JP4235450B2

JP4235450B2 - ニトリラーゼを用いて対応するアルファーヒドロキシニトリルからアルファーヒドロキシ酸、グリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸の製造法

Info

Publication number: JP4235450B2
Application number: JP2002568752A
Authority: JP
Inventors: チャウハンサリタ; ディコシモロバート; ディー．ファロンロバート; イー．ガヴァガンジョン; エス．ペインマーク
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2001-02-23
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: WO2002068658A1; DE60223250D1; DE60223250T2; US6383786B1; CA2433036A1; EP1399567B1; CN1549860A; EP1399567A1; MXPA03007484A; KR20040004535A; JP2005504506A; CN100402652C; US6416980B1

Description

本発明は、ニトリラーゼ活性を有する触媒を用いてαーヒドロキシ酸類の製造法に関するものである。より詳細には、本発明は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼ活性を有する触媒を用いたグリコロニトリルからグリコール酸、またはアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸の製造に関する。

出発物質として対応するαーヒドロキシニトリルおよび触媒として微生物を用いたαーヒドロキシ酸類の種々の調製法は知られている。製造されるαーヒドロキシ酸類の例としては、グリコール酸、乳酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、マンデル酸、２−ヒドロキシ−３，３−ジメチル−４−ブチロラクトン、および４−メチルチオ酪酸が挙げられる。

これらの生成物は、ノカルジア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、オーレオバクテリウム属、シュードモナスス属、Ｃａｓｅｏｂａｃｔｅｒ属、アルカリゲネス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、アルトロバクター属、エシェリキア属、ミクロコッカス属、ストレプトミセス属、フラボバクテリウム属、アエロモナス属、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属、セルロモナス属、エルウィニア属、カンジダ属、Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ属、フサリウム属、ロドシュードモナス属、ロードコッカス属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、Ｏｂｓｕｍｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、およびＧｏｒｄｏｎｅ属に属するものなどの微生物を用いて合成される。（米国特許公報（特許文献４）に対応する日本国特許公開公報（特許文献１）、（特許文献２）および（特許文献３）；米国特許公報（特許文献６）に対応する日本国特許公開公報（特許文献５）；米国特許公報（特許文献８）に対応する日本国特許公開公報（特許文献７）；日本国特許公開公報（特許文献９）；米国特許公報（特許文献１１）に対応する日本国特許公開公報（特許文献１０）；欧州特許公開公報（特許文献１３）に対応する日本国特許公開公報（特許文献１２）；米国特許公報（特許文献１５）に対応する日本国特許公開公報（特許文献１４）；米国特許公報（特許文献１７）に対応する日本国特許公開公報（特許文献１６））。

しかしながら、上記のように対応するαーヒドロキシニトリル類からαーヒドロキシ酸類を調製するために知られた多くの方法は、商業ニーズに合致するのに十分な高濃度で生成物を製造せず、かつ蓄積しない。これは、反応段階の早期に酵素が不活化することが多いからである。米国特許公報（特許文献１８）には、「αーヒドロキシニトリルが、ニトリラーゼまたはニトリルヒドラターゼを用いて酵素的に加水分解され、または水和されて、αーヒドロキシ酸またはαーヒドロキシアミドを生成する際、酵素が短時間で不活化されるという問題が発生する。したがって、αーヒドロキシ酸またはαーヒドロキシアミドを高濃度、高収率で得ることは困難である」（１欄、４９〜５４行）ことを教示している。

米国特許公報（特許文献１７）には、さらに急速な酵素不活化に関する困難さを扱っている。具体的には、米国特許公報（特許文献１７）は、αーヒドロキシニトリル化合物は、解離平衡によって部分的に対応するアルデヒド類に解離することを記載している。これらのアルデヒド類が、蛋白質に結合することにより短時間で酵素を不活化して、αーヒドロキシニトリル類から高生産性、高収率でαーヒドロキシ酸またはαーヒドロキシアミドを得ることを困難にしている（２欄、１６〜２９行）。アルデヒド類の蓄積によって酵素不活化を防ぐ溶媒として、リン酸塩イオンまたはホスフィン酸塩イオンが反応混合物に添加された。米国特許公報（特許文献１１）は、アルデヒドを抑えかつ酵素不活化を防ぐために亜硫酸塩、二亜硫酸塩またはジチオン酸塩が用いられること以外、米国特許公報（特許文献１７）と同様である。しかし、上記のような添加物を用いても、生成し蓄積されたαーヒドロキシ酸の濃度は高くはない。

米国特許公報（特許文献１９）でも、αーヒドロキシ酸生成物の蓄積の低さは、解離アルデヒドの蓄積によって短時間で酵素が不活化することに関連することを教示している。これらの発明者らは、水中のαーヒドロキシニトリルの部分的解離で対応するアルデヒドまたはケトン（非特許文献２）と一緒に生成されるシアン化水素の存在で酵素活性が阻害されること（非特許文献１）を示唆している。この発明者らは、反応混合物にシアン化物を添加することによって酵素活性を改善できる微生物を用いることにより、アルデヒド誘導酵素不活化の課題を解決した。シアン化物質の添加は、αーヒドロキシニトリルをアルデヒドおよびシアン化水素の解離を制限した。（αーヒドロキシニトリルをアルデヒドおよびシアン化水素への解離により形成された）アルデヒド濃度および／または特定の範囲内で反応混合物中でのαーヒドロキシニトリル濃度を維持することは、本課題を避ける１つの方法である。

