher schwierig, die α-Hydroxysäure oder das α-Hydroxyamid in hoher Konzentration und hoher Ausbeute zu erhalten" (Spalte 1, Zeilen 49–54).
Die US 5508181 befasst sich des Weiteren mit Schwierigkeiten, die mit der schnellen Enzyminaktivierung zusammenhängen. Spezifisch erwähnt die US 5508181 , dass α-Hydroxynitrilverbindungen sich teilweise zu den entsprechenden Aldehyden dem Disassoziationäquilibrium entsprechend disassoziieren. Diese Aldehyde inaktivieren das Enzym innerhalb einer kurzen Zeitspanne durch Binden an das Protein, so dass es schwierig wird, α-Hydroxysäure oder α-Hydroxyamid in einer hohen Konzentration mit hoher Produktivität aus α-Hydroxynitrilen zu erhalten (Spalte 2, Zeilen 16–29). Als Lösung zur Verhinderung der Enzyminaktivierung aufgrund des Ansammeln von Aldehyden wurden Phosphat- oder Hypophosphitionen der Reaktionsmischung hinzugegeben. Die US 5326702 ist der US 5508181 ähnlich, mit der Ausnahme, dass Sulfit-, Disulfit- oder Dithionitionen zum Sequestrieren von Aldehyd und Verhindern der Enzyminaktivierung verwendet werden. Jedoch ist die Konzentration der hergestellten und angesammelten α-Hydroxysäure selbst bei Anwendung derartiger Zusatzmittel, wie sie oben beschrieben sind, nicht hoch.
Die US 6037155 lehrt auch, dass eine geringe Ansammlung von α-Hydroxysäureprodukten mit der Enzyminaktivierung innerhalb kurzer Zeit aufgrund der Ansammlung von disassoziiertem Aldehyd verbunden ist. Diese Erfinder schlagen vor, dass die enzymatische Aktivität durch die Anwesenheit von Blausäure gehemmt wird (Agricultural Biological Chemistry, Band 46, Seite 1165 (1982)), die bei der partiellen Disassoziation von α-Hydroxynitril in Wasser zusammen mit dem entsprechenden Aldehyd oder Keton gebildet wird (Chemical Reviews, Band 42, Seite 189 (1948)). Die Erfinder haben das Problem der durch Aldehyd induzierten Enzyminaktivierung durch Verwendung von Mikroorganismen gelöst, deren Enzymaktivität durch Zusetzen einer Cyanidsubstanz zur Reaktionsmischung verbessert werden konnte. Der Zusatz einer Cyanidsubstanz begrenzte die Disassoziation eines α-Hydroxynitrils zu Aldehyd und Blausäure. Das Aufrechterhalten der Aldehydkonzentration (die durch die Disassoziation eines α-Hydroxynitrils zu Aldehyd und Blausäure gebildet wird) und/oder der α-Hydroxynitrilkonzentration in der Reaktionsmischung innerhalb eines spezifischen Bereichs ist eine Methode, um dieses Problem zu vermeiden.
Glykolsäure (HOCH₂COOH; CAS-Nummer 79-14-1) ist das einfachste Mitglied der α-Hydroxysäurefamilie von Carbonsäuren. Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften ist sie für ein breites Spektrum von Anwendungen durch den Verbraucher und in der Industrie, einschließlich der Verwendung bei der Wasserquellensanierung, in der Lederindustrie, der Öl- und Gasindustrie, der Wäscherei- und Textilindustrie und als Komponente in persönlichen Pflegeprodukten wie Hautcremes ideal. Glykolsäure ist auch der Hauptbestandteil für Reinigungsmittel für eine Reihe verschiedener Industrien (Reinigungsmittel für Molkerei- und Nahrungsmittelverarbeitungsgeräte, Haushaltsreinigungsmittel und Reinigungsmittel für den öffentlichen Sektor, Industriereiniger [für Transporteinrichtungen, Mauerwerk, gedruckte Schaltungen, Edelstahlerhitzer und Verarbeitungseindrichtungen und Kühltürme/Wärmeaustauscher] und die Metallverarbeitung [für das Beizen von Metall, das Glänzendmachen von Kupfer, Ätzen, Galvanisieren, Elektropolieren]). Eine neue Technologie zur kommerziellen Herstellung von Glykolsäure würde von der Industrie mit großer Freude aufgenommen werden.
Spezifisch bezüglich der Herstellung von Glykolsäure ist Glykolnitril dafür bekannt, dass es sich reversibel zu Blausäure und Formaldehyd disassoziiert, die beide die Enzymaktivität inaktivieren können. Die US 3940316 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen einer organischen Säure aus dem entsprechenden Nitril mit Hilfe eines Bakteriums mit „Nitrilase"-Aktivität und fuhrt Glykolnitril als Substrat auf. Insbesondere beschreibt dieses Patent die Verwendung von Bacillus, Bacteridium, Micrococcus und Brevibacterium für diesen Zweck. Obwohl Brevibacterium R312 als eine Nitrilaseaktivität aufweisend beschrieben ist, ist es der einzige Stamm, der in allen Beispielen der US 3940316 verwendet wird. Brevibacterium R312 ist dafür bekannt, dass es Nitrilhydratase- und -amidaseaktivitäten, jedoch keine Nitrilaseaktivität aufweist (Tourneix et al., Antonie van Leeuwenhoek, 1986, 52: 173–182). Die JP 09028390 offenbart eine Methode zur Herstellung von hochreiner Glykolsäure aus Glykolnitril durch die Wirkung von Rhodococcus- oder Gordona-Hydrolase. Die Selektivität für Glykolsäure wird als fast 100%-ig ohne Bildung von Glykolsäureamid berichtet.
2-Hydroxyisobuttersäure (CAS-Nummer 594-61-6) wird als Zwischenprodukt bei der Herstellung industrieller Materialien verwendet, die in einer Reihe verschiedener Industrien, einschließlich Klebstoffen und Beschichtungen, nützlich sind.
