JP4551224B2 - ニトリラーゼ又はニトリルヒドラターゼ活性を有する細胞を保存及び/又は貯蔵する方法 - Google Patents
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Description
の化合物を意味する。特に、芳香族アルデヒドが好ましく、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒド、例えば、o−クロロベンズアルデヒド、m−クロロベンズアルデヒド、p−クロロベンズアルデヒド、o−ブロモベンズアルデヒド、m−ブロモベンズアルデヒド、p−ブロモベンズアルデヒド、o−メチルベンズアルデヒド、m−メチルベンズアルデヒド及びp−メチルベンズアルデヒドが極めて好ましい。
*は任意により活性中心であり、
R1、R2およびR3は、互いに独立に、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のC1−C10−アルキル−、C2−C10−アルケニル−、置換又は非置換のアリール−、ヘタリール−、OR4又はNR4R5であり、基R1、R2およびR3は常に異なるものであり、
R4は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のC1−C10−アルキル−、C2−C10−アルケニル−、C1−C10−アルキルカルボニル−、C2−C10−アルケニルカルボニル−、アリール−、アリールカルボニル−、ヘタリール−又はヘタリールカルボニル−であり、
R5は、水素、置換又は非置換の、分枝鎖又は非分枝鎖のC1−C10−アルキル−、C2−C10−アルケニル−、アリール−又はヘタリール−である)。
を用いる場合には、保存/貯蔵に用いられるアルデヒドは、水素シアン酸又はシアン化物との反応により前記αヒドロキシニトリルを生じる同じアルデヒドである、すなわち、基R6は式III及びIVにおいて同一のものが選択される。
R−CN + H2O → R−CO−NH2
その際、ニトリルヒドラターゼはECクラス4.2.1.84(ニトリルヒドラターゼ)の酵素を含むのが好ましい。
R−CN + 2H2O → R−COOH−NH3
ニトリラーゼは、好ましくは、ECクラス3.5.5.1(ニトリラーゼ)、3.5.5.2(リシニンニトリラーゼ)、3.5.5.4(シアノアラニンニトリラーゼ)、3.5.5.5(アリールアセトニトリラーゼ)、3.5.5.6(ブロモキシニルニトリラーゼ)並びに3.5.5.7(脂肪族ニトリラーゼ)を含む。
1.アシドボラクス・ファシリス(Acidovorax facilis)ニトリラーゼ72W (Gavagan JEら(1999) Appl Microbiol Biotechnol 52:654-659)
2.アシネトバクターsp.AK226ニトリラーゼ(Yamamoto K及びKomatsu K (1991) Agric Biol Chem 55(6):1459-1466)
3.アシネトバクターsp.RFB1ニトリラーゼ(Finnegan Iら (1991) Appl Microbiol Biotechnol 36:142-144)
4.アルカリゲネス・フェカーリスATCC8750ニトリラーゼ(Yamamoto Kら (1991) Appl Environ Microbiol 57(10):3028-3032)
5.アルカリゲネス・フェカーリスJM3ニトリラーゼ(Nagasawa Tら (1990) Eur J Biochem 194:765-772)
6.アラビドプシス・タリアーナニトリラーゼ(NIT1/NIT2/NIT3)(Vorwerk S ら (2001) Planta 212:508-516)
7.アルスロバクターsp.J−1ニトリラーゼ(Bandyopadhyay AKら(1986) Appl Environ Microbiol 51(2):302-306)
8.バチルス・パリダス(Bacillus pallidus)Dac521ニトリラーゼ (Cramp Rら(1997) Microbiology 143:2313-2320)
9.コマモナスsp.NI1ニトリラーゼ(Cerbelaud Eら(1996) Ind Chem Libr 8:189-200)
10.コマモナス・テストステロニsp.ニトリラーゼ(Levy-Schil Sら (1995) Gene 161:15-20)
