KR20040004535A - 니트릴라제를 이용하여 상응하는 알파-히드록시니트릴로부터 알파-히드록시산, 글리콜산,2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 이용하여 상응하는 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 글리콜로니트릴을 글리콜산으로 또는 아세톤 시아노히드린을 2-히드록시이소부티르산으로 가수분해하는 데 있어서 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 니트릴라제의 용도에 관한 것이다. 글리콜로니트릴을 수성 혼합물중에서 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 갖는 촉매와 반응시켜, 선택적으로 글리콜산을 고농도 및 고수율로 수득한다.
Description
출발 물질로서 상응하는 α-히드록시 니트릴 및 촉매로서 미생물을 이용하여 α-히드록시산을 제조하는 다양한 방법이 공지되어 있다. 제조되는 α-히드록시산의 예로는 글리콜산, 락트산, 2-히드록시이소부티르산, 2-히드록시-2-히드록시페닐 프로피온산, 만델산, 2-히드록시-3,3-디메틸-4-부티로락톤 및 4-메틸티오부티르산이 포함된다.
이들 생성물은 미생물, 예를 들어 노카르디아 (Nocardia), 바실러스 (Bacillus), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 아우레오박테리움(Aureobacterium), 수도모나스 (Pseudomonas), 카세오박터 (Caseobacter), 알칼리게네스 (Alcaligenes), 아시네토박터 (Acinetobacter), 엔테로박터 (Enterobacter), 아르트로박터 (Arthrobacter), 에스케리키아 (Escherichia), 마이크로코커스 (Micrococcus), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 아에로모나스 (Aeromonas), 마이코플라나 (Mycoplana), 셀룰로모나스 (Cellulomonas), 에르위니아 (Erwinia), 칸디다 (Candida), 박테리디움 (Bacterium), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 페니실리움 (Penicillium), 코클리오볼루스 (Cochliobolus), 푸사리움 (Fusarium), 로도수도모나스 (Rhodopseudomonas), 로도코커스 (Rhodococcus), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 옵섬박테리움 (Obsumbacterium) 및 고르도나 (Gordona) 속에 속하는 미생물을 이용하여 합성한다 (미국 특허 제5,223,416호에 대응하는 JP-A-4-99454, JP-A-4-99496 및 JP-A-4-218385; 미국 특허 제5,234,826호에 대응하는 JP-A-4-99497; 미국 특허 제5,296,373호에 대응하는 JP-A-5-95795; 미국 특허 제5,326,702호에 대응하는 JP-A-5-192189; EP-A-0610048에 대응하는 JP-A-6-237789; EP-A-0610049에 대응하는 JP-A-6-284899; 미국 특허 제5,508,181호에 대응하는 JP-A-7-213296).
그러나, 상기 언급된 바와 같이 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 제조하는 가장 널리 공지된 방법은 상업적 요구를 충족시킬 정도로 충분히 높은 농도로 생성물을 생산 및 축적하지 못한다. 흔히, 이는 반응 기간 동안 효소의 조기 불활성화의 결과이다. 미국 특허 제5,756,306호에서는 "니트릴라제 또는 니트릴히드라타제를 이용하여 α-히드록시 니트릴을 효소적으로 가수분해 또는 수화시켜 α-히드록시산 또는 α-히드록시 아미드를 제조할 때, 단시간내에 효소가 불활성화되는 문제가 발생하였다. 따라서, α-히드록시산 또는 α-히드록시 아미드를 고농도 및 고수율로 수득하기가 어럽다" (제1단 49-54행)라고 교시하고 있다.
미국 특허 제5,508,181호에는 급속한 효소 불활성화에 따른 추가의 난점을 제기하고 있다. 구체적으로, 미국 특허 제5,508,181호에서는 α-히드록시 니트릴 화합물이 해리 평형에 따라 상응하는 알데히드로 부분적으로 해리된다고 언급하고 있다. 이들 알데히드는 단백질에 결합하여 단시간내에 효소를 불활성화시켜서, α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산 또는 α-히드록시 아미드를 고농도 및 고수율로 수득하기 어렵게 만든다 (제2단 16-29행). 알데히드로 인한 효소 불활성화를 방지하기 위한 해결책으로서, 포스페이트 또는 하이포포스파이트 이온을 반응 혼합물에 첨가하다. 미국 특허 제5,326,702호는 술파이트, 디술파이트 또는 디티오나이트 이온을 사용하여 알데히드를 격리시켜 효소 불활성화를 방지하는 것을 제외하고는 미국 특허 제5,508,181호와 유사하다. 그러나, 상기 기재된 바와 같은 첨가제를 사용하더라도 제조 및 축적되는 α-히드록시산의 농도는 그다지 높지 않다.
미국 특허 제6,037,155호에서도 α-히드록시산 생성물의 적은 축적량이 해리된 알데히드 축적으로 인한 단시간내 효소 불활성화와 관련이 있다고 교시하고 있다. 그의 발명자들은 효소 활성이 상응하는 알데히드 또는 케톤 [Chemical Reviews, Vol. 42, page 189 (1948)]과 함께 물에서 α-히드록시 니트릴의 부분 해리에 의해 발생되는 시안화수소 [Agricultural Biological Chemistry, Vol. 46, page 1165 (1982)]의 존재하에 억제된다고 제안하고 있다. 상기 발명자들은 알데히드 유도된 효소 불활성화의 문제점을 반응 혼합물에 시아나이드 물질을 첨가하여 효소 활성을 개선시킬 수 있는 미생물을 이용함으로써 해결하였다. 시아나이드 물질의 첨가는 α-히드록시 니트릴이 알데히드 및 시안화수소로 해리되는 것을 제한하였다. (α-히드록시 니트릴이 알데히드 및 시안화수소로 해리됨으로써 형성되는) 알데히드의 농도 및(또는) α-히드록시 니트릴의 농도를 반응 혼합물중에서 특정 범위내로 유지하는 것이 상기 문제점을 해결하기 위한 한 방법이다.
글리콜산 (HOCH2COOH; CAS 등록 번호 79-14-1)은 카르복실산류의 α-히드록시산의 가장 간단한 일원이다. 그의 독특한 특성은 광범위한 소비자 및 산업 용도, 예를 들어 우물 정화 (water well rehabilitation)에서의 용도, 가죽 산업, 오일 및 가스 산업, 세탁물 및 직물 산업에서, 및 스킨 크림과 같은 개인 위생 제품의 성분으로서 그의 이용을 가능하게 하였다. 글리콜산은 또한 다양한 산업에서 클리너 (낙농 및 식품 가공 장비 클리너; 가정용 및 공공시설용 클리너; 수송 장비, 석조물, 인쇄된 회로판, 스테인리스강 보일러 및 가공 장비, 및 냉각탑/열교환기를 위한 산업용 클리너; 및 금속 산세척, 구리 표백, 에칭, 전기도금, 전기연마를 위한 금속 가공)의 주요 성분이다. 글리콜산을 상업적으로 제조하는 새로운 기술이 산업적으로 강력히 수용될 것이다.