Eine Methode zum Herstellen von Milchsäure, Glykolsäure und 2-Hydroxyisobuttersäure unter Anwendung eines Mikroorganismus, der zu Corynebacterium spp. gehört, ist in der offengelegten Japanischen Patentschrift Nr. Sho 61-56086 offenbart. 2-Hydroxyisobuttersäure ist auch schon aus Acetoncyanohydrin mit Hilfe von Mikroorganismen hergestellt worden, die zur Gattung Rhodococcus, Pseudomonas, Arthrobacter oder Brevibacterium ( JP 04040897 A2 ) und Achromobacter ( JP 06237776 A2 ) gehören. Die Effizienz der 2-Hydroxyisobuttersäureherstellung bei Verwendung von Rhodococcus rhodochrous (ATCC 19140) wurde durch Zusetzen von Aceton in einer Konzentration von 0,5–50 Gew.-% zur Reaktionsmischung ( JP 05219969 A2 ) vermutlich durch Sequestrierung von Blausäure verbessert.
Die US 6037155 bietet ebenfalls Beispiele von Methoden zur Herstellung von α-Hydroxysäuren aus α-Hydroxynitrilen, einschließlich Glykolsäure und 2-Hydroxyisobuttersäure. Diese Offenbarung bestätigt, dass nicht alle mikrobiellen Katalysatoren hohe Konzentrationen von Glykolsäure aufgrund der oben erwähnten Probleme bilden können und gibt an, dass Studien zum Screenen durchgeführt werden müssen, um industriell vorteilhafte Mikroorganismen zu finden. Spezifisch identifiziert die US 6037155 Mikroorganismen, die zu Variovorax spp. und Arthrobacter spp. gehören und gegen die unterdrückende Wirkung von α-Hydroxynitril oder α-Hydroxysäure widerstandsfähig sind, eine dauerhafte Aktivität aufweisen und das erwünschte Produkt in hoher Konzentration bilden können.
Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) ist durch aliphatische Nitrilase-(EC 3.5.5.7) Aktivität sowie eine Kombination von Nitrilhydratase-(EC 4.2.1.84)- und Amidase-(EC 3.5.1.4) Aktivitäten gekennzeichnet. Die US 5858736 beschreibt die Verwendung der Nitrilaseaktivität dieser Mikrobe als Katalysator für die Hydrolyse von aliphatischen α, ω-Dinitrilen zu den entsprechenden ω-Cyanocarbonsäuren und Ammoniak in einer wässrigen Reaktionsmischung. Die Nitrilase erwies sich als äußerst regioselektiv, wobei die Hydrolyse eines α-Alkyl-α,ω-dinitrils nur die ω-Cyanocarbonsäure bildete, die aus der Hydrolyse der ω-Nitrilgruppe herrührte. Die US 5814508 offenbart das Erhitzen einer Suspension von Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) in einem geeigneten Puffermittel bei 35–70°C für eine kurze Zeitspanne, um die unerwünschte Nitrilhydratase- und -amidaseaktivitäten des Ganzzellenkatalysators zu deaktivieren, ohne eine signifikante Reduzierung der erwünschten Nitrilaseaktivität hervorzurufen.
Wie oben veranschaulicht, hat sich das Entwickeln eines industriellen Verfahrens unter Anwendung eines Nitrilasekatalysators zur effizienten Herstellung von α-Hydroxysäuren als schwierig erwiesen. Wenn die Konzentration eines Produkts gering ist, so ist es den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt, dass das Verfahren im Allgemeinen kompliziert ist, insbesondere bezüglich des Trennens des Produkts von unreagiertem Ausgangsmaterial oder des Isolieren einer geringen Menge des erwünschten Produkts von einem großen Volumen von Produktmischung. Das Problem, das gelöst werden muss, bleibt weiterhin das Fehlen eines leicht anzuwendenden enzymatischen Katalysators zum Umwandeln von α-Hydroxynitrilen in die entsprechende Säure in einem Verfahren, das durch hohe Ausbeute, hohe Konzentration und hohe Selektivität gekennzeichnet ist und die zusätzlichen Vorteile eines niedrigen Temperaturbedarfs und einer geringen Ausschussproduktion aufweist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bietet ein Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure aus dem entsprechenden α-Hydroxynitril mit hoher Selektivität und hoher Umwandlung. Die Erfindung weist die Schritte des (a) Kontaktieren eines α-Hydroxynitrils in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator auf, der durch eine von Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) abgeleiteten Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der in (a) gebildeten α-Hydroxysäure.
Noch spezifischer bietet die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Glykolsäure aus Glykolnitril mit hoher Selektivität und einer hohen Umwandlung. Die Erfindung weist die Schritte des (a) Kontaktieren von Glykolnitril in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator, der durch eine von Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) abgeleiteten Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der in (a) hergestellten Glykolsäure. Außerdem bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung 2-Hydroxyisobuttersäure aus Acetoncyanohydrin unter Anwendung eines Katalysators, der eine Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität aufweist.
Bei weiteren Ausführungsformen der Erfindung wird ein Katalysator verwendet, der eine Nitrilaseaktivität in Form ganzer mikrobieller Zellen, permeabilisierter mikrobieller Zellen, einer oder mehrerer Zellkomponenten eines mikrobiellen Zellextrakts und eines teilweise gereinigten Enzyms bzw. teilweise gereinigter Enzyme oder eines gereinigten Enzyms bzw. gereinigter Enzyme vorliegt. Mikroorganismen, die durch eine Nitrilaseaktivität gekennzeichnet und in dem Verfahren nützlich sind, sind Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) und seine Mutanten, Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745). Außerdem werden erfindungsgemäß transformierte mikrobielle Zellen, die eine A. facilis-Nitrilaseaktivität enthalten, verwendet. Escherichia coli SS1001 (ATCC PTA-1177) und Escherichia coli SW91 (ATCC PTA-1175) sind Beispiele eines derartigen transformierten mikrobiellen Zellkatalysators.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werde ganze mikrobielle Zellen, die durch (1) Nitrilaseaktivität und (2) Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten gekennzeichnet sind, als Enzymkatalysator für das Umwandeln von Glykolnitril zu Glykolsäure oder von Acetoncyanohydrin zu 2-Hydroxyisobuttersäure verwendet. Eine bevorzugte ganze Zelle ist der A. facilis 72 W-Stamm. Jedoch werden vor der Verwendung als Katalysator die ganzen mikrobiellen A. facilis 72 W-Zellen auf eine Temperatur von etwa 35°C bis 70°C 10 bis 120 Minuten lang erhitzt, wodurch die Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten zerstört werden und die Nitrilaseaktivität konserviert wird. Bei dieser Behandlung wird die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten (jeweils Glykolamid oder 2-Hydroxyisobutteramid) vermieden. Fehlen den Mutanten und transformierten ganzen mikrobiellen Zellen die Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten, so ist kein Erhitzungsbehandlungsschritt erforderlich. Escherichia coli SS1001 (ATCC PTA-1177) und Escherichia coli SW91 (ATCC PTA-1175) sind Beispiele eines transformierten mikrobiellen Zellkatalysators, dem die Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten fehlen.