11.フザリウム・オキシスポラムf.sp.メロニスニトリラーゼ(Goldlust A及びBohak Z (1989) Biotechnol Appl Biochem 11:581-601)
12.フザリウム・ソラニニトリラーゼ(Harper BH (1977) Biochem J 167:685-692)
13.クレブシエラ・オザエナニトリラーゼ(McBride KEら(1986) Appl Environ Microbiol 52(2):325-330)
14.シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluoreszenz)DSM 7155ニトリラーゼ(Layh Nら(1998) J Mol Catal B: Enzym 5:467-474)
15.シュードモナスsp.ニトリラーゼ(Layh Nら(1992) Arch Microbiol 158:405-411)
16.シュードモナスsp.(S1)ニトリラーゼ(Dhillon Jら (1999) Can J Microbiol 45: 811-815)
17.シュードモナスsp.13 ニトリラーゼ(Yanase Hら(1982) Agric Biol Chem 46:2925)
18.ロドコッカス・ロドクラウスJ1ニトリラーゼ(Kobayashi Mら(1989) Eur J Biochem 182:349-356)
19.ロドコッカス・ロドクラウスK22ニトリラーゼ(Kobayashi Mら(1990) J Bacteriol 172(9):4807-4815)
20.ロドコッカス・ロドクラウスNCIB11215ニトリラーゼ(Harper BH (1985) Int J Biochem 17(6):677-683)
21.ロドコッカス・ロドクラウスNCIB11216ニトリラーゼ(Harper BH (1977) Biochem J 165:309-319)
22.ロドコッカス・ロドクラウスPA34ニトリラーゼ(Bhalla TCら(1992) Appl Microbiol Biotechnol 37:184-190)
23.ロドコッカスsp.ATCC39484ニトリラーゼ(Stevenson DEら (1992) Biotechnol Appl Biochem 15:283-302)。
a)配列番号1に記載の配列を有する核酸配列、
b)遺伝暗号の縮合により配列番号1に記載の核酸配列から誘導される核酸配列、
c)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、アミノ酸レベルで少なくとも35%の相同性を示すと共に、少なくとも1つのニトリルを対応するカルボン酸に変換することができる、配列番号1に記載の核酸配列の誘導体。
a)好ましくは、大腸菌におけるpQE70、pQE60及びpQE−9(QIAGEN, Inc.); pBluescriptベクター、Phagescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、 pNH46A(Stratagene Cloning Systems, Inc);ptrc99a、pKK223−3、pKK233−3、pDR540、pRIT5(Pharmacia Biotech, Inc.);pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN−III113−B1、λgt11若しくはpBdCI、
b)好ましくは、ストレプトミセス属におけるpIJ101、pIJ364、pIJ702若しくはpIJ361、
c)好ましくは、バチルス属におけるpUB110、pC194若しくはpBD214、
d)コリネバクテリウム属におけるpSA77若しくはpAJ667、
又は前記プラスミドの誘導体。これらのプラスミドは、使用可能なプラスミドのほんの一部の選択に過ぎない。その他のプラスミドは当業者にはよく知られており、例えば、書籍:Cloning Vectors(編集:Pouwels P. H.ら、Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に記載されている。
選択マーカーは、概して、形質転換細胞を首尾よく選択し、かつ、時間経過による、及び細胞分裂中の、宿主細胞からのDNA構築物の喪失を防止するために必要である。このような喪失は、特に、発現させようとする核酸配列によりコードされる組換えタンパク質が原核生物に有毒な作用を及ぼす場合に起こりうる。発現構築物と一緒に導入される選択マーカーは、首尾よく形質転換された細胞に対して生物致死剤(例えば、アンピシリン、カナマイシン又はヒグロマイシンのような抗生物質)に対する耐性を賦与する。選択マーカーの例としては、以下のものが挙げられる:
−Amp(アンピシリン耐性;b−ラクタマーゼ)
−Cab(カルベニシリン耐性)
−Cam(クロラムフェニコール耐性)
−Kan(カナマイシン耐性)
−Rif(リファンピシン耐性)
−Tet(テトラサイクリン耐性)
−Zeo(ゼオシン耐性)
−Spec(スペクチノマイシン)
適量の抗生物質を用いることにより、選択圧を維持する。例として以下のものが挙げられる:アンピシリン、100mg/l、カルベニシリン、100mg/l、クロラムフェニコール、35mg/l、カナマイシン、30mg/l、リファンピシン、200mg/l、テトラサイクリン、12.5mg/l並びにスペクチノマイシン、50mg/l。
転写ターミネーターは、不要な転写を低減し、プラスミド及びmRNA安定性を増強する。
シャイン−ダルガーノ(SD)配列は、翻訳を開始するのに必要であり、16SリボソームRNAの3’末端と相補的である。開始コドンでの翻訳の開始の効率は実際の配列に左右される。大腸菌に適したコンセンサス配列の例として、5’-TAAGGAGG-3’がある。これは、開始コドンの約4〜14ヌクレオチド上流に位置し、8ヌクレオチドが最適である。二次構造の形成(発現を低減する可能性がある)を防止するために、この領域はA/Tヌクレオチドが豊富であるのが好ましい。
開始コドンは、翻訳が開始される位置である。ATGは大腸菌で最も多く用いられる開始コドンであり、これに代わり、GTGを用いることもできる。
比較的短いペプチド(タグ)又は他方のタンパク質(融合パートナー)を有する、発現させようとする組換えタンパク質のN又はC末端融合物が有利である。これらにより、例えば、発現、溶解度、検出可能性及び精製の改善を達成することができる。このような融合物と、発現及び精製後にタグ又は融合パートナーを除去することができるプロテアーゼ切断配列(例:トロンビン又は第X因子の場合)との組合せが好ましい。
考えられる3つの停止コドンのうち、TAGおよびTGAを用いた場合、翻訳は全く終結していないのにリードスルーが起こりうることから、TAAが好ましい。信頼できる終結を確実にするため、いくつかの停止コドンの配列を用いてもよい。
リポーター遺伝子は、容易に定量可能なタンパク質をコードし、これらのタンパク質は、固有の色又は酵素活性により、形質転換の効率、発現レベル、並びに発現の部位又は時間を評価することができる。リポーター遺伝子は、例えば、以下のタンパク質をコードする:加水分解酵素、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、グルコシダーゼ又はペルオキシダーゼ。ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、ホスホトランスフェラーゼ及びアデニルトランスフェラーゼが好ましい(Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44も参照)。
a)0.1〜100mM/lの範囲の総アルデヒド濃度をもたらす少なくとも1種のアルデヒド、及び
b)総濃度が、総アルデヒド濃度の10モル%以下である、ニトリル、シアン化水素酸及びシアン化塩からなる群より選択されるシアン化物の化合物。
a)少なくとも1つのニトリルヒドラターゼ又はニトリラーゼ酵素活性を有する微生物を培養するステップ、
b)少なくとも1種のアルデヒドを添加するステップであって、総アルデヒド濃度が0.1〜100mM/lの範囲であるステップ、
c)前記微生物のアルデヒド処理調製物を少なくとも1種のニトリルと接触させ、このニトリルをカルボン酸及び/又はアミドに変換させるステップ
を含む方法に関する。
a)少なくとも100mM、好ましくは300〜700mMの濃度で、少なくとも1種の無機塩(好ましくは、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩及び塩酸塩からなる群より選択される)を添加するステップ;
b)ニトリラーゼ及び/又はニトリルヒドラターゼ補欠分子族として機能する金属カチオンを有する金属塩(例:塩化コバルト又は硫酸鉄)を添加するステップ;