グリコール酸（ＨＯＣＨ₂ＣＯＯＨ；ＣＡＳ登録番号７９−１４−１）は、カルボン酸類中のαーヒドロキシ酸族のうちで最も簡単な化合物である。その独特の性質により、水源の再生、皮革産業、オイルおよびガス産業、クリーニングおよび織物産業での利用、そしてスキンクリームのような個人ケア製品の成分としての利用など消費者から産業適用まで広範囲なものにとって理想的となる。グリコール酸はまた、多様な産業におけるクリーナー（乳製品および食品加工装置のクリーナー、家庭用および施設用クリーナー、産業用クリーナー[輸送設備、石工、プリント回路盤、ステンレス鋼ボイラーと加工装置、およびクーリングタワー／熱交換器]、金属加工[金属浸漬、銅磨き、エッチング、電気メッキ、電気研磨]）の本質的な成分である。グリコール酸を商業的に製造する新技術は工業界で熱望されるであろう。

具体的にグリコール酸の製造については、グリコロニトリルは、シアン化水素およびホルムアルデヒドに可逆的に解離することが知られており、そのいずれかが酵素活性を不活化できる。米国特許公報（特許文献２０）には、「ニトリラーゼ」活性を有する微生物を用いて、対応するニトリルから有機酸を調製する方法を記載し、基質としてグリコロニトリルをリストアップしている。特に、該特許には、この目的のために、バチルス属、Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ属、ミクロコッカス属およびブレビバクテリウム属の使用を記載している。ニトリラーゼ活性を有するものとして記載しているが、ブレビバクテリウム属Ｒ３１２は、米国特許公報（特許文献２０）の全ての実施例に使用されている唯一の株である。ブレビバクテリウム属Ｒ３１２は、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を有するが、ニトリラーゼ活性のないことが知られている（非特許文献１）。（特許文献２１）には、ロードコッカス属またはＧｏｒｄｏｎａ属ヒドロラーゼの作用により、グリコロニトリルから高純度のグリコール酸の製造法を開示している。グリコール酸の選択性は、グリコール酸アミドの形成を伴なわずほとんど１００％と報告されている。

２−ヒドロキシイソ酪酸（ＣＡＳ登録番号５９４−６１−６）は、接着剤および被覆剤などの種々の産業に有用な産業材料の製造中間体として用いられる。

Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．に属する微生物を用いることによる乳酸、グリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸の調製法は、日本国特許公開公報（特許文献２２）に開示されている。２−ヒドロキシイソ酪酸はまた、ロードコッカス属、シュードモナス属、アルトロバクター属、またはブレビバクテリウム属日本国特許公開公報（特許文献２３）およびアクモバクター属日本国特許公開公報（特許文献２４）に属する微生物を用いてアセトンシアノヒドリンから製造されている。ロードコッカス属ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ（ＡＴＣＣ１９１４０）を用いる２−ヒドロキシイソ酪酸の製造効率は、反応混合物に０．５〜５０重量％のアセトンを添加することにより改善されたが日本国特許公開公報（特許文献２５）、おそらくはシアン化水素の金属イオン封鎖により改善された。

（特許文献１９）にはまた、グリコール酸および２−ヒドロキシイソ酪酸など、αーヒドロキシニトリル類からのαーヒドロキシ酸製造法の例を提供している。この開示には、微生物触媒の全てが、前記課題によってかならずしも高濃度のグリコール酸を製造できるわけではないことを認めており、また産業的に有利な微生物を見つけ出すためのスクリーニング研究を実施する必要があることを教示している。米国特許公報（特許文献１９）には、具体的にＶａｒｉｏｖｏｒａｘｓｐｐ．およびアルトロバクターｓｐｐ．に属する微生物を同定しているが、これらは、αーヒドロキシニトリルまたはαーヒドロキシ酸の抑制作用に抵抗性であり、永続的活性を有し、高濃度で所望の産物を製造できる。

アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）は、脂肪族ニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．７）活性並びにニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）活性およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性の組み合わせを特徴とする。米国特許公報（特許文献２６）には、水性反応混合物中で、脂肪族α，ωージニトリル類を対応するωーシアノカルボン酸およびアンモニアへ加水分解するための触媒としてこの微生物のニトリラーゼ活性の利用を記載している。該ニトリラーゼは、高い位置選択性があることが判り、αーアルキルーα，ωージニトリルの加水分解では、ωーニトリル基の加水分解から生じるωーシアノカルボン酸のみを生じた。米国特許公報（特許文献２７）には、所望のニトリラーゼ活性については大きな減少を生じることなく、細胞全体触媒のうち望ましくないニトリルヒドラターゼ活性とアミダーゼ活性とを不活化するために、適切な緩衝液中のアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ６６７４６）の懸濁液を、３５〜７０℃で短時間加熱することを記載している。