In irgendeiner Form und wahlweise kann der Enzymkatalysator in oder auf einem löslichen oder unlöslichen Träger immobilisiert werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER BIOLOGISCHEN HINTERLEGUNG

Die Anmelder haben folgende biologische Hinterlegungen unter den Bedingungen der Budapest Treaty an the International Recognition of Microorganisms zum Zwecke des Patentverfahrens durchgeführt:

Hinterlegeridentifikationsbezugsnummer	Internationale Hinterlegungsbezeichnung	Datum der Hinterlegung
Acidovorax facilis 72-PF-17	ATCC 55745	8. März 1996
Acidovorax facilis 72 W	ATCC 55746	8. März 1996
Acidovorax facilis 72-PF-15	ATCC 55747	8. März 1996
Escherichia coli SS1001	ATCC PTA-1177	11. Januar 2000
Escherichia coli SW91	ATCC PTA-1175	11. Januar 2000

Wie hier verwendet bezieht sich „ATCC" auf die American Type Culture Collection International Depository Authority, ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA. Die „internationale Hinterlegungsbezeichnung" ist die Zugangsnummer zu der bei ATCC hinterlegten Kultur.
Die aufgelisteten Hinterlegungen werden an der angegebenen internationalen Hinterlegungsstelle mindestens dreißig (30) Jahre lang aufbewahrt und der Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patents, das sie offenbart, zur Verfügung gestellt. Die Verfügbarkeit einer Hinterlegung stellt keine Lizenz zum praktischen Durchführen der betreffenden Erfindung unter Beeinträchtigung der durch Regierungsmaßnahmen erteilten Patentrechte dar.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben das angegebene Problem durch Bereitstellen eines Verfahrens zur Herstellung von α-Hydroxysäuren aus dem entsprechenden α-Hydroxynitril in hohen Ausbeuten und in hoher Konzentration unter Anwendung der Nitrilaseaktivität von Acidovorax facilis 72 W gelöst. Die Anmelder haben insbesondere das angegebene Problem durch Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen von Glykolsäure aus dem entsprechenden Glykolnitril in hohen Ausbeuten und in hoher Konzentration unter Anwendung der Nitrilaseaktivität von Acidovorax facilis 72 W gelöst. Außerdem betrifft die Erfindung die Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure aus Acetoncyanohydrin mit Hilfe eines Katalysators, der eine Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität aufweist. Das Produkt wird mit hoher Selektivität und hohen Umwandlungsraten hergestellt.
Die durch die vorliegende Erfindung hergestellte Glykolsäure, 2-Hydroxyisobuttersäure oder α-Hydroxysäure finden in einer Reihe verschiedener Industrien nützliche Anwendung. Beispielsweise wird die 2-Hydroxyisobuttersäure als Zwischenprodukt zum Herstellen von Methacrylsäure verwendet. Die Erfindung bietet wünschenswerte Verfahrensvorteile durch geringe Temperaturerfordernisse und geringe Ausschussbildung im Vergleich mit vorher bekannten Methoden.
Die Erfindung umfasst die Schritte des (a) Kontaktieren eines α-Hydroxynitrils in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator, der durch Nitrilaseaktivität (EC 3.5.5.7) oder durch Nitrilhydratase-(EC 4.2.1.84) und Amidase-(EC 3.5.1.4) Aktivitäten gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der entsprechenden, in (a) gebildeten α-Hydroxysäure als Säure oder entsprechendes Salz. Bin Nitrilaseenzym wandelt ein aliphatisches Nitril direkt in die entsprechende Carbonsäure ohne Bildung des entsprechenden Amids als Zwischenprodukt (Gleichung 1) um. Gleichung 1
DEFINITIONEN
In dieser Offenbarung werden eine Anzahl von Begriffen und Abkürzungen benutzt. Die folgenden Definitionen treffen zu, es sei denn, es wird spezifisch etwas Anderes angegeben.
Der Begriff „Katalysator", „Enzymkatalysator" oder „ganzer mikrobieller Zellkatalysator" bezieht sich auf einen Katalysator, der durch eine Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist. Der Enzymkatalysator kann in Form einer ganzen mikrobiellen Zelle, permeabilisierten mikrobiellen Zelle(n), einer oder mehreren Zellkomponenten eines teilweise gereinigten Enzyms oder teilweise gereinigter Enzyme oder gereinigten Enzyms oder gereinigter Enzyme vorliegen.
Die Begriffe „Acidovorax facilis" und „A. facilis" werden austauschbar verwendet.
Die Begriffe „Escherichia coli" und „E. coli" werden austauschbar verwendet.
Der Begriff „Glykolnitril" ist mit Hydroxyacetonitril, 2-Hydroxyacetonitril, Hydroxymethylnitril und allen anderen Synonymen der CAS-Nummer 107-16-4 synonym.
Der Begriff „Glykolsäure" ist mit Hydroxyessigsäure, Hydroxyethanonsäure und allen anderen Synonymen der CAS-Nummer 79-14-1 synonym.
Der Begriff „Acetoncyanohydrin" ist mit 2-Hydroxy-2-methyl-propannitril, 2-Methyllactonitril, α-Hydroxyisobutyronitril; 2-Cyano-2-hydroxypropan; 2-Cyano-2-propanol, 2-Hydroxy-2-cyanopropan, 2-Hydroxy-2-methylpropannitril, 2-Hydroxy-2-methylpropionitril, 2-Hydroxyisobutyronitril, 2-Methyl-2-hydroxypropionitril, 2-Methyllactonitril, 2-Propanoncyanohydrin, Dimethylketoncyanohydrin und allen anderen Synonymen der CAS-Nummer 75-86-5 synonym.