특별히 글리콜산의 제조와 관련하여, 글리콜로니트릴은 시안화수소 및 포름알데히드로 가역적으로 해리되는 것으로 알려져 있으며, 시안화수소 또는 포름알데히드는 효소 활성을 불활성화시킬 수 있다. 미국 특허 제3,940,316호에는 "니트릴라식 (nitrilasic)" 활성을 갖는 박테리아를 이용하여 상응하는 니트릴로부터 유기산을 제조하는 방법이 기재되어 있으며, 기질로 글리콜로니트릴을 언급하고 있다. 특히, 이 특허에는 그를 위해 바실러스, 박테리디움, 마이크로코커스 및 브레비박테리움을 이용하는 것이 기재되어 있다. 니트릴라식 활성을 갖는 것으로 기재되었음에도 불구하고, 미국 특허 제3,940,316호의 모든 실시예에서는 브레비박테리움 R312만이 균주로 사용되었다. 브레비박테리움 R312는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 갖는 것으로 공지되어 있으나, 니트릴라제 활성은 갖지 않는다 [Tourneix et al., Antonie van Leeuwenhoek, 1986, 52:173-182]. JP 09028390호에는 로도코커스 또는 고르도나 히드롤라제의 작용에 의해 글리콜로니트릴로부터 고순도의 글리콜산을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 글리콜산아미드의 형성없이 글리콜산에 대한 선택률이 거의 100％인 것으로 보고되었다.
2-히드록시이소부티르산 (CAS 등록번호 594-61-6)은 부착제 및 코팅제를 비롯한 다양한 산업에서 유용한 산업용 물질의 제조에서 중간체로서 사용된다.
코리네박테리움종에 속하는 미생물을 이용하여 락트산, 글리콜산 및 2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법은 일본 특허 공개 소-61-56086호에 개시되어 있다. 2-히드록시이소부티르산 또한 로도코커스, 수도모나스, 아르트로박터 또는 브레비박테리움 속 (JP 04040897 A2), 및 아크로모박터 속 (JP 06237776 A2)에 속하는 미생물을 이용하여 아세톤 시아노히드린으로부터 제조되었다. 로도코커스 로도크로우스 (ATCC 19140)를 이용한 2-히드록시이소부티르산의 제조 효율은 반응 혼합물에 0.5 내지 50 중량％의 농도로 아세톤을 첨가함으로써 개선되었고 (JP 05219969 A2), 이는 시안화수소의 격리에 의한 것으로 추정된다.
미국 특허 제6,037,155호 또한 α-히드록시 니트릴로부터 글리콜산 및 2-히드록시이소부티르산을 비롯한 α-히드록시산을 제조하는 방법의 예를 제공한다. 상기 특허에는 상기 언급한 문제점으로 인해 모든 미생물 촉매가 글리콜산을 고농도로 제조하지는 못한다는 것은 아니라고 인정하며, 산업적으로 유리한 미생물을 찾기 위한 선별 연구가 수행되어야 한다고 제시하고 있다. 미국 특허 제6,037,155호는 구체적으로 α-히드록시 니트릴 또는 α-히드록시산의 억제 효과에 내성을 갖는 바리오보락스종 (Variovorax spp.) 및 아르트로박터종 (Arthrobacter spp.)에 속하는 미생물을 동정하여, 고농도로 목적하는 생성물을 제조할 수 있었다.
액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)는 지방족 니트릴라제 (EC 3.5.5.7) 활성 뿐만 아니라, 니트릴 히드라타제 (EC 4.2.1.84) 및 아미다제 (EC 3,5,1.4) 활성의 조합을 특징으로 한다. 미국 특허 제5,858,736호에는 수성 반응 혼합물중에서 지방족 α,ω-디니트릴을 상응하는 ω-시아노카르복실산 및 암모니아로의 가수분해시키는 촉매로서 상기 미생물의 니트릴라제 활성을 이용하는 것이 기재되어 있다. 니트릴라제는 고도로 위치 선택적 (regioselective)인 것으로 밝혀졌으며, 따라서 α-알킬-α,ω-디니트릴의 가수분해에 의해 ω-니트릴기의 가수분해로부터 생성된 ω-시아노카르복실산만을 생성한다. 미국 특허 제5,814,508호에는 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)의 현탁액을 적합한 완충액중에서 단시간 동안 35내지 75℃로 가열하여, 온전한 세포 촉매의 목적하는 니트릴라제 활성은 상당히 감소시키지 않으면서 목적하지 않는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 불활성화시키는 것을 개시하고 있다.
상기 기술한 바와 같이, 니트릴라제 촉매를 사용하여 α-히드록시산을 효율적으로 제조하기 위한 산업용 방법을 개발하는 것이 어려운 것으로 밝혀졌다. 생성물의 농도가 낮은 경우, 특히 미반응 출발 물질로부터 생성물을 분리하기 위한 또는 대용적의 생성 혼합물로부터 소량의 목적하는 생성물을 단리하기 위한 공정이 복잡하다는 것은 당업자들에게 널리 공지되어 있다. 고수율, 고농도 및 고선택률을 특징으로 하고 저온 조건 및 적은 폐기물 생산이라는 추가 이점이 있는 방법으로 α-히드록시 니트릴을 상응하는 산으로 전환시키기 위한 양호한 효소 촉매가 없다는 것이 해결해야 할 문제점으로 남아있다.
<발명의 개요>
본 발명은 상응하는 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 고선택률 및 고전환율로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 α-히드록시 니트릴과 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 유래되는 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 접촉시키는 단계, 및 (b) (a)에서 제조된 상응하는 α-히드록시산을 단리하는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 글리콜로니트릴로부터 글리콜산을 고선택률 및 고전환율로 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 글리콜로니트릴과 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 유래되는니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 접촉시키는 단계, 및 (b) (a)에서 제조된 글리콜산을 단리하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 이용하여 아세톤 시아노히드린으로부터 2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 실시태양은 온전한 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소(들), 또는 정제된 효소(들) 형태의, 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 사용한다. 니트릴라제 활성을 특징으로 하며 상기 방법에 유용한 미생물은 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 및 그의 돌연변이체인 액시도보랙스 파실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 및 액시도보랙스 파실리스 72-PF-17 (ATCC 55745)이다. 또한, 액시도보랙스 니트릴라제 활성을 갖는 변형된 미생물 세포도 본 발명에 포함된다. 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) SS1001 (ATCC PTA-1177) 및 에스케리키아 콜리 SW91 (ATCC PTA-1175)가 그러한 변형된 미생물 세포 촉매의 예이다.