特開平４−９９４９５号公報特開平４−９９４９６号公報特開平４−２１８３８５号公報米国特許第５，２２３，４１６号明細書特開平４−９９４９７号公報米国特許第５，２３４，８２６号明細書特開平５−９５７９５号公報米国特許第５，２９６，３７３号明細書特開平５−２１９８７号公報特開平５−１９２１８９号公報米国特許第５，３２６，７０２号明細書特開平６−２３７７８９号公報欧州特許公開公報０６１００４８明細書特開平６−２８４８９９号公報欧州特許公開第０６１００４９号明細書特開平７−２１３２９６号公報米国特許第５，５０８，１８１号明細書米国特許第５，７５６，３０６号明細書米国特許第６，０３７，１５５号明細書米国特許第３，９４０，３１６号明細書特開平９−０２８３９０号公報特開昭６１−５６０８６号号公報特開平４−０４０８９７Ａ２号公報特開平６−２３７７７６Ａ２号公報特開平５−２１９９６９Ａ２号公報米国特許第５，８５８，７３６号明細書米国特許第５，８１４，５０８号明細書ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、４６巻、１９８２年１１６５頁ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ，４２巻、１９４８年、１８９頁Ｔｏｕｒｎｅｉｘら、ＡｎｔｏｎｉｅｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ、１９８６年、５２：１７３〜１８２頁ＭＥＴＨＯＤＳｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１卷：ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＣｅｌｌｓ；ＧｏｒｄｏｎＦ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ著、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ、米国ニュージャージー州トトワ、１９９７年Ｓｔｅｗａｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６２巻：３２８１〜５頁、（１９４０年）

上記に説明したように、αーヒドロキシ酸を効率的に製造するためにニトリラーゼ触媒を用いる産業プロセスを開発することは、困難であることが判った。生成物の濃度が低い場合、該プロセスは、特に未反応の出発原料から生成物を分離すること、または大容量の生成混合物から少量の所望の生成物を単離することに関して複雑になりがちであることは、当業者によく知られていることである。高収率、高濃度、高選択性、追加の利点として低温要件と低廃棄生産を特徴とするプロセスでαーヒドロキシニトリル類を対応する酸へ変換するための好適な酵素触媒の不足が解決すべき課題として残っている。

本発明は、高選択性かつ高変換で対応するαーヒドロキシニトリルからαーヒドロキシ酸を調製する方法を提供する。本発明は、（ａ）適切な水性反応混合物中で、α−ヒドロキシニトリルを、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）に由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）で製造されたα−ヒドロキシ酸を単離するステップとを有する。

本発明は、さらに具体的に、高選択性かつ高変換でグリコロニトリルからグリコール酸を調製する方法を提供する。本発明は、（ａ）適切な水性反応混合物中でグリコロニトリルを、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）に由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒と接触させるステップと、（ｂ）（ａ）で製造された対応するグリコール酸を単離するステップとを有する。さらに、本発明は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼ活性を有する触媒を用いて、アセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸の製造に関する。

本発明のさらなる実施態様は、微生物細胞全体、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の1種または２種以上の細胞成分、部分的に精製された酵素、または精製された酵素の形態でニトリラーゼ活性を有する触媒を用いる。ニトリラーゼ活性を特徴とし、プロセスに有用な微生物は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）とその変異体、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ５５７４７）、およびアシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）である。さらにＡ．ｆａｃｉｌｉｓニトリラーゼ活性を含有する形質変換微生物細胞は本発明に包含される。エシェリキア・コリＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）およびエシェリキア・コリＳＷ９１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７５）は、このような形質変換微生物細胞触媒の例である。

本発明のさらなる実施態様は、グリコロニトリルをグリコール酸への変換またはアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸へ変換するための酵素触媒として（１）ニトリラーゼ活性および（２）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性、を特徴とする微生物細胞全体を使用する。好ましい細胞全体は、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ株である。しかしながら、触媒として使用する前にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ微生物細胞全体を、１０分間から１２０分間、約３５℃から７０℃の温度に加熱し、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を破壊し、ニトリラーゼ活性を維持する。この処理は、不必要な副生成物（それぞれグリコールアミドまたは２−ヒドロキシイソブチルアミド）の形成を避ける。変異体および形質変換微生物細胞全体は、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を欠くので、熱処理ステップを必要としない。エシェリキア・コリＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）およびエシェリキア・コリＳＷ９１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７５）は、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を欠く形質変換微生物細胞触媒の例である。

いかなる形態でもかつ任意に、酵素触媒を、可溶性または不溶性支持体内または支持体上に固定できる。

（生物寄託の簡単な説明）
出願人は、特許手続きの目的のために微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に従って以下の生物寄託を行った。