Der Begriff „2-Hydroxyisobuttersäure" ist mit 2-Hydroxy-2-methylpropanonsäure, 2-Methylmilchsäure, α-HIB, α-Hydroxy-α-methylpropanonsäure, α-Hydroxyisobutanonsäure, α-Hydroxyisobuttersäure, 2-Hydroxy-2-methylpropanonsäure, 2-Hydroxy-2-methylpropionsäure, 2-Methylmilchsäure, Acetonsäure, Hydroxydimethylessigsäure und allen anderen Synonymen der CAS-Nummer 594-61-6 synonym.
Der Begriff „geeignete wässrige Reaktionsmischung" bezieht sich auf die Materialien und Wasser, in denen das α-Hydroxynitril (z. B. Glykolnitril oder Acetoncyanohydrin) und der Enzymkatalysator in Kontakt kommen. Tabellen, die Komponenten der geeigneten wässrigen Reaktionsmischung beschreiben, werden hier bereitgestellt und die mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleute sind sich der Reihe der verschiedenen Komponentenvariationen, die für dieses Verfahren geeignet sind, bewusst.
Die Abkürzungen in der Beschreibung entsprechen Messeinheiten, Techniken, Eigenschaften oder Verbindungen wie folgt: „sec" bedeutet Sekunde(n), „min" bedeutet Minute(n), „h" bedeutet Stunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „ml" bedeutet Milliliter, „l" bedeutet Liter, „mM" bedeutet millimolar, „M" bedeutet molar, „mMol" bedeutet Millimol(e) und „Gew." bedeutet Gewicht. „HPLC" bedeutet Hochleistungsflüssigchromatografie, „ca." bedeutet ungefähr, „OD" bedeutet optische Dichte bei der angegebenen Wellenlänge, „IE" bedeutet internationale Einheiten.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
METHODEN UND MATERIALIEN
Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) ist ein Mikroorganismus, der durch eine Nitrilaseaktivität gekennzeichnet und bei dem Verfahren nützlich ist. Ganze mikrobielle Zellen, die durch (1) Nitrilaseaktivität und (2) Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten gekennzeichnet sind, können als Enzymkatalysator verwendet werden. Eine bevorzugte ganze Zelle ist der A. facilis 72 W-Stamm. Jedoch werden ganze mikrobielle A. facilis 72 W Zellen vor Verwendung als Katalysator 10 bis 120 Minuten lang auf eine Temperatur von etwa 35°C bis 70°C erhitzt, wodurch die Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten zerstört werden und die Nitrilaseaktivität erhalten bleibt ( US 5814508 ). Diese Hitzebehandlung ergibt einen Katalysator, der die Bildung eines unerwünschten Nebenprodukts (Glykolamid oder 2-Hydroxyisobutyramid), das erhalten wird, wenn die Umwandlung des entsprechenden α-Hydroxynitrils nicht vollständig ist, vermeidet. Dort, wo Mutanten und transformierten ganzen mikrobiellen Zellen die unerwünschten Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten fehlen, ist kein Hitzebehandlungsschritt erforderlich.
Es sind zwei Mutanten des Acidovorax facilis 72 W-(ATCC 55746) Stamms hergestellt worden ( US 5858736 ), die nur sehr geringe Niveaus der unerwünschten Nitrilhydrataseaktivität erzeugen, die für die nicht regioselektive Nitrilhydrolyse aliphatischer Dinitrile verantwortlich sind. Diese Mutantenstämme, nämlich Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747) und Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745) erfordern keine Hitzebehandlung der Zellen vor der Verwendung als erfindungsgemäßen Katalysator.
Transformierte mikrobielle Zellen, die die A. facilis-Nitrilaseaktivität enthalten und denen die Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten fehlen, sind erfindungsgemäß nützlich. Escherichia coli SS1001 (ATCC PTA-1177) und Escherichia coli SW91 (ATCC PTA-1175) sind Beispiele eines derartigen transformierten mikrobiellen Zellkatalysators.
WACHSTUM DES ACIDOVORAX FACILIS-STAMMS 72 W (ATCC55746)

Eine Phiole einer gefrorenen Samencharge von Acidovorax facilis–Stamm 72 W (ATCC 55746) wurde aufgetaut und die Inhalte von 1 ml in 500 ml steriles Inokulummedium (Komponenten unten in den Tabellen 1 und 2 angegeben) eingegeben. Das Inokulum wurde unter Schütteln bei 250 UpM in einem Kolben von 21 bei 30°C 24–30 h lang gezüchtet. TABELLE 1

Inokulummedium
Komponente	Endkonzentration	Komponente	Endkonzentration
Monobasisches Kaliumphosphat	1,5 g/l	Zweibasisches Kaliumphosphat	3,4 g/l
Ammoniumsulfat	1,5 g/l	Trinatriumcitrat-Dihydrat	1 g/l
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	0,4 g/l	Spurenmetalllösung (unten)	1 ml/l
Amberex 695 (Universal Foods)	1 g/l	Glycerin (getrennt sterilisiert)	8 g/l

TABELLE 2

Spurenmetalllösung
Komponente	Stammkonzentration	Komponente	Stammkonzentration
Salzsäure	10 ml/l	Zinksulfat-Heptahydrat	1,77 g/l
Calciumchlorid-Dihydrat	11,4 g/l	Natriummolybdat- Dihydrat	0,05 g/l
Mangansulfat-Monohydrat	1,23 g/l	Vanadylsulfat-Dihydrat	0,08 g/l
Kupfersulfat-Pentahydrat	0,63 g/l	Nickelnitrat-Hexahydrat	0,04 g/l
Kobaltchlorid-Hexahydrat	0,16 g/l	Natriumselenit	0,04 g/l
Borsäure	0,91 g/l	Eisen(II)sulfat-Heptahydrat	6,0 g/l