c)ニトリル(例:ベンゾニトリル、イソブチロニトリル若しくはスクシノニトリル)及び/又はアミド(s−カプロラクタム、イソブチルアミド若しくはプロピオンアミド)を添加するステップ。
大腸菌株(TG10 pDHE1650 pAgro4 pHSG575)を20lの生物反応器で発酵させた。10lの作業容量を含むこの反応器に、振盪器付きフラスコから200mlの前培養物を接種した。前培養培地は、主要培養培地と一致する。
40gの99.5%グリセロール
15gのトリプトン
13.3gのリン酸二水素カリウム
5gの酵母エキス
4gのリン酸水素二アンモニウム
1.7gのクエン酸
1.1gの硫酸マグネシウム七水和物
1mlのSL Korz 1000C微量元素溶液
0.1mlのTego KS911消泡剤
0.062gの硫酸鉄(II)七水和物
10mgの塩酸チアミン
1lになるよう脱イオン水を添加する
培地を121℃で30分滅菌する。次に、0.1gのアンピシリンを滅菌条件下で添加する。
クエン酸*H20 20g
塩化コバルト(II)六塩化物 CoCl2*6H2O 2.5g
塩化マンガン(II)四塩化物 MnCl2*4H2O 3.0g
塩化銅(II)二水和物 CuCl2*2H2O 0.3g
ホウ酸 H3BO3 0.6g
モリブデン酸ナトリウム二水和物 Na2MoO4*2H2O 0.5g
酢酸亜鉛脱水和物(dehydrate) Zn(CH3COO)2*2H2O 2.6g
1lになるよう脱イオンH2Oを添加する
グリセロール供給溶液
2lの脱イオン水
211gの硫酸ナトリウム
13.6gの硫酸鉄(II)七水和物
8.8kgの99.5%グリセロール
220mlの微量元素溶液
ラムノース供給溶液
703gの脱イオン水
297gのラムノース一水和物
37℃の温度で発酵を実施する。攪拌器の回転速度を400〜1500l/分に調節しながら、ガス抜きを8〜30l/分に調節することにより、pO2を20%以上に維持する。1時間の発酵時間後、IPTG(0.15mM)を用いて培養を誘導する。次に、18.5gのラムノース供給溶液を添加する。最初に導入した量のグリセロールが消費されたら、グリセロールを連続的に供給する。44時間にわたる発酵時間の後、1l当たり50gDBM及び1l当たり50〜60kUの細胞懸濁液を得る。前記細胞を4℃まで冷却する。
50μlの細胞懸濁液をピペットで880μlのリン酸ナトリウムカリウムバッファー(10mM)へと移し、全体を30℃で平衡化させる。20μlのマンデロニトリルのメタノール溶液(12%)を添加することにより、反応を開始する。10分後、50μlの1M HCを添加することにより、酵素反応を停止させる。細胞塊を遠心して分離し、上清中のマンデル酸の濃度をHPLC(ODS Hypersil 100*2.0mm、移動相:75%H3PO4(14.8mM)/25%メタノール;流速:0.5ml/分;注入量:2μl;カラム温度:40℃;検出:210nm;マンデル酸滞留時間:0.9分)により測定する。
細胞懸濁液をpH6.6に調節した後、2-クロロベンズアルデヒドを1.35mMの濃度まで添加してから、細胞懸濁液を4℃で保存した。活性の推移を図2に示す。
Claims (6)
- 少なくとも1つのニトリラーゼ酵素活性を示す微生物を保存及び/又は貯蔵する方法であって、保存及び/又は貯蔵が、0.1〜100mM/lの範囲の総アルデヒド濃度で少なくとも1種のアルデヒドを含む水性媒体中で行われ、該水性媒体が、シアン化物化合物の添加を全く含まないものである、上記方法。
- 細胞により触媒される反応の反応物質で該細胞を処理する前に保存ステップを実施する、請求項1又は2に記載の方法。
- アルデヒドが、非置換ベンズアルデヒド及び置換ベンズアルデヒドからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 微生物が、エンテロバクテリア科又はノカルジア科の種から選択される、請求項1に記載の方法。
- 微生物が、シュードモナス属、バークホルデリア属、ノカルジア属、アセトバクター属、グルコノバクター属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、クロストリジウム属、シアノバクター属、スタフィロコッカス属、アエロバクター属、アルカリゲネス属、ロドコッカス属及びペニシリウム属からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
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