本願明細書で用いられる「ＡＴＣＣ」とは、米国２０１１０−２２０９バージニア州マナサス、大学通り１０８０１、アメリカ種培養菌収集国際寄託局を指す。「国際寄託呼称」とは、ＡＴＣＣ寄託培養菌に対する承認番号である。

リストアップされた寄託微生物は、指定された国際保管書で少なくとも３０年間保持され、特許付与時に開示して公に利用できる。寄託微生物の入手により、政府決定により付与された特許権を損なって発明内容の実施許可の構成要素とはならない。

出願人は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を用いて、高収率かつ高濃度で対応するαーヒドロキシニトリルからαーヒドロキシ酸の調製法を提供することにより記載された課題を解決した。出願人は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を用いて、高収率かつ高濃度で対応するαーヒドロキシニトリルからαーヒドロキシ酸の調製法を提供することにより記載された課題をより具体的に解決した。さらに、本発明は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を有する触媒を用いてアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸の製造に関するものである。生成物は、高選択性かつ高変換で生成される。

本発明によるグリコール酸、２−ヒドロキシイソ酪酸またはαーヒドロキシ酸は、種々の産業において有用に適用される。本発明は、これまで知られた方法と比較して低温要件および低廃棄製造の所望の製法利点を提供する。

本発明は、（ａ）適切な水性反応混合物中で、α−ヒドロキシニトリルを、ニトリラーゼ活性（ＥＣ３．５．５．７）またはニトリルヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．８４）活性およびアミダーゼ（ＥＣ３．５．１．４）活性を特徴とする触媒と接触させるステップと、（ｂ）酸または対応する塩の形態で（ａ）で製造された対応するα−ヒドロキシ酸を単離するステップとを含む。ニトリラーゼ酵素は、中間体として対応するアミドを形成することなく、脂肪族ニトリルを直接対応するカルボン酸に変換する（式１）。

（定義）：
本開示において、多くの用語および略語が使用されている。他に具体的に述べない限り、以下の定義が適用される。

用語の「触媒」、「酵素触媒」または「微生物細胞全体触媒」は、ニトリラーゼ活性を特徴とする触媒を称する。該酵素触媒は、微生物細胞全体、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の1種または２種以上の細胞成分、部分的に精製された酵素、または精製された酵素の形態で存在できる。

用語「アシドボラックス・ファシリス」および「Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ」は、代替可能に使用される。

用語「エシェリキア・コリ」および「Ｅ．ｃｏｌｉ」は、代替可能に使用される。

用語「グリコロニトリル」は、ヒドロキシアセトニトリル、２−ヒドロキシアセトニトリル、ヒドロキシメチルアセトニトリルと同義語であり、ＣＡＳ登録番号１０７−１６−４の他の全てと同義語である。

用語「グリコール酸」は、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシエタン酸と同義語であり、ＣＡＳ登録番号７９−１４−１の他の全てと同義語である。

用語「アセトンシアノヒドリン」は、２−ヒドロキシ−２−メチル−プロパンニトリル、２−メチル−ラクトニトリル、α−ヒドロキシイソブチロニトリル；２−シアノ−２−ヒドロキシプロパン；２−シアノ−２−プロパノール、２−ヒドロキシ−２−シアノプロパン、２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンニトリル、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオニトリル、２−ヒドロキシプチロニトリル、２−メチル−２−ヒドロキシプロピオニトリル、２−メチルアセトニトリル、２−プロパノンシアノヒドリン、ジメチルケトンシアノヒドリンと同義語であり、ＣＡＳ登録番号７５−８６−５の他の全てと同義語である。

用語「２−ヒドロキシイソ酪酸」は、２−ヒドロキシ−２−メチル−プロパン酸、２−メチル−乳酸、α−ＨＩＢ、α−ヒドロキシ−α−メチルプロパン酸、α−ヒドロキシ−イソブタン酸、α−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン酸、２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸、２−メチル乳酸、アセトン酸、ヒドロキシジケチル酢酸、と同義語であり、ＣＡＳ登録番号５９４−６１−６の他の全てと同義語である。

用語「適切な水性反応混合物」は、αーヒドロキシニトリル（例えば、グリコロニトリルまたはアセトンシアノヒドリン）と酵素触媒が接触している物質と水を称する。適切な水性反応混合物の成分を記載する表をここに提供し、当業者は、このプロセスに適切な成分変動範囲を認識する。

明細書中の略語は、次のとおり測定、技術、性質または化合物の単位に対応する：「ｓｅｃ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」は、時間を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「ｍＭ」は、ミリモルを意味し、「Ｍ」は、モルを意味し、「ｍｍｏｌ」は、ミリモルを意味し、「ｗｔ」は、重量を意味する。「ＨＰＬＣ」は、高性能液体クロマトグラフィを意味し、「ｃａ」は、約を意味し、「Ｏ．Ｄ．」は、指定された光学密度を意味し、「ＩＵ」は、国際単位を意味する。