Das Inokulum aus dem Schüttelkolben wurde aseptisch in einen vorsterilisierten Braun Biostat C-Fermentor übertragen, der Fermentormedium enthielt (Komponenten unten in Tabelle 3 angegeben). Das Wachstum erfolgte unter folgenden Bedingungen: 32°C, pH-Wert 6,8–7,0, Sauerstoff in einer Konzentration von 25% der Sättigung gelöst. Bei der Inokulation enthielt der Fermentor 8,5 l Fermentormedium plus 218 g Nährspeiselösung, was eine Ausgangskonzentration von etwa 7 g/l Glycerin ergab. Die Nährspeiselösung enthielt folgende Komponenten, die getrennt sterilisiert und nach dem Kühlen kombiniert wurden: monobasisches Kaliumphosphat, 19,6 g in 0,25 l entionisiertem Wasser; Magnesiumsulfat-Heptahydrat 3,3 g plus Schwefelsäure, 4 ml, in 0,15 l entionisiertem Wasser; Spurenmetalllösung (Komponenten oben in Tabelle 2 aufgeführt), 67 ml, plus 400 g Glycerin in 0,80 Litern entionisiertem Wasser. 18 h nach der Impfung begann das Einführen von Nährspeiselösung. Zu Beginn wurde die Nährspeiselösung mit einer Rate von 0,4 g Einspeisung/min (0,15 g Glycerin/min) zugesetzt. Die Kultur-OD 550 betrug etwa 8–9. Nach 26 h wurde die Einspeiserate auf 0,9 g Einspeisung/min (0,3 g Glycerin/min) erhöht. Die OD 550 betrug etwa 16–18. Eine letztliche Erhöhung der Einspeiserate auf 1,8 g Einspeisung/min (0,6 Glycerin/min) erfolgte nach 34 h. Diese Rate wurde bis zum Schluss des Laufs (etwa 42 h) fortgeführt. Die endgültige OD 550 betrug etwa 65–75. TABELLE 3

Fermentormedium

Komponente Stamm- konzentration Komponente Stammkonzentration

Monobasisches Kaliumphosphat 0,39 g/l Zweibasisches Kaliumphosphat 0,39 g/l

Difco-Hefeextrakt 5,0 g/l
Es wurden durch Zentrifugieren Zellen als nasse Zellpaste gewonnen und bis zur Verwendung gefroren aufbewahrt. Das Trockenzellgewicht der nassen Zellpaste, die durch Lyophilisierung erhalten wurde, betrug typischerweise 24% des Nasszellengewichts. Zur Verwendung als Biokatalysator wurden A. facilis 72 W-(ATCC 55746) Zellen zuerst wahlweise 1 h lang in 0,35 M Phosphatpuffer (pH 7,0) auf 50°C erhitzt, um die Nitrilhydrataseaktivität zu inaktivieren.
ANWENDUNG DER NITRILASEAKTIVITÄT VON ACIDOVORAX FACILIS 72 W FÜR DIE HERSTELLUNG VON α-HYDROXYSÄURE
Ganze A. facilis 72 W-Zellen enthalten eine Nitrilhydratase und eine Amidase zusätzlich zur Nitrilase. Die Nitrilhydratase wandelt ein α-Hydroxynitril in ein α-Hydroxyamid (z. B. Glykolnitril zu Glykolamid), einem unerwünschten Nebenprodukt, um, das zu Ausbeuteverlust führt (Beispiel 2). Um dieses Nebenprodukt zu vermeiden, kann der A. facilis 72 W-Ganzzellenkatalysator hitzebehandelt werden, um die Nitrilhydratase-/Amidaseaktivitäten unter Bildung eines mikrobiellen Katalysators zu entfernen, der eine hohe Selektivität für Glykolsäure ohne Bildung von Glykolamid ergibt (Beispiel 1). Glykolsäure und 2-Hydroxisobuttersäure können in Konzentrationen von 1 mM bis 5 M, bevorzugt von 200 mM bis 2 M hergestellt werden. Die enzymatische Aktivität wird in einem stabilen Zustand für lange Zeit beibehalten.
Ganze mikrobielle Zellen können als Katalysator ohne Vorbehandlung wie Permeabilisierung verwendet werden. Alternativ können die ganzen Zellen durch Verfahren permeabilisiert werden, die den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten bekannt sind (z. B. Behandlung mit Toluol, Detergenzien oder Gefriertauen), um die Diffusionsrate der Materialien in und aus den Zellen zu verbessern.
Der Enzymkatalysator kann in einer Polymermatrix (z. B. Alginat, Carrageenan, Polyvinylalkohol oder Polyacrylamidgel (PAG)) oder auf einem löslichen oder unlöslichen Träger (z. B. Celite) immobilisiert werden, um die Wiedergewinnung und Wiederverwendung des Katalysators zu erleichtern. Es ist von Methoden zum Immobilisieren von Zellen in einer Polymermatrix oder auf einem löslichen oder unlöslichen Träger umfangreich berichtet worden und sie sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt. Das Nitrilaseenzym kann auch von den ganzen Zellen isoliert und direkt als Katalysator verwendet werden oder die Nitrilase kann in einer Polymermatrix oder auf einem löslichen oder unlöslichen Träger immobilisiert werden. Von diesen Methoden ist ebenfalls umfangreich berichtet worden und sie sind den mit dem Stand der Technik vertrauten Fachleuten allgemein bekannt (Methods in Biotechnology (Methoden in der Biotechnologie), Band 1: Immobilization of Enzymes and Cells (Immobilisierung von Enzymen und Zellen); Gordon F. Bickerstaff, Verfasser; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997).
Die Konzentration von Enzymkatalysator in der Reaktionsmischung hängt von der spezifischen katalytischen Aktivität des Enzymkatalysators ab und wird so gewählt, dass die erwünschte Reaktionsrate erhalten wird. Das Nasszellengewicht des mikrobiellen Ganzzellenkatalysators bei Hydrolysereaktionen liegt typischerweise im Bereich von 0,001 g bis 0,100 g Nasszellen pro ml gesamtes Reaktionsvolumen, bevorzugt 0,002 g bis 0,050 g Nasszellen pro ml. Die spezifische Aktivität des mikrobiellen Ganzzellenkatalysators (IE/Gramm Nasszellengew.) wird durch Messen der Umwandlungsrate einer 0,10 M Lösung von Glykolnitril zu Glykolsäure bei 25°C unter Anwendung eines bekannten Gewichts des mikrobiellen Ganzzellenkatalysators bestimmt. Eine IE der Enzymaktivität wird als die Menge Enzymaktivität definiert, die zum Umwandeln eines Mikromols Substrat zu Produkt pro Minute erforderlich ist.