본 발명의 추가의 실시태양은 글리콜로니트릴을 글리콜산으로 또는 아세톤 시아노히드린을 2-히드록시이소부티르산으로 전환시키기 위한 효소 촉매로서 (1) 니트릴라제 활성 및 (2) 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 특징으로 하는 온전한 미생물 세포를 사용한다. 바람직한 온전한 세포는 액시도보랙스 파실리스 72W 균주이다. 그러나, 촉매로 사용하기 전에 액시도보랙스 파실리스 72W의 온전한 미생물 세포를 약 35 내지 70℃의 온도로 10 내지 120분 동안 가열하여, 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 파괴시키고, 니트릴라제 활성은 보존시킨다. 이러한 처리를 통해 원치않는 부산물 (각각 글리콜아미드 또는 2-히드록시이소부티르아미드)의 형성을 피할 수 있다. 돌연변이체 및 변형된 온전한 미생물 세포는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성이 없기 때문에, 열처리 단계가 필요하지 않다. 에스케리키아 콜리 SS1001 (ATCC PTA-1177) 및 에스케리키아 콜리 SW91 (ATCC PTA-1175)는 히드라타제 및 아미다제 활성이 없는 변형된 미생물 세포 촉매의 예이다.
어떠한 형태로든 임의로 효소 촉매는 가용성 또는 불용성 지지체 중에 또는 상기 지지체 상에 고정될 수 있다.
<미생물 기탁의 간단한 설명>
본 출원인들은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 다음과 같은 미생물 기탁을 행하였다.
기탁자가 부여한 식별 표시 국제 수탁 번호 기탁일
액시도보랙스 파실리스 72-PF-17 ATCC 55745 1996년3월8일
액시도보랙스 파실리스 72W ATCC 55746 1996년3월8일
액시도보랙스 파실리스 72-PF-15 ATCC 55747 1996년3월8일
에스케리키아 콜리 SS1001 ATCC PTA-1177 2000년1월11일
에스케리키아 콜리 SW91 ATCC PTA-1175 2000년1월11일
여기에서 사용된 "ATCC"란 미국 버지니아 20110-2209 마나시스 유니버시티 불러바드 10801에 위치한 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) 국제기탁기관을 나타낸다. "국제 수탁 번호"는 ATCC에 기탁시에 배양물에 주어진 승인 번호이다.
기록된 기탁물은 적어도 30년 동안 표시된 국제기탁기관에 유지되며, 그것을 개시하는 특허가 인정될 때 공중에게 이용될 수 있다. 기탁물의 이용가능성은, 정부에 의해 수여된 특허권을 손상시키는 주제 발명의 실시권을 구성하지는 않는다.
본 발명은 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 이용하여 α-히드록시산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 액시도보랙스 파실리스 (Acidovorax facilis) 72W 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 이용하여 글리콜로니트릴로부터 글리콜산을, 또는 아세톤 시아노히드린으로부터 2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 출원인들은 액시도보랙스 파실리스 72W의 니트릴라제 활성을 이용하여 상응하는 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 고수율 및 고농도로 제조하는 방법을 제공함으로써 상기한 문제점을 해결하였다. 본 출원인들은 보다 구체적으로 액시도보랙스 파실리스 72W의 니트릴라제 활성을 이용하여 상응하는 글리콜로니트릴로부터 글리콜산을 고수율 및 고농도로 제조하는 방법을 제공함으로써 상기한 문제점을 해결하였다. 또한, 본 발명은 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 갖는 촉매를 이용하여 아세톤 시아노히드린으로부터 2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법에 관한 것이다. 생성물은 고선택률 및 고전환율로 제조된다.
본 발명에 의해 제조되는 글리콜산, 2-히드록시이소부티르산 또는 α-히드록시산은 다양한 산업에 유용한 용도를 갖는다. 예를 들어, 2-히드록시이소부티르산은 메타크릴산 제조에 중간체로서 사용된다. 본 발명은 기존의 공지된 방법에 비해 저온 조건 및 적은 폐기물 생산의 이점을 갖는 바람직한 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 α-히드록시 니트릴과 니트릴라제 활성 (EC 3.5.5.7), 또는 니트릴 히드라타제 (EC 4.2.1.84) 또는 아미다제 (EC 3.5.1.4) 활성을 특징으로 하는 촉매와 접촉시키는 단계, 및 (b) (a)에서 제조된 상응하는 α-히드록시산을 산 또는 상응하는 염의 형태로 단리하는 단계를 포함한다. 니트릴라제 효소는 중간체로서 상응하는 아미드를 형성하지 않고 지방족 니트릴을 상응하는 카르복실산으로 바로 전환시킨다 (반응식 1).
정의
본 개시에는 수많은 용어 및 약어들이 사용된다. 달리 언급하지 않는 한 하기 정의가 적용된다.
용어 "촉매", "효소 촉매" 또는 "온전한 미생물 세포 촉매"는 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 나타낸다. 효소 촉매는 온전한 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소(들), 또는 정제된 효소(들)의 형태일 수 있다.
용어 "액시도보랙스 파실리스"와 "A. 파실리스"는 서로 교환되어 사용된다.
용어 "에스케리키아 콜리"와 "E. 콜리"는 서로 교환되어 사용된다.
용어 "글리콜로니트릴"은 히드록시아세토니트릴, 2-히드록시아세토니트릴, 히드록시메틸니트릴, 및 CAS 등록 번호 107-16-4의 다른 모든 유사어와 동의어이다.
용어 "글리콜산"은 히드록시아세트산, 히드록시에탄산, 및 CAS 등록 번호 79-14-1의 다른 모든 유사어와 동의어이다.