（方法と材料）
ニトリラーゼ活性を特徴とし、プロセスに有用な微生物は、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）である。酵素触媒として（１）ニトリラーゼ活性および（２）ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を特徴とする微生物細胞全体が使用できる。好ましい細胞全体は、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ株である。しかしながら、触媒として使用する前にＡ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ微生物細胞全体を、１０分間から１２０分間、約３５℃から７０℃の温度に加熱し、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を破壊し、ニトリラーゼ活性が維持される米国特許公報（特許文献２７）。この熱処理は、それぞれのαーヒドロキシニトリル変換が不完全な場合に得られる不必要な副生成物（例えば、グリコールアミドまたは２−ヒドロキシイソブチルアミド）の形成を避ける触媒を精製する。変異体および形質変換微生物細胞全体は、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を欠くので、熱処理を必要としない。

脂肪族のジニトリル類の非位置特異的ニトリル加水分解を招く不必要なニトリルヒドラターゼ活性の極低濃度のみを生ずるアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）株の２種の変異体が調製されている（特許文献２６）。これらの変異株である、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ５５７４７）とアシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）は、本発明の触媒として使用する前に細胞の熱処理を必要としない。

Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ活性を含有し、ニトリルヒドラターゼ活性およびアミダーゼ活性を欠く形質変換微生物細胞は、本発明に包含される。エシェリキア・コリＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）およびエシェリキア・コリＳＷ９１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７５）は、このような形質変換微生物細胞触媒の例である。

（アシドボラックス・ファシリス株７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の増殖）
１瓶のアシドボラックス・ファシリス株７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の凍結シードロットバイアルを解凍し、１ｍＬの内容物を５００ｍＬの滅菌接種培地に入れた（成分は下表１と２に掲げている）。接種により、２Ｌフラスコ中、２５０ｒｐｍで振とうさせながら３０℃で２４〜３０時間増殖させた。

振とうフラスコからの接種物を発酵槽用培地（下表３に掲載した成分）を含有した、予め滅菌したブラウンバイオスタット（ＢｒａｕｎＢｉｏｓｔａｔ）Ｃ発酵槽へ無菌的に移した。増殖は以下の条件で生じた：３２℃、ｐＨ６．８〜７．０、２５％飽和の酸素を溶解。接種時、発酵槽は８．５Ｌの発酵槽用培地プラス２１８ｇのＮｕｔｒｉｅｎｔＦｅｅｄ溶液を含有し、グリセロールの出発濃度は、おおよそ７ｇ/Ｌであった。ＮｕｔｒｉｅｎｔＦｅｅｄ溶液は、別々に滅菌され、冷却後に配合した以下の成分を含む：一塩基性リン酸カリウム、脱イオン水０．２５Ｌ中１９．６ｇ；硫酸マグネシウム７水塩、３．３ｇプラス硫酸、脱イオン水０．１５Ｌ中４ｍＬ；微量金属溶液（上記表２に掲げた成分）６７ｍＬプラス脱イオン水０．８０Ｌ中グリセロール４００ｇ。接種１８時間後、ＮｕｔｒｉｅｎｔＦｅｅｄ溶液の供給を始めた。最初は供給量０．４ｇ／分（グリセロール０．１５ｇ／分）の率で加えた。培養ＯＤ５５０はおおよそ８〜９であった。２６時間の時点で供給率を供給量０．９ｇ／分（グリセロール０．３ｇ／分）に増加させた。ＯＤ５５０は、おおよそ１６〜１８であった。供給量１．８ｇ／分（グリセロール０．６ｇ／分）への最終供給率増加は３４時間の時点で行われた。この率を操作終了時（約４２時間）まで続けた。最終のＯＤ５５０はおおよそ６５〜７５であった。

湿潤細胞ペーストとしての細胞を遠心分離によって回収し、使用まで凍結保存した。湿潤細胞ペーストの凍結乾燥によって得られた乾燥細胞重量は、典型的には、湿潤細胞重量の２４％であった。生物触媒として使用するためには、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）を、場合によっては０．３５Ｍリン酸緩衝液中、５０℃まで１時間加熱し、ニトリルヒドラターゼ活性を先ず不活化する。

（αーヒドロキシ酸製造のためのアシドボラックス・ファシリス７２Ｗニトリラーゼ活性の利用）
Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ細胞全体は、ニトリラーゼの他に、ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを含有する。ニトリルヒドラターゼは、αーヒドロキシニトリルをαーヒドロキシアミドへ変換するが（例えば、グリコロニトリルからグリコールアミドへ）、これは収量損失を導く、不必要な副産物である（実施例２）。この副産物を避けるために、Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ細胞全体触媒は、加熱処理してニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性を除去し、グリコールアミド産生を伴なわずにグリコール酸への高い選択性を与える微生物触媒を生産することができる（実施例１）。グリコール酸および２−ヒドロキシイソ酪酸は、１ｍＭから５Ｍへ、好ましくは２００ｍＭから２Ｍへの濃縮により生産できる。酵素活性は長時間安定状態で保持される。

微生物細胞全体は、透過性付与などの前処理なしに触媒として利用できる。他に、細胞全体は、当業者によく知られた方法（例えば、トルエンでの処理界面活性剤または凍結融解）により透過性を与えられて、その細胞内外への物質の拡散速度を高めることができる。