Die Temperatur der Hydrolysereaktion wird so gewählt, dass sowohl die Reaktionsrate als auch die Stabilität der Enzymkatalysatoraktivität optimiert werden. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich von gerade über dem Gefrierpunkt der Suspension (etwa 0°C) bis 70°C liegen, wobei ein bevorzugter Bereich der Reaktionstemperatur 5°C bis 35°C beträgt. Die aus mikrobiellem Ganzzellenkatalysator bestehende Suspension kann durch Suspendieren der Zellen in destilliertem Wasser oder in einer wässrigen Reaktionsmischung, die einen Puffer (z. B. Natrium- oder Kaliumphosphat) enthält, wobei der Anfangs-pH-Wert der Reaktion zwischen 5,0 und 10,0 und bevorzugt zwischen 6,0 und 8,0 liegt, hergestellt werden. Mit fortschreitender Reaktion kann der pH-Wert der Reaktionsmischung aufgrund der Bildung eines Ammoniumsalzes der α-Hydroxysäure aus der entsprechenden Nitrilfunktionalität des α-Hydroxynitrils geändert werden. Die Reaktion kann bis zur vollständigen Umwandlung des α-Hydroxynitrils ohne pH-Regulierung stattfinden, oder es kann eine geeignete Säure oder Base im Laufe der Reaktion zum Aufrechterhalten des erwünschten pH-Werts zugegeben werden.
Die so erhaltene Glykolsäure kann durch Behandeln der Reaktionsmischung, von der unlösliche Substanz, einschließlich der Zellen, entfernt worden ist, durch Verfahren, die einem gewöhnlichen Fachmann allgemein bekannt sind, isoliert werden. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Konzentration, Ionenaustausch, Elektrodialyse, Extraktion und Kristallisation. Das Produkt kann als Ammoniumsalz oder nach der Ansäuerung als Glykolsäure isoliert werden.
Acetoncyanohydrin ist dafür bekannt, dass es sich zu Blausäure und Aceton in Wasser disassoziiert (Stewart et al., J. Am. Chem. Soc. 62: 3281–5 (1940)) und das Äquilibrium wird bezüglich Acetoncyanohydrin mit abnehmendem pH-Wert der Reaktionsmischung begünstigt. Ein optimaler pH-Wert für die enzymkatalysierte Hydrolyse von Acetoncyanohydrin ist der geringstmögliche pH-Wert, bei dem das Enzym bzw. die Enzyme ihre Aktivität beibehalten, typischerweise, jedoch nicht darauf beschränkt, pH 4,5–6,0. Aceton, das am Ende einer Reaktion verbleibt, kann zurückgewonnen und zum Herstellen von Acetoncyanohydrin verwendet werden. Die Wiederverwendung von Aceton zur Verwendung als Ausgangsreaktande gestattet eine hohe Gesamtumwandlung des Acetoncyanohydrins zu 2-Hydroxyisobuttersäure.
Die so erhaltene 2-Hydroxyisobuttersäure kann durch Behandeln der Reaktionsmischung (aus der unlösliche Substanz, einschließlich der Zellen, entfernt worden ist) durch Verfahren, die dem gewöhnlichen Fachmann allgemein bekannt sind, isoliert werden. Derartige Verfahren umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Konzentration, Ionenaustausch, Destillation, Elektrodialyse, Extraktion und Kristallisation. Das Produkt kann als Ammoniumsalz oder (nach der Ansäuerung) als 2-Hydroxyisobuttersäure isoliert werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen noch näher definiert. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass diese Beispiele zwar bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angeben, jedoch nur zur Veranschaulichung angegeben sind.
In den Beispielen 1–4 wurde die Umwandlung von Glykolnitril zu den Reaktionsprodukten Glykolsäure und Glykolamid durch HPLC mit Hilfe einer Bio-Rad HPX-87H-Säule zur Analyse organischer Säure (Durchmesser 30 cm × 7,8 mm) mit einer Vorsäule bei 50°C und 0,010 N H₂SO₄ als Elutionsmittel und einem Brechungsindexdetektor bestimmt.
In den Beispielen 5 und 6 basierten der Prozentsatz der Rückgewinnung von Acetoncyanohydrin und die Prozentausbeuten von 2-Hydroxyisobuttersäure, 2-Hydroxyisobutyramid und Aceton auf der Anfangskonzentration von Acetoncyanohydrin, das in der Reaktionsmischung vorliegt, und wurden durch HPLC mit Hilfe eines Brechungsindexdetektors und einer Bio-Rad HPX-87H-Säule für die Analyse organischer Säuren (Durchmesser 30 cm × 7,8 mm) mit einer Vorsäule bei 50°C und 0,010 N H₂SO₄ als Elutionsmittel bei 1 ml/min bestimmt.
BEISPIEL 1
UMWANDLUNG VON GLYKOLNITRIL ZU GLYKOLSÄURE UNTER ANWENDUNG DER NITRILASEAKTIVITÄT VON ACIDOVORAX FACILIS 72 W
Eine Suspension von 0,62 g (Nasszellenpaste) Acidovorax facilis 72 W-Zellen (ATCC 55746) in 9,38 ml 0,100 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) wurde in ein Polypropylenzentrifugenglas von 15 ml eingegeben und die Zellsuspension 1 h lang bei 50°C erhitzt (um unerwünschte Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten vollständig zu inaktivieren), dann in einem Wasserbad auf 25°C abgekühlt. Die Suspension wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Das Zellgranulat wurde erneut in 9,48 ml 0,020 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) suspendiert, 15 min lang bei 25°C gemischt und die Suspension wurde dann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert. Das so gebildete Zellgranulat wurde erneut in 9,38 ml 0,020 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) suspendiert. In das Glas wurden dann 0,106 ml einer Lösung von 55 Gew.-% Glykolnitril in Wasser (Endkonzentration von Glykolnitril in der Suspension 0,10 M) eingegeben und die so gebildete Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 25°C gemischt. Die Proben zur Analyse (0,200 ml) wurden zuerst mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, um die Reaktion abzubrechen, zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde mit einem Filter von 0,2 Mikron filtriert. Das so gebildete Filtrat wurde durch HPLC auf Glykolnitril, Glykolsäure und Glykolamid analysiert. Nach 2 h hatte sich das Glykolnitril vollständig zu Glykolsäure umgewandelt und es wurde kein Glykolamid gebildet.