용어 "아세톤 시아노히드린"은 2-히드록시-2-메틸-프로판니트릴, 2-메틸-락토니트릴, α-히드록시이소부티로니트릴; 2-시아노-2-히드록시프로판; 2-시아노-2-프로판올, 2-히드록시-2-시아노프로판, 2-히드록시-2-메틸프로판니트릴, 2-히드록시-2-메틸프로피오니트릴, 2-히드록시이소부티로니트릴, 2-메틸-2-히드록시프로피오니트릴, 2-메틸락토니트릴, 2-프로판 시아노히드린, 디메틸 케톤 시아노히드린, 및 CAS 등록 번호 75-86-5의 다른 모든 유사어와 동의어이다
용어 "2-히드록시이소부티르산"은 2-히드록시-2-메틸-프로판산, 2-메틸-락트산, α-HIB, α-히드록시-α-메틸프로판산, α-히드록시이소부탄산, α-히드록시이소부티르산, 2-히드록시-2-메틸프로판산, 2-히드록시-2-메틸프로피온산, 2-메틸락트산, 아세톤산, 히드록시디메틸아세트산, 및 CAS 등록 번호 594-61-6의 다른 모든 유사어와 동의어이다.
용어 "적합한 수성 반응 혼합물"은 α-히드록시 니트릴 (예, 글리콜로니트릴 또는 아세톤 시아노히드린) 및 효소 촉매가 그안에서 접촉하게 되는 물질 및 물을 나타낸다. 적합한 수성 반응 혼합물의 성분을 기재한 표는 본원에 제공되며, 당업자라면 본 발명의 방법에 적합한 다양한 범위의 성분들에 대해 잘 알 것이다.
본 명세서의 약어는 다음과 같은 측정 단위, 기술, 특성 또는 화합물에 상응한다: "sec"는 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하고, "h"는 시간을 의미하고, "d"는 일을 의미하고, "mL"는 밀리리터를 의미하고, "L"은 리터를 의미하고, "mM"은 밀리몰농도를 의미하고, "M"은 몰농도를 의미하고, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "wt"는 중량을 의미하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하고,"ca"는 대략을 의미하고, "O.D."는 지정된 파장에서의 광학 농도를 나타내고, "I.U."는 국제 단위를 의미한다.
<바람직한 실시태양의 설명>
방법 및 물질:
니트릴라제 활성을 특징으로 하고 본 발명의 방법에 유용한 미생물은 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)이다. (1) 니트릴라제 활성 및 (2) 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 특징으로 하는 온전한 미생물 세포는 효소 촉매로 사용될 수 있다. 바람직한 온전한 세포는 A. 파실리스 72W 균주이다. 그러나, 촉매로 사용하기 전에 A. 파실리스 72W의 온전한 미생물 세포를 약 35 내지 70℃의 온도로 10 내지 120분 동안 가열하여, 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 파괴시키고, 니트릴라제 활성은 유지시킨다 (미국 특허 제5,814,508호). 이러한 열처리를 통해 각각의 α-히드록시 니트릴의 전환이 완료될 때 수득되는 원치않는 부산물 (예, 글리콜아미드 또는 2-히드록시이소부티르아미드)을 형성하지 않는 촉매를 얻는다. 돌연변이체 및 변형된 온전한 미생물 세포는 목적하지 않는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성이 없기 때문에, 열처리 단계가 필요하지 않다.
액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 균주의 2가지 돌연변이체는 지방족 디니트릴의 위치 비선택적 니트릴 가수분해에 관여하는 목적하지 않는 니트릴 히드라타제 활성의 수준이 매우 낮아지도록 제조되었다 (미국 특허 제5,858,736호). 이들 돌연변이체 균주인 액시도보랙스 파실리스 72-PF-15 (ATCC 55747) 및 액시도보랙스 파실리스 72-PF-17 (ATCC 55745)는 본 발명에서 촉매로 사용하기 전에 세포를 열처리할 필요가 없다.
A. 파실리스 니트릴라제 활성을 가지며 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성이 없는 변형된 미생물 세포는 본 발명에 포함된다. 에스케리키아 콜리 SS1001 (ATCC PTA-1177) 또는 에스케리키아 콜리 SW91 (ATCC PTA-1175)가 그러한 변형된 미생물 세포 촉매의 예이다.
액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 균주의 증식
액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 균주의 냉동된 시드 로트 바이알 하나를 해동시키고, 내용물 1 mL을 500 mL 무균 접종 배지 (성분들은 하기 표 1 및 2에 열거되어 있음)에 넣었다. 접종물을 2 L 플라스크에서 250 rpm으로 진탕하면서 24 내지 30시간 동안 30℃에서 증식시켰다.
| 접종 배지 | |||
| 성분 | 최종 농도 | 성분 | 최종 농도 |
| 인산칼륨, 1염기성 | 1.5 g/L | 인산칼륨, 2염기성 | 3.4 g/L |
| 황산암모늄 | 1.5 g/L | 시트르산삼나트륨, 2수화물 | 1 g/L |
| 황산마그네슘, 7수화물 | 0.4 g/L | 미량의 금속 용액 (하기) | 1 mL/L |
| 암베렉스 (Amberex) 695(Universal Foods) | 1 g/L | 글리세롤 (별도로 멸균처리) | 8 g/L |
| 미량의 금속 용액 | |||
| 성분 | 원액 농도 | 성분 | 원액 농도 |
| 염산 | 10 mL/L | 황산아연, 7수화물 | 1.77 g/L |
| 염화칼슘, 2수화물 | 11.4 g/L | 몰리브덴산나트륨, 2수화물 | 0.05 g/L |
| 황산망간, 1수화물 | 1.23 g/L | 황산바나딜, 2수화물 | 0.08 g/L |
| 황산구리, 5수화물 | 0.63 g/L | 질산니켈, 6수화물 | 0.04 g/L |
| 염화코발트, 6수화물 | 0.16 g/L | 아셀렌산나트륨 | 0.04 g/L |
| 붕산 | 0.91 g/L | 황산제1철, 7수화물 | 6.0 g/L |
진탕 플라스크로부터의 접종물을 발효 배지 (성분들은 하기 표 3에 열거되어 있음)를 함유하는 멸균 브라운 바이오스탯 (Braun Biostat) C 발효기로 무균적으로 옮겼다. 하기 조건하에 증식이 일어났다: 32℃, pH 6.8-7.0, 25％ 포화도로 용해된 산소. 접종시, 발효기는 발효 배지 8.5 L 및 영양 공급 용액 218 g을 함유하고, 글리세롤의 출발 농도는 대략 7 g/L이었다. 영양 공급 용액은 별도로 멸균처리되고 냉각후 합해진 하기 성분들을 포함하였다: 탈이온수 0.25 L 중 인산칼륨, 1염기성 19.6 g; 탈이온수 0.15 L 중 황산마그네슘, 7수화물 3.3 g 및 황산 4 mL; 탈이온수 0.80 L 중 미량의 금속 용액 (성분들은 상기 표 2에 열거되어 있음) 67 mL 및 글리세롤 400 g. 접종한지 18시간 후에, 영양 공급 용액을 공급하기 시작했다. 먼저, 영양 공급 용액을 0.4 g 공급/분 (0.15 g 글리세롤/분)의 속도로 첨가하였다. 배양물의 OD 550은 대략 8 내지 9이었다. 26시간째에, 공급 속도를 0.9 g 공급/분 (0.3 g 글리세롤/분)으로 증가시켰다. OD 550은 대략 16 내지 18이었다. 34시간째에, 최종 공급 속도를 1.8 g 공급/분 (0.6 g 글리세롤/분)으로 증가시켰다. 최종 OD 550은 대략 65 내지 75이었다.