酵素触媒は、触媒の回収及び再使用を容易にするためにポリマーマトリックス（例えば、アルギン酸塩、カラゲニン、ポリビニルアルコールまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ））内に、または可溶性または不溶性の支持体（例えば、セライト）上に固定化できる。ポリマーマトリックス内へ、または可溶性または不溶性の支持体上への細胞固定法は広汎に報告されており、当業者によく知られている。ニトリラーゼ酵素もまた細胞全体から単離でき、触媒として直接利用されるか、またはニトリラーゼはポリマーマトリックス内へ、または可溶性または不溶性の支持体上へ固定化できる。これらの方法もまた、広汎に報告されており、当業者によく知られている（非特許文献４）。

反応混合液中の酵素触媒の濃度は、グリコールアミドの特異的触媒活性に依存しており、望ましい反応速度を得るために選択される。加水分解反応における微生物細胞全体触媒の湿潤細胞重量は典型的には１ｍＬにつき湿潤細胞０．００１ｇから０．１００ｇであり、好ましくは１ｍＬにつき湿潤細胞０．００２ｇから０．０５０ｇである。微生物細胞全体触媒（ＩＵ／グラム湿潤細胞重量）の特異的活性は、微生物細胞全体触媒の知られた重量を用いて２５℃での０．１０Ｍグリコロニトリル溶液からグリコール酸への変換速度の測定により決定される。酵素活性のＩＵは、１分間につき１ミクロモルの基質を生成物に変換するために要する酵素活性の量として定義される。

加水分解の温度は、反応速度と酵素触媒活性の安定性の双方を最適化するために選択される。反応温度は懸濁液の氷点の僅か上（約０℃）から７０℃までの範囲にでき、好ましい反応速度の範囲は５℃から３５℃である。微生物細胞全体触媒懸濁液は、蒸留水に、または緩衝液（例えば、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを含有する水性反応混合液中に）細胞を懸濁させることによって調製され、ここで反応開始時のｐＨは５．０から１０．０の間、好ましくは６．０から８．０の間である。反応が進行するにつれ、反応混合液のｐＨは、αーヒドロキシニトリルのニトリル官能性から生じる対応するαーヒドロキシ酸アンモニウム塩の形成により変化する。この反応は、ｐＨ制御なしで、αーヒドロキシニトリルの完全変換へと進行でき、または望ましいｐＨを維持するために、反応経過中、好適な酸または塩基を加えることができる。

このようにして得られたグリコール酸は、細胞などの不溶物質を、通常の当業者によく知られた方法により反応混合液を処理することにより単離できる。このような方法として、限定はしないが、濃縮、イオン交換、電気透析、抽出および結晶化が挙げられる。生成物は、アンモニウム塩として、または酸性化後にグリコール酸として単離できる。

アセトンシアノヒドリンは、水中で可逆的にシアン化水素とアセトンに分かれ（非特許文献５）、反応混合液のｐＨが低下するつれ、アセトンシアノヒドリンが平衡となることが好ましい。アセトンシアノヒドリンの酵素触媒による加水分解の至適ｐＨは、酵素が活性を保持できる最低ｐＨ、限定しないが、典型的にはｐＨ４．５〜６．０である。反応終了時に残留するアセトンは回収され、アセトンシアノヒドリンの生産に利用できる。反応出発物質として利用するためにアセトンをリサイクルすることで、アセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸への総交換率を高めることができる。

このようにして得られた２−ヒドロキシイソ酪酸は、反応混合液（細胞などの不溶性物質は除去される）を、通常の当業者によく知られた方法により処理することによって単離できる。このような方法として、限定はしないが、濃縮、イオン交換、蒸留、電気透析、抽出および結晶化が挙げられる。生成物は、アンモニウム塩として、または（酸性化後に）２−ヒドロキシイソ酪酸として単離できる。

本発明は、以下の実施例によって、さらに明らかに示される。これらの実施例は、本発明の好適な実施態様を示しているが、例示としてのみ与えられることを理解されたい上記の検討とこれらの実測値から、当業者は本発明の本質的特徴を確認でき、その精神と範囲から逸脱することなく、それを様々な利用法や条件に適合させるために、本発明の種々の変更や修飾を行うことができる。

実施例１〜４では、グリコロニトリルから反応生成物であるグリコール酸とグリコールアミドへの変換は、Ｂｉｏ−ＲａｄＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラム（直径３０ｃｍ×７．８ｍｍ）、５０℃での予備カラム、溶出液として０．０１０ＮＨ₂ＳＯ₄および屈折率検出器を用いたＨＰＬＣによって確認された。

実施例５と６では、アセトンシアノヒドリンの回収パーセント、２−ヒドロキシイソ酪酸、２−ヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率は、反応混合液に存在するアセトンシアノヒドリンの最初の濃度に基づいており、屈折率検出器およびＢｉｏ−ＲａｄＨＰＸ−８７Ｈ有機酸分析カラム（直径３０ｃｍ×７．８ｍｍ）と５０℃での予備カラム、溶出液として０．０１０ＮＨ₂ＳＯ₄を１ｍＬ／分で用いたＨＰＬＣによって確認された。