Zusätzliche 0,312 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (zusätzliche Konzentration von Glykolnitril, das der Reaktionsmischung hinzugegeben wurde von 0,30 M, insgesamt 0,40 M) wurden der Reaktionsmischung nach vollständiger Umwandlung der ursprünglichen Konzentration an Glykolnitril hinzugegeben und die Reaktion fortgesetzt. Nach 14 h war das zusätzliche Glykolnitril fast vollständig zu Glykolsäure umgewandelt und zusätzliche 0,625 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (zusätzliche Konzentration von Glykolnitril 0,60 M, 1,0 M insgesamt) wurden der Reaktionsmischung hinzugegeben. Nach 40 h wurde die vollständige Umwandlung von 1,0 M Glykolnitril zu Glykolsäure ohne Bildung von Glykolamid beobachtet.
BEISPIEL 2 (VERGLEICHSBEISPIEL)
UMWANDLUNG VON GLYKOLNITRIL ZU GLYKOLSÄURE UND GLYKOLAMID DURCH ACIDOVORAX FACILIS 72 W-ZELLEN, DIE SOWOHL NITRILASE- ALS AUCH NITRILHYDRATASE/AMIDASEAKTIVITÄTEN AUFWEISEN
Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wurde wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Suspension von A. facilis 72 W-Zellen in Phosphatpuffer nicht 1 h lang bei 50°C zum Inaktivieren der Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten der Zellen vor der Verwendung in der Reaktion erhitzt wurde. Eine Suspension von 0,52 g (Nasszellenpaste) A. facilis 72 W-Zellen (ATCC 55746) in 9,48 ml 0,020 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), der 0,106 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (Endkonzentration von Glykolnitril in der Suspension von 0,10 M) enthielt, wurde bei 25°C gemischt. Nach 2 h war die Umwandlung von Glykolnitril abgeschlossen und die Ausbeuten an Glykolsäure und Glykolamid betrugen jeweils ungefähr 61% und 39%.
Zusätzliche 0,312 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (zusätzliche Konzentration von der Reaktionsmischung zugegebenem Glykolnitril von 0,30 M, 0,40 M insgesamt) wurde der Reaktionsmischung 2 h nach der Reaktion zugegeben. Nach 4 h verblieb eine signifikante Menge des zusätzlichen Glykolnitrils und das Verhältnis der Konzentrationen von Glykolsäure und Glykolamid betrug etwa 3,4:1. Zusätzliche 0,624 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (zusätzliche Konzentration von Glykolnitril 0,60 M, 1,0 M insgesamt) wurden der Reaktionsmischung zugegeben. Nach 22 h verblieben etwa 40% Glykolnitril und das Verhältnis der Konzentrationen von Glykolsäure und Glykolamid betrug etwa 9:1.
BEISPIEL 3
UMWANDLUNG VON GLYKOLNITRIL ZU GLYKOLSÄURE MIT HILFE VON ACIDOVORAX FACILIS-MUTANT 72-PF-15 (ATCC 55747) ODER 72-PF-17 (ATCC 55745)
Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Mutantenstämme A. facilis 72-PF-15 oder 72-PF-17 anstatt A. facilis 72 W verwendet werden. Eine Suspension von 0,50 g (Nasszellenpaste) A. facilis 72-PF-15 oder 72-PF-17 in 8,44 ml 0,020 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) wird in ein Polypropylenzentrifugenglas von 15 ml eingegeben. Dann werden 1,06 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (endgültige Konzentration von Glykolnitril in der Suspension von 1,0 M) in das Glas eingegeben und die so gebildete Suspension wird auf einer rotierenden Plattform bei 25°C gemischt. Proben der Suspension zur Analyse (0,200 ml) werden zuerst mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, um die Reaktion abzubrechen, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit Hilfe eines Filters von 0,2 Mikron filtriert. Nach ausreichender Zeit wird die vollständige Umwandlung von Glykolnitril zu Glykolsäure ohne Bildung des Nebenprodukts Glykolamid erhalten.
BEISPIEL 4
UMWANDLUNG VON GLYKOLNITRIL ZU GLYKOLSÄURE MIT HILFE VON E. COLI TRANSFORMANTEN SS1001 (ATCC PTA-1177) ODER SW91 (ATCC PTA-1175)
Die in Beispiel 1 beschriebene Reaktion wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass der E. coli-Transformant SS1001 oder SW91 anstatt A. facilis 72 W verwendet wird. Eine Suspension von 0,50 g (Nasszellenpaste) E. coli SS1001 oder SW91 in 8,44 ml 0,020 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) wird in ein Polypropylenzentrifugenglas von 15 ml eingegeben. Dann werden 1,06 ml einer Lösung von Glykolnitril von 55 Gew.-% in Wasser (endgültige Konzentration von Glykolnitril in der Suspension von 1,0 M) in das Glas eingegeben und die so gebildete Suspension wird auf einer rotierenden Plattform bei 25°C gemischt. Proben der Suspension zur Analyse (0,200 ml) werden zuerst mit 6 N HCl auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, um die Reaktion abzubrechen, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit mit Hilfe eines Filters von 0,2 Mikron filtriert. Nach ausreichender Zeit wird die vollständige Umwandlung von Glykolnitril zu Glykolsäure ohne Bildung des Nebenprodukts Glykolamid erhalten.