| 발효 배지 | |||
| 성분 | 원액 농도 | 성분 | 원액 농도 |
| 인산칼륨, 1염기성 | 0.39 g/L | 인산칼륨, 2염기성 | 0.39 g/L |
| 디프코 (Difco) 효모 추출물 | 5.0 g/L |
세포를 습윤 세포 페이스트로서 원심분리에 의해 회수하고, 사용할 때까지 냉동 저장하였다. 습윤 세포 페이스트를 동결 건조시켜 얻은 건조 세포의 중량은전형적으로 습윤 세포 중량의 24％이었다. 생촉매로 사용하기 위해, A. 파실리스 72W (ATCC 55746) 세포를 먼저 0.35 M 인산염 완충액 (pH 7.0)중에서 1시간 동안 50℃로 임의로 가열하여 니트릴 히드라타제 활성을 불활성화시켰다.
α-히드록시산 제조에 있어서 니트릴라제 액시도보랙스 파실리스 72W의 니트릴라제 활성의 이용
A. 파실리스 72W의 온전한 세포는 니트릴라제 활성뿐 아니라 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성도 갖는다. 니트릴 히드라타제는 α-히드록시 니트릴을 α-히드록시 아미드로 (예, 글리콜로니트릴을 글리콜아미드로) 전환시켜, 원치않는 부산물을 생성시킴으로써 수율 손실을 야기시킨다 (실시예 2). 이러한 부산물을 피하기 위해, A. 파실리스 72W의 온전한 세포 촉매를 열처리하여 니트릴 히드라타제/아미다제 활성을 제거하여, 글리콜아미드를 생성하지 않고 고선택률로 글리콜산을 제공하는 미생물 촉매를 제조할 수 있다 (실시예 1). 글리콜산 및 2-히드록시이소부티르산은 1 mM 내지 5 M, 바람직하게는 200 mM 내지 2 M의 농도로 제조될 수 있다. 효소 활성은 장기간 동안 안정한 상태로 유지된다.
온전한 미생물 세포는 투과화와 같은 어떠한 예비처리 없이도 촉매로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 온전한 세포를 당업자에게 잘 알려진 방법 (예, 톨루엔, 세제로 처리, 또는 냉동 해동)으로 투과화시켜, 세포 안팎으로 물질의 확산 속도를 개선시킬 수 있다.
효소 촉매는 중합체 매트릭스 (예, 알기네이트, 카라기난, 폴리비닐 알콜 또는 폴리아크릴아미드 겔 (PAG)) 중에, 또는 가용성 또는 불용성 지지체 (예, 셀라이트) 상에 고정시켜, 촉매의 회수 및 재이용을 촉진시킬 수 있다. 중합체 매트릭스 중에 또는 가용성 또는 불용성 지지체 상에 세포를 고정시키는 방법은 널리 보고되었고 당업자에게 잘 알려져 있다. 니트릴라제 효소는 또한 온전한 세포로부터 단리되어 촉매로 직접 사용될 수 있거나, 니트릴라제를 중합체 매트릭스 중에 또는 가용성 또는 불용성 지지체 상에 고정시킬 수 있다. 이들 방법 또한 널리 보고되었고 당업자에게 잘 알려져 있다 [Methods in Biotechnology, Vol. 1: Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997].
반응 혼합물 중 효소 촉매의 농도는 효소 촉매의 특이적 촉매 활성에 따라 좌우되고, 목적하는 반응 속도를 달성하도록 선택된다. 가수분해 반응시 온전한 미생물 세포 촉매의 습윤 세포 중량은 전형적으로 전체 반응 부피 1 mL 당 0.001 g 내지 0.100 g의 습윤 세포, 바람직하게는 0.002 g 내지 0.050 g의 습윤 세포이다. 온전한 미생물 세포 촉매의 특이적 활성 (IU/g 습윤 세포 중량)은 기지 중량의 온전한 미생물 세포 촉매를 이용하여 25℃에서 0.10 M 글리콜로니트릴 용액의 글리콜산으로 전환율을 측정함으로써 결정된다. 효소 화성의 IU는 1분 당 기질 1 마이크로몰이 생성물로 전환되는 데 필요한 효소 활성의 양으로서 정의된다.
가수분해 반응의 온도는 반응 속도 및 효소 촉매 활성의 안정성 둘다를 최적화시키도록 선택된다. 반응 온도는 현탁액의 빙점 (약 0℃) 초과 내지 70℃, 바람직하게는 5 내지 35℃일 수 있다. 온전한 미생물 세포 촉매 현탁액은 증류수에 또는 완충액 (인산나트륨 또는 인산칼륨) 함유 수성 반응 혼합물에 세포를 현탁시킴으로써 제조할 수 있고, 반응의 초기 pH는 5.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0이다. 반응이 진행됨에 따라, 반응 혼합물의 pH는 α-히드록시 니트릴의 상응하는 니트릴 관능기로부터 α-히드록시산의 암모늄염의 형성으로 인해 변화될 수 있다. 반응은 pH 조절없이 α-히드록시 니트릴의 전환을 완료하도록 진행될 수 있거나, 적합한 산 또는 염기를 반응 과정에 걸쳐 첨가하여 목적하는 pH를 유지할 수 있다.
수득한 글리콜산은 세포를 비롯한 불용성 물질이 제거된 반응 혼합물을 당업자에게 잘 알려진 절차로 처리하여 단리할 수 있다. 이러한 절차에는 농축, 이온 교환, 전기투석, 추출 및 결정화가 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다. 생성물은 암모늄염으로서 또는 산성화후에는 글리콜산으로서 단리될 수 있다.