（実施例１）
（アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を利用したグリコロニトリルからグリコール酸への変換）
９．３８ｍＬの０．１００Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、０．６２ｇ（湿潤細胞ペースト）のアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞懸濁液を、１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブに入れ、細胞懸濁液を５０℃で１時間（望ましくないニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性を完全に不活化させるため）加熱し、次に水浴で２５℃まで冷却した。該懸濁液を遠心分離にかけ、上澄液をデカントした。一方、細胞ペレットは９．４８ｍＬの０．０２０Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に再懸濁し、２５℃で１５分間混合してから、該懸濁液を遠心分離にかけた。上澄液をデカントした。生じた細胞ペレットを、９．３８ｍＬの０．０２０Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に再懸濁した。次にこのチューブに５５重量％のグリコロニトリルの水溶液の０．１０６ｍＬを加え（懸濁液中のグリコロニトリルの最終濃度は０．１０Ｍ）、生じた懸濁液を２５℃で回転プラットホーム上で混合した。分析用サンプル（０．２００ｍＬ）を先ず６ＮＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、反応を中止させ、遠心分離にかけ、上澄液を０．２ミクロンフィルタを用いて濾過した。生じた濾液は、グリコロニトリル、グリコール酸、グリコールアミドに関してＨＰＬＣにより分析した。２時間後、グリコロニトリルはグリコール酸へ完全に変換されておりグリコールアミドは生成していなかた。

グリコロニトリルの最初の濃度が完全に変換されてから、反応混合液に追加の５５重量％グリコロニトリル水溶液０．３１２ｍＬ（反応混合液にグリコロニトリル０．３０Ｍ追加、全体で０．４０Ｍ）を加え、反応を続行した。１４時間後、追加したグリコロニトリルは殆ど完全にグリコール酸に転換されたら、反応混合液に追加の５５重量％グリコロニトリル水溶液０．６２４ｍＬ（グリコロニトリル０．６０Ｍ濃度追加、全体で１．０Ｍ）を加えた。４０時間後、１．０Ｍグリコロニトリルはグリコールアミドの産生なしにグリコール酸へ完全に変換されたことが観察された。

（実施例２（比較））
（ニトリラーゼおよびニトリルヒドラターゼ／アミダーゼ活性の双方を有するアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞によるグリコロニトリルのグリコール酸とグリコールアミドへの変換）
リン酸塩緩衝液中のＡ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ細胞懸濁液を反応に使用する前に５０℃で１時間加熱しなかったこと以外は、実施例１に記載された反応を繰り返した。５５重量％のグリコロニトリル水溶液０．１０６ｍＬを含有する０．０２０Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）９．４８ｍＬ、０．５２ｇ（湿潤細胞ペースト）のＡ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗ細胞（懸濁液中グリコロニトリルの最終濃度は０．１０Ｍ）を２５℃で混合した。２時間後、グリコロニトリルは完全に変換し、グリコール酸とグリコールアミドの収率は、それぞれおおよそ６１％と３９％であった。

２時間の反応後、反応混合液に追加の５５重量％グリコロニトリル水溶液０．３１２ｍＬ（反応混合液にグリコロニトリル０．３０Ｍ濃度追加、全体で０．４０Ｍ）を加えた。４時間後、追加のグリコロニトリルのかなりの量が残存し、グリコール酸とグリコールアミドの濃度比は約３．４：１であった。反応混合液に追加の５５重量％グリコロニトリル水溶液０．６２４ｍＬ（グリコロニトリル０．６０Ｍ濃度追加、全体で１．０Ｍ）を加えた。２２時間後、約４０％のグリコロニトリルが残存し、グリコール酸とグリコールアミドの濃度比は約９：１であった。

（実施例３）
（アシドボラックス・ファシリス変異体、７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ５５７４７）または７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）を用いたグリコロニトリルのグリコール酸への転換）
Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗの代わりに、変異株Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２−ＰＦ−１５または７２−ＰＦ−１７を用いること以外は、実施例１に記載された反応を繰り返した。０．０２０Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）８．４４ｍＬ中の、０．５０ｇ（湿潤細胞ペースト）のＡ．ｆａｃｉｌｉｓ７２−ＰＦ−１５または７２−ＰＦ−１７懸濁液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブに入れた。次にこのチューブに５５重量％のグリコロニトリルの水溶液の１．０６ｍＬを加え（懸濁液中のグリコロニトリルの最終濃度は１．０Ｍ）、生じた懸濁液を２５℃で回転プラットホーム上で混合した。分析用懸濁液サンプル（０．２００ｍＬ）を先ず６ＮＨＣｌでｐＨ２．５に調整して、反応を中止させ、遠心分離にかけ、上澄液を０．２ミクロンフィルタを用いて濾過した。十分な時間後、副産物グリコールアミドを伴なわずにグリコロニトリルからグリコール酸への完全な変換が達成できる。