BEISPIEL 5
UMWANDLUNG VON ACETONCYANOHYDRIN ZU 2-HYDROXYISOBUTTERSÄURE DURCH DIE NITRILASEAKTIVITÄT VON ACIDOVORAX FACILIS 72 W
Eine Suspension von 0,34 g (Nasszellenpaste) Acidovorax facilis 72 W-Zellen (ATCC 55746) in 5,61 ml 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) wurde in ein Polypropylenzentrifugenglas von 15 ml eingegeben und die Zellsuspension 0,5 h lang bei 50°C erhitzt (um die unerwünschten Nitrilhydratase- und Amidaseaktivitäten zu inaktivieren, während die Nitrilaseaktivität erhalten bleibt), dann in einem Wasserbad auf 25°C abgekühlt. In das Glas wurden dann 51,0 mg Acetoncyanohydrin (Endkonzentration von Acetoncyanohydrin in der Suspension von 0,10 M) zugegeben und die so gebildete Suspension auf einer rotierenden Plattform bei 25°C gemischt. Proben zur Analyse (0,180 ml) wurden mit 0,020 ml 1,0 M Propionsäure (externer HPLC-Standard) gemischt, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch HPLC auf Acetoncyanohydrin, Aceton, 2-Hydroxyisobuttersäure und 2-Hydroxyisobutyramid analysiert. Nach 21 h betrugen die Ausbeuten an 2-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobutyramid und Aceton jeweils 21,6%, 0% und 71,3%, wobei kein Acetoncyanohydrin verblieb.
BEISPIEL 6
UMWANDLUNG VON ACETONCYANOHYDRIN ZU 2-HYDROXYISOBUTTERSÄURE MIT HILFE VON E. COLI-TRANSFORMANT SS1001
Eine Suspension von 0,66 g (Nasszellenpaste) E. coli-Transformant SS1001 (ATCC PTA-1177) in 5,29 ml 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0) wurde in ein Polypropylenzentrifugenglas von 15 ml eingegeben, dann wurden 51,0 mg Acetoncyanohydrin (endgültige Konzentration von Acetoncyanohydrin in der Suspension von 0,10 M) hinzugegeben und die so gebildete Suspension wurde auf einer rotierenden Plattform bei 25°C gemischt. Proben zur Analyse (0,180 ml) wurden mit 0,020 ml 1,0 M Propionsäure (externer HPLC-Standard) gemischt, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch HPLC auf Acetoncyanohydrin, Aceton und 2-Hydroxyisobuttersäure analysiert. Nach 8 h betrugen die Ausbeuten an 2-Hydroxybuttersäure, 2-Hydroxyisobutyramid und Aceton jeweils 23,0%, 0% und 65,6%, wobei kein Acetoncyanohydrin verblieb.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer α-Hydroxysäure aus einem entsprechenden α-Hydroxynitril umfassend: (a) das Kontaktieren eines α-Hydroxynitrils in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator, der durch eine von Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) abgeleitete Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der entsprechenden, in (a) gebildeten α-Hydroxysäure in Form eines Salzes oder einer Säure.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die α-Hydroxysäure Glykolsäure oder 2-Hydroxyisobuttersäure ist und das entsprechende α-Hydroxynitril Glykolnitril oder Acetoncyanohydrin ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 oder 2, wobei der Katalysator in Form ganzer mikrobieller Zellen, permeabilisierter mikrobieller Zellen, einer oder mehrerer Zellkomponenten eines mikrobiellen Zellextrakts, eines teilweise gereinigten Enzyms oder gereinigten Enzyms vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Katalysator in Form ganzer mikrobieller Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745), ganzer mikrobieller Zellen, die zum Exprimieren von Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität transformiert sind, und Acidovorax facilis 72 W vorliegt, die vor Schritt (a) auf eine Temperatur erhitzt werden, durch die die Nitrilhydrataseaktivität und Amidaseaktivität zerstört werden und die Nitrilaseaktivität erhalten bleibt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die ganzen mikrobiellen Zellen, die zum Exprimieren der Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität transformiert werden, Escherichia coli SS1001 (ATCC PTA-1177) oder Escherichia coli SW91 (ATCC PTA-1175) sind.
Verfahren zur Herstellung von Glykolsäure aus Glykolnitril, umfassend: (a) das Kontaktieren von Glykolnitril in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator, der durch eine von Acidovorax facilis 72 W (ATCC 55746) abgeleitete Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der in (a) hergestellten Glykolsäure in Form eines Salzes oder einer Säure.
Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyisobuttersäure aus Acetoncyanohydrin, umfassend (a) das Kontaktieren von Acetoncyanohydrin in einer geeigneten wässrigen Reaktionsmischung mit einem Katalysator, der durch eine von Acidovorax facilis 72 W abgeleitete Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist; und (b) Isolieren der in (a) hergestellten 2-Hydroxyisobuttersäure in Form eines Salzes oder einer Säue.
Verfahren nach den Ansprüchen 6 oder 7, wobei der Katalysator, der durch Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist, in Form mikrobieller Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acidovorax facilis 72-PF-15 (ATCC 55747), Acidovorax facilis 72-PF-17 (ATCC 55745), mikrobieller Zellen, die zum Exprimieren von Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität transformiert sind, und Acidovorax facilis 72 W vorliegt, die vor Schritt (a) auf eine Temperatur erhitzt werden, durch die die Nitrilhydrataseaktivität und Amidaseaktivität zerstört werden und die Nitrilaseaktivität erhalten bleibt.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Katalysator, der durch von Acidovorax facilis 72 W-Nitrilaseaktivität abgeleitete Nitrilaseaktivität gekennzeichnet ist, Escherichia coli SS1001 (ATCC PTA-1177) oder Escherichia coli SW91 (ATCC PTA-1175) ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 4, 5, 6 oder 7, wobei der Katalysator in Form intakter mikrobieller Zellen, permeabilisierter mikrobieller Zellen, einer oder mehrerer Zellkomponenten eines mikrobiellen Zellextrakts, eines teilweise gereinigten Enzyms bzw. teilweise gereinigter Enzyme oder eines gereinigten Enzyms bzw. gereinigter Enzyme vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Katalysator in oder an einem löslichen oder unlöslichen Träger immobilisiert ist.