아세톤 시아노히드린은 물에서 시안화수소 및 아세톤으로 가열적으로 해리되는 것으로 알려져 있으며 [Stewart et al., J. Am. Chem. Soc. 62:3281-5 (1940)], 반응 혼합물의 pH가 감소함에 따라 아세톤 사이노히드린쪽으로의 평형이 우세해진다. 아세톤 시아노히드린의 효소 촉매된 가수분해를 위한 최적 pH는 효소가 활성을 보유하는 가능한 최저 pH이며, 전형적으로 pH 4.5 내지 6.0이나 이로 한정되는 것은 아니다. 반응 종료시 잔류하는 아세톤은 회수되어 아세톤 시아노히드린을 제조하는 데 사용될 수 있다. 출발 물질로 사용하기 위해 아세톤을 회수함으로써 아세톤 시아노히드린의 2-히드록시이소부티르산으로의 전환율이 전반적으로 높아진다.
수득한 2-히드록시이소부티르산은 (세포를 비롯한 불용성 물질이 제거된) 반응 혼합물을 당업자에게 잘 알려진 절차로 처리하여 단리할 수 있다. 이러한 절차에는 농축, 이온 교환, 전기투석, 추출 및 결정화가 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다. 생성물은 암모늄염으로서 또는 (산성화후에는) 2-히드록시이소부티르산으로서 단리될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예를 통해 추가로 설명된다. 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내는 이들 실시예는 단지 설명을 위한 목적으로 제시된 것임을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터 당업자는 본 발명의 핵심적 특징을 확인할 수 있고, 본 발명의 개념 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변화 및 변형을 가하여 다양한 용도 및 조건에 적용할 수 있다.
실시예 1 내지 4에서는, 글리콜로니트릴의 반응 생성물인 글리콜산 및 글리콜아미드로의 전환을 50℃의 예비컬럼 및 용리액으로서 0.010 N H2SO4를 갖춘 바이오-라드 (Bio-Rad) HPX-87H 유기산 분석 컬럼 (30 cm ×7.8 mm 직경) 및 굴절률 검출기를 이용하여 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 5 및 6에서는, 아세톤 시아노히드린의 회수율 및 2-히드록시이소부티르산, 2-히드록시이소부티르아미드 및 아세톤의 수율을 반응 혼합물에 존재하는 아세톤 시아노히드린의 초기 농도를 기준으로 하여, 50℃의 예비컬럼 및 용리액으로서 0.010 N H2SO4(1 mL/분)를 갖춘 바이오-라드 HPX-87H 유기산 분석 컬럼 (30 cm ×7.8 mm 직경) 및 굴절률 검출기를 이용하여 HPLC에 의해 측정하였다.
실시예 1: 액시도보랙스 파실리스 72W의 니트릴라제 활성을 이용한 글리콜로니트릴의 글리콜산으로의 전환
0.100 M 인산칼륨 완충액 (pH 7.0) 9.38 mL 중 액시도보랙스 파실리스 72W 세포 (ATCC 55746) 0.62 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣고, 세포 현탁액을 50℃에서 1시간 동안 (목적하지 않는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 완전히 불활성화시키기 위해) 가열한 다음, 수조에서 25℃로 냉각시켰다. 현탁액을 원심분리하고, 상청액을 경사분리하고, 세포 펠렛을 0.020 M 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 9.48 mL에 재현탁시키고, 25℃에서 15분 동안 혼합한 다음, 현탁액을 원심분리하였다. 상청액을 경사분리하였다. 생성된 세포 펠렛을 0.020 M 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 9.38 mL에 재현탁시켰다. 다음, 튜브에 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.106 mL을 첨가하고 (현탁액 중 글리콜로니트릴의 최종 농도 0.10 M), 생성된 현탁액을 회전 플랫폼상에서 25℃에서 혼합하였다. 먼저 6N HCl을 이용하여 분석용 샘플 (0.200 mL)을 pH 2.5로 조정하여 반응을 종료시키고, 원심분리하고, 상청액을 0.2 미크론 필터를 이용하여 여과하였다. 생성된 여액을 글리콜로니트릴, 글리콜산 및 글리콜아미드에 대해 HPLC로 분석하였다. 2시간 후, 글리콜로니트릴은 완전히 글리콜산으로 전환되었고, 글리콜아미드는 전혀 생성되지 않았다.
초기 농도의 글리콜로니트릴이 완전히 전환된 후, 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.312 mL을 반응 혼합물에 추가로 첨가하고 (반응 혼합물에 첨가된 글리콜로니트릴의 추가 농도 0.30 M, 총 0.40 M), 계속 반응시켰다. 14시간 후,추가의 글리콜로니트릴이 거의 완전히 글리콜산으로 전환되었고, 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.624 mL을 반응 혼합물에 추가로 첨가하였다 (글리콜로니트릴의 추가 농도 0.60 M, 총 1.0 M). 40시간 후, 1.0 M 글리콜로니트릴이 글리콜산으로 완전히 전환된 것이 확인되었고, 글리콜아미드는 전혀 생성되지 않았다.
실시예 2 (비교예): 니트릴라제 및 니트릴 히드라타제/아미다제 활성을 모두 갖는 액시도보랙스 72W 세포에 의한 글리콜로니트릴의 글리콜산 및 글리콜아미드로의 전환
인산염 완충액 중 A. 파실리스 72W 세포의 현탁액을 반응에 사용하기 전에 세포의 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성을 불활성화시키기 위해 50℃에서 1시간 동안 가열하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 반응을 반복하였다. 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.106 mL을 함유하는 0.020 M 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 9.48 mL 중 A. 파실리스 72W 세포 (ATCC 55746) 0.52 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액 (현탁액 중 글리콜로니트릴의 최종 농도 0.10 M)을 25℃에서 혼합하였다. 2시간 후, 글리콜로니트릴의 전환이 완료되었고, 글리콜산 및 글리콜아미드의 수율은 각각 대략 61％ 및 39％이었다.
반응 2시간 후, 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.312 mL을 반응 혼합물에 추가로 첨가하였다 (반응 혼합물에 첨가된 글리콜로니트릴의 추가 농도 0.30 M, 총 0.40 M). 4시간 후, 상당량의 추가의 글리콜로니트릴이 잔류하였고, 글리콜산 및 글리콜아미드의 농도비는 약 3.4:1이었다. 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.624 mL을 반응 혼합물에 추가로 첨가하였다 (글리콜로니트릴의추가 농도 0.60 M, 총 1.0 M). 22시간 후, 약 40％의 글리콜로니트릴이 잔류하였고, 글리콜산 및 글리콜아미드의 농도비는 약 9:1이었다.