（実施例４）
（Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）またはＳＷ９１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７５）を用いたグリコロニトリルからグリコール酸への変換）
Ａ．ｆａｃｉｌｉｓ７２Ｗの代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１またはＳＷ９１を用いること以外は、実施例１に記載された反応を繰り返した。０．０２０Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）８．４４ｍＬ中の、０．５０ｇ（湿潤細胞ペースト）のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１またはＳＷ９１懸濁液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブに入れた。次にこのチューブに５５重量％のグリコロニトリルの水溶液の１．０６ｍＬを加え（懸濁液中のグリコロニトリルの最終濃度は１．０Ｍ）、生じた懸濁液を２５℃で回転プラットホーム上で混合した。分析用懸濁液サンプル（０．２００ｍＬ）を先ず６ＮＨＣｌでｐＨ２．５に調整し、反応を中止させ、遠心分離にかけ、上澄液を、０．２ミクロンフィルタを用いて濾過した。十分な時間後、副産物グリコールアミドを伴なわずにグリコロニトリルからグリコール酸への完全な変換が達成できる。

（実施例５）
（アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性によるアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸への変換）
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．６１ｍＬ中の、０．３４ｇ（湿潤細胞ペースト）のアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ細胞（ＡＴＣＣ５５７４６）を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブに入れ、細胞懸濁液を５０℃で０．５時間（望ましくないニトリルヒドラターゼとアミダーゼ活性を完全に不活化させる一方、ニトリラーゼ活性を保持するため）加熱し、次に水浴で２５℃まで冷却した。次にこのチューブにアセトンシアノヒドリン５１．０ｍｇを加え（懸濁液中のアセトンシアノヒドリンの最終濃度は０．１０Ｍ）生じた懸濁液を回転プラットホーム上、２５℃で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）を１．０Ｍプロピオン酸（ＨＰＬＣ外部基準）０．０２０ｍＬと混合し遠心分離し、上澄液をアセトンシアノヒドリン、アセトン、２−ヒドロキシイソ酪酸、および２ーヒドロキシイソブチルアミドに関してＨＰＬＣにより分析した。２１時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２ーヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率は、アセトンシアノヒドリンの残留なしで、それぞれ２１．６％、０％および７１．３％であった。

（実施例６）
（Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１を用いたアセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸への変換）
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５．２９ｍＬ中の、０．６６ｇ（湿潤細胞ペースト）のＥ．ｃｏｌｉ形質転換体ＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）懸濁液を１５ｍＬのポリプロピレン遠心分離チューブに入れ、次に５１．０ｍｇのアセトンシアノヒドリンを加え（懸濁液中、アセトンシアノヒドリンの最終濃度は０．１０Ｍ）、生じた懸濁液を回転プラットホーム上、２５℃で混合した。分析用サンプル（０．１８０ｍＬ）を１．０Ｍプロピオン酸（ＨＰＬＣ外部基準）の０．０２０ｍＬと混合し遠心分離し、上澄液をアセトンシアノヒドリン、アセトン、２−ヒドロキシイソ酪酸に関してＨＰＬＣにより分析した。８時間後、２−ヒドロキシイソ酪酸、２ーヒドロキシイソブチルアミドおよびアセトンの収率は、アセトンシアノヒドリンの残留なしで、それぞれ２３．０％、０％および６５．６％であった。

Claims

グリコロニトリルからグリコール酸を製造する方法であって、
（ａ）適切な水性反応混合物中でグリコロニトリルを、グリコロニトリルと接触させる前に１０分間から１２０分間、３５℃から７０℃の温度に加熱したアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ５５７４７）、またはアシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒と接触させる工程と、
（ｂ）塩または酸の形態で（ａ）で製造されたグリコール酸を単離する工程とを含むことを特徴とする方法。
アセトンシアノヒドリンから２−ヒドロキシイソ酪酸を製造する方法であって、
（ａ）適切な水性反応混合物中でアセトンシアノヒドリンを、アセトンシアノヒドリンと接触させる前に１０分間から１２０分間、３５℃から７０℃の温度に加熱したアシドボラックス・ファシリス７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）、アシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１５（ＡＴＣＣ５５７４７）、またはアシドボラックス・ファシリス７２−ＰＦ−１７（ＡＴＣＣ５５７４５）由来のニトリラーゼ活性を特徴とする触媒と接触させる工程と、
（ｂ）塩または酸の形態で（ａ）で製造された２−ヒドロキシイソ酪酸を単離する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
前記触媒が、アシドボラックス・ファシリス７２Ｗのニトリラーゼ活性を発現するために形質転換された微生物細胞全体の形態であり、前記微生物細胞全体がエシェリキア・コリＳＳ１００１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７７）またはエシェリキア・コリＳＷ９１（ＡＴＣＣＰＴＡ−１１７５）であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記触媒は、未処理微生物細胞、微生物細胞抽出物の１種または２種以上の細胞成分、部分的に精製された酵素、または精製された酵素の形態であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
前記触媒は、可溶性または不溶性の支持体中または支持体上に固定されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。