실시예 3: 액시도보랙스 파실리스 돌연변이체 72-PF-15 (ATCC 55747) 또는 72-PF-17 (ATCC 55745)를 이용한 글리콜로니트릴의 글리콜산으로의 전환
A. 파실리스 72W 대신에 돌연변이체 균주 A. 파실리스 72-PF-15 또는 72-PF-17을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 반응을 반복하였다. 0.020 M 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 8.44 mL 중 A. 파실리스 72-PF-15 또는 72-PF-17 0.50 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣었다. 다음, 이 튜브에 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.106 mL을 첨가하고 (현탁액 중 글리콜로니트릴의 최종 농도 1.0 M), 생성된 현탁액을 회전 플랫폼상에서 25℃에서 혼합하였다. 먼저 6N HCl을 이용하여 분석용 샘플 (0.200 mL)을 pH 2.5로 조정하여 반응을 종료시키고, 원심분리하고, 상청액을 0.2 미크론 필터를 이용하여 여과하였다. 충분한 시간이 지난 후, 글리콜로니트릴은 완전히 글리콜산으로 전환되었고, 글리콜아미드는 전혀 생성되지 않았다.
실시예 4: E. 콜리 변형체 SS1001 (ATCC PTA-1177) 또는 SW91 (ATCC PTA-1175)를 이용한 글리콜로니트릴의 글리콜산으로의 전환
A. 파실리스 72W 대신에 E. 콜리 변형체 SS1001 또는 SW91을 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1에 기재된 반응을 반복하였다. 0.020 M 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 8.44 mL 중 E. 콜리 SS1001 또는 SW91 0.50 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣었다. 다음, 이 튜브에 물 중 글리콜로니트릴의 55 중량％ 용액 0.106 mL을 첨가하고 (현탁액 중 글리콜로니트릴의 최종 농도 1.0 M), 생성된 현탁액을 회전 플랫폼상에서 25℃에서 혼합하였다. 먼저 6N HCl을 이용하여 분석용 샘플 (0.200 mL)을 pH 2.5로 조정하여 반응을 종료시키고, 원심분리하고, 상청액을 0.2 미크론 필터를 이용하여 여과하였다. 충분한 시간이 지난 후, 글리콜로니트릴은 완전히 글리콜산으로 전환되었고, 글리콜아미드는 전혀 생성되지 않았다.
실시예 5: 액시도보랙스 파실리스 72W의 니트릴라제 활성에 의한 아세톤 시아노히드린의 2-히드록시이소부티르산으로의 전환
100 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 5.61 mL 중 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746) 0.34 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣고, 세포 현탁액을 50℃에서 0.5시간 동안 (목적하지 않는 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 완전히 불활성화시키고 니트릴라제 활성은 유지시키기 위해) 가열한 다음, 수조에서 25℃로 냉각시켰다. 다음, 이 튜브에 아세톤 시아노히드린 51.0 mg을 첨가하고 (현탁액 중 아세톤 시아노히드린의 최종 농도 0.10 M), 생성된 현탁액을 회전 플랫폼상에서 25℃에서 혼합하였다. 분석용 샘플 (0.180 mL)을 1.0 M 프로피온산 0.020 mL과 혼합하고 (HPLC 외부 표준), 원심분리하고, 상청액을 아세톤 시아노히드린, 아세톤, 2-히드록시이소부티르산 및 2-히드록시이소부티르아미드에 대해 HPLC로 분석하였다. 21시간 후, 2-히드록시이소부티르산, 2-히드록시이소부티르아미드 및 아세톤의 수율은 각각 21.6％, 0％ 및 71.3％이었고, 아세톤 시아노히드린은 전혀 잔류하지 않았다.
실시예 6: E. 콜리 변형체 SS001에 의한 아세톤 시아노히드린의 2-히드록시이소부티르산으로의 전환
50 mM 인산칼륨 완충액 (pH 6.0) 5.29 mL 중 E. 콜리 변형체 SS1001 (ATCC PTA-1177) 0.66 g (습윤 세포 페이스트)의 현탁액을 15 mL 폴리프로필렌 원심분리 튜브에 넣고, 아세톤 시아노히드린 51.0 mg을 첨가하고 (현탁액 중 아세톤 시아노히드린의 최종 농도 0.10 M), 생성된 현탁액을 회전 플랫폼상에서 25℃에서 혼합하였다. 분석용 샘플 (0.180 mL)을 1.0 M 프로피온산 0.020 mL과 혼합하고 (HPLC 외부 표준), 원심분리하고, 상청액을 아세톤 시아노히드린, 아세톤 및 2-히드록시이소부티르산에 대해 HPLC로 분석하였다. 8시간 후, 2-히드록시이소부티르산, 2-히드록시이소부티르아미드 및 아세톤의 수율은 각각 23.0％, 0％ 및 65.6％이었고, 아세톤 시아노히드린은 전혀 잔류하지 않았다.
Claims (13)
- (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 α-히드록시 니트릴과 액시도보랙스 파실리스 (Acidovorax facilis) 72W (ATCC 55746)로부터 유래되는 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 접촉시키는 단계, 및(b) (a)에서 제조된 상응하는 α-히드록시산을 염 또는 산의 형태로 단리하는 단계를 포함하는, 상응하는 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, α-히드록시산이 글리콜산 또는 2-히드록시이소부티르산이고, 상응하는 α-히드록시 니트릴이 글리콜로니트릴 또는 아세톤 시아노히드린인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 촉매가 온전한 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소, 또는 정제된 효소의 형태인 방법.
- 제3항에 있어서, 촉매가 액시도보랙스 파실리스 72-PF-15 (ATCC 55747), 액시도보랙스 파실리스 72-PF-17 (ATCC 55745), 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 나타내도록 변형된 온전한 미생물 세포, 및 단계 (a) 이전에 소정 온도로 가열하여 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 파괴되고 니트릴라제 활성은 보존된 액시도보랙스 파실리스 72W로 구성된 군으로부터 선택된 온전한 미생물 세포 형태인 방법.
- 제4항에 있어서, 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 나타내도록 변형된 온전한 미생물 세포가 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) SS1001 (ATCC PTA-1177) 또는 에스케리키아 콜리 SW91 (ATCC PTA-1175)인 방법.
- (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 글리콜로니트릴과 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 유래되는 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 접촉시키는 단계, 및(b) (a)에서 제조된 상응하는 글리콜산을 염 또는 산의 형태로 단리하는 단계를 포함하는, 상응하는 글리콜로니트릴로부터 글리콜산을 제조하는 방법.
- (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 아세톤 시아노히드린과 액시도보랙스 파실리스 72W로부터 유래되는 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매를 접촉시키는 단계, 및(b) (a)에서 제조된 상응하는 2-히드록시이소부티르산을 염 또는 산의 형태로 단리하는 단계를 포함하는, 상응하는 아세톤 시아노히드린으로부터 2-히드록시이소부티르산을 제조하는 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매가 액시도보랙스 파실리스 72-PF-15 (ATCC 55747), 액시도보랙스 파실리스 72-PF-17 (ATCC 55745), 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성을 나타내도록 변형된 미생물 세포, 및 단계 (a) 이전에 소정 온도로 가열되어 니트릴 히드라타제 및 아미다제 활성은 파괴되고 니트릴라제 활성은 보존된 액시도보랙스 파실리스 72W로 구성된 군으로부터 선택된 미생물 세포의 형태인 방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 액시도보랙스 파실리스 72W 니트릴라제 활성으로부터 유래된 니트릴라제 활성을 특징으로 하는 촉매가 에스케리키아 콜리 SS1001 (ATCC PTA-1177) 또는 에스케리키아 콜리 SW91 (ATCC PTA-1175)인 방법.
- 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제6항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 촉매가 온전한 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소(들), 또는 정제된 효소(들)의 형태인 방법.
- 제8항에 있어서, 촉매가 가용성 또는 불용성 지지체 중에 또는 상기 지지체상에 고정된 방법.
- 액시도보랙스 파실리스 72W (ATCC 55746)로부터 유래되는 니트릴라제 활성을 나타내도록 변형된 숙주 세포.
- (a) 적합한 수성 반응 혼합물중에서 α-히드록시 니트릴과 제10항의 변형된 숙주 세포를 접촉시키는 단계, 및(b) (a)에서 제조된 상응하는 α-히드록시산을 염 또는 산의 형태로 단리하는 단계를 포함하는, 상응하는 α-히드록시 니트릴로부터 α-히드록시산을 제조하는 방법.
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| US7148051B2 (en) * | 2004-08-16 | 2006-12-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production of 3-hydroxycarboxylic acid using nitrilase |
| CN1772912B (zh) * | 2004-11-12 | 2012-12-26 | 上海市农药研究所 | 生物催化生产羟基乙酸 |
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| CN101087750B (zh) * | 2004-12-22 | 2011-10-05 | 纳幕尔杜邦公司 | 通过醇解从羧酸铵盐制备羧酸酯的方法 |
| US7445917B2 (en) * | 2004-12-22 | 2008-11-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Process for producing glycolic acid from formaldehyde and hydrogen cyanide |
| US7198927B2 (en) | 2004-12-22 | 2007-04-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Enzymatic production of glycolic acid |
| US20060160197A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-07-20 | Xu Li | Method for the production of glycolic acid from ammonium glycolate by solvent extraction |
| WO2006069129A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Method for the production of glycolic acid from ammonium glycolate by direct deammoniation |
| WO2006069114A2 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-29 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Process for producing glycolic acid from formaldehyde and hydrogen cyanide |
| EP2361900B1 (en) | 2005-05-27 | 2015-04-08 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing glycolic acid |
| JPWO2007049707A1 (ja) * | 2005-10-26 | 2009-04-30 | 三井化学株式会社 | グリコール酸の製造方法 |
| JP2007289062A (ja) * | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Asahi Kasei Chemicals Corp | 生体触媒を用いたα−ヒドロキシ酸或いはα−ヒドロキシ酸アンモニウムの製造方法 |
| JP4901293B2 (ja) * | 2006-04-28 | 2012-03-21 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | バイオ法グリコール酸水溶液又はグリコール酸アンモニウム水溶液の脱色方法 |
| JP5024855B2 (ja) * | 2006-05-01 | 2012-09-12 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | グリコール酸とアンモニアからなる新規結晶並びにその製造方法 |
| JP4906395B2 (ja) * | 2006-05-01 | 2012-03-28 | 旭化成ケミカルズ株式会社 | 高純度グリコール酸水溶液の製造法 |
| WO2007140816A1 (en) * | 2006-06-09 | 2007-12-13 | Metabolic Explorer | Glycolic acid production by fermentation from renewable resources |
| US20100267100A1 (en) * | 2007-03-21 | 2010-10-21 | Ling Hua | Enzymatic synthesis of optically pure beta-hydroxy carboxylic acids and their derivatives |
| US20090004720A1 (en) * | 2007-06-26 | 2009-01-01 | Ling Hua | Smart Biocatalysts For Organic Synthesis |
| US7741088B2 (en) | 2007-10-31 | 2010-06-22 | E.I. Dupont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
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| US7695945B2 (en) * | 2007-10-31 | 2010-04-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immobilized microbial nitrilase for production of glycolic acid |
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| CN110205315B (zh) * | 2019-05-30 | 2021-01-01 | 中国石油大学(华东) | 腈水解酶XiNit2及其编码基因和应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2245585B1 (ko) | 1973-09-19 | 1976-05-14 | Anvar | |
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| JP2974737B2 (ja) | 1990-08-16 | 1999-11-10 | 三菱レイヨン株式会社 | 光学活性乳酸の製造法 |
| DE69126762T2 (de) | 1990-11-14 | 1997-10-23 | Nitto Chemical Industry Co Ltd | Biologisches Verfahren zur Herstellung von Alpha-Hydroxyamid und Alpha-Hydroxysäure |
| JP2676568B2 (ja) | 1991-06-26 | 1997-11-17 | 日東化学工業株式会社 | Ｒ（−）−マンデル酸およびその誘導体の製造法 |
| JP3354688B2 (ja) | 1994-01-28 | 2002-12-09 | 三菱レイヨン株式会社 | 微生物によるα−ヒドロキシ酸またはα−ヒドロキシアミドの製造法 |
| JP3154646B2 (ja) | 1995-07-19 | 2001-04-09 | 三菱レイヨン株式会社 | グリコール酸の微生物学的製造法 |
| US5756306A (en) | 1995-11-10 | 1998-05-26 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for producing a-hydroxy acid or a-hydroxyamide by microorganism |
| US5858736A (en) | 1996-05-17 | 1999-01-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Preparation of lactams from aliphatic α,ω-dinitriles |
| US6037155A (en) * | 1997-02-27 | 2000-03-14 | Nippon Soda Co., Ltd. | Process for preparing α-hydroxy acids using microorganism and novel microorganism |
| EP1280892B1 (en) * | 2000-03-31 | 2011-01-12 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | ISOLATION AND EXPRESSION OF A GENE FOR A NITRILASE FROM i ACIDOVORAX FACILIS 72W |
| US6562603B2 (en) * | 2000-08-04 | 2003-05-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | 3-hydroxycarboxylic acid production and use in branched polymers |
| US6455730B1 (en) * | 2000-08-04 | 2002-09-24 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Preparation of dicarboxylic acid monoesters from cyanocarboxylic acid esters